KR20230088426A - 항-ccr8 단클론성 항체 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

인간 케모카인(C-C 모티프) 수용체 8(CCR8) 단백질에 대한 결합 특이성을 가지는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다. 이들 항체는 높은 친화도로 CCR8에 결합할 수 있고 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있다.

Description

항-CCR8 단클론성 항체 및 그것의 용도
본 발명은 항-CCR8 단클론성 항체 및 그것의 용도에 관한 것이다.
케모카인(C-C 모티프) 수용체 8(CCR8)은 베타 케모카인 수용체 패밀리의 구성원이며, G 단백질 결합 수용체와 유사한 7개의 경막 단백질이다. 케모카인 및 그것의 수용체는 다양한 세포 유형의 염증 부위로의 이동에 중요하다. 이 수용체 단백질은 흉선에서 우선적으로 발현된다. CCR8의 리간드는 CCL1이다. CCL8은 또한 CCR8 작용물질로서도 기능한다.
CCR8은 주로 조절 T 세포(Treg) 상에서 발현되며 CCR8+ Treg 매개 면역억제에 중요하다. 최근의 연구는 CCR8이 암 환자의 인간 종양 상주 Treg에서 독특하게 상향조절되는 것을 입증하였다. 또한 CCR8+ 골수 세포는 암 환자에서 팽창된 것으로 입증되었다.
CCR8을 표적화하는 항체는 동물 모델에서 종양 성장을 상당히 억제하고 장기간 생존율을 개선시키는 것으로 나타났다. 이런 항종양 활성은 증가된 종양 특이적 T 세포, 및 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 향상된 침윤과 상관이 있었다. 항체로의 치료는 CD8+ T 세포에 영향을 미치지 않으면서 Treg의 유도 및 억제성 기능을 방지하였다. 그러므로, CCR8을 표적화하는 것은 유망한 암 면역치료 접근법이다.
항-CCR8 항체는 인간 CCR8 단백질에 대해 높은 결합 친화도를 가지는 것으로 본원에서 발견되며, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 매개하는데 효율적이다.
한 구체예에서, 인간 케모카인(C-C 모티프) 수용체 8(CCR8) 단백질에 대해 결합 특이성을 가지는 항체 또는 그것의 단편이 제공된다. 항체 또는 그것의 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열을 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열을 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고 , CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 일부 구체예에서, 항체 또는 그것의 단편 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 조성물은 종양 항원에 대해 특이성을 가진 제2 항체를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 항체는 종양 옵소닌화 항체이다.
질환 및 병태의 치료 방법 및 용도가 또한 제공된다. 한 구체예에서, 환자에게 본 개시의 항체 또는 그것의 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다.
도 1은 쥐과 VH/VL과의 키메라 항체의 CCR8 결합 친화도를 도시한다.
도 2는 3개의 키메라 항체의 ADCC 활성을 도시한다.
도 3은 인간화된 88D2C6 항체가 높은 친화도를 가지는 것을 도시한다.
도 4는 인간화된 137D1H10 항체가 높은 친화도를 가지는 것을 도시한다.
도 5는 키메라 항체와 비교하여, 인간화된 항체가 상당히 더 높은 ADCC 활성을 가지는 것을 도시한다.
도 6은 유세포분석에 의한 LM-108 및 참조 항체의 인간 CCR8에 대한 세포 기반 결합의 결과를 도시한다. 상부 패널: 인간 CCR8 발현 HEK293에 대한 LM-108의 FACS 결합. 하부 패널: HEK293 세포에서 LM-108의 FACS 결합.
도 7은 유세포분석에 의한 인간 CCR8 고발현 U2OS 세포에 대한 LM-108의 세포 기반 결합을 도시한다.
도 8은 유세포분석에 의한 인간 CCR8 저발현 Jurkat 세포에 대한 LM-108의 세포 기반 결합을 도시한다.
도 9는 CCR8 고발현 U2OS 세포를 표적화하는, Jurkat/CD16a(158v)/NFAT-luc 세포를 사용하는 LM-108의 ADCC 리포터 유전자 검정의 결과를 도시한다.
도 10은 CCR8 저발현 Jurkat 세포를 표적화하는, Jurkat/CD16a(158v)/NFAT 세포를 사용하는 LM-108의 ADCC 리포터 유전자 검정의 결과를 도시한다.
도 11은 CCR8 발현 세포(상부 패널) 또는 대조군 세포(하부 패널)를 표적화하는 hPBMC로 LM-108의 ADCC 테스트의 결과를 도시한다.
도 12는 FACS에 의한 단핵세포 유래 대식세포루 LM-108의 ADCP를 도시한다. 상부 패널: LM-108 LM-108의 ADCP는 인간 CCR8 과다 발현 CHO-K1 세포를 향한다. 하부 패널: LM-108 LM-108의 ADCP는 대조군 CHO-K1 세포를 향한다.
도 13은 Operetta에 의한 단핵세포 유래 대식세포를 사용한 LM-108의 ADCP의 이미징 결과를 도시한다.
도 14는 BALB/c 마우스를 사용한 CT26 시너지 모델에 대한 LM-108m의 생체내 효능 연구에서, LM-108m 및 항-mPD-1 Ab의 투여 후 CT26 종양 보유 마우스의 종양 성장 곡선을 도시한다.
도 15는 hCCR8 ki 마우스를 사용한 MC38 시너지 모델에 대한 LM-108m의 생체내 효능 연구에서, LM-108m 및 비히클의 투여 후 MC38 종양 보유 마우스의 종양 성장 곡선을 도시한다.
도 16은 hCCR8 발현 세포에 대한 LM-108-vc-MMAE의 세포독성 평가의 결과를 도시한다.
정의
하나("a" 또는 "an")의 실체를 나타내는 용어는 그 실체의 하나 이상을 지칭하는 것에 유의하여야 한다; 예를 들어, "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 하나("a"(또는 "an")), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 복수의 "폴리펩타이드" 뿐만 아니라 단수의 "폴리펩타이드"를 포함하는 것으로 의도되고, 아미드 결합(펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩타이드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 특정 길이의 생성물을 지칭하는 것은 아니다. 그러므로, 둘 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 지칭하기 위해 사용된 펩타이드, 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 올리고펩타이드, "단백질", "아미노산 사슬", 또는 임의의 다른 용어는 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩타이드"는 이들 용어 중 어느 것 대신, 또는 어느 것과도 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩타이드"는 또한 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 알려져 있는 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 절단, 또는 비자연 발생 아미노산에 의한 변형을 포함한, 폴리펩타이드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 폴리펩타이드는 자연적인 생물학적 공급원으로부터 유도되거나 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 그것은 화학적 합성에 의한 것을 포함한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩타이드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교의 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교된 서열의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 차지될 때에는, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성 정도는 서열에 의해 공유된 매칭 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. "관련이 없는" 또는 "비상동성" 서열은 본 개시의 서열 중 하나와 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역(또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)은 또 다른 서열에 대해 특정 백분율(예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%)의 "서열 동일성"을 가지며, 이것은, 정렬될 때, 그 백분율의 염기(또는 아미노산)가 두 서열을 비교하여 동일한 것을 의미한다.
용어 "동등한 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드"는 핵산 또는 그것의 보체의 뉴클레오타이드 서열과 특정 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 가진 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 지칭한다. 이중 가닥 핵산의 상동체는 핵산 또는 그것의 보체과 특정 정도의 상동성을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산을 포함하는 것으로 의도된다. 한 측면으로, 핵산의 상동체는 핵산 또는 그것의 보체와 혼성화할 수 있다. 마찬가지로, "동등한 폴리펩타이드"는 참조 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 특정 정도의 상동성, 또는 서열 동일성을 가진 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 측면으로, 서열 동일성은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%이다. 일부 측면으로, 동등한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 1, 2, 3, 4 또는 5개의 첨가, 결실, 치환 및 그것들의 조합을 가진다. 일부 측면으로, 동등한 서열은 참조 서열의 활성(예컨대, 에피토프 결합) 또는 구조(예컨대, 염-가교)를 유지한다.
본원에서 사용되는 바, "항체" 또는 "항원 결합 폴리펩타이드"는 항원을 특이적으로 인식하고 결합하는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 지칭한다. 항체는 전체 항체 및 그것의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬일 수 있다. 그러므로 용어 "항체"는 항원에 대한 결합의 생물학적 활성을 가지는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 분자를 함유한 임의의 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 그러한 것의 예로는, 한정하는 것은 아니지만 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역(CDR) 또는 그것의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크(FR) 영역, 또는 그것들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 한 부분을 들 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 부분이다. 구조와 관계 없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편"에는 압타머, 스피겔머, 및 디아바디가 포함된다. 용어 "항체 단편"에는 또한 특정 항원에 대한 결합에 의해 복합체를 형성하는 항체와 같이 작용하는 임의의 합성 또는 유전자 조작된 단백질이 포함된다.
"단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질을 지칭한다. 일부 측면으로, 영역은 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 링커 펩타이드와 연결된다. 링커는 유연성을 위해 글리신이 풍부할 수 있을뿐만 아니라, 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부할 수 있고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결시키거나, 또는 그 역으로 연결시킬 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래의 면역글로불린의 특이성을 유지한다. ScFv 분자는 기술분야에 알려져 있고, 예컨대, 미국 특허 제 5,892,019호에 기술되어 있다.
용어 항체는 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 넓은 부류의 폴리펩타이드를 포함한다. 기술분야에 숙련된 사람들은 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로서 분류되고 그것들 중 일부는 하위부류(예컨대, γ 1- γ4)가 있는 것을 인지할 것이다. 항체의 "부류"를 각각 IgG, IgM, IgA IgG, 또는 IgE로서 결정하는 것은 이 사슬의 본질이다. 면역글로불린 하위부류(아이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, 등은 특성확인이 잘 되어 있고 기능적 전문화를 부여하는 것으로 알려져 있다. 이들 부류 및 아이소타입의 각각의 변형된 버전은 본 개시의 관점에서 숙련된 전문가에 의해 쉽게 식별될 수 있고, 따라서, 본 개시의 범주 내에 있다. 모든 면역글로불린 부류는 분명하게 본 개시의 범주 내에 있으며, 다음의 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 부류에 대한 것일 것이다. IgG와 관련하여, 표준 면역글로불린 분자는 대략 23,000 달톤의 분쟈량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 53,000-70,000의 분자량의 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 사슬은 전형적으로 "Y"의 입구에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 경쇄가 묶는 "Y"자형 구성으로 이황화 결합에 의해 연결된다.
본 개시의 항체, 항원 결합 폴리펩타이드, 변이체, 또는 그것들의 유도체에는, 한정하는 것은 아니지만, 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, 에피토프 결합 단편, 예컨대, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일 사슬 Fv(scFv), 단일 사슬 항체, 이황화 연결된 Fv(sdFv), VK 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 및 항-이디오타입(항-Id) 항체(예컨대, 본원에 기술된 LIGHT 항체에 대한 항-Id 항체 포함)가 포함된다. 본 개시의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예컨대, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류(예컨대, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나로서 분류된다(κ, λ). 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄 중 어느 하나와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로에게 공유 결합되고, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 공유 이황화 결합 또는 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 비공유 결합에 의해 서로에게 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 "Y"자 구성의 갈라진 단부에서 N-말단으로부터 각 사슬의 하단에서의 C-말단까지 이어진다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동체의 영역으로 나누어진다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이런 견지에서, 두 경쇄(VK) 및 중쇄(VH) 사슬 부분의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것이 인정될 것이다. 역으로, 경쇄(CK) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합, 등과 같은 중요한 생물학적 특성을 부여한다. 통상적으로 불변 영역 도메인의 넘버링은 항원 결합 부위 또는 항체의 아미노 말단으로부터 더 멀어짐에 따라 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분에는 불변 영역이 있다; CH3 및 CK 도메인은 실제로 각각 중쇄 및 경쇄의 카르복시 말단을 포함한다.
위에서 나타낸 것과 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합하는 것을 허용한다. 즉, 항체의 VK 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역(CDR)의 하위세트는 조합되어 삼차원 항원 결합 부위를 규정하는 가변 영역을 형성한다. 이런 4요소 항체 구조는 Y의 각각의 아암의 단부에 존재하는 항원 결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원 결합 부위는 VH 및 VK 사슬의 각각의 3개의 CDR(즉 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에 의해 규정된다. 일부 경우에, 예컨대, 특정 면역글로불린 분자가 낙타과 종으로부터 유래되거나 낙타과 면역글로불린을 토대로 조작되는 경우에, 완전한 면역글로불린 분자는 경쇄 없이, 중쇄로만 이루어질 수 있다. 예컨대, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)]을 참고한다.
자연적으로 발생하는 항체에서, 각각의 항원 결합 도메인에 존재하는 6개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 삼차원 구성을 가정하기 때문에 항원 결합 도메인을 형성하기 위해 특이적으로 위치한 짧은, 비연속성 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역으로서 지칭되는, 항원 결합 도메인의 아미노산의 나머지는 더 적은 분자간 가변성을 보인다. 프레임워크 영역은 대부분 β 시트 형태를 채택하며 CDR은 β 시트 구조를 연결시키고, 일부 경우에 β 시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 그러므로, 프레임워크 영역은 사슬간 비공유 상호작용에 의해 정확한 방향으로 CDR 배치를 제공하는 스캐폴드를 형성한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 이런 상보적인 표면은 항체의 동족 에피토프에 대한 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 프레임워크 영역을 각각 포함하는 아미노산은, 그것들이 정확하게 정의되어 있기 때문에 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 쉽게 확인될 수 있다("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. MoI. Biol., 196:901-917 (1987) 참고).
기술분야 내에서 사용되고/거나 수용되는 용어의 둘 이상의 정의가 있는 경우에, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 명백하게 반대되는 표기가 없는 한 모든 그러한 의미를 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비연속성 항원 결합 부위를 기술하기 위해 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")을 사용하는 것이다. 이 특별한 영역은 Kabat 등에 의해 문헌[U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 Chothia 등에 의해 문헌[J. MoI. Biol. 196:901-917 (1987)]에기술되어 있고, 이들 문헌의 전체 내용은 참조로 본원에 포함된다. Kabat 및 Chothia에 따르는 CDR 정의는 서로에 대해 비교될 때 중복되거나 하위세트의 아미노산 잔기를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그것의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 하나의 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용되는 용어의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 위에서 인용된 참고문헌의 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 아래의 표에 비교하여 제시된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 기술분야에 숙련된 사람들은 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 제공된 특정 CDR을 포함하는 잔기를 일상적으로 결정할 수 있다.
Figure pct00001
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용할 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 기술분야에 통상적인 지식이 있는 사람은 서열 자체 이외의 어떠한 실험 데이터에 의존하지 않고, 임의의 가변 도메인 서열에 "Kabat 넘버링"의 이 시스템을 분명하게 할당할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "Kabat 넘버링"은 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에서 제시된 넘버링 시스템을 지칭한다.
위의 표 외에, Kabat 넘버링 시스템은 다음과 같이 CDR 영역을 기술한다: CDR-H1은 대략 아미노산 31(즉, 제1 시스테인 잔기에서 대략 9개 잔기 뒤)에서 시작하고, 대략 5-7개 아미노산을 포함하며, 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-H2는 CDR-H1이 끝난 후 15번째 잔기에서 시작하고, 대략 16-19개 아미노산을 포함하며, 다음 아르기닌 또는 리신 잔기에서 끝난다. CDR-H3은 CDR-H2가 끝난 후 대략 33번째 아미노산 잔기에서 시작하고; 3-25개 아미노산을 포함하며; 서열 W-G-X-G에서 끝나고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다. CDR-L1은 대략 잔기 24(즉, 시스테인 잔기 다음)에서 시작하고; 대략 10-17개 잔기를 포함하며; 다음 트립토판 잔기에서 끝난다. CDR-L2는 CDR-L1이 끝난 후 대략 16번째 잔기에서 시작하고 대략 7개 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2가 끝난 후 대략 33번째 잔기에서 시작하고(즉, 시스테인 잔기 다음); 7-11개 잔기를 포함하며 서열 F 또는 W-G-X-G에서 끝나고, 여기서 X는 임의의 아미노산이다.
본원에 개시된 항체는 조류 및 포유류를 포함한 임의의 동물 기원으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 항체는 인간, 쥐과, 당나귀, 토끼, 염소, 기니 피그, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구체예에서, 가변 영역은 콘드릭토이드(예컨대, 상어로부터) 기원일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "중쇄 불변 영역"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드는: CH1 도메인, 힌지(예컨대, 상부, 중간, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 그것들의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 개시에서 사용하기 위한 항원 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬; CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬, 또는 CH1 도메인, 힌지 도메인의 적어도 일부, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 개시의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 추가로, 개시에서 사용하기 위한 항체는 CH2 도메인의 적어도 일부(예컨대, CH2 도메인의 전부 또는 일부)가 없을 수 있다. 위에서 제시된 것과 같이, 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에 의해 자연적으로 발생하는 면역글로불린 분자와 아미노산 서열이 달라지도록 중쇄 불변 영역이 변형될 수 있는 것이 이해될 것이다.
본원에 개시된 항체의 중쇄 불변 영역은 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 불변 영역은 IgG1 분자로부터 유래된 CH1 도메인 및 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 불변 영역은 부분적으로 IgG1 분자로부터 및, 부분적으로 IgG3 분자로부터 유래된 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자로부터 및, 부분적으로 IgG4 분자로부터 유래된 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "경쇄 불변 영역"은 항체 경쇄로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 경쇄 불변 영역은 불변 카파 도메인 또는 불변 람다 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
"경쇄-중쇄 쌍"은 경쇄의 CL 도메인과 중쇄의 CH1 도메인 사이의 이황화 결합을 통해 다이머를 형서알 수 있는 경쇄와 중쇄의 집합체를 지칭한다.
이전에 나타낸 것과 같이, 다양한 면역글로불린 부류의 불변 영역의 하위단위 구조 및 삼차원 구성은 잘 알려져 있다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함하고 용어 "CH1 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 제1(가장 아미노 말단 쪽) 불변 영역 도메인을 포함한다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하고 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본원에서 사용되는 바 용어 "CH2 도메인"은 종래의 넘버링 도식을 사용하여 항체의 예컨대 약 잔기 244에서 잔기 360까지 연장되는 중쇄 분자의 부분을 포함한다(잔기 244 내지 360, Kabat 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) 참고). CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬은 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 끼어 있다. 또한 CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인으로부터 C-말단까지 연장되고 대략 108개 잔기를 포함하는 것이 잘 문서화되어 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "힌지 영역"은 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결시키는 중쇄 분자 부분을 포함한다. 이 힌지 영역은 대략 25개 잔기를 포함하며 유연하고, 그로써 2개의 N-말단 항원 결합 영역이 독립적으로 움직이는 것을 허용한다. 힌지 영역은 3개의 별개 도메인: 상부, 중간, 하부 힌지 도메인으로 세분화될 수 있다(Roux et al., J. Immunol 161:4083 (1998)).
본원에서 사용되는 용어 "이황화 결합"은 2개의 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 포함한다. 아미노산 시스테인은 이황화 결합을 형성하거나 또는 제2 티올기와 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 자연적으로 발생하는 IgG 분자에서, CH1 및 CK 영역은 이황화 결합에 의해 연결되고 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 사용하여 239 및 242(위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에 상응하는 위치에 있는 2개의 이황화 결합에 의해 연결된다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 얻어지거나 유래되고 불변 영역(본 개시에 따라 온전하거나, 부분적이거나 변형될 수 있음)은 제2 종으로부터 얻어지는 임의의 항체를 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 특정 구체예에서 표적 결합 영역 또는 부위는 비인간 공급원(예컨대 마우스 또는 영장류)으로부터 유래될 것이고 불변 영역은 인간이다.
본원에서 사용되는 바, "퍼센트 인간화"는 인간화된 도메인과 생식선 도메인 사이의 프레임워크 아미노산의 차이(즉, 비-CDR 차이)의 수를 결정하고, 아미노산의 총 수로부터 그 수를 뺀 후, 아미노산의 총 수로 그 값을 나누고 100을 곱함으로써 계산된다.
"특이적으로 결합하는" 또는 "에 대해 특이성을 가지는"은, 일반적으로 항체가 그것의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하고, 결합은 항원 결합 도메인과 에피토프 사이에 약간의 상보성을 수반하는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 항체는 무작위의, 무관한 에피토프에 결합하는 것보다 더 쉽게 그것의 항원 결합 도메인을 통해 한 에피토프에 결합할 때, 그 에피토프에 "실질적으로 결합"하는 것으로 말할 수 있다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정 항체가 특정 에피토프에 결합하는 상대적인 친화도를 한정하기 위해 사용된다. 예를 들어, 항체 "A"는 주어진 에피토프에 대해 항체 "B"보다 더 높은 특이성을 가지는 것으로 간주될 수 있거나, 또는 항체 "A"는 관련된 에피토프 "D"에 대해 가지는 것보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 말할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "치료하다" 또는 '치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지하는 조치를 모두 지칭하며, 여기서 목적은 바람직하지 못한 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 진행을 방지 또는 둔화(경감)시키는 것이다. 유익한 또는 바람직한 임상 결과에는, 한정하는 것은 아니지만, 측정 가능하거나 측정 가능하지 않거나간에 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 차도(부분적이거나 전체적임)가 포함된다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상된 생존율과 비교하여 연강된 생존율을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람들에는 이미 병태 또는 장애를 가진 사람들뿐만 아니라 병태 또는 장애에 걸리기 쉬운 사람들 또는 병태 또는 장애가 예방되어야 하는 사람들이 포함된다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 진단, 예후, 또는 치료법이 바람직할 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체를 의미한다. 포유류 대상체에는 인간, 가축 동물, 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 암소, 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "치료를 필요로 하는 환자에게" 또는 "치료를 필요로 하는 대상체"와 같은 구절은 예컨대, 진단 과정 및/또는 치료를 위해 사용된 본 개시의 항체 또는 조성물의 투여로부터 유익을 얻을 대상체, 예컨대 포유류 환자를 포함한다.
항-CCR8 항체
본 개시는 인간 CCR8 단백질에 대한 높은 친화도를 가지고 있고, ADCC 및 ADCP를 매개하는 데 강력하며, 강력한 생체내 종양 억제 효능을 보인 항-CCR8 항체 및 단편을 제공한다. 흥미로운 것은, 항-CCR8 항체(WO2020138489로부터 유래됨)를 벤치마크로서 사용할 때, 본 개시된 항체는 비-CCR8 발현 세포에 결합하지 않는 것으로 나타난 한편, 벤치마크 항체는 그런 대조군 세포에도 결합하였다. 그러므로, 본 항체는 임상 용도에서 바람직하지 않은 유해 효과가 적을 것으로 예상될 수 있다. 그러므로, 이들 항체는 과다발현된 CCR8을 특징으로 하는 다양한 질환, 예컨대 암을 치료하기 위한 적합한 작용제이다.
그러므로, 본 개시의 한 구체예에 따르면, CCR8에 결합할 수 있는 항체 및 그것의 항원 결합 단편이 제공된다. 예시의 항체에는 표 1에 열거된 쥐과의 항체(예컨대, 137D1H10, 88D2C6, 89B6F8, 132H8E10, 10F11B2, 40H10F3, 53D6A9, 352H11C11, 362G7D3, 362H10A3, 367D10E7, 370D2C10)뿐만 아니라, 표 2-3의 인간화된 항체가 포함된다. 또한 본원에 예시된 것과 동일한 CDR을 포함하는 것들도 포함된다. 일부 구체예에서, 개시된 항체 및 단편에는 본원에 예시된 것과 동일한 에피토프에 결합하는 것들과, CCD8에 대한 결합에서 본원에 개시된 것과 경합하는 것들이 포함된다.
본 개시의 한 구체예에 따르면, 본원에 개시된 CDR 영역을 가지는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 또는 그것의 단편, 뿐만 아니라 그것의 생물학적 등가물이 제공된다.
한 구체예에서, CDR은 표 2B 및 2D에서 예시된 것과 같이, 88D2C6의 것들 또는 그것들의 인간화된 대응물이다. 한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 22의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 23의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함한다.
한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 22의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 23의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함한다.
한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열을 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 일부 구체예에서, 88D2C6 또는 그것의 인간화된 대응물과 동일한 CDR을 포함하는 것들이 제공된다. 일부 구체예에서, 개시된 항체 및 단편에는 88D2C6 또는 그것의 인간화된 대응물과 동일한 에피토프에 결합하는 것들, 및 CCR8에 대한 결합에서 그것들 중 어느 것과 경합하는 것들이 포함된다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:3(마우스 또는 키메라) 및 29-31(인간화된)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:3(마우스 또는 키메라) 및 29-31(인간화된)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:2(마우스 또는 키메라), 32-34 및 41-43(인간화된)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호(마우스 또는 키메라): 2, 32-34 및 41-43(인간화된)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 가진 펩타이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:30의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:31의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, CDR은 표 3B 및 3D에서 예시된 것과 같이, 137D1H10 또는 그것의 인간화된 대응물의 것들이다. 한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 35의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 36의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 37의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함한다.
한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 35의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 36의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 37의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열 또는 1, 2, 또는 3개의 결실, 첨가, 치환 또는 그것들의 조합을 가지는 그것의 변이체를 포함한다.
한 구체예에서, CDRH1은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열을 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 일부 구체예에서, 137D1H10 또는 그것의 인간화된 대응물과 동일한 CDR을 포함하는 것들이 제공된다. 일부 구체예에서, 개시된 항체 및 단편에는 137D1H10 또는 그것의 인간화된 대응물과 동일한 에피토프에 결합하는 것들, 및 CCR8에 대한 결합에서 그것들 중 어느 것과 경합하는 것들이 포함된다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:1(마우스 또는 키메라) 및 38-40(인간화된)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호:3(마우스 또는 키메라) 및 29-31(인간화된)로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 펩타이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:2(마우스 또는 키메라), 32-34 및 41-43(인간화된)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 서열 번호: 2(마우스 또는 키메라), 32-34 및 41-43(인간화된)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 가지는 펩타이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:38의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:39의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함한다.
이들 CDR 영역을 함유한 항체는 마우스, 인간화된 또는 키메라이든, 강력한 CCR8 결합 및 억제 활성을 가졌다. 실시예 4에서 나타내는 것과 같이, CDR 내의 특정 잔기는 특성을 보유 또는 개선하도록 또는 번역 후 변형(PTM)될 잠재력을 감소시키도록 변형될 수 있다. 그러한 변형된 CDR은 친화도 성숙 또는 위험 제거 CDR로 언급될 수 있다(예컨대, 서열 번호:25).
변형된 CDR은 1, 2 또는 3개의 아미노산 첨가, 결실 및/또는 치환을 가지는 것들을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 치환은 보존성 치환일 수 있다.
"보존성 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 염기성 측쇄를 가진 아미노산 잔기(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비대전 극성 측쇄를 가진 아미노산 잔기(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산 잔기(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지형 측쇄를 가진 아미노산 잔기(예컨대, 트레오닌, 발린, 아이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산 잔기(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하여, 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 기술분야에서 정의되어 있다. 그러므로, 면역글로불린 폴리펩타이드의 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 또 다른 구체예에서, 아미노산의 문자열은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한 구조적으로 유사한 문자열로 대체될 수 있다.
보존성 아미노산 치환의 비제한적인 예가 아래의 표에 제공되며, 표에서 0 이상의 유사성 점수는 두 아미노산 사이의 보존성 치환을 나타낸다.
Figure pct00002
Figure pct00003
기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람에게는 본원에 개시된 항체가 그것이 유래되는 자연적으로 발생하는 결합 폴리펩타이드와는 아미노산 서열이 달라지도록 변형될 수 있는 것이 또한 이해될 것이다. 예를 들어, 지정된 단백질로부터 유래된 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 유사할 수 있고, 예컨대 출발 서열에 대해 특정 퍼센트의 동일성을 가질 수 있으며, 예컨대, 출발 서열에 대해 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다.
특정 구체예에서, 항체는 항체와 정상적으로 회합되지 않는 아미노산 서열 또는 하나 이상의 모이어티를 포함한다. 예시의 변형은 아래에서 보다 상세하게 기술된다. 예를 들어, 본 개시의 항체는 유연한 링커 서열을 포함하거나, 또는 기능적 모이어티(예컨대, PEG, 약물, 독소, 또는 표지)를 부가하도록 변형될 수 있다.
본 개시의 항체, 변이체, 또는 그것의 유도체는 변형된, 즉, 공유 부착이 항체가 에피토프에 결합하는 것을 방해하지 않도록 항체에 임의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 항체는 예컨대, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 인산화, 아미드화, 알려진 보호/차단기에 의한 유도, 단백질 가수분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 대한 결합, 등에 의해 변형될 수 있다. 수많은 화학적 변형 중 어느 것이든지, 한정하는 것은 아니지만, 특정 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성, 등을 포함한 알려져 있는 기법에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 항체는 하나 이상의 비고전적 아미노산을 함유할 수 있다.
일부 구체예에서, 항체는 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 제약학적 작용제, 또는 PEG에 콘쥬게이션될 수 있다.
항체는 방사성 표지, 면역조절제, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 광활성 치료제 또는 진단제, 약물 또는 독소일 수 있는 세포독성제, 초음파 향상제, 비방사성 표지, 이것들의 조합 및 기술분야에 알려져 있는 다른 그러한 작용제와 같은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있는 치료제에 콘쥬게이션되거나 융합될 수 있다.
항체는 화학발광 화합물에 결합됨으로써 검출 가능하게 표지화될 수 있다. 화학발광 태그 부착된 항원 결합 폴리펩타이드의 존재는 그런 후에 화학 반응 과정 중에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지화 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 유채색의 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항체는 또한 152Eu, 또는 란탄계의 다른 것과 같은 형광 방출 금속을 사용하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 그러한 금속 킬레이트화 기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 다양한 모이어티를 항체에 콘쥬게이션하기 위한 기법은 잘 알려져 있고, 예컨대, 다음의 문헌을 참고한다: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. (52:119-58 (1982).
이중기능성 분자 및 병용 요법
CCR8은 케모카인이고 종양 항원이다. 종양 항원 표적화 분자로서, CCR8에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편은 면역 세포에 특이적인 제2 항원 결합 단편, 또는 병용 요법 또는 이중특이적 항체를 생성하기 위한 면역 체크포인트에 특이적인 항원 결합 단편과 조합될 수 있다.
일부 구체예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 단핵세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 식세포, 자연 살해 세포, 호산성 세포, 호염기성 세포, 및 비만 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 표적화될 수 있는 면역 세포 상의 분자로는, 예를 들어, CCL1, CD3, CD16, CD19, CD28, 및 CD64를 들 수 있다. 다른 예로는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3(또한 CD223으로도 알려짐), CD28, CD122, 4-1BB(또한 CD137로도 알려짐), TIM3, OX-40 또는 OX40L, CD40 또는 CD40L, LIGHT, ICOS/ICOSL, GITR/GITRL, TIGIT, CD27, VISTA, B7H3, B7H4, HEVM 또는 BTLA(또한 CD272로도 알려짐), 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 및 CD47을 들 수 있다.
면역 체크포인트 억제제로서, CCR8에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편은 종양 항원에 특이적인 제2 항원 결합 단편과 조합될 수 있다. "종양 항원"은 종양 세포에서 생성되는 항원성 물질이며, 즉, 그것은 숙주에서 면역 반응을 촉발시킨다. 종양 항원은 종양 세포를 확인하는데 유용하며 암 요법에 사용하기 위한 잠재적 후보이다. 체내의 정상 단백질은 항원성이 아니다. 그러나, 어떤 단백질은 종양형성 중에 생성되거나 과다발현되므로 신체에는 "이물질"로 나타난다. 이것에는 면역 체계로부터 잘 격리되는 일반 단백질, 일반적으로 극소량으로 생성되는 단백질, 일반적으로 특정 발달 단계에서만 생성되는 단백질, 또는 돌연변이로 인해 구조가 변형되는 단백질이 포함된다.
풍부한 종양 항원은 기술분야에 알려져 있고 새로운 종양 항원은 스크리닝에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 종양 항원의 비제한적인 예에는 EGFR, Her2, EpCAM, CD20, CD30, CD33, CD47, CD52, CD133, CD73, CEA, gpA33, 뮤신, TAG-72, CIX, PSMA, 엽산 결합 단백질, GD2, GD3, GM2, VEGF, VEGFR, 인테그린, aVb3, a5b1, ERBB2, ERBB3, MET, IGF1R, EPHA3, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP 및 테나신이 포함된다.
일부 측면으로, 일가 단위는 상응하는 비종양 세포와 비교하여 종양 세포 상에서 과다발현되는 단백질에 대해 특이성을 갖는다. 본원에서 사용되는, "상응하는 비종양 세포"는 종양 세포가 기원하는 것과 동일한 세포 유형의 것인 비종양 세포를 지칭한다. 그러한 단백질은 종양 항원과 반드시 상이하지 않는 것에 유의하여야 한다. 비제한적인 예로는 대부분의 결장, 직장, 유방, 폐, 췌장 및 위장관 암종에서 과다발현되는 암배아 항원(CEA); 유방, 난소, 결장, 폐, 전립선 및 자궁경부 암에서 자주 과다발현되는 헤레굴린 수용체(HER-2, neu 또는 c-erbB-2); 유방, 두경부, 비-소세포 폐 및 전립선의 고체 종양을 포함한 다양한 고체 종양에서 고도로 발현되는 상피 성장 인자 수용체(EGFR); 아시알로당단백질 수용체; 트랜스페린 수용체; 간세포에서 발현되는 세르핀 효소 복합 수용체; 췌장관 선암종 세포 상에서 과다발현되는 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR); 항-혈관신생 유전자 요법을 위한 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR); 비점액성 난소 암종의 90%에서 선택적으로 과다발현되는 엽산 수용체; 세포 표면 글리코칼릭스; 탄수화물 수용체; 및 호흡기 상피 세포로의 유전자 전달에 유용하고 낭포성 섬유증과 같은 폐 질환의 치료에 매력적인 중합체 면역글로불린 수용체를 들 수 있다.
상이한 포맷의 이중특이적 항체가 또한 제공된다. 일부 구체예에서, 항-PD-L1 단편의 각각 및 제2 단편 각각은 Fab 단편, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 또는 단일 도메인 항체로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구체예에서, 이중특이적 항체는 추가로 Fc 단편을 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편만이 아니라 이중기능성 분자가 또한 제공된다. 종양 항원 표적화 분자로서, CCR8에 특이적인 항체 또는 항원 결합 단편, 예컨대 본원에 기술된 것들은 선택적으로 펩타이드 링커를 통해 면역 사이토카인 또는 리간드와 조합될 수 있다. 연결된 면역 사이토카인 또는 리간드에는, 한정하는 것은 아니지만, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, GM-CSF, TNF-a, CD40L, OX40L, CD27L, CD30L, 4-1BBL, LIGHT 및 GITRL이 포함된다. 그러한 이중기능성 분자는 면역 체크포인트 차단 효과를 종양 부위 국지적 면역 조절과 조합할 수 있다.
항체-약물 콘쥬게이트
일부 구체예에서, 항체 또는 단편은 치료제, 전구약물, 펩타이드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 변형제, 제약학적 작용제, 또는 PEG와 콘쥬게이션될 수 있다.
한 구체예에서, 본 개시의 항체 또는 단편은 약물 모이어티에 공유 부착될 수 있다. 약물 모이어티는 항체 상의 콘쥬게이션 지점과 반응하는 기이거나, 그런 기를 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 약물 모이어티는 알킬화(예컨대, 항체의 엡실론-아미노 기 리신 또는 N-말단에서), 산화된 탄수화물의 환원성 아미노화, 하이드록실과 카르복실 기 사이의 에스테르 교환 반응, 아미노기 또는 카르복실기에서의 아미드화, 및 티올에이 콘쥬게이션에 의해 부착될 수 있다.
일부 구체예에서, 항체 분자당 콘쥬게이션되는 약물 모이어티의 수, p는 평균 1 내지 8; 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2의 범위이다. 일부 구체예에서, p의 범위는 평균 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4 또는 2 내지 3이다. 다른 구체예에서, p는 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 일부 구체예에서, p의 범위는 평균 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 10, 약 2 내지 약 9, 약 1 내지 약 8, 약 1 내지 약 7, 약 1 내지 약 6, 약 1 내지 약 5, 약 1 내지 약 4, 약 1 내지 약 3, 또는 약 1 내지 약 2이다. 일부 구체예에서, p의 범위는 약 2 내지 약 8, 약 2 내지 약 7, 약 2 내지 약 6, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4 또는 약 2 내지 약 3이다.
예를 들어, 단백질의 화학적 활성화가 자유 티올기의 형성을 초래할 때, 단백질은 설프하이드릴 반응성 작용제와 콘쥬게이션될 수 있다. 한 측면으로, 작용제는 실질적으로 자유 티올기에 대해 특이적인 것이다. 그러한 작용제로는, 예를 들어, 말레이미드, 할로아세타미드(예컨대, 요오도, 브로모 또는 클로로), 할로에스테르(예컨대, 요오도, 브로모 또는 클로로), 할로메틸 케톤(예컨대, 요오도, 브로모 또는 클로로), 벤질 할라이드(예컨대, 요오다이드, 브로마이드 또는 클로라이드), 비닐 설폰 및 피리딜티오를 들 수 있다.
약물은 링커에 의해 항체 또는 단편에 연결될 수 있다. 적합한 링커로는, 예를 들어, 절단 가능한 및 절단 가능하지 않은 링커를 들 수 있다. 절단 가능한 링커는 전형적으로 세포내 조건 하에서 절단되기 쉽다. 적합한 절단 가능한 링커로는, 예를 들어, 세포내 프로테아제, 예컨대 리소좀성 프로테아제 또는 엔도솜성 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커를 들 수 있다. 예시의 구체예에서, 링커는 다이펩타이드 링커, 예컨대 발린-시트룰린(val-cit), 페닐알라닌-리신(phe-lys) 링커, 또는 말레이미도카프로닉-발린-시트룰린-p-아미노벤질옥시카르보닐(mc-Val-Cit-PABA) 링커일 수 있다. 또 다른 링커는 설포석신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카르복실레이트(smcc)이다. 설포-smcc 콘쥬게이션은 설프하이드릴(티올, -SH)과 반응하는 말레이미드 기를 통해 일어나는 한편, 그것의 설포-NHS 에스테르는 일차 아민에 대해 반응성이다(리신 및 단백질 또는 펩타이드 N-말단에서 발견됨). 또 다른 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 적합한 링커에는 특정 pH 또는 pH 범위에서 가수분해 가능한 링커, 예컨대 하이드라존 링커가 포함된다. 추가의 적합한 절단 가능한 링커에는 이황화물 링커가 포함된다. 링커, 예컨대 mc 링커 등은 약물이 방출되기 위해 항체가 세포내에서 분해되어야 하는 정도로 항체에 공유 결합될 수 있다.
링커는 항체에의 결합을 위한 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커에는 아미노, 하이드록실, 카르복실 또는 설프하이드릴 반응성 기(예컨대, 말레이미드, 할로아세타미드(예컨대, 요오도, 브로모 또는 클로로), haloesters(예컨대, 요오도, 브로모 또는 클로로), 할로메틸 케톤(예컨대, 요오도, 브로모 또는 클로로), 벤질 할라이드(예컨대, 요오다이드, 브로마이드 또는 클로라이드), 비닐 설폰 및 피리딜티오)가 포함될 수 있다.
일부 구체예에서, 약물 모이어티는 세포독성제 또는 세포정지제, 면역억제제, 방사성 동위원소, 독소, 등이다. 콘쥬게이트는 종양 세포 또는 암 세포의 증식을 억제하기 위해, 종양 또는 암 세포에서 세포자멸사를 유발하기 위해, 또는 환자에서 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 콘쥬게이트는 따라서 다양한 환경에서 동물의 암 치료를 위해 사용될 수 있다. 콘쥬게이트는 종양 세포 또는 암 세포에 약물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않으면서, 일부 구체예에서, 콘쥬게이트는 클라우딘 18.2를 발현하는 암 세포에 결합하거나 회합되며, 콘쥬게이트 및/또는 약물은 수용체 매개 세포내이입을 통해 종양 세포 또는 암 세포 내부로 흡수될 수 있다.
세포 내부에 들어가면, 콘쥬게이트 내의(예컨대, 링커의) 하나 이상의 특정 펩타이드 서열은 하나 이상의 종양 세포 또는 암 세포 회합 프로테아제에 의해 가수분해적으로 절단되어 약물이 방출되는 결과가 초래된다. 방출된 약물은 그런 후 세포 내에서 자유롭게 이동하여 세포독성 또는 세포정지성 또는 기타 활성을 유도한다. 일부 구체예에서, 약물은 종양 세포 또는 암 세포 외부에서 항체로부터 절단되고, 약물은 후속해서 세포를 침투하거나, 세포 표면에서 작용한다.
약물 모이어티 또는 페이로드의 예는 DM1(메이탄신, N2'-탈아세틸-N2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)- 또는 N2'-탈아세틸-N2'-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신), mc-MMAD(6-말레이미도카프로일-모노메틸아우리스타틴-D 또는 N-메틸-L-발릴-N-[(1S,2R)-2-메톡시-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-[[(1S)-2-페닐-1-(2-티아졸릴)에틸]아미노]프로필]-1-피롤리디닐]-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸]-N-메틸-(9Cl)-L-발린아미드), mc-MMAF(말레이미도카프로일-모노메틸아우리스타틴 F 또는 N-[6-(2,5-다이하이드로-2,5-다이옥소-1H-피롤-1-일)-1-옥소헥실]-N-메틸-L-발릴-L-발릴-(3R,4S,5S)-3-메톡시-5-메틸-4-(메틸아미노)헵타노일-(αR, βR,2S)-β-메톡시-α-메틸-2-피롤리덴프로파노일-L-페닐알라닌) 및 mc-Val-Cit-PABA-MMAE(6-말레이미도카프로일-ValcCit-(p-아미노벤질옥시카르보닐)-모노메틸아우리스타틴 E 또는 N-[[[4-[[N-[6-(2,5-다이하이드로-2,5-di옥소-1H-피롤-1-일)-1-옥소헥실]-L-발릴-N5-(아미노카르보닐)-L-오르니틸]아미노]페닐]메톡시]카르보닐]-N-메틸-L-발릴-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-하이드록시-1-메틸-2-페닐에틸]아미노]-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]-1-피롤리디닐]-2-메톡시-1-[(1S)-1-메틸프로필]-4-옥소부틸]-N-메틸-L-발린아미드)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. DM1은 튜불린 억제제 메이탄신의 유도체인 한편 MMAD, MMAE, 및 MMAF는 아우리스타틴 유도체이다. 일부 구체예에서, 약물 모이어티는 mc-MMAF 및 mc-Val-Cit-PABA-MMAE로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 약물 모이어티는 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴이다.
항체 또는 단편은 방사성 표지, 면역조절제, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 광활성 치료제 또는 진단제, 약물 또는 독소일 수 있는 세포독성제, 초음파 향상제, 비방사성 표지, 이것들의 조합 및 기술분야에 알려져 있는 다른 그러한 작용제와 같은 검출 가능한 표지를 포함할 수 있는 치료제에 콘쥬게이션되거나 융합될 수 있다.
항체는 화학발광 화합물에 항체를 결합시킴으로써 검출 가능하게 표지화될 수 있다. 화학발광 태그 부착된 항원 결합 폴리펩타이드의 존재는 그런 후에 화학 반응 과정 중에 발생하는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지화 화합물의 예는 루미놀, 아이소루미놀, 유채색의 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
항체는 또한 152Eu, 또는 란탄계의 다른 것과 같은 형광 방출 금속을 사용하여 검출 가능하게 표지될 수 있다. 이들 금속은 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 그러한 금속 킬레이트화 기를 사용하여 항체에 부착될 수 있다. 다양한 모이어티를 항체에 콘쥬게이션하기 위한 기법은 잘 알려져 있고, 예컨대, 다음의 문헌을 참고한다: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56(Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibody For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623- 53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), 및 Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. (52:119-58 (1982)).
항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 항체의 제조 방법
본 개시는 또한 본 개시의 항체를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자 또는 그것의 변이체 또는 유도체를 제공한다. 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 상의 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 상의 항원 결합 폴리펩타이드, 그것의 변이체 또는 유도체의 전체 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화할 수 있다. 추가적으로, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 폴리뉴클레오타이드 분자 상의 또는 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 상의 항원 결합 폴리펩타이드, 그것의 변이체 또는 유도체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 일부를 암호화할 수 있다.
항체 제조 방법은 기술분야에 잘 알려져 있고 본원에서 기술된다. 특정 구체예에서, 본 개시의 항원 결합 폴리펩타이드의 가변 및 불변 영역은 완전히 인간이다. 완전히 인간 항체는 기술분야에 기술되고 본원에 기술된 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 특정 항원에 대한 완전히 인간 항체는 항원 도전에 대한 반응으로 그러한 항체를 생성하도록 변형되어 있지만, 그것의 내인성 유전자좌는 비활성화된 유전자도입 동물에 항원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 그러한 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 예시의 기법은 미국 특허 제 6,150,584호; 제 6,458,592호; 제 6,420,140호에 기술되어 있고, 이들은 전체 내용이 참조로 포함된다.
치료 방법
본원에서 기술된 것과 같이, 본 개시의 항체, 그것의 변이체 또는 유도체는 특정 치료 및 진단 방법에 사용될 수 있다.
본 개시는 본원에 기수로딘 장애 또는 병태 중 하나 이상을 치료하기 위하여 동물, 포유류, 및 인간과 같은 환자에게 본 개시의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항체 기반 치료법에 추가로 관련된다. 본 개시의 치료적 화합물에는, 한정하는 것은 아니지만, 본 개시의 항체(본원에 기술된 그것의 변이체 및 유도체를 포함함) 및 본 개시의 항체를 암호화하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드(본원에 기술된 그것의 변이체 및 유도체를 포함함)가 포함된다.
본 개시의 항체는 또한 암을 치료 또는 억제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 환자의 암 세포는 CCR8을 발현 또는 과다발현한다. 위에서 제공된 것과 같이, CCR8은 종양 세포, 특히 위, 췌장, 식도, 난소, 및 폐 종양에서 과다발현될 수 있다. CCR8의 억제는 종양을 치료하는데 유용한 것으로 나타났다.
따라서, 일부 구체예에서, 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은, 한 구체예에서, 본 개시의 항체의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 수반한다. 일부 구체예에서, 환자의 적어도 하나의 암 세포(예컨대, 간질 세포)는 CCR8을 과다발현한다.
세포 요법, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법이 또한 본 개시에서 제공된다. 본 개시의 항-CCR8 항체와 접촉하게 되는(또는 대안적으로 본 개시의 항-CCR8 항체를 발현하도록 조작된) 적합한 세포가 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 키메라 항원 수용체(CAR)에 제시된다. 그러한 접촉 또는 조작시, 세포는 그 후에 치료를 필요로 하는 암 환자에게 도입될 수 있다. 암 환자는 본원에서 개시된 유형 중 임의의 유형의 암을 가질 수 있다. 세포(예컨대, T 세포)는, 예를 들어, 제한 없이, 종양 침윤 T 림프구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 이것들의 조합일 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 암 환자 자신으로부터 분리되었다. 일부 구체예에서, 세포는 기증자에 의해 또는 세포 은행으로부터 제공되었다. 세포가 암 환자로부터 분리될 때, 바람직하지 못한 면역 반응이 최소화될 수 있다.
암의 비제한적인 예로는 방광암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 대장암(colorectal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 식도암(esophageal cancer), 두경부암(head and neck cancer), 신장암(kidney cancer), 백혈병(leukemia), 간암(liver cancer), 폐암(lung cancer), 림프종(lymphoma), 흑색종(melanoma), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 및 갑상선암(thyroid cancer)을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 암은 위, 췌장, 식도, 난소, 및 폐 암 중 하나 이상이다.
본 개시의 항체 또는 그것의 변이체, 또는 유도체로 치료, 예방, 진단 및/또는 예후될 수 있는, 증가된 세포 생존율과 관련된 추가 질환 또는 병태로는, 한정하는 것은 아니지만, 악성 종양 및 관련된 장애, 예컨대 백혈병(급성 백혈병(예컨대, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병(골수모세포성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵세포성, 및 적백혈병) 포함) 및 만성 백혈병(예컨대, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병) 포함), 진성적혈구증가증(polycythemia vera), 림프종(예컨대, 호지킨병(Hodgkin's disease) 및 비호지킨병, 다발성 골수종(multiple myeloma), 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환(heavy chain disease), 및 고체 종양, 이를테면 한정하는 것은 아니지만, 육종(sarcoma) 및 암종(carcinoma), 예컨대 섬유육종(fibrosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 골형성성 육종(osteogenic sarcoma), 척색종(chordoma), 혈관육종(angiosarcoma), 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 림프관내피육종(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyo sarcoma), 결장 암종(colon carcinoma), 췌장암, 유방암, 난소암(ovarian cancer), 전립선암, 평편 세포 암종(squamous cell carcinoma), 기저 세포 암종(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 땀샘 암종(sweat gland carcinoma), 피지선 암종(sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 유두상 선암종(papillary adenocarcinoma), 낭샘암종(cystadenocarcinoma), 수질 암종(medullary carcinoma), 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 신장 세포 암종(renal cell carcinoma), 간세포암(hepatoma), 담관 암종(bile duct carcinoma), 융모막암종(choriocarcinoma), 정상피종(seminoma), 배아 암종(embryonal carcinoma), 윌름스 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암(cervical cancer), 고환 종양(testicular tumor), 폐 암종(lung carcinoma), 소세포 폐 암종, 방광 암종(bladder carcinoma), 상피 암종(epithelial carcinoma), 신경교종(glioma), 성상세포종(astrocytoma), 수모세포세종(medulloblastoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 뇌실막종(ependymoma), 송과체종(pinealoma), 혈관모세포종(hemangioblastoma), 청신경종(acoustic neuroma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 뇌수막종(menangioma), 흑색종, 신경모세포종(neuroblastoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma)의 진행, 및/또는 전이를 들 수 있다.
임의의 특정 환자에 대한 구체적인 투여량 및 치료 요법은 사용된 특정 항체, 그것의 변이체 또는 유도체, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 및 식단, 및 투여 시간, 배설 속도, 약물 조합, 및 치료되는 특정 질환의 중증도를 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 것이다. 의료 간병인에 의한 그러한 요인의 판단은 기술분야의 통상적인 기술 내에 있다. 양은 또한 치료될 개별 환자, 투여 경로, 제제의 유형, 사용된 화합물의 특징, 질환의 중증도, 및 원하는 효과에 따라 달라질 것이다. 사용된 양은 기술분야에 잘 알려져 있는 약물학적 및 약동학적 원리에 의해 결정될 수 있다.
항체, 변이체 또는 유도체의 투여 방법에는, 한정하는 것은 아니지만, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 및 구강 경로가 포함된다. 항원 결합 폴리펩타이드 또는 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 내벽(예컨대, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적으로 활성인 작용제와 함께 투여될 수 있다. 그러므로, 본 개시의 항원 결합 폴리펩타이드를 함유하는 제약학적 조성무른 경구로, 직장으로, 비경구적으로, 낭내로(intracistemally), 질내로, 복강내로, 국소적으로(분말, 연고, 드롭 또는 경피 패치에 의한 것과 같이), 볼로, 또는 구강 또는 비강 스프레이로서 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식을 지칭한다.
투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 더불어, 본 개시의 항체를 심실내 및 척수강내 주사를 포함한 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있고; 심실내 주사는 예를 들어, 저장소, 예컨대 Ommaya 저장소에 부착된 심실내 카테터에 의해 용이해질 수 있다. 예컨대, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 포함한 제제의 사용에 의해 폐 투여가 또한 사용될 수 있다.
본 개시의 항원 결합 폴리펩타이드 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이것은 예를 들어, 한정하는 것이 아니라, 수술 중 국소적 주입에 의해, 국소적 적용에 의해, 예컨대 수술 후 상처 드레싱과 함께, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌제에 의해, 또는 임플란트에 의해 이루어질 수 있고, 상기 임플란트는 막, 예컨대 시알라스틱 막, 또는 섬유를 포함한 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질이다. 바람직하게, 본 개시의 항체를 포함한 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수하지 않는 물질을 사용하기 위해 주의가 기울여져야 한다.
염증성, 면역 또는 악성 질환, 장애 또는 병태의 치료, 억제 및 예방에 효과적일 본 개시의 항체의 양은 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 더불어, 시험관내 검정이 최적의 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 사용될 수 있다. 제제에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환, 장애 또는 병태의 심각성에 따라 달라질 것이며, 전문가 및 각 환자의 상황의 판단에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 용량은 시험관내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 용량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
일반적인 제의로서, 환자에게 투여된 본 개시의 항원 결합 폴리펩타이드의 투여량은 전형적으로 환자의 체중 kg당 0.1 mg 내지 100 mg, 환자의 체중 kg당 0.1 mg/ 내지 20 mg, 또는 환자의 체중 kg당 1 mg 내지 10 mg이다. 일반적으로, 인간 항체는 외래 폴리펩타이드에 대한 면역 반응으로 인해 다른 종으로부터의 항체보다 인체 내에서 더 긴 반감기를 가진다. 그러므로, 인간 항체의 더 낮은 투여량 및 더 적은 빈도의 투여가 종종 가능하다. 추가로, 본 개시의 항체의 투여량 및 투여 빈도는, 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의해 항체의 흡수 및 조직 침투(예컨대, 뇌로의 침투)를 향상시킴으로써 감소될 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 개시의 조성물은 사이토카인과 조합되어 투여된다. 개시의 조성물과 함께 투여될 수 있는 사이토카인에는, 한정하는 것은 아니지만, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, 항-CD40, CD40L, 및 TNF-α가 포함된다.
추가의 구체예에서, 개시의 조성물은 다른 치료 또는 예방 요법, 예컨대, 예를 들어, 방사선 요법과 조합되어 투여된다.
진단 방법
CCR8의 과다발현은 특정 종양 샘플에서 관찰되며, CCR8 과다 발현 세포를 갖는 환자는 본 개시의 항-CCR8 항체로의 치료에 반응할 가능성이 있다. 따라서, 본 개시의 항체는 또한 진단 및 예후 목적으로 사용될 수 있다.
바람직하게 세포를 포함하는 샘플이 암 환자이거나 진단을 요하는 환자일 수 있는 환자로부터 얻어질 수 있다. 세포는 종양 조직 또는 종양 블록, 혈액 샘플, 소변 샘플 또는 환자로부터의 임의의 샘플의 세포일 수 있다. 샘플의 선택적 사전 처리시, 샘플은 본 개시의 항체와 함께 항체가 샘플에 잠재적으로 존재하는 CCR8 단백질과 반응하는 것을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 샘플 중의 CCR8 단백질의 존재를 검출하기 위하여, 항-CCR8 항체의 장점을 취하여, ELISA와 같은 방법이 사용될 수 있다.
샘플 중의 CCR8 단백질의 존재(선택적으로 양 또는 농도와 함께)는 환자가 항체로의 치료에 적합하다는 표시로서, 또는 환자가 암 치료에 응답하였다(또는 하지 않았다)는 표시로서 암 진단에 사용될 수 있다. 예후 방법의 경우, 검출은 치료의 진전을 나타내기 위해 암 치료의 개시 시에, 특정 단계에서, 1회, 2회 또는 그 이상 실시될 수 있다.
조성물
본 개시는 또한 제약학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 유효량의 항체, 및 허용 가능한 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 제2 항암제(예컨대, 면역 체크포인트 억제제)를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "제약학적으로 허용 가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간에서의 사용에 대해 미연방 또는 미국 주 정부의 규제 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 약전에서 열거된 것을 의미한다. 추가로, "제약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 유형의 무독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제제화 보조제일 수 있다.
용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 제약학적 담체는 멸균된 액체, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것을 포함한 물 및 오일, 예컨대 땅콩 기름, 대두유, 미네랄 오일, 참기름 등일 수 있다. 물은 제약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로사, 특히 주사 가능한 용액으로 사용될 수 있다. 적합한 제약학적 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은 필요하다면 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 pH 완충제를 함유할 수 있다. 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌다이아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조정제가 또한 고려된다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속성 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트라이글리세라이드와 같은 전통적인 결합제 및 담체와 함께 좌약으로서 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 제약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산 마그네슘, 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 제약학적 담체의 예는 본원에 참조로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기술되어 있다. 그러한 조성물은 환자에게 적절한 투려를 위한 형태를 제공하기 위하여 적합한 양의 담체와 함께 치료적 유효량의 항원 결합 폴리펩타이드를, 바람직하게 정제된 형태로 함유할 것이다. 제제는 투여 방식과 잘 맞아야 한다. 비경구 조제물은 앰풀, 일회용 주사기 또는 유리나 플라스틱으로 만든 다회 용량 바이알에 담겨질 수 있습니다.
구체예에서, 조성물은 인간에게 정맥내 투여를 위해 적응된 제약학적 조성물로서 일상적인 과정에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요하다면, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위의 통증을 완화하기 위해 리그노카인과 같은 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 별도로 또는 단위 투여 형태로 함께 혼합되어, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰풀 또는 향낭과 같은 밀폐 밀봉 용기에 건조 동결건조 분말 또는 수분 없는 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 멸균된 제약 등급의 물 또는 식염수를 함유한 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀이 제공되어 성분이 투여 전에 혼합될 수 있다.
본 개시의 화합물은 중성 또는 염 형태로 제제화될 수 있다. 제약학적으로 허용 가능한 염에는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온으로 형성된 것들, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철 수산화물, 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온으로 형성된 것이 포함된다.
실시예
실시예 1: 인간 CCR8에 대한 쥐과 단클론성 항체의 생성
인간 CCR8 단백질을 사용하여 마우스의 상이한 스트레인을 면역화하였고, 그에 따라 하이브리도마를 생성하였다. CCR8 양성 결합제를 선택하여 하위클로닝하였다. 후속해서, 시험관내 결합 및 기능적 스크리닝을 수행하고 최고 결합 친화도 및 최강 기능적 효능을 가진 리드 항체를 확인하였다.
리드 쥐과 항체의 VH/VL 서열을 아래의 표에 제공한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 2. U2OS 세포 상에서 CCR8에 대한 결합
이 실시예는 U2OS 세포 상에서 발현된 인간 CCR8 단백질에 대한 결합에서 항체의 활성을 테스트하였다.
위에서 확인된 쥐과 항체 중 몇 개의 키메라 항체(인간 IgG1 불변 영역에 융합됨)가 cDNA로부터 발현되었다. 항체를 인간 CCR8을 발현하는 U2OS 세포와 함께 인큐베이션하였다. 테스트된 항체 중에서, 88D2C6 및 137D1H10이 용량 의존성 방식으로, 나머지보다 상당히 더 높은 친화도를 나타냈다(도 1).
실시예 3. ADCC 측정
ADCC 매개에서, 370D2C10과 함께 88D2C6 및 137D1H10(모두 인간 IgG1 불변 영역에 융합되고, Fc에 ADCC 활성화 돌연변이를 포함함)의 효능을 CCR8을 과다발현하는 CHO K1 및 U2OS 세포로 측정하였다. 3개 항체는 모두 높은 ADCC 활성을 나타냈다(도 2).
3개 항체는 모두 강력한 ADCC 활성을 나타냈다. 그러나, 그것들 중에서, 88D2C6이 상당히 더 높은 효능을 가졌다(EC50: CHO 세포로 0.01743 nM 및 U2OS 세포에 대해 0.1108).
실시예 4. 마우스 mAb의 인간화
88D2C6 및 352H11C11의 쥐과 항체 가변 영역 유전자를 사용하여 인간화된 mAb를 생성하였다. mAb의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 인간 Ig 유전자 서열의 이용 가능한 데이터베이스에 대해 비교하여 전체적으로 최상으로 매칭되는 인간 생식선 Ig 유전자 서열을 찾았다. 그런 후 쥐과 항체의 CDR을 매칭된 인간 서열에 그라프팅시켰다. cDNA를 합성하고 그것을 사용하여 인간화된 항체를 제조하였다. 그런 후 쥐과 항체로부터의 특정 복귀 돌연변이를 인간화된 항체에 다시 도입하였다. 특정 아미노산을 돌연변이시켜서 번역 후 변형 기회를 감소시켰다.
인간화된 항체의 아미노산 서열을 아래에 제공한다.
인간화된 서열
A. 88D2C6
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
B. 137D1H10
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 5. 인간화된 항체의 테스트
이 실시예는 CCR8에 대한 결합 친화도 및 ADCC를 유도하는 능력에 대해 일부 인간화된 항체를 테스트하였다.
실험 과정은 실시예 2-3과 유사하다. 도 3은 88D2C6의 인간화된 항체의 친화도를 도시한다. 외관상, 모두 높은 친화도를 가졌다(또한 표 4 참고).
Figure pct00016
Figure pct00017
도 4는 137D1H10의 인간화된 항체의 친화도를 도시한다(표 5의 데이터).
Figure pct00018
Figure pct00019
ADCC(도 5)의 견지에서, 놀랍게도, 모든 인간화된 항체는 키메라 대응물보다 훨씬 더 높은(약 5 내지 10배) ADCC 유도 활성을 나타냈다.
실시예 6. 세포 기반 항체 결합
이 실시예는 세포 기반 결합과 관련하여 137-H3L2(LM-108)를 참조 항체와 비교하였다.
LM-108 및 참조 Ab(WO2020138489에 따라 합성됨)의 인간 CCR8 과다발현 세포(HEK293/H_CCR8)에 대한 세포 기반 결합을 유세포분석을 사용하여 평가하였다. 인간 CCR8 과다발현 HEK293(HEK293/H_CCR8) 및 부모 HEK293 세포를 적정된 LM-108, 참조 Ab 및 그것의 아이소타입 대조군(200 nM로부터, 4배 희석, 12 지점)과 함께 4℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 형광 콘쥬게이션된 이차 항체(Alexa Fluor® 647 염소 항-인간 IgG, Jackson, 109-605-098)로 4℃에서 60분 동안 염색하였다. 세포를 2회 세척한 후 유세포분석에 의해 분석하였다.
LM-108 및 참조 Ab는 모두 용량 의존성 방식으로, 각각 1.03 nM 및 0.99 nM의 EC50으로 HEK293/H_CCR8 세포에 효과적으로 결합하였다(도 6a 및 표 6A). LM-108에 대해서는 비특이적 결합이 관찰되지 않았지만 참조 Ab는 부모 HEK293 세포에 대해 약간 비특이적 결합을 보였다(도 6b 및 표 6B).
Figure pct00020
Figure pct00021
고수준으로 CCR8을 발현하는 세포 상에서 LM-108의 세포 기반 결합을 유세포분석을 사용하여 평가하였다. 사용된 세포는 U2OS(U2OS/H_CCR8)였다. 도 7 및 표 7에서 나타낸 것과 같이, LM-108은 용량 의존성 방식으로 0.25 nM의 EC50으로 U2OS/H_CCR8 세포에 효과적으로 결합할 수 있었다.
Figure pct00022
저수준으로 CCR8을 발현하는 세포 상에서 LM-108의 세포 기반 결합을 또한 유세포분석을 사용하여 평가하였다. 사용된 세포는 Jurkat 조작 세포(Jurkat/H_CCR8)였다. 도 8 및 표 8에서 나타낸 것과 같이, LM-108은 용량 의존성 방식으로 0.21 nM의 EC50으로 Jurkat/H_CCR8 세포에 효과적으로 결합할 수 있었다.
Figure pct00023
실시예 7. ADCC 리포터 유전자 검정
이 실시예는 상이한 CCR8 발현 세포를 표적화하는 ADCC 리포터 유전자 검정의 결과를 보여준다.
U2OS/H_CCR8을 표적화하는 ADCC 리포터 유전자 검정
LM-108의 ADCC 활성을 이펙터 세포로서 CD16a(158v) 발현 Jurkat/NFAT-luc 리포터 세포를 사용하여 리포터 유전자 검정으로 평가하였다. 인간 CCR8 과다발현 U2OS 세포를 표적 세포로서 사용하였다. U2OS/H_CCR8 세포를 96 웰 플레이트에 웰당 1E4 세포의 밀도로 밤새 플랜팅한 후, 각 웰당 1.5x105 이펙터 세포 및 적정된 LM-108 및 10 μg/ml로부터의 최종 농도, 5배 희석, 10개 지점의 아이소타입 대조군와 함께 로 공동 배양하였다. 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, 발광 검출을 위해 One-Glo(Promega)를 첨가하였다.
결과를 도 9에 도시한다. LM-108은 강력한 ADCC 효과를 나타냈고(EC50=0.00605 nM) Jurkat/CD16a/NFAT-luc 리포터 세포는 U2OS/H_CCR8 세포를 표적화하였다.
Jurkat/H_CCR8을 표적화하는 ADCC 리포터 유전자 검정
LM-108의 ADCC 활성을 CD16a(158v) 과다발현 Jurkat/NFAT-luc 리포터 세포를 이펙터 세포로서 사용하여 리포터 유전자 검정에 의해 평가하였다. 인간 CCR8 저발현 Jurkat 세포를 종양 관련 Treg 상에서의 발현 수준을 모방하기 위한 표적 세포로서 생성하였다.
3:1의 비율의 이펙터 세포(Jurkat 리포터 세포) 및 표적 세포(Jurkat/H_CCR8)를 적정된 LM-108 및 아이소타입 대조군(200 nM로부터의 최종 농도, 5배 희석, 11개 지점)과 혼합하였다. 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, 발광 검출을 위해 One-Glo(Promega)를 첨가하였다. 도 10에서 나타낸 것과 같이, LM-108은 용량 의존성 ADCC 효과를 가졌고 EC50=0.14 nM이었다.
인간 CCR8 과자발현 HEK293(HEK293/H_CCR8) 및 일차 인간 PBMC를 가진 HEK293 세포를 향한 인간 CCR8에 대한 LM-108의 ADCC 효과
50:1 비율의 이펙터 세포(hPBMC) 및 표적 세포(HEK293/H_CCR8 또는 HEK293)를 적정된 LM-108 및 아이소타입 대조군(10 nM로부터의 최종 농도, 7배 희석, 12개 지점)과 혼합하였다. 37℃ 하에서 6시간 동안 인큐베이션한 후, 각 웰로부터의 50 μl 상층액을 세포독성 검출 키트(Roche, 04744934001)에 의해 분석하였다.
도 11A에서 나타낸 것과 같이, LM-108은 용량 의존성 방식으로 0.002 nM의 EC50으로 CCR8 발현 HEK293 세포를 향해 특이적으로 강력한 ADCC 효과를 나타냈다(도 6a). 부모 HEK293 세포 상에서 비특이적 사멸은 관찰되지 않았다(도 11B).
실시예 8.항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)의 테스트
이 실시예에서, 인간 CCR8 과다발현 CHO-K1 세포에 대한 LM-108의 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP) 효과를 단핵세포 유래 대식세포(MDM)를 사용하여 FACS에 의해 평가하였다.
이펙터 세포, MDM을 100 ng/mL의 인간 M-CSF의 존재로 7일 동안 인간 PBMC로부터 분리된 단핵세포로부터 유도하였다. 표적 세포는 CHO-K1(음성 대조군) 및 CFSE로 표지된 인간 CCR8을 과다발현하는 CHO-K1 세포였다. 이펙터 세포, CFSE 표지된 표적 세포, 및 적정된 테스트 항체 LM-108 또는 그것의 아이소타입 대조군을 37℃에서, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척한 후(1 x DPBS + 2% FBS), APC 콘쥬게이션된 인간 CD14 항체로 염색하여 대식세포를 확인하였다. FACS 완충액으로 2회 세척한 후, 샘플을 유세포분석에 의해 분석하였다. 식세포작용 지수를 총 CD14+ 양성 세포 중의 CD14-APC+/CFSE+ 이중 양성 세포의 백분율로서 결정하였다.
도 12A-B에서 나타낸 것과 같이, LM-108은 인간 CCR8 과다발현 CHO-K1 세포에 대해 특이적이고 용량 의존적인 식세포작용을 가졌지만, 대조군 세포에 대해서는 그렇지 않았다.
단핵세포 유래 대식세포(MDM)로의 LM-108의 ADCP를 또한 Operetta에 의해 측정하였다. 이펙터 세포, MDM을 100 ng/mL의 인간 M-CSF의 존재로 6일 동안 인간 PBMC로부터 분리된 단핵세포로부터 유도하였다. 그런 후 이펙터 세포를 투명한 바닥을 가진 검은색 96 웰 플레이트에 2x104 카운트/웰로 시딩하고 부착을 위해 다시 2일 동안 배양하였다. 표적 세포는 Jurkat(음성 대조군) 및 인간 CCR8 과다발현 Jurkat 세포(Jurkat/H_CCR8)였다. CFSE 표지된 표적 세포 및 테스트 항체 LM-108 또는 그것의 아이소타입 대조군을 대식세포가 있는 플레이트에 첨가하고, 37℃에서, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이펙터 세포: 표적 세포 비율은 1:2이다. 세포를 세척하고 APC 콘쥬게이션된 인간 CD14 항체로 염색하여 대식세포를 확인하였다. 2회 세척 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드(PFA) 희석을 사용하여 고정하고 Operetta에 의해 사진을 촬영하기 전에 암실에서 4℃ 냉동고에서 보관하였다.
도 13에서 나타낸 것과 같이, LM-108은 인간 CCR8 과다발현 Jurkat 세포에 대해 ADCP를 유도하였지만, 그것의 아이소타입 대조군은 그렇지 못하였다. LM-108 또는 아이소타입 대조군 중 어느 것도 Jurkat 세포에 대해 명백한 식세포작용을 유도하지 못하였다.
실시예 9. 생체내 효능
이 실시예에서, LM-108 또는 그것의 마우스 대리물의 생체내 효능 연구를 수행하였다.
제1 실험을 LM-108에 대한 대리물 항체인 LM-108a를 사용하여 CT26 동계 모델에서 수행하였다. 이 연구에서, 각각의 마우스를 종양 발생을 위해 0.1 ml의 PBS 중의 CT26 종양 세포(5x105)로 오른쪽 겨드랑이(측면)에 피하 접종하였다. 동물을 세포 접종 후 3일 째에 무작위로 4개 그룹(n=7마리)으로 나눈 후, 치료를 시작하였다. 비히클로서 PBS 그룹, LM-108m 및 mPD-1 항체를 단일 작용제로서 또는 조합으로서 10 mg/kg의 용량으로 0일, 3일, 7일, 10일, 14일 및 17일에 복강내(i.p.) 투여하였다. 대조군 그룹의 평균 종양 부피가 2000 mm3 이상에 도달하였기 때문에 실험을 18일에 종결하였다.
종양 크기를 캘리퍼스를 사용하여 2차원으로 매주 3회 측정하였고 부피를 식: V = 0.5 a x b 2을 사용하여 mm3으로 표시하였으며, 식에서 a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이었다. 그런 후 종양 크기를 T/C(%) 값의 계산에 사용하였다. T/C(%)를 식: T/C % =(Ti-T0)/(Vi-V0) x 100을 사용하여 계산하였고, 여기서 Ti는 주어진 날에 치료 그룹의 평균 종양 부피였고, T0는 치료의 제1일에 치료 그룹의 평균 종양 부피였으며, Vi는 Ti와 동일한 날에 비히클 대조군 그룹의 평균 종양 부피였고, V0는 치료의 제1일에 비히클 그룹의 평균 종양 부피였다. TGI를 식: TGI(%) = [100-T/C]를 사용하여 각 그룹에 대해 계산하였다.
도 14는 LM-108m 및 항-mPD-1 Ab의 투여 후 CT26 종양 보유 Balb/c 마우스의 종양 성장 곡선을 도시한다. 단일 작용제로서 또는 mPD-1 항체와 조합된 LM-108m은 강력한 항 종양 활성을 보였다(표 9). 데이터 포인트는 그룹(n=7마리) 평균을 나타내고, 오차 막대는 평균(SEM)의 표준 오차를 나타낸다. p 값을 PBS를 사용하는 비히클 대조군과 비교하여, t-테스트에 의해 종양 크기를 토대로 계산하였다.
Figure pct00024
제2 실험은 BIOCYTOGEN사로부터 구입한 인간 CCR8 ki 마우스를 사용하였다. 각각의 hCCR8 ki 마우스를 종양 발생을 위해 0.1 ml의 PBS 중의 MC38 종양 세포(1x105)로 오른쪽 겨드랑이(측면)에 피하 접종하였다. 동물을 세포 접종 후 3일 째에 무작위로 나눈 후, 효능 연구를 위한 치료를 시작하였다. 10 mg/kg의 용량의 LM-108을 복강내(i.p.)를 통해 0일, 3일, 7일, 10일에 투여하였다. 대조군 그룹의 평균 종양 부피가 2000 mm3 이상에 도달하였을 때 실험을 종결하였다.
종양 크기를 캘리퍼스를 사용하여 2차원으로 매주 3회 측정하였고 부피를 식: V = 0.5 a x b 2을 사용하여 mm3으로 표시하였으며, 식에서 a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경이었다. 그런 후 종양 크기를 T/C(%) 값의 계산에 사용하였다. T/C(%)를 식: T/C % =(Ti-T0)/(Vi-V0) x 100을 사용하여 계산하였고, 여기서 Ti는 주어진 날에 치료 그룹의 평균 종양 부피였고, T0는 치료의 제1일에 치료 그룹의 평균 종양 부피였으며, Vi는 Ti와 동일한 날에 비히클 대조군 그룹의 평균 종양 부피였고, V0는 치료의 제1일에 비히클 그룹의 평균 종양 부피였다. TGI를 식: TGI(%) = [100-T/C]를 사용하여 각 그룹에 대해 계산하였다.
데이터 포인트는 그룹(n=8마리) 평균을 나타내고, 오차 막대는 평균(SEM)의 표준 오차를 나타낸다. p 값을 비히클 대조군과 비교하여, t-테스트에 의해 종양 크기를 토대로 계산하였다.
도 15는 LM-108의 투여 후 MC38 종양 보유 마우스의 종양 성장 곡선을 도시하며, 데이터를 표 10에 요약한다. LM-108은 강력한 종양 억제 효과를 보였다.
Figure pct00025
실시예 10. 세포독성 평가
이 실시예는 인간 CCR8 발현 HEK293 세포에 미치는 항체-약물 콘쥬게이트, LM-108-vc-MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E)의 세포독성을 평가하였다.
LM-108이 ADC 발생에 사용될 수 있는지를 평가하기 위하여, MMAE 콘쥬게이션된 LM-108의 세포독성을 인간 CCR8 과다발현 HEK293 세포의 LM-108-vc-MMAE의 적정된 ADC와의 공동 배양에 의해 평가하였다.
HEK293/H_CCR8 세포를 96 웰 플레이트에서 웰당 1.5 x 104 세포의 밀도로 밤새 플랜팅한 후, 100 nm로부터의 최종 농도, 3배 희석, 9개 지점의 적정된 LM-108-vc-MMAE와 함께 공동 배양하였다. 37℃에서 96시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 생존력 평가를 위해 세포-Titer-Glo(Promega)를 첨가하였다.
도 16에서 나타낸 것과 같이, MMAE 콘쥬게이션된 LM-108은 인간 CCR8 발현 HEK293 세포에 대해 강력한 세포독성(IC50=0.5285 nM)을 가졌다.
* * *
본 개시는 개시의 개별적인 측면의 단일 예시로서 의도된 기술된 특정 구체예에 의해 범주가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법은 본 개시의 범주 내에 있다. 기술분야에 숙련된 사람들에게는 다양한 변형 및 변동이 개시의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않고 본 개시의 방법 및 조성물에서 이루어질 수 있는 것이 분명할 것이다. 그러므로, 본 개시는 첨부된 청구범위 및 그것의 등가물의 범주 내에 속하는 한 본 개시의 변형 및 변동을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 언급된 모든 출판물 및 특허 출원은 각각의 개별적인 출판물 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시되는 것과 같은 정도로 참조로 본원에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> LaNova Medicines Limited Company <120> Anti-CCR8 Monoclonal Antibodies and Uses Thereof <130> FSP1P213331J <150> PCT/CN2020/121494 <151> 2020-10-16 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Arg Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg Asp Arg Ser Arg Gly Glu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr 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Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg Asp Arg Ser Arg Gly Glu Asp Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 43 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims (17)

  1. 인간 케모카인(C-C 모티프) 수용체 8(CCR8) 단백질에 대해 결합 특이성을 가지는 항체 또는 그것의 단편으로서, 항체 또는 그것의 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서:
    (a) CDRH1은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRH2는 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하며,
    CDRH3은 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열을 포함하며,
    CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는
    (b) CDRH1은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRH2는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하며,
    CDRH3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRL1은 서열 번호: 25 또는 28의 아미노산 서열을 포함하며,
    CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고,
    CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그것의 단편.
  2. 제1항에 있어서, CDRH1은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고 , CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  3. 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 38-40으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  4. 제2항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:40의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  5. 제1항에 있어서, CDRH1은 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하고, CDRH2는 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하며, CDRH3은 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL1은 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하며, CDRL2는 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하고, CDRL3은 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  6. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호: 29-31로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 서열 번호: 32-34 및 41-43으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  7. 제5항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호:29의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열 번호:33의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화된 것임을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  9. 항체 또는 그것의 단편으로서, 인간 케모카인(C-C 모티프) 수용체 8(CCR8) 단백질에 대한 결합 특이성을 가지며 제1항의 항체 또는 그것의 단편과 동일한 CCR8 단백질 상의 에피토프에 결합하거나, 또는 CCR8 단백질에 대한 결합에서 제1항의 항체 또는 그것의 단편과 경합하는, 항체 또는 그것의 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)을 매개할 수 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  11. 제10항에 있어서, 아퓨코실화되지 않는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 표적 단백질에 대한 결합 특이성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그것의 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 종양 항원에 대한 특이성을 가지는 제2 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 암을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 항체 또는 그것의 단편의 용도.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 암은 방광암(bladder cancer), 간암(liver cancer), 결장암(colon cancer), 직장암(rectal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 췌장암(pancreatic cancer), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비-소세포 폐암, 유방암(breast cancer), 요도암(urethral cancer), 두경부암(head and neck cancer), 위장암(gastrointestinal cancer), 위암(stomach cancer), 식도암(oesophageal cancer), 난소암(ovarian cancer), 신장암(renal cancer), 흑색종(melanoma), 전립선암(prostate cancer) 및 갑상선암(thyroid cancer)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법 또는 용도.
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