JP2023018678A - 抗ｃｃｒ８抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＣＣＲ８に特異的に結合し、ＣＣＲ８発現ＴｒｅｇのＡＤＣＣを媒介する、モノクローナルヒト化抗体のためのアミノ酸配列を提供する。【解決手段】（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む、抗ＣＣＲ８抗体であって、ＶＨ ＣＤＲ＃１が、ＧＦＩＦＳＮＡＶＭＹ（配列番号１）であり、ＶＨ ＣＤＲ＃２が、ＲＩＫＴＫＦＮＮＹＡＴＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号２）であり、ＶＨ ＣＤＲ＃３が、ＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号３）であり、ＶＬ ＣＤＲ＃１が、ＲＡＳＴＳＶＩＴＬＬＨ（配列番号４）であり、ＶＬ ＣＤＲ＃２が、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）であり、ＶＬ ＣＤＲ＃３が、ＱＱＳＷＮＤＰＹＴ（配列番号６）である、抗ＣＣＲ８抗体を提供する。【選択図】図４Ｂ

Description

本出願は、ＳＬ－ＡＮＴＩ－ＣＣＲ８ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳと名付けられた、２０２２年７月２５日に作成され、１７キロバイトのサイズを有するｘｍｌファイルとして電子的に提出された配列表を含む。配列表は、参照により本明細書に組み込む。
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０２１年７月２７日に出願された米国特許仮出願第６３／２２６，１１８号の利益を主張し、この開示は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本出願は、とりわけ、新規の抗ＣＣＲ８抗体並びにこれを作製及び使用する方法に関する。
腫瘍において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、抗腫瘍免疫応答を防ぐことで知られる鍵となる抑制性集団である。腫瘍内Ｔｒｅｇの存在の増加は、いくつかのがんにおいて患者の転帰が不良となることに関連している（Ｓｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５；Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７；Ｂｒｕｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０２０）。ケモカイン受容体８（ＣＣＲ８）は、いくつかのヒトがんにおいて腫瘍内Ｔｒｅｇによってユニークに発現する細胞表面タンパク質である（Ｐｌｉｔａｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１６；ＤｅＳｉｍｏｎｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１６）。このためＣＣＲ８は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して腫瘍内Ｔｒｅｇの選択的枯渇を媒介し、抗腫瘍免疫を増強する魅力的な標的となる。
Ｔｒｅｇ枯渇は長い間、研究されているが、このような治療のほとんどが、腫瘍浸潤エフェクターＴ細胞集団及び／又は腫瘍環境外部のＴｒｅｇ上で標的発現するために有効性が限られている。腫瘍微小環境における他の鍵となるエフェクターＴ細胞集団又は末梢Ｔｒｅｇを枯渇させずに腫瘍内免疫抑制性Ｔｒｅｇの死を引き起こす、モノクローナル抗体治療薬に対する当技術分野における必要性が残存している。
Ｓｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５ Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｂｒｕｎｉら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２０２０ Ｐｌｉｔａｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１６ ＤｅＳｉｍｏｎｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２０１６
（発明の要旨）
抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して腫瘍内Ｔｒｅｇの選択的枯渇を媒介することがわかっている。ＣＣＲ８が、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇにより優先的に発現し、末梢血Ｔｒｅｇにおいて又は有益なエフェクターＴ細胞集団により高度には発現しないため、抗ＣＣＲ８抗体は、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させ、抗腫瘍免疫を増強する。抗ＣＣＲ８抗体単独療法は、独立して有効であるが、腫瘍におけるＴｒｅｇの特異的除去によって、抗腫瘍免疫応答の同時刺激を目標とした適切な併用療法の手段に適した環境がもたらされる。例えば、抗ＰＤ－１などのチェックポイント阻害剤との組合せが、Ｔｒｅｇ枯渇時に潜在的抗腫瘍免疫を十分に駆動するのに必要とされ得る。
したがって、ＣＣＲ８に特異的に結合し、ＣＣＲ８発現ＴｒｅｇのＡＤＣＣを媒介する、モノクローナルヒト化抗体のためのアミノ酸配列を提供する。抗体は構造的に、ＣＣＲ８に特異的に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、可変重鎖及び可変軽鎖からなる。また、抗体は、結晶化可能断片領域（Ｆｃ）を含むヒト重鎖定常領域、及び軽鎖定常領域を含む。抗体のアミノ酸配列によりコードされる、このような構造的エレメントは、患者における固形腫瘍の治療において有効な医薬組成物を、単独療法として又は他の治療薬と組み合わせて含む。
ヒト又はカニクイザルＣＣＲ８を発現するジャーカット細胞に対するキメララット／ｈＩｇＧ１ヒトＣＣＲ８特異的キメラｍＡｂの結合を示す図である。 エピトープ結合実験の結果を示す図である。 ＡＢＢＶ－５１４の重鎖及び軽鎖配列を示す図である。 内因性ＣＣＲ８を発現するＴＡＬＬ－１細胞又はＴＡＬＬ－１ＣＣＲ８ノックアウト細胞に対して及びジャーカット親細胞又はヒト若しくはｃｙｎｏＣＣＲ８を高発現する細胞に対する脱フコシル化ＡＢＢＶ－５１４の結合用量応答曲線を示す図である。 ＴＡＬＬ－１細胞に対するフコシル化（ＷＴ ＰＲ－１９２５５１４）対脱フコシル化ＡＢＢＶ－５１４の結合を示す図である。 フコシル化（ＷＴ ＰＲ－１９２５５１４）対脱フコシル化ＡＢＢＶ－５１４のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイデータを示す図である。 フコシル化（ＷＴ ＰＲ－１９２５５１４）対脱フコシル化ＡＢＢＶ－５１４のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイデータを示す図である。 フコシル化（ＷＴ ＰＲ－１９２５５１４）対脱フコシル化ＡＢＢＶ－５１４のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイデータを示す図である。 フコシル化（ＷＴ ＰＲ－１９２５５１４）対脱フコシル化ＡＢＢＶ－５１４のＡＤＣＣレポーターバイオアッセイデータを示す図である。 精製ＮＫエフェクター細胞及びＴＡＬＬ－１標的細胞によるＡＤＣＣアッセイの結果を示す図である。 ＣＣＲ８へのＣＣＬ１結合に対するＡＢＢＶ－５１４の作用を示すＣＣＲ８ベータ－アレスチンレポーターアッセイの結果を示す図である。
Ｔｒｅｇは、腫瘍内免疫抑制作用を有するＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットである。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化、増殖及びサイトカイン産生を抑制して、有害な自己免疫応答を防ぐ。しかし、Ｔｒｅｇは、腫瘍免疫をも抑制し、高レベルの腫瘍内Ｔｒｅｇは、いくつかのがんにおいて負の転帰と関連している。
ＣＣＲ８は、２型ヘルパーＴ（Ｔｈ２）リンパ球免疫応答及び皮膚へのＴ細胞輸送の関連において走化性及び細胞／細胞相互作用を媒介する７回膜貫通タンパク質からなるＣ－Ｃモチーフケモカイン受容体である。ＣＣＲ８欠損マウスは、特定のＴｈ２関連前臨床モデルにおいて強固なＴｈ２応答を開始することができないことを除いて、生存可能、繁殖性であり、ほとんどの場合は正常である（Ｃｈｅｎｓｕｅら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ５、２００１）。ＣＣＲ８と主に結合するリガンドはＣＣＬ１であるが、ＣＣＬ１８（ヒト）及びＣＣＬ８（マウス）も、この受容体のリガンドである。
腫瘍に浸潤するＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇは、高度に活性化され、免疫抑制性の表現型を示す。ＣＣＲ８ノックアウトマウスにおける腫瘍研究では、ＣＣＲ８発現の減少は、腫瘍微小環境へのＴｒｅｇの動員、活性化状態又は抑制能に影響しないことが示されている（ＶａｎＤａｍｍｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．９（２）、２０２１）。むしろ、ＣＣＲ８発現は、高度に抑制性のＴｒｅｇのマーカーである。したがって、ＣＣＲ８発現Ｔｒｅｇの枯渇は、抗腫瘍の利益をもたらす。
ＣＣＲ８特異的代替抗体は、ＡＤＣＣを介して腫瘍内Ｔｒｅｇの選択的枯渇を媒介する。加えて、抗ＣＣＲ８代替抗体は、腫瘍特異的ＣＤ８＋エフェクターＴリンパ球の循環の頻度を著しく増強する。このような作用は、同系腫瘍マウスモデルにおいて、有効性と相関する（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８１、２０２１）。
本発明者らは、例えば、腫瘍内Ｔｒｅｇなどの細胞表面上で発現するＣＣＲ８に特異的に結合するモノクローナル治療抗体を開発した。実施形態では、抗体は、重鎖１つ及び軽鎖１つの２つの可変鎖からなる。各可変鎖上には、抗体がＣＣＲ８に結合することが可能となる３つのＣＤＲが存在する。両可変鎖上には、合計６つの異なるＣＤＲが存在する。加えて、抗体は、免疫グロブリンクラスＧ１（ＩｇＧ１）のヒトＦｃを含むヒト重鎖定常領域を含む。本明細書に記載の抗ＣＣＲ８抗体は、フコシル化又は脱フコシル化されて、インビトロでの機能性、免疫安全性及び薬物様特性を実証することができる。
一部の実施形態では、抗体は、脱フコシル化されているＩｇＧ Ｆｃ定常領域を含む。実施形態では、脱フコシル化Ｆｃ定常領域は、ＩｇＧ１である。脱フコシル化は、当技術分野において公知の技術により実行し得る。例えば、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ（２０２０）１９（５）：１１０２～１１０９及びＰＮＡＳ（２０１３）１１０（１４）５４０４～５４０９を参照されたい。例えば、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼの欠乏により、例えば、ＧＤＰ－フコース形成が欠損した細胞株における抗体の産生、フコシルトランスフェラーゼのレベルが低下した細胞における抗体の産生、ＧＤＰ－フコース輸送体のレベルが低下した細胞における抗体の産生、β－１，４－マンノシル－糖タンパク質４－β－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を高発現する細胞における抗体の産生、又は細菌ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）を発現する細胞における抗体の産生が挙げられる。実施形態では、本発明の脱フコシル化抗ＣＣＲ８抗体の産生に使用する細胞は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＲＭＤを発現するように改変したＣＨＯ細胞である。抗体の脱フコシル化の程度は、当技術分野において公知の技術により定量することができる。
ヒト及びカニクイザルＣＣＲ８と交差反応する抗ＣＣＲ８抗体を得るために、ヒト又はカニクイザルのいずれかのＣＣＲ８を高発現するジャーカット細胞に結合するマウス－ヒト（ラット／ｈＩｇＧ１）キメラ抗体の能力を評価した。結果は、当技術分野において公知の技術により実行するフローサイトメトリーによって分析した。結果として、最終抗ＣＣＲ８抗体は、ヒト及びカニクイザルＣＣＲ８と交差反応し、両方の種においてＡＤＣＣを媒介するが、マウス、ラット又はウサギＣＣＲ８には結合しない。
特定の実施形態では、本発明の脱フコシル化抗体は、この抗体のフコシル化形態と比較して、ＩｇＧの受容体の活性化に対する高い親和性、並びに精製ナチュラルキラー細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ＡＤＣＣアッセイにおける活性の増強を有する。抗ＣＣＲ８抗体のＡＤＣＣ活性は、当技術分野において公知のＡＤＣＣバイオアッセイ技術を使用して実証することができる。例えば、ヒト又はカニクイザルＣＣＲ８発現ジャーカット細胞と培養したヒトＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８又はＦ１５８アレルバリアントレポーター株では、抗ＣＣＲ８抗体は、当技術分野において公知の技術を使用する発光誘導により測定した場合、ＡＤＣＣを引き起こした。
加えて、本明細書に記載の抗体は、ＣＣＲ８にも結合するが、結合又はＡＤＣＣ活性に対するものよりも実質的に高いＥＣ５０でのみ結合するＣＣＬ１などの天然に存在する他のリガンドの有効性に干渉する。この検査は、当技術分野において公知の技術、例えば、ベータ－アレスチンレポーターアッセイにより実行した。
本明細書において使用する場合、「抗体」（Ａｂ）の用語は、特定の抗原、例えば、ＣＣＲ８に特異的に結合する、免疫グロブリン分子を指す。本開示の抗ＣＣＲ８抗体は、Ｔｒｅｇ上のヒトＣＣＲ８に結合し、これにより免疫系を調節する。本開示の抗ＣＣＲ８抗体は、軽鎖及び重鎖の両可変ドメイン内に、超可変領域としても知られる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。可変ドメインのさらに高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と呼ぶ。当技術分野において公知のように、抗体の超可変領域を描くアミノ酸部分／境界は、これらの関連及び当技術分野における公知の種々の定義に応じて異なり得る。可変ドメイン内の一部の位置は、このような位置が、一連のある基準の下では超可変領域内に存在すると思われるが、一連の別の基準の下では超可変領域の外部に存在すると思われるため、ハイブリッド高頻度可変位置であると考えることができる。また、このような位置の１つ以上は、伸長した超可変領域において見出すことができる。本開示は、このようなハイブリッド超可変位置において修飾を含む抗体を提供する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、ほとんどの場合では、βシート構造に連結する、及び一部の場合ではβシート構造の部分を形成するループを形成している、３つのＣＤＲにより連結したβシート構造を組み入れた、４つのＦＲ領域をそれぞれ含む。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によってごく近接して結合し、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の標的結合部位の形成に寄与する。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．１９８７）を参照されたい。
本開示の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、遺伝子改変及び／又はその他天然に修飾された抗体であり、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体等を含み得るが、これらに限定されない。種々の実施形態では、抗体は、抗体の定常領域のすべて又は部分を含む。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）及びＩｇＭから選択されるアイソタイプである。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＣＲ８抗体は、ＩｇＧ１を含む。他の実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体は、ＩｇＧ２を含む。さらに他の実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体は、ＩｇＧ４を含む。本明細書において使用する場合、抗体の「定常領域」は、天然定常領域、アロタイプ又はバリアントを含む。
抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖定常領域は、カッパ（κ）軽鎖領域又はラムダ（λ）領域であり得る。λ軽鎖領域は、公知のサブタイプ、例えば、λ１、λ２、λ３又はλ４のいずれか１つであり得る。一部の実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体は、カッパ（κ）軽鎖領域を含む。
「モノクローナル抗体」の用語は、本明細書において使用する場合、ハイブリドーマ技術により産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、利用可能な任意の手段による又は当技術分野において公知の、任意の真核、原核又はファージクローンを含む、単一クローンに由来する。本開示により有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術又はこれらの組合せの使用を含む、当技術分野において公知の多種多様な技術を使用して調製することができる。
「キメラ」抗体の用語は、本明細書において使用する場合、ラット又はマウス抗体などの非ヒト免疫グロブリンに由来する可変配列を有する抗体、及びヒト免疫グロブリン鋳型から典型的に選択されるヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体を指す。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、少なくとも１つ及び典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、このＣＤＲ領域のすべて又は実質的にすべては非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、このＦＲ領域のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である。また、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の少なくとも一部を含み得る。
「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンを遺伝子導入し、機能性の内因性免疫グロブリンを発現しない動物から単離した抗体を含む。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ方法を含む、当技術分野において公知の種々の方法により作製することができる。
本開示の抗ＣＣＲ８抗体は、完全長（インタクト）抗体分子を含む。
抗ＣＣＲ８抗体は、定常領域により媒介される少なくとも１つの生物学的エフェクター機能を変化させるように配列が修飾されている抗体であり得る。例えば、本明細書に記載の抗ＣＣＲ８抗体は、定常領域により媒介される少なくとも１つの生物学的エフェクター機能を獲得又は非修飾抗体と比較して向上させて、例えば、ＦｃγＲ相互作用を増強（例えば、米国特許出願第２００６／０１３４７０９号を参照）又はＡＤＣＣを媒介する抗体の能力を増強するように修飾されている抗体を含む。例えば、本開示の抗ＣＣＲ８抗体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＩＢに、対応する非修飾定常領域よりも高い親和性で結合する定常領域を有し得る。本開示の抗ＣＣＲ８抗体は、修飾Ｆｃ領域を有し、ＡＤＣＣ応答の増強を媒介する抗体であってもよく、この場合、ＡＤＣＣ応答は、同一の可変領域（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）及び野生型ＩｇＧ１Ｆｃ領域（すなわち、野生型ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する抗体に関して増強される。ＡＤＣＣの増強が可能なＦｃ修飾、例えば、アミノ酸配列変異は、当技術分野において公知であり、次の組の変異：Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ；及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを含み得る。
ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＣＣＲ８抗体は、Ｆａｂアーム交換を防ぐことが報告されているＳ２２８Ｐ変異を含み得る。例えば、Ｓｉｌｖａ，ＪＰらＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９０（９）、５４６２～５４６９（２０１５）を参照されたい。
一部の実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体は、例えば、ＦｃＲｎ相互作用に関与する特定の領域における免疫グロブリン定常領域セグメントを変異させることにより、胎児性Ｆｃ受容体、ＦｃＲｎに対するこれらの結合親和性を上昇又は低下させる修飾を含む。特定の実施形態では、ＩｇＧクラスの抗ＣＣＲ８抗体は、重鎖定常領域のアミノ酸残基２５０、３１４及び４２８の少なくとも１つを単独又はこれらの任意の組合せで置換するように変異させる。２５０番目では、置換するアミノ酸残基は、スレオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むが、これらに限定されない。３１４番目では、置換するアミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むが、これらに限定されない。４２８番目では、置換するアミノ酸残基は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン又はチロシンを含むが、これらに限定されない。Ｆｃエフェクター機能を修飾することで知られている、例となる置換は、Ｆｃ置換Ｍ４２８Ｌであり、これは、Ｆｃ置換Ｔ２５０Ｑと併せて生じ得る。適するアミノ酸置換のさらなる特異的組合せは、米国特許第７，２１７，７９７号の表１に同定されている。このような変異によってＦｃＲｎへの結合が向上し、これにより抗体が分解から保護され、この半減期が向上する。
ヒトＣＣＲ８に対する高親和性を有する抗ＣＣＲ８抗体は、治療的及び診断的使用に望まれ得る。したがって、本開示は、ヒトＣＣＲ８に対する高い結合親和性を有する抗体を企図する。特定の実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体は、少なくとも約１００ｎＭの親和性でヒトＣＣＲ８に結合するが、例えば、少なくとも約９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭの高い親和性又はこれらよりさらに高い親和性を示し得る。一部の実施形態では、抗体は、約１ｐＭ～約１０ｎＭ、約１００ｐＭ～約１０ｎＭ、約１００ｐＭ～約１ｎＭの範囲の親和性、又は前述の値のいずれかの間の範囲に及ぶ親和性でヒトＣＣＲ８に結合する。
一部の実施形態では、６つの異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）を２組、２つの異なる可変領域を２組、２つの完全重鎖、２つの完全軽鎖及びヒト重鎖定常領域を含む、モノクローナル抗ＣＣＲ８抗体を本発明において提供する。
一部の実施形態では、抗体は、ケモカイン受容体８に結合する組換え、脱フコシル化、ヒト化、ＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体である。
実施形態では、抗体は、次の配列を含むＣＤＲ６つを含む。
Figure 2023018678000002
一部の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ１、配列番号５として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ２及び配列番号６として示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ－Ｌ３を含む。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号７として示されるアミノ酸配列：
Figure 2023018678000003
 を含む重鎖可変領域、及び配列番号８として示されるアミノ酸配列：
Figure 2023018678000004
 を含む軽鎖可変領域を含む。
一部の実施形態では、本開示の抗体は、配列番号９として示されるアミノ酸配列（定常領域は太字、可変重鎖ドメインは下線、ＣＤＲは下線を引いた太字のイタリック体（表示順にそれぞれ配列番号１～３として開示））：
Figure 2023018678000005
 （配列番号９として開示される完全長配列）を含む重鎖、及び配列番号１０として示されるアミノ酸配列（定常領域は太字、可変軽鎖ドメインは下線、ＣＤＲは下線を引いた太字のイタリック体（表示順にそれぞれ配列番号４～６として開示されるＣＤＲ配列））：
Figure 2023018678000006
 （配列番号１０として開示される完全長配列）を含む軽鎖を含む。
実施形態では、本開示の抗体は、配列番号１０による軽鎖、及びＣ末端のリジンが切断された重鎖、例えば、Ｃ末端のリジンが切断された配列番号９による重鎖：
Figure 2023018678000007
 （配列番号１１として開示される末端リジン切断配列）を含む。
一実施形態では、本開示の抗体の重鎖は、次のヌクレオチド配列（配列番号１２として開示される完全長配列）によりコードされる。
Figure 2023018678000008
 分泌シグナルペプチドはイタリック体であり、最終の終止コドン（ＴＧＡ）を含み、定常領域は太字であり、ＣＤＲには下線を引く。
一実施形態では、本開示の抗体の軽鎖は、次のヌクレオチド配列（配列番号１３として開示される完全長配列）によりコードされる。
Figure 2023018678000009
 分泌シグナルペプチドはイタリック体であり、最終の終止コドン（ＴＡＧ）を含み、定常領域は太字であり、ＣＤＲには下線を引く。
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＣＨ１、ヒトヒンジ、ヒトＣＨ２及びヒトＣＨ３ドメインを含むヒト重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、コードされる重鎖定常領域は、Ｆｃ部分を含み、この場合、Ｆｃ部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭアイソタイプである。実施形態では、ＦｃはＩｇＧ１であり、アロタイプはｚ ｎｏｎ ａである。実施形態では、軽鎖は、カッパ軽鎖である。
一部の実施形態では、抗体は、脱フコシル化されているＩｇＧ１ Ｆｃ定常領域を含む。脱フコシル化は、当技術分野において公知の技術により実行し得る。例えば、ＧＤＰ－マンノース４，６－デヒドラターゼの欠乏により、例えば、ＧＤＰ－フコース形成が欠損した細胞株における抗体の産生、フコシルトランスフェラーゼのレベルが低下した細胞における抗体の産生、ＧＤＰ－フコース輸送体のレベルが低下した細胞における抗体の産生、β－１，４－マンノシル－糖タンパク質４－β－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｎＴ－ＩＩＩ）を高発現する細胞における抗体の産生、又は細菌ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）を発現する細胞における抗体の産生が挙げられる。本発明の脱フコシル化抗ＣＣＲ８抗体の産生に使用する細胞は、シュードモナスＲＭＤを発現するように改変したＣＨＯ細胞である。抗体の脱フコシル化の程度は、当技術分野において公知の技術により定量することができる。典型的には、抗体は、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約９９％又は約１００％脱フコシル化されている。好ましくは、脱フコシル化の程度は、８０％以上である。一部の実施形態では、抗体は、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）の位置において７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約１００％脱フコシル化されている。脱フコシル化は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）アッセイ技術により定量することができ、この脱フコシル化の程度は、断片化抗体の極性依存的分離により定量する。
実施形態では、脱フコシル化グリカン種の総量は、蛍光検出を用いたＨＩＬＩＣによる遊離Ｎ連鎖グリカンの分析によって定量する。グリカンは、ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を使用して遊離させた後、蛍光タグで標識する。蛍光標識Ｎ連鎖グリカンは、蛍光検出を用いたＨＩＬＩＣにより分析する。パーセント脱フコシル化グリカン種は、すべての脱フコシル化グリカンピークのピーク領域の和に基づいて、クロマトグラムにおけるすべてのグリカンピークの全ピーク領域と比較して定量する。０．５％以上の相対存在量によるすべてのピークは、パーセント脱フコシル化グリカン種の定量に含まれる。
７．１．抗ＣＣＲ８抗体をコードするポリヌクレオチド、発現系及び抗体を作製する方法
本開示は、抗ＣＣＲ８抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び本開示の抗ＣＣＲ８抗体を産生可能な宿主細胞を包含する。
本開示の抗ＣＣＲ８抗体は、宿主細胞における免疫グロブリン軽鎖及び重鎖遺伝子の組換え発現により調製することができる。抗体を組換えにより発現させるために、宿主細胞に、抗体の免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ断片を保有する１つ以上の組換え発現ベクターをトランスフェクトすることにより、宿主細胞において軽鎖及び重鎖を発現させ、任意選択で、宿主細胞を培養した培地中に分泌させて、この培地から抗体を回収することができる。
このような抗ＣＣＲ８抗体をコードするポリヌクレオチドを生成するために、軽鎖及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡ断片を最初に得る。このようなＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用した、軽鎖及び重鎖可変配列をコードする生殖系列ＤＮＡ又はｃＤＮＡの増幅及び修飾により得ることができる。
抗ＣＣＲ８抗体関連ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、このようなＤＮＡ断片を、標準的組換えＤＮＡ技術によってさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。このような操作では、ＶＬ又はＶＨコードＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域又は可動性リンカーをコードする別のＤＮＡ断片に動作可能に連鎖する。「動作可能に連鎖」の用語は、この文脈において使用する場合、ＤＮＡ断片２つによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるようにＤＮＡ断片２つを連結することを意味することを意図する。
ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び任意選択で、ＣＨ４）をコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連鎖させることにより、ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照）、このような領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、特定の実施形態では、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連鎖し得る。
ＶＬコードＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連鎖させることにより、ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１～３２４２を参照）、このような領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、特定の実施形態では、カッパ定常領域である。
本開示の抗ＣＣＲ８抗体を発現させるために、上記のように得られる部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、発現ベクターに挿入することにより、遺伝子を転写及び翻訳調節配列に動作可能に連鎖させる。この文脈では、「動作可能に連鎖」の用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、これらの意図する、抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御する機能に役立つように、抗体遺伝子をベクター内にライゲーションすることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現調節配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入することができ、又はより典型的には、両遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入する。
抗体遺伝子は、標準的方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補性制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合、平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入する。抗ＣＣＲ８抗体関連軽鎖又は重鎖配列の挿入前には、発現ベクターは、抗体定常領域配列を既に保有し得る。例えば、抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体関連ＶＨ及びＶＬ配列の完全長抗体遺伝子への変換のための一手法は、これらを、重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターにそれぞれ挿入することにより、ＶＨセグメントを、ベクター内のＣＨセグメント（複数可）に動作可能に連鎖させ、ＶＬセグメントを、ベクター内のＣＬセグメントに動作可能に連鎖させることである。加えて又は代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易とするシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子をベクター内にクローニングすることにより、シグナルペプチドを抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連鎖し得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を保有する。「制御配列」の用語は、プロモーター、エンハンサー及び抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を調節する他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子などのさらなる配列を保有し得る。選択的マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする。軽鎖及び重鎖の発現では、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」の用語の種々の形態は、原核又は真核宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等を包含することを意図する。
原核又は真核のいずれかの宿主細胞において本開示の抗体を発現させることが可能である。特定の実施形態では、抗体の発現は、適切に折り畳まれかつ免疫学的に活性な抗体の分泌に最適な、真核細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞において実施する。本開示の組換え抗体を発現させるための哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１～６２１に記載のＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６～４２２０に記載のＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、又は宿主細胞を増殖させる培養培地中への抗体の分泌が可能となるのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準的タンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。また、宿主細胞を使用して、インタクトな抗体の部分、例えば、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖ分子を産生することができる。上記の手順の変形形態は、本開示の範囲内であることが理解される。例えば、宿主細胞に、本開示の抗ＣＣＲ８抗体の軽鎖又は重鎖のいずれか（両方ではなく）をコードするＤＮＡをトランスフェクトすることが望まれ得る。
また、組換えＤＮＡ技術を使用して、ヒトＣＣＲ８に結合させるのに不必要な軽鎖及び重鎖のいずれか又は両方をコードするＤＮＡの一部又は全部を除去することができる。また、このような切断ＤＮＡ分子から発現する分子は、本開示の抗体に包含する。
本開示の抗ＣＣＲ８抗体の組換え発現では、宿主細胞は、本開示の発現ベクター２つと同時トランスフェクトすることができ、第１のベクターは、重鎖由来ポリペプチドをコードし、第２のベクターは、軽鎖由来ポリペプチドをコードする。２つのベクターは、同一の選択可能なマーカーを含んでもよく、又はこれらは、別々の選択可能なマーカーを含み得る。代替的に、重鎖及び軽鎖の両ポリペプチドをコードする、単一のベクターを使用することができる。
抗ＣＣＲ８抗体の１つ以上の部分をコードするポリヌクレオチドが得られると、さらなる変化又は変異をコード配列に導入して、例えば、種々のＣＤＲ配列を有する抗体、Ｆｃ受容体に対する親和性が低下した抗体、又は種々のサブクラスの抗体をコードするポリヌクレオチドを生成することができる。
また、本開示の抗ＣＣＲ８抗体は、化学合成により又は無細胞プラットフォームを使用することにより産生することができる。
７．２．抗ＣＣＲ８抗体の精製
本開示のポリペプチドを組換え発現により産生すると、タンパク質の精製のための当技術分野において公知の任意の方法により、これを精製することができる。単離すると、抗ＣＣＲ８抗体は、さらに精製することができる。
７．３．組成物
本開示の抗体は、対象への投与に適する組成物として提供し得る。一部の実施形態では、抗体組成物は、本開示の抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
実施形態では、複数の抗ＣＣＲ８抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。実施形態では、医薬組成物の複数の抗ＣＣＲ８抗体は、脱フコシル化されている。典型的には、複数の抗体は、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約９９％又は約１００％脱フコシル化されている。好ましくは、脱フコシル化の程度は、９０％以上である。一部の実施形態では、複数の抗体は、ＡＳＮ－３００（ＥＵ：ＡＳＮ－２９７）の位置において７０％以上、８０％以上、９０％以上又は約１００％脱フコシル化されている。抗体の脱フコシル化の程度は、当技術分野において公知の技術により定量することができる。脱フコシル化は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）アッセイ技術により定量することができ、この脱フコシル化の程度は、断片化抗体の極性依存的分離により定量する。実施形態では、脱フコシル化グリカン種の総量は、蛍光検出を用いたＨＩＬＩＣによる遊離Ｎ連鎖グリカンの分析によって定量する。グリカンは、ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を使用して遊離させた後、蛍光タグで標識する。蛍光標識Ｎ連鎖グリカンは、蛍光検出を用いたＨＩＬＩＣにより分析する。パーセント脱フコシル化グリカン種は、すべての脱フコシル化グリカンピークのピーク領域の和に基づいて、クロマトグラムにおけるすべてのグリカンピークの全ピーク領域と比較して定量する。０．５％以上の相対存在量によるすべてのピークは、パーセント脱フコシル化グリカン種の定量に含まれる。
７．４．主題の抗体の特性の要約
ＡＢＢＶ－５１４により例証するが、これに限定されない主題の抗体の特性は、以下を含む。
ＣＣＲ８に対する高親和性結合、例えば、ＴＡＬＬ－１細胞上に内因的に発現したＣＣＲ８により定量した場合（ヒト成人Ｔ－ＡＬＬ；ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ １７３６）、ＦＡＣＳ結合平均ＥＣ５０が２μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．３～０．７μｇ／ｍＬ、０．４～０．６μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ、若しくは０．５５μｇ／ｍＬ；又はジャーカット細胞上で高発現したヒトＣＣＲ８に対するＦＡＣＳ結合平均ＥＣ５０が２μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．３～０．８μｇ／ｍＬ、０．４～０．７μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ、若しくは０．６μｇ／ｍＬ；又はヒト血中ＣＤ４５ＲＡ ｌｏｗ Ｔｒｅｇ上で発現したＣＣＲ８に対するＦＡＣＳ結合平均ＥＣ５０が２μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．２～０．６μｇ／ｍＬ、０．３～０．５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ、若しくは０．４８μｇ／ｍＬである。
ヒトＣＣＲ８に対する高特異性結合、例えば、ＴＡＬＬ－１ ＣＣＲ８ノックアウト細胞又は親ジャーカット細胞に対する非特異的ＦＡＣＳ結合。
カニクイザルＣＣＲ８との交差反応性、例えば、ジャーカット細胞上で高発現したｃｙｎｏＣＣＲ８に対するＦＡＣＳ結合平均ＥＣ５０が５μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下、およそ１．５μｇ／ｍＬ、若しくは１．８２μｇ／ｍＬ；又はｃｙｎｏ血中ＣＤ４５ＲＡ ｌｏｗ Ｔｒｅｇ上で発現したＣＣＲ８に対するＦＡＣＳ結合平均ＥＣ５０が５μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下、およそ１．５μｇ／ｍＬ、若しくは１．６２μｇ／ｍＬである。
ＣＣＬ１／ＣＣＲ８相互作用を遮断する能力が弱いこと、例えば、ＣＣＬ１／ＣＣＲ８遮断活性におけるＥＣ５０が、ヒトＣＣＲ８に対する結合におけるＥＣ５０よりも少なくとも３０×高く、少なくとも４０×高く、３０×～７０×高く、少なくとも５０×高く、又は少なくとも約５０×高い。
同一の可変領域及び野生型フコシル化ＩｇＧ１を有する抗体に関するＡＤＣＣを誘導する能力の増強。
同一の可変領域及び野生型フコシル化ＩｇＧ１を有する抗体に関するＦｃγ受容体に対する結合の増強。
サイトカイン放出アッセイにより定量した免疫安全性が良好であること。
７．５．使用の方法
実施形態では、本明細書に記載の方法は、固形腫瘍を有する患者を本発明の抗ＣＣＲ８抗体により治療するステップを含む。実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体を含む組成物は、これを必要とする対象に投与する。
ＰＤ－１抵抗性Ｐａｎ０２マウスモデルでは、ＣＣＲ８及びＰＤ－１標的化抗体の組合せにより、いずれかの抗体による単独療法に対してインビボでの有効性の向上が示された。免疫抑制ＣＣＲ８＋Ｔｒｅｇの枯渇は、ＰＤ－１／ＰＤリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）遮断と協同して、さらに強力なＣＤ８＋エフェクターＴ細胞応答を促進し、抗腫瘍免疫を増強し得る。実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体を含む組成物は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１標的化抗体の投与を含む併用療法の一部として投与する。実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体を含む組成物は、ペムブロリズマブ、ブディガリマブ（ｂｕｄｉｇａｌｉｍａｂ）、ニボルマブ、セミプリマブ又はドスタルリマブ（ｄｏｓｔａｒｌｉｍａｂ）とともに併用療法として投与する。実施形態では、抗ＣＣＲ８抗体を含む組成物は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブとともに併用療法として投与する。
本明細書に記載の抗体及び結合断片の例となる実施形態の特定の特徴及び特性を強調する、以下の実施例は、例示の目的のために提供する。
８．１．［実施例１］ラットハイブリドーマの産生
ラットを２つの異なる完全長ヒトＣＣＲ８ｃ ＤＮＡベクターにより免疫化した（各ベクターに対してラット６匹）。リンパ節細胞を単離し、ＮＳ０に融合させてハイブリドーマを生成した。増殖後、ハイブリドーマ上清を、ＨＥＫ２９３細胞上で高発現したヒト又はカニクイザル（「ｃｙｎｏ」又は「ｃｙ」）ＣＣＲ８への結合についてスクリーニングした。４６種のラット／ｈＩｇＧ１キメラｍＡｂが、ハイスループット抗体産生により発現し、２１種が、ヒトＣＣＲ８に結合することが確認された（図１）。ＡＣ－２５４２９０、ＡＣ－２５４５３２、ＡＣ－２５４５４６及びＡＣ－２５４２５９の４つのキメラｍＡｂを、完全ヒト化のために、ジャーカットＣＣＲ８高発現株における最も高いｃｙｎｏ交差反応性に基づいて選択した。
８．２．［実施例２］ｈｕＣＣＲ８に対する競合結合によるエピトープマッピング
選択したキメラ抗体を、ジャーカット細胞上のヒトＣＣＲ８への結合について、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（クローン４３３Ｈ）及びＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社（クローンＬ２６３Ｇ８）のヒトＣＣＲ８抗体とともに細胞エピトープマッピングアッセイにより検査した。市販の両抗体は、ヒトＣＣＲ８トランスフェクタントによるマウスの免疫化により生成されたものとして報告され、いずれもｃｙｎｏＣＣＲ８と交差反応性ではなかった。抗体は、飽和濃度の抗体１で染色した細胞と対で検査、洗浄し、次いで、抗体２で染色し、又はこの逆を行った。
ＡＣ－２５４２９０及びＡＣ－２５４５３２のｍＡｂは、いずれかの順序で結合に干渉し、これらが同一のエピトープ（エピトープＡ）に結合することを示唆した（図２）。ＡＣ－２５４５４６は、ＡＣ－２５４２９０及びＡＣ－２５４５３２と中程度のエピトープ結合干渉を示すが、同一エピトープへの結合の証拠はなく、したがって、ＡＣ－２５４５４６は、ユニークであるがエピトープＡに近い、エピトープＢに結合する。ＡＣ－２５４２５９は、他のいかなる抗体との結合干渉も有せず、ユニークなエピトープであり得る（エピトープＣ）。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のクローン４３３Ｈは、ＡＣ－２５４２９０と同一のエピトープ結合を有し、ＡＣ－２５４５３２、ＡＣ－２５４５４６及びＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社のクローンＬ２６３Ｇ８との一部の干渉結合を有し、したがって、エピトープＡとビニングされる。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のクローン４３３Ｈ及び他の抗体による干渉データに基づいて、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社のクローンＬ２６３Ｇ８は、ユニークであるがエピトープＢではなくエピトープＡに近い、エピトープＤとしてビニングされる。
８．３．［実施例３］ラット可変ドメイン／ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラのヒト化
４つのキメラ抗体ＡＣ－２５４２９０、ＡＣ－２５４５３２、ＡＣ－２５４５４６及びＡＣ－２５４２５９を、（ｉ）げっ歯類抗体配列を同定し、（ｉｉ）ＣＤＲ及び抗体フレームワークを同定し、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＶＬ構造モデルを作出し、（ｉｖ）復帰変異のフレームワーク残基を同定して、げっ歯類抗体の機能を維持し、（ｖ）高い同一性を有するヒト生殖系列、最も類似するＣＤＲ正準構造及び必要とされる最小復帰変異を選択し、（ｖｉ）ＣＤＲ移植及び選択した復帰変異の組込みによりＶＨ／ＶＬ配列を生成することによりヒト化した。
ヒト化抗体４つは、選択した各抗体について作出した。ＡＣ－２５４２９０は、配列及び構造の両方に基づくヒト化の手法を必要とした。ストレートＣＤＲ移植により、ヒトＣＣＲ８発現ジャーカット細胞への結合が弱い抗体が生じた。予想されたげっ歯類ＶＨ／ＶＬ構造／界面に基づく復帰変異を検査した。ＨＣＤＲ３の前の三つ組の残基はＣＴＡであり、これは非定型であった。９４番目（ＣＴＡのＡ）は、ほとんどの場合、アルギニン（Ｒ）である。ＣＴＲを有するヒト化バージョン２つは、ヒトＣＣＲ８発現ジャーカット細胞への結合が弱いことを示し、ＥＣ５０は３．９６及び５．６１μｇ／ｍＬであった。対照的に、ＨＣＤＲ３の前にＣＴＡを有するヒト化バージョン（ＣＴＡＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号１４））２つは、このうちの１つはＡＣ－２６４７００であるが、強力な結合を実証し、ＥＣ５０は０．２５５９及び０．２３０２μｇ／ｍＬであり、ＡＣ－２５４２９０親抗体に引けを取らないものだった（ＥＣ５０は０．４５３８μｇ／ｍＬ）。
ヒト化抗体は、ヒト又はカニクイザルＣＣＲ８に結合する能力について評価した。ＥＣ５０は、５×希釈で３０μｇ／ｍＬから開始する８つの濃度の抗体を、ヒト又はカニクイザルＣＣＲ８高発現ジャーカット細胞への結合について検査することにより定量した。ＣＣＲ８検査抗体とのインキュベーション後、細胞を洗浄し、蛍光色素標識二次抗体とともにインキュベート、洗浄して、フローサイトメトリーにより分析した。
ＡＣ－２５４２５９及びＡＣ－２５４５３２は、ｃｙｎｏＣＣＲ８への結合の低下及びＨＥＫ２９３細胞への高い非特異的結合をそれぞれ示した。ＡＣ－２６４７１１（ヒト化ＡＣ－２５４５４６）及びＡＣ－２６４７００（ヒト化ＡＣ－２５４２９０）は、優れた標的結合、非特異的結合の非存在及びライアビリティ改変のための要件が限定的であることにより、進歩的であった。
８．４．［実施例４］ＡＣ－２６４７００のライアビリティ改変
ＡＣ－２６４７００は、ＨＣＤＲ２及びＬＣＤＲ１のアミノ酸６１～６２及び２７～２８（ｋａｂａｔ）において、異性化のリスクであるＤＳモチーフをそれぞれ有し、ＬＣＤＲ３のアミノ酸９４～９５番目（ｋａｂａｔ）において、潜在的に断片化させるＤＰモチーフを有した。ＨＣＤＲ２のＤＳライアビリティは、これまでの抗体による経験に基づいてＤＡに変異させた。ＤＰモチーフの除去によって結合は破壊されたが、ＤＰモチーフを保持する抗体の断片化は、ストレス検査下で現れなかった。ＬＣＤＲ１ ＤＳバリアント抗体２２種を作出し、これらの結合特性を、ｈｕＣＣＲ８又はｃｙＣＣＲ８高発現ジャーカット細胞に対してフローサイトメトリーを使用して評価した。ジャーカット親細胞への非特異的結合をフローサイトメトリーにより評価した。バリアント抗体１０種は、好ましい機能及び薬物様特性に基づいて、さらなる特性決定のために選択した。２つは、結合、自己相互作用の低下、非特異性の欠如、ｃｙｎｏ交差反応性及びｈＦｃγＲＩＩＩａ ＶバリアントＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）における活性を含む、特性の全組合せに基づいて、進歩的利点のために選択した。
候補分子は、ジャーカット細胞表面上の高発現したｈｕＣＣＲ８又はｃｙＣＣＲ８に対し、公知の方法によりフローサイトメトリーを使用して、結合能について評価した。例となる抗体は、自己相互作用し、ｈｕＣＣＲ８及びｃｙＣＣＲ８に結合する能力、レポーターバイオアッセイを使用したＡＤＣＣの能力、並びにＨＥＫ２９３細胞への非特異的結合について検査した。ＡＣ－２７７３５７は、親及び他の候補抗体と比較した場合、ｈｕＣＣＲ８及びｃｙＣＣＲ８の両ジャーカット細胞について優れた結合能を有した（表１）。各候補のＡＣ－ＳＩＮＳ自己相互作用スコアは、＜１であった。１００μｇ／ｍＬでは、非特異的結合最大値は、９７～１４４ＧＭＦＩの範囲に及んだ。１０μｇ／ｍＬでは、非特異的結合最大値は、９４～１１１ＧＭＦＩの範囲に及んだ。１μｇ／ｍＬでは、非特異的結合最大値は、８７～１０２ＧＭＦＩの範囲に及んだ。ＡＣ－２７７３５７は、ＨＥＫ２９３細胞に対して１００μｇ／ｍＬにおいて最も低い非特異的結合最大値を有し、ｈｕＣＣＲ８及びｃｙＣＣＲ８ジャーカット細胞への最も強力な結合を有し、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいてｈｕＣＣＲ８及びｃｙＣＣＲ８の両ジャーカット細胞による最大倍率のシグナル誘導を有した。加えて、ＡＣ－２７７３５７は、親抗体と比較した場合、最も低い自己相互作用スコアのうちの１つを有した。
Figure 2023018678000010
８．５．［実施例５］ＡＣ－２６４７１１のライアビリティ改変
ＡＣ－２６４７１１は、ＨＣＤＲ２領域のアミノ酸６０～６１（ｋａｂａｔ）において、脱アミノ化のリスクを呈するＮＳモチーフを有した。加えて、ＨＣＤＲ３のＭ１００ｃ残基は、ストレス検査中に高レベルの酸化を示した。
ライアビリティを除去するＮＳ変異を有するＡＣ－２６４７１１候補バリアントは、自己相互作用し、ＨＥＫ２９３細胞に非特異的に結合し、ｈｕＣＣＲ８及びｃｙＣＣＲ８ジャーカット細胞に結合し、標的としてのｈｕＣＣＲ８発現ジャーカット細胞によりＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいてシグナルを誘導する能力について検査した。ＮＳモチーフの除去は、耐容性を示した。ＮＳバリアント２９種を作出し、これらの結合特性を、ジャーカット親細胞及び高発現ｈｕＣＣＲ８又はｃｙＣＣＲ８ジャーカット細胞に対してフローサイトメトリーを使用して評価した。最良の結合及び薬物様特性プロファイルを有する抗体５つをＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいて検査したところ、特性の最良の組合せを有する抗体３つ、ＡＣ－２７５８８９、ＡＣ－２７５８９６及びＡＣ－２７５８９８は、酸化を防ぐＭ１００ｃ変異のために進歩的であった。
Ｍ１００ｃ変異を有するＡＣ－２７５８８９、ＡＣ－２７５８９６及びＡＣ－２７５８９８のバリアントを生成し、ＮＳ変異体として同一のアッセイにおいて検査した。このようなアッセイのデータを使用して、薬物様特性検査について抗体８つの優先順位をつけた。ＡＣ－２９１７７４及びＡＣ－２９１７９０は、それぞれ８．３８及び６．７５の最も高い自己相互作用ＡＣ－ＳＩＮＳスコアを有した。残りの候補は、１．７３～２．７９の範囲に及ぶ同等のＡＣ－ＳＩＮＳスコアを有した。ＡＣ－２７５８９６及びＡＣ－２７５８９８は、それぞれ１７８０及び１０６５ＧＦＭＩのＨＥＫ２９３細胞に対する最も高い非特異的結合を有した。ＡＣ－２９１７９０、ＡＣ－２７５８８９及びＡＣ－２７５８９８は、それぞれ３３５、１４８及び１４１の非特異的結合最大値を有した。１０及び１μｇ／ｍＬでは、すべての候補分子は、それぞれ６１～６７及び５７～６０の範囲に及ぶ同等の非特異的結合最大値を有した。ＡＣ－２９１７７４及びＡＣ－２９１７９０は、ジャーカット親細胞への結合及び疎水性相互作用クロマトグラフィーにより示す場合、ＡＣ－２７５８８９、ＡＣ－２７５８９６及びＡＣ－２７５８９８と比較して、最も低い非特異的結合を有したが、ｈｕＣＣＲ８及びｃｙＣＣＲ８発現ジャーカット細胞への強力な結合、並びにｈｕＣＣＲ８及びｃｙＣＣＲ８発現両ジャーカット細胞によるＡＤＣＣレポーターシグナルの同等のＥＣ５０及び倍率誘導を維持した（表２）。
Figure 2023018678000011
８．６．［実施例６］最終候補抗体の選択
ＡＣ－２７７３５７、ＡＣ－２７７３７１、ＡＣ－２９１７７４及びＡＣ－２９１７９０を選択して、さらなる薬物様特性及びインビトロでの免疫安全性実験においてさらに評価した。特性決定のための脱フコシル化バリアントを生成するために、ＡＣ－２７７３５７を発現する細胞にプラスミドをトランスフェクトしてシュードモナス酵素ＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）を発現させた。これにより、フコースのデノボ合成において中間体が最終産物に変換され、脱フコシル化ＡＣ－２７７３５７の産生が生じる。
候補分子を、ジャーカットｈｕＣＣＲ８、ジャーカットｃｙＣＣＲ８及びＴＡＬＬ－１結合活性、標的としてのＴＡＬＬ－１によるｈＰＢＭＣ ＡＤＣＣ活性、標的としてのｈｕＣＣＲ８高発現ジャーカット細胞によるＦ１５８エフェクター細胞及び標的としてのｈｕＣＣＲ８高発現ジャーカット細胞によるＶ１５８エフェクター細胞におけるＡＤＣＣ活性について評価した。ＡＣ－２７７３５７（ＰＲ－１９２５５１４とも呼ぶ）は、ＴＡＬＬ－１細胞上のＣＣＲ８発現の内因的レベルへの結合の向上を示し、脱フコシル化バージョンは、初代細胞ＡＤＣＣアッセイにおいてさらに活性であった（データ非表示）。ＡＣ－２７７３５７／ＰＲ－１９２５５１４は、ＡＣ－２９１７７４（ＰＲ－１９２８４４４とも呼ぶ）よりも強力にヒトＴｒｅｇ上のＣＣＲ８に結合し、サイトカイン放出アッセイにおいて、より良好なプロファイルを有する（データ非表示）。最良のインビトロでの機能性及びインビトロでの免疫安全性（ＩＮＩＳ）プロファイル、並びに卓越した薬物様特性を有したため、脱フコシル化ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するＡＣ－２７７３５７／ＰＲ－１９２５５１４を主要抗体として選択した。
８．７．［実施例７］結合及び機能的能力アッセイ
抗体を単一点のフローサイトメトリーによりスクリーニングして、ヒト又はカニクイザルＣＣＲ８を高発現するジャーカット細胞株への結合を評価した。ＥＣ５０は、５×希釈で３０μｇ／ｍＬから開始する８つの濃度の抗体を、ジャーカットヒトＣＣＲ８、ジャーカットｃｙｎｏＣＣＲ８及び親ジャーカット細胞への結合について、フローサイトメトリーにより検査することによって定量した。検査ＣＣＲ８抗体とのインキュベーション後、細胞を洗浄して蛍光色素標識二次抗体とともにインキュベートし、洗浄してフローサイトメトリーにより分析した。
ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖバリアントコアキット又はヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｆバリアント細胞増殖モデルをＰｒｏｍｅｇａ社から購入し、指示通りに使用した。ヒト若しくはカニクイザルＣＣＲ８を高発現するジャーカット標的細胞株又は親ジャーカット対照細胞をＡＤＣＣアッセイ緩衝液中で１回洗浄し、ＡＤＣＣアッセイ緩衝液中１ｍＬあたり６×１０６細胞に希釈して、白壁の９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ社）内に１ウェルあたり２５μＬで播種した。抗体は、ＡＤＣＣアッセイ緩衝液中３×最終濃度で希釈して、１ウェルあたり２５μＬを追加した（１μｇ／ｍＬ～０．００００６４μｇ／ｍＬの範囲に及ぶ１：５倍７点希釈を検査した）。エフェクター細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８バリアント、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ Ｆ１５８バリアント又はマウスＦｃγＲＩＶのいずれか、及びホタルルシフェラーゼの発現を駆動するＮＦＡＴ応答エレメントを安定に発現する）を解凍し、最終エフェクター対標的比１：２：５で加えた。３７℃、５％ＣＯ２で６時間のインキュベーション後、ＢｉｏＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を指示通りに混合して加え、発光シグナルを測定した。
８．８．［実施例８］ＡＢＢＶ－５１４の用量応答曲線
ＡＣ－２７７３５７／ＰＲ－１９２５５１４のフコシル化及び脱フコシル化（ＡＢＢＶ－５１４と再命名）バージョンを、ヒト又はｃｙｎｏＣＣＲ８を高発現するジャーカット細胞株及び内因的レベルのＣＣＲ８を発現するＴＡＬＬ－１細胞に結合する細胞について評価した。細胞結合は、上記の類似の方法を使用したフローサイトメトリーにより評価した。加えて、結合を、親ジャーカット（ＣＣＲ８無発現）及びＣＣＲ８ノックアウト（ＫＯ）ＴＡＬＬ－１対照株について評価した。ＡＢＢＶ－５１４は、ジャーカット細胞では、高発現したヒト及びｃｙｎｏの両ＣＣＲ８への結合を示したが、親ジャーカット又はＣＣＲ８ ＫＯ ＴＡＬＬ－１細胞では示さなかった（図４Ａ）。また、ＡＢＢＶ－５１４は、フコシル化（ＷＴ）ＡＣ－２７７３５７／ＰＲ－１９２５５１４と同様に、ＴＡＬＬ－１細胞上の内因性ＣＣＲ８に結合した（図４Ｂ）。
ヒト（図５Ａ、５Ｂ）又はｃｙｎｏ（図５Ｃ、５Ｄ）ＣＣＲ８高発現ジャーカット細胞と同時培養したＦｃγＲＩＩＩａ Ｖ１５８（図５Ａ、５Ｃ）又はＦ１５８（図５Ｂ、５Ｄ）アレルバリアントレポーター株のいずれかを使用した、ヒトＦｃγＲＩＩＩａレポーター細胞に基づくバイオアッセイにおいて発光誘導により測定した場合、フコシル化ＷＴ ＰＲ－１９２５５１４及びＡＢＢＶ－５１４の両方は、ＡＤＣＣを媒介する。無処理同時培養物と比較した発光の倍率変化は、２～５回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示す。ＡＢＢＶ－５１４は、フコシル化ＷＴ ＰＲ－１９２５５１４と比較してＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにより示す場合、ＡＤＣＣ活性の上昇を示した。μｇ／ｍＬで表す濃度との比較目的では、１μｇ／ｍＬの抗体の濃度は、６．７６ｎＭと等しい。
８．９．［実施例９］ＡＢＢＶ－５１４の初代細胞ＡＤＣＣアッセイデータ
ＡＢＢＶ－５１４の活性を、ＴＡＬＬ－１細胞を標的として及びヒト初代ＮＫ細胞をエフェクターとして使用する細胞の細胞傷害性に基づくＡＤＣＣアッセイにおいて、さらに評価した。ＮＫ細胞のドナーソース６つを標的細胞として使用し、ＴＡＬＬ－１標的細胞の細胞死を、上記の類似の方法を使用したフローサイトメトリーにより評価した。ＡＢＢＶ－５１４は、ドナーＮＫ細胞検体６つすべてによるＣＣＲ８発現ＴＡＬＬ－１細胞のＡＤＣＣを媒介した（図６）。ヒト全血培養物におけるＡＤＣＣ活性を、上記の適応手順を使用したフローサイトメトリーにより評価した。４８時間後、ＡＢＢＶ－５１４を有するヒト全血の培養物を分析して、ＣＤ４５＋造血細胞の総量におけるＣＤ４５ＲＡ ｌｏｗ Ｔｒｅｇの割合を評価した。ＣＤ４５ＲＡ ｌｏｗ Ｔｒｅｇは、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７ ｌｏｗ、Ｆｏｘｐ３＋、ＣＤ４５ＲＡ ｌｏｗ生細胞を含み、これらは、ＣＣＲ８発現において濃縮されることで知られている。健常ドナー１１人のヒト全血細胞データを評価した。各ドナーにおいて、ＡＢＢＶ－５１４は、ＣＤ４５＋生細胞のＣＤ４５ＲＡ ｌｏｗ Ｔｒｅｇの量のパーセンテージが低下した（データ非表示）。
８．１０．［実施例１０］ＡＢＢＶ－５１４によるＣＣＬ１リガンド遮断の評価
ＣＣＲ８ベータ－アレスチンレポーターアッセイを使用して、ＡＢＢＶ－５１４が、ＣＣＲ８とこのリガンドＣＣＬ１との相互作用を遮断するかどうかを判定した（図７）。ＡＢＢＶ－５１４存在下でのＣＣＬ１媒介レポーター活性の阻害が、結合又はＡＤＣＣ活性が観察された濃度よりも実質的に高い濃度の抗体のみにおいて観察され、ＣＣＬ１遮断におけるＥＣ５０が２３．１μｇ／ｍＬ観察された。
例となる実施形態
種々の特定の実施形態を例示及び開示しており、一部を以下に述べるが、本発明（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができることが理解される。
１．（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む、抗ＣＣＲ８抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１が、ＧＦＩＦＳＮＡＶＭＹ（配列番号１）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃２が、ＲＩＫＴＫＦＮＮＹＡＴＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号２）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃３が、ＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号３）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃１が、ＲＡＳＴＳＶＩＴＬＬＨ（配列番号４）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃２が、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃３が、ＱＱＳＷＮＤＰＹＴ（配列番号６）である、抗ＣＣＲ８抗体。
２．アミノ酸配列ＣＴＡをＶＨ ＣＤＲ＃３の直前に含み、これによりアミノ酸配列ＣＴＡＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号１４）を含む、実施形態１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
３．配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
４．配列番号９として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
５．脱フコシル化されている、実施形態３に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
６．実施形態１に記載の複数の抗ＣＣＲ８抗体を含む、組成物。
７．組成物中の抗ＣＣＲ８抗体の８０％超が、脱フコシル化されている、実施形態６に記載の組成物。
８．ＩｇＧである、実施形態１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
９．Ｆｃ部分を含むヒト重鎖定常領域を含み、前記Ｆｃ部分が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭアイソタイプである、実施形態１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
１０．カッパ軽鎖定常領域を含む、実施形態９に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
１１．重鎖のＣ末端のリジンが切断されている、実施形態４に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
１２．ヒト化抗体である、実施形態１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
１３．実施形態６に記載の組成物を、これを必要とする患者に投与するステップを含む、固形腫瘍を治療する方法。
１４．抗ＣＣＲ８抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドであって、前記抗体が、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含み、
ＶＨ ＣＤＲ＃１が、ＧＦＩＦＳＮＡＶＭＹ（配列番号１）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃２が、ＲＩＫＴＫＦＮＮＹＡＴＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号２）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃３が、ＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号３）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃１が、ＲＡＳＴＳＶＩＴＬＬＨ（配列番号４）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃２が、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃３が、ＱＱＳＷＮＤＰＹＴ（配列番号６）である、ポリヌクレオチド。
１５．実施形態１４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
１６．実施形態１５に記載のベクターをトランスフェクトした、真核宿主細胞。
１７．哺乳動物宿主細胞である、実施形態１６に記載の真核宿主細胞。
１８．（ａ）実施形態１５に記載の真核宿主細胞を培養するステップ及び（ｂ）抗ＣＣＲ８抗体を回収するステップを含む、抗ＣＣＲ８抗体を産生する方法。
１９．実施形態６に記載の組成物を、これを必要とする患者に投与するステップを含む、固形腫瘍を治療する方法。
２０．次の特性：
（ａ）カニクイザルＣＣＲ８との交差反応性、
（ｂ）ＣＣＬ１／ＣＣＲ８相互作用を遮断する能力が弱いこと、
（ｃ）ＡＤＣＣを誘導する能力の増強、
（ｄ）Ｆｃγ受容体に対する結合の増強、及び
（ｅ）サイトカイン放出アッセイにより定量した免疫安全性が良好であること
の１つ以上を有する抗ＣＣＲ８抗体。
２１．次の特性：
（ａ）カニクイザルＣＣＲ８との交差反応性、
（ｂ）ＣＣＬ１／ＣＣＲ８相互作用を遮断する能力が弱いこと、
（ｃ）ＡＤＣＣを誘導する能力の増強、
（ｄ）Ｆｃγ受容体に対する結合の増強、及び
（ｅ）サイトカイン放出アッセイにより定量した免疫安全性が良好であること
を有する抗ＣＣＲ８抗体。
２２．次の特性：
（ａ）カニクイザルＣＣＲ８との交差反応性、
（ｂ）ＣＣＬ１／ＣＣＲ８相互作用を遮断する能力が弱いこと、
（ｃ）ＡＤＣＣを誘導する能力の増強
を有する抗ＣＣＲ８抗体。
２３．（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む、実施形態１９～２１のいずれか一項に記載の抗ＣＣＲ８抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１が、ＧＦＩＦＳＮＡＶＭＹ（配列番号１）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃２が、ＲＩＫＴＫＦＮＮＹＡＴＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号２）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃３が、ＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号３）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃１が、ＲＡＳＴＳＶＩＴＬＬＨ（配列番号４）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃２が、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃３が、ＱＱＳＷＮＤＰＹＴ（配列番号６）である、抗ＣＣＲ８抗体。
２４．配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、実施形態２０～２２のいずれか一項に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
２５．配列番号９として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態２０～２２のいずれか一項に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
２６．脱フコシル化されている、実施形態２０～２２のいずれか一項に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
２７．（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む、実施形態２０～２２のいずれか一項に記載の抗ＣＣＲ８抗体であって、
ＶＨ ＣＤＲ＃１が、ＧＦＩＦＳＮＡＶＭＹ（配列番号１）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃２が、ＲＩＫＴＫＦＮＮＹＡＴＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号２）であり、
ＶＨ ＣＤＲ＃３が、ＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号３）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃１が、ＲＡＳＴＳＶＩＴＬＬＨ（配列番号４）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃２が、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）であり、
ＶＬ ＣＤＲ＃３が、ＱＱＳＷＮＤＰＹＴ（配列番号６）であり、
前記抗体が、脱フコシル化されている、抗ＣＣＲ８抗体。
２８．実施形態６に記載の組成物及び抗ＰＤ－１抗体を含む組成物の組合せを、これを必要とする患者に投与するステップを含む、固形腫瘍を治療する方法。
２９．抗ＰＤ－１抗体が、ブディガリマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ及びドスタルリマブからなる群から選択される、実施形態２８に記載の方法。
３０．抗ＰＤ－１抗体が、ブディガリマブである、実施形態２９に記載の方法。
３１．抗ＰＤ－１抗体が、ペムブロリズマブである、実施形態２９に記載の方法。
３２．実施形態６に記載の組成物及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含む組成物の組合せを、これを必要とする患者に投与するステップを含む、固形腫瘍を治療する方法。
３３．抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブからなる群から選択される、実施形態３２に記載の方法。
３４．抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブである、実施形態３３に記載の方法。
３５．組成物中の抗ＣＣＲ８抗体の約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約１００％以上が、脱フコシル化されている、実施形態６に記載の組成物。
３６．脱フコシル化されている、実施形態２～４のいずれか一項に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
３７．実施形態３６に記載の複数の抗ＣＣＲ８抗体を含む、組成物。
３８．組成物中の抗ＣＣＲ８抗体の約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約１００％以上が、脱フコシル化されている、実施形態３７に記載の組成物。
３９．それぞれが、配列番号９として記載されるアミノ酸配列を含む２つの重鎖、及びそれぞれが、配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む２つの軽鎖を含む、抗ＣＣＲ８抗体であって、脱フコシル化されている、抗ＣＣＲ８抗体。
４０．実施形態３９に記載の複数の抗ＣＣＲ８抗体を含む、組成物。
４１．組成物中の抗ＣＣＲ８抗体の約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上又は約１００％以上が、脱フコシル化されている、実施形態４０に記載の組成物。

Claims (16)

  1. （ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含む、抗ＣＣＲ８抗体であって、
    ＶＨ ＣＤＲ＃１が、ＧＦＩＦＳＮＡＶＭＹ（配列番号１）であり、
    ＶＨ ＣＤＲ＃２が、ＲＩＫＴＫＦＮＮＹＡＴＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号２）であり、
    ＶＨ ＣＤＲ＃３が、ＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号３）であり、
    ＶＬ ＣＤＲ＃１が、ＲＡＳＴＳＶＩＴＬＬＨ（配列番号４）であり、
    ＶＬ ＣＤＲ＃２が、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）であり、
    ＶＬ ＣＤＲ＃３が、ＱＱＳＷＮＤＰＹＴ（配列番号６）である、抗ＣＣＲ８抗体。
  2. 配列番号７として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号８として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
  3. 配列番号９として記載されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１０として記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
  4. 脱フコシル化されている、請求項３に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
  5. 請求項１に記載の複数の抗ＣＣＲ８抗体を含む、組成物。
  6. 組成物中の抗ＣＣＲ８抗体の８０％超が、脱フコシル化されている、請求項５に記載の組成物。
  7. ＩｇＧである、請求項１に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
  8. Ｆｃ部分を含むヒト重鎖定常領域を含み、前記Ｆｃ部分が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はＩｇＭアイソタイプである、請求項７に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
  9. カッパ軽鎖定常領域を含む、請求項８に記載の抗ＣＣＲ８抗体。
  10. 請求項４に記載の抗体を、これを必要とする患者に投与するステップを含む、固形腫瘍を治療する方法。
  11. 抗ＣＣＲ８抗体をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドであって、前記抗体が、（ｉ）３つのＣＤＲを含むＶＨ鎖及び（ｉｉ）３つのＣＤＲを含むＶＬ鎖を含み、
    ＶＨ ＣＤＲ＃１が、ＧＦＩＦＳＮＡＶＭＹ（配列番号１）であり、
    ＶＨ ＣＤＲ＃２が、ＲＩＫＴＫＦＮＮＹＡＴＹＹＡＤＡＶＫＧ（配列番号２）であり、
    ＶＨ ＣＤＲ＃３が、ＧＤＲＮＫＰＦＡＹ（配列番号３）であり、
    ＶＬ ＣＤＲ＃１が、ＲＡＳＴＳＶＩＴＬＬＨ（配列番号４）であり、
    ＶＬ ＣＤＲ＃２が、ＧＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）であり、
    ＶＬ ＣＤＲ＃３が、ＱＱＳＷＮＤＰＹＴ（配列番号６）である、ポリヌクレオチド。
  12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  13. 請求項１２に記載のベクターをトランスフェクトした、真核宿主細胞。
  14. 哺乳動物宿主細胞である、請求項１３に記載の真核宿主細胞。
  15. （ａ）請求項１４に記載の真核宿主細胞を培養するステップ及び（ｂ）抗ＣＣＲ８抗体を回収するステップを含む、抗ＣＣＲ８抗体を産生する方法。
  16. 請求項５に記載の組成物を、これを必要とする患者に投与するステップを含む、固形腫瘍を治療する方法。
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