CN104673623A - 血液样品收集装置 - Google Patents
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Abstract
血液样品收集装置，包括采集管，其管口处设有密封胶塞，胶塞的外面设有保护帽，采集管内填充有添加剂，所述添加剂由血液抗凝剂、血细胞核酸稳定剂、血浆核酸稳定剂、pH缓冲液组成。所说血液抗凝剂为草酸盐、肝素盐、枸橼酸盐中的一种或多种；所说pH缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中的一种；所说血细胞核酸稳定剂为尿囊素、5,5-二甲基海因、噁唑烷中的一种或多种；所述血浆核酸稳定剂为N-乙酸甲亚胺、N-(3-乙酸-戊胺)甲亚胺中的一种或多种。该血液样品收集装置同时含有血细胞核酸稳定剂和血浆核酸稳定剂，不含游离醛类物质，因此可常温、长期保存血样，同时可稳定血液样品中游离核酸水平及维持游离核酸的完整性。
Description
技术领域
本发明涉及一种血液样品收集装置，尤其涉及一种用于稳定血液样品中游离核酸水平及保持游离核酸完整性的血液样品收集装置。
背景技术
早在1948年，血液中游离的脱氧核糖核酸(简称为cfDNA)就被发现了，但其在临床医学的应用还未超过二十年。具体地的说，cfDNA被证明存在于系统性红斑狼疮患者的血清中。
现在对于cfDNA的研究有两大热点:
一个是利用癌症患者中的cfDNA明显升高来诊断癌症,cfDNA水平在癌症患者的血清中明显增高。据调查，类风湿关节炎、大肠癌、乳腺癌、胰腺癌、头颈部癌症患者的cfDNA浓度都明显上升。该cfDNA提取自癌症患者的血浆或血清，呈现出典型特征的肿瘤DNA，并且可以充当非侵入性生物标记用于癌症检测和管理；
另一个是胎儿cfDNA在产前诊断中的应用,临床应用涉及了胎儿cfDNA分析，包括了性别判定，单基因紊乱，妊娠相关疾病和非整倍体检测。
健康人的cfDNA浓度水平极低，平均循环浓度是30ng/ml，cfDNA通常来说是双链的，大约为18～21个碱基大小。其浓度极易受到血细胞裂解、核酸酶降解等因素影响而波动。
影响cfDNA的精确检测的主要因素如下：
(1)血细胞自然裂解释放出其基因组DNA，干扰cfDNA的检测；
(2)样品在抽取、加工过程中受机械损伤而导致细胞裂解，这导致cfDNA浓度水平增高；
(3)血浆中DNA酶的存在，导致cfDNA的降解，因此cfDNA浓度水平降低。
为减少细胞DNA的对血浆cfDNA的污染，减少DNA酶的降解作用，现阶段主要采用如下技术：
(1)选用带有特殊添加剂的不同类型的血液样品收集装置，如带抗凝血剂(EDTA、肝素、柠檬酸盐)的采血管，以防止全血细胞凝血，减少来自白细胞的DNA释放；
(2)改善样品存储条件，如4℃低温保存，抑制DNA酶的活性；
(3)优化离心分离条件，以减少分离血浆过程中，血细胞裂解释放DNA。
通过以上技术处理，对cfDNA的精确检测可得一定的改善。但是由于运输及离心分离过程产生机械振动等因素，血细胞裂解仍然存在；在4℃低低温情况下，DNA酶仍然具有一定的活性，血液中的核酸水平仍然存在不稳定因素，长期保存的条件下，真正的游离核酸仍然有大量损失，不利于游离核酸的精确检测。同时现有条件下，血液采集、运输和存储都必须在低温下进行，但是 低温给样品的采集、运输和存储带来了许多不便与困难，同时经济成本较高。
李勤在其硕士学位论文《体外存放和甲醛处理对孕妇血浆中胎儿DNA水平的影响的实验研究》中介绍了一种甲醛处理血样以减少细胞裂解、抑制DNA酶活性，以延长血液样品体外存储时间的方法。然而由于甲醛具有导致核酸断裂、核酸-蛋白质交联、核酸交联等作用，甲醛破坏核酸结构的完整性，不利于对cfDNA的精确检测分析。
中国发明专利“常温保存核酸的采集容器”(申请公布号CN103789202A；申请公布日2014.05.14)，其公开了如下的技术方案，“一种常温保存核酸的采集容器，包括采集管和胶塞，胶塞密封在采集管的管口上，胶塞的外面设有保护帽，采集管内设置有添加剂，所述添加剂由血液抗凝剂及其缓冲液、防腐固定剂、核酸酶抑制剂、代谢抑制剂及细胞膜稳定剂混合而成。所述采集管是用玻璃或塑料制作；玻璃为硅硼玻璃或石英玻璃；塑料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)或聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)。所述胶塞是用橡胶制作，橡胶为丁基橡胶。所述胶塞可以用铝塑膜替代”，该添加剂含有甲醛。
因此有必要提供一种可以稳定血液样品中游离核酸水平及保护游离核酸的完整性的血液样品收集装置，以消除甲醛对核酸的结构完整性的不利影响，最小化细胞核酸物质的影响，最小化运输、存储、加工处理条件对游离核酸水平影响，比如机械震荡导致的DNA链的损伤。
发明内容
本发明目的是为了克服现有血液样品收集装置无法稳定血液样品中游离核酸水平及保护游离核酸的完整性的缺陷，发明一种血液样品收集装置，该装置可在常温下长期保存(7～14天)血液样品，稳定血液样品中游离核酸水平，保护游离核酸的完整性，有利于对cfDNA的精确检测分析。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
血液样品收集装置，包括一容器，容器内设有添加剂，所述添加剂由血液抗凝剂、血细胞核酸稳定剂、血浆核酸稳定剂、pH缓冲液组成。
具体的，上述血液样品收集装置的容器有两种实现方案。
方案一，容器包括采集管，其管口处设有密封胶塞，胶塞的外面设有保护帽。
方案二，根据权利要求1所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说容器包括采集管，其管口与密封胶塞可拆的相连，胶塞的外面设有保护帽，保护帽上固定设有可截留细胞并允许血浆通过的微孔滤膜制成的膜囊。
较佳的，所说的采集管由玻璃或塑料制成。
较佳的，所说的玻璃为硅硼玻璃或石英玻璃；塑料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯或聚萘二甲酸乙二醇酯中的一种。
较佳的，所说胶塞由橡胶制成。更进一步的，所说的橡胶为丁基橡胶。
所说胶塞可由铝塑膜替代。
较佳的，所说血液抗凝剂选自草酸盐、肝素盐、枸橼酸盐中的一种或多种；
所说pH缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中的一种；
所说血细胞核酸稳定剂选自尿囊素、5,5-二甲基海因、噁唑烷中的一种或多种；
所述血浆核酸稳定剂选自N-乙酸甲亚胺、N-(3-乙酸-戊胺)的一种或多种；
其中，血液抗凝剂按1.0～4.0mg/ml血液的剂量添加；血细胞核酸稳定剂按0.001g～3.5g/ml血液的剂量添加；血细胞核酸稳定剂与血浆核酸稳定剂的摩尔比为1:0.01～1:5；pH缓冲液按液体血液样品的1～5％体积百分数添加。
优选技术方案为：血液抗凝剂，选用乙二胺四乙酸盐，按2.2mg/ml血液样品的剂量添加；血细胞核酸稳定剂与血浆核酸稳定剂的摩尔比为1:1；pH缓冲液的添加量为血液样品体积分数2％。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所述血液样品收集装置中含有血细胞核酸稳定剂与血浆核酸稳定剂，不含有破坏核酸完整性的游离醛类物质，因此可以常温、长期保存(7～14天)，同时可以稳定血液样品中游离核酸水平及维 持游离核酸的完整性。
该血液样品收集装置可用于在需要进行精确游离核酸检测的血液样本的采集、储存和运输、加工处理；保证血液样品中游离核酸水平、游离核酸的完整性，以保证游离核酸检测的准确性；降低了样本采集后的储存条件，延长了样本的保存时间，从而节约了游离核酸检测经济成本，利于游离核酸检测技术的推广与普及；降低了血细胞因机械损伤而释出核酸的几率。
附图说明
图1为本发明所述血液样品收集装置的实施例1或2的结构示意图；
图2为本发明实施例3的结构分解图；
其中：1、保护帽；2、胶塞；3、采集管；4、添加剂；5、膜囊。
具体实施方式
下面，结合附图1、附图2以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
实施例1
如图1所示，所述血液样品收集装置，包括采集管3和胶塞2，胶塞2密封在采集管1的管口上，胶塞2的外面设有保护帽3，采集管1内设置有添加剂4，所述添加剂4由血液抗凝剂、血细胞核酸稳定剂、血浆核酸稳定剂组成混合而成。本实施例采用了中国发明专 利“常温保存核酸的采集容器”(申请公布号CN 103789202A；申请公布日2014.05.14)公开的装置，但采用的添加剂4是不同的。
所述采集管3是用玻璃或塑料制作。较佳的，玻璃为硅硼玻璃或石英玻璃；塑料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)或聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)。
所述胶塞2是用橡胶制作。较佳的，橡胶为丁基橡胶。作为一种替代方式，所述胶塞2可以用铝塑膜替代。
配制处理10ml血液样品的添加剂4时，首先按添加剂4的体积300微升计算，根据优选血液抗凝剂EDTA-K3的浓度2.2mg/ml血液，计算所需配置添加剂4中血液抗凝剂的浓度为73mg/ml，假如配置100ml添加剂4，则需要加入EDTA-K37.3g。其他添加剂4按如下标准计算，血细胞核酸稳定剂5,5-二甲基海因按浓度为0.005g/ml血液；血细胞核酸稳定剂5,5-二甲基海因与血浆核酸稳定剂N-乙酸甲亚胺的摩尔比为1:1。
综上，若配置100ml该添加剂4，其配方如下：
| EDTA-K3 | 7.3g |
| 5,5-二甲基海因 | 16.7g |
| N-乙酸甲亚胺 | 11.4g |
最后将上述混合物定容至100ml pH7.2三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液,最终获得添加剂4成品。所以添加剂4中含有上述缓冲液的成分。
对上述添加剂4成品进行C13谱检测后，可见添加剂4中不含破 坏核酸的完整性的游离醛类物质；
制作真空采集管时，按采血量计算添加剂4的添加量，然后抽真空即可。
用本实施例所述的血液样品收集装置(如图1所示)采集受试者血液各5ml并在常温下放置，然后于第0天、第1天、第3天和第7天，进行血浆DNA浓度测试，发现血浆DNA浓度，在第0天、第1天、3天与第7天，第14天无明显变化。
进行QPCR测试血浆核酸变化，进行QPCR测试血浆核酸变化，结果显示CT值变化不明显，测试证明放置1天、3天、7天和第14天的结果，与抽血后即刻测试的结果没有显著性差异。所以证明，加入此种添加剂4可维持血液样品中游离核酸水平及游离核酸的完整性，以保证游离核酸检测的准确性；降低了样本采集后的储存条件，延长了样本的保存时间。
实施例1的实验证据与实施例2的实验证据将一起展示。
实施例2
如图1所示，所述血液样品收集装置，包括采集管3和胶塞2，胶塞2密封在采集管1的管口上，胶塞2的外面设有保护帽1，采集管1内设置有添加剂4，所述添加剂4由血液抗凝剂、血细胞核酸稳定剂、血浆核酸稳定剂组成混合而成。本实施例采用了中国发明专利“常温保存核酸的采集容器”(申请公布号CN 103789202A；申请公布日2014.05.14)公开的装置，但采用的添加剂4是不同的。
所说的添加剂4优选为，血液抗凝剂EDTA-Na2.2H2O，血细胞核 酸稳定剂N-(2,5-二氧代-4-咪唑啉啶基)尿素，血浆核酸稳定剂N-(3-乙酸-戊胺)甲亚胺。
配制处理10ml血液样品的添加剂4时，首先按添加剂4的体积300微升计算。优选的，血液抗凝剂EDTA-Na2.2H2O的浓度2.2mg/ml血液，计算出所需配置添加剂4中血液抗凝剂的浓度为73mg/ml，假如配置100ml添加剂4，则需要加入EDTA-Na2.2H2O7.3g。其他添加剂4按如下标准计算，血细胞核酸稳定剂N-(2,5-二氧代-4-咪唑啉啶基)尿素按浓度为0.005g/ml血液；血细胞核酸稳定剂N-(2,5-二氧代-4-咪唑啉啶基)尿素与血浆核酸稳定剂N-(3-乙酸-戊胺)甲亚胺的摩尔比为1:1。
综上，若配置100ml该添加剂4，其配方如下：
最后将上述混合物定容至100ml pH7.2三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液,最终获得添加剂4成品。所以添加剂4中含有上述缓冲液的成分。
对上述添加剂4成品进行C13谱检测后，可见添加剂4中不含破坏核酸的完整性的游离醛类物质；
制作真空采集管时，按采血量计算添加剂4的添加量，然后抽真空即可。
使用采用了上述添加剂4的采血管采集受试者血液各5ml并常温放置，然后于第0天、第1天、第3天、第7天和第14天，进行血浆DNA浓度测试，发现血浆DNA浓度，在第0天、第1天、第3天、第7天和第14天，无明显变化。
进行QPCR测试血浆核酸变化，结果显示CT值变化不明显。测试证明，放置1天、3天、7天和14天的结果与抽血后即刻测试的结果没有显著性差异。所以证明，加入此种添加剂4可保证血液样品中游离核酸水平及游离核酸的完整性，以保证游离核酸检测的准确性；降低了样本采集后的储存条件，延长了样本的保存时间。
下面提供本发明实施例1和实施例2的实验测试结果。
表1放置不同时间的血浆DNA浓度测试结果，如下：
| 血浆DNA浓度 | 实施例(ng/μl) | 实施例(ng/μl) |
| 第0天 | 2.5 | 2.1 |
| 第1天 | 2.4 | 2.4 |
| 第3天 | 2.2 | 2.4 |
| 第7天 | 2.3 | 2.2 |
| 第14天 | 2.1 | 2.0 |
表2放置不同时间的QPCR方法测试血浆核酸变化的CT值结果，如下：
| 放置天数 | 实施例1的CT值 | 实施例2的CT值 |
| 第0天 | 35.8834 | 34.8590 |
| 第1天 | 35.5932 | 35.0511 |
[0071]
| 第3天 | 34.7538 | 34.8227 |
| 第7天 | 34.9931 | 34.2875 |
| 第14天 | 36.2931 | 36.3875 |
本发明经测试，本发明血液样品收集装置中含有血细胞核酸稳定剂与血浆核酸稳定剂，不含破坏核酸完整性的游离醛类物质，因此可以常温、长期保存(14天)，同时可以稳定、保护血液样品中游离核酸水平、及游离核酸的完整性。该添加剂4与血液相互作用也并不产生甲醛。
实施例3
如图2所示，所述血液样品收集装置，所说容器包括采集管3，其管口处可拆的连接有密封胶塞2，胶塞2的外面设有保护帽1，保护帽上1固定设有可截留细胞并允许血浆通过的微孔滤膜制成的膜囊5。膜囊5开口一端与保护帽1固定相连，该膜囊5的位置高于采集血液样品后的液面高度。该膜囊5为可截留细胞的微孔滤膜。采集管1底部填充有添加剂4，所述添加剂4由血液抗凝剂、血细胞核酸稳定剂、血浆核酸稳定剂组成混合而成。
对于膜囊5的大小，较佳的，膜囊5比胶塞低2～3cm即可，确保膜囊5不容易被注射针刺破，膜囊5又不长期碰到试管里的血液样品。在抽血后，图2所示的液位会升高。
使用时，预先将多孔膜浸渍在本添加剂4溶液中，使微孔滤膜含有所配添加剂。当血液流入到膜囊5中，血浆透过膜囊5，血细胞被膜囊5截留。膜囊5的设计使得血浆与血细胞在一定程度上分离。检 测血浆内成分时，移除保护帽时膜囊5被一并移除，检测余留的血浆成分即可，非常方便。
微孔过滤膜经过如上的添加剂4处理，保证过滤过程中血细胞不破裂，保持血细胞的稳定。
添加剂4可采用实施例1或2的优选方案。本实施例的技术方案针对血液样品收集装置进行了改进，使用效果更加优异。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.血液样品收集装置，包括一容器，容器内设有添加剂，其特征在于，所述添加剂由血液抗凝剂、血细胞核酸稳定剂、血浆核酸稳定剂、pH缓冲液组成。
2.根据权利要求1所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说容器包括采集管，其管口处设有密封胶塞，胶塞的外面设有保护帽。
3.根据权利要求1所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说容器包括采集管，其管口与密封胶塞可拆的相连，胶塞的外面设有保护帽，保护帽上固定设有可截留细胞并允许血浆通过的微孔滤膜制成的膜囊。
4.根据权利要求2所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说的采集管由玻璃或塑料制成。
5.根据权利要求4所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说的玻璃为硅硼玻璃或石英玻璃；塑料为聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯或聚萘二甲酸乙二醇酯中的一种。
6.根据权利要求2所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说胶塞由橡胶制成。
7.根据权利要求6所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说的橡胶为丁基橡胶。
8.根据权利要求2所述的血液样品收集装置，其特征在于，所说胶塞由铝塑膜替代。
9.根据权利要求1所述的血液样品收集装置，其特征在于，
所说血液抗凝剂选自草酸盐、肝素盐、枸橼酸盐中的一种或多种；
所说pH缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中的一种；
所说血细胞核酸稳定剂选自尿囊素、5,5-二甲基海因、噁唑烷中的一种或多种；
所述血浆核酸稳定剂选自N-乙酸甲亚胺、N-(3-乙酸-戊胺)中的一种或多种；
其中，血液抗凝剂按1.0～4.0mg/ml血液的剂量添加；血细胞核酸稳定剂按0.001g～3.5g/ml血液的剂量添加；血细胞核酸稳定剂与血浆核酸稳定剂的摩尔比为1:0.01～1:5；pH缓冲液按液体血液样品的1～5％体积百分数添加。
10.根据权利要求9所述的血液样品收集装置，其特征在于，
血液抗凝剂，选用乙二胺四乙酸盐，按2.2mg/ml血液样品的剂量添加；血细胞核酸稳定剂与血浆核酸稳定剂的摩尔比为1:1；pH缓冲液的添加量为血液样品体积分数2％。
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