CN113686996B - 一种hplc测定血浆中腐植酸钠检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血浆中腐植酸钠的检测方法，其检测过程所需器具材料如下：Waters e2695高效液相色谱仪，电子天平，量瓶，稀释剂，流动相，腐植酸钠水溶液，乙腈；其检测步骤为：S1、取样，S2、血浆制备，S3、建立色谱条件，S4、色谱实验，S5、专属实验。本发明通过改变流动相和色谱条件进行高效液相色谱分析实验，建立了血浆中腐植酸钠的检测方法。该方法操作简便，结果准确，可用于血浆中腐植酸钠的测定，对于实现腐植酸钠外用制剂在动物实验中、安全性保证具有极其重要的意义。

Description

一种HPLC测定血浆中腐植酸钠检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地说，尤其涉及一种腐植酸钠。同时，本发明还涉及一种腐植酸钠外用制剂动物实验方法。
背景技术
腐植酸钠是以风化煤、泥炭和褐煤为原料经特殊工艺加工制成的一种具有多种功能的大分子有机弱酸钠盐，其结构比较复杂。腐植酸钠具有胶体特性和吸附能力，形成良好的离子交换和催化作用，有效改善胃肠功能，促进胃液分泌;刺激胃肠道有益菌生长，抑制腐败菌繁殖。腐植酸钠中的羟基具有沉淀蛋白质的作用，从而达到止血的效果;高分子化合物吸附在沉积的血小板之间，增强血液凝胶的强度，属于复合止血;羰基参与氧化还原过程，使新陈代谢旺盛，促进细胞增殖，加速生长，使大部分坏死组织和坏死骨骼脱落，萎缩或愈合，从而达到去坏死组织生肌的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HPLC测定血浆中腐植酸钠检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种HPLC测定血浆中腐植酸钠检测方法，其检测过程所需器具材料如下：Waterse2695高效液相色谱仪，电子天平，量瓶，稀释剂，流动相，腐植酸钠水溶液，乙腈。
优选的，所述流动相是由乙腈-含0.1％乙酸的水溶液 以90∶10的比例混合制成。
优选的，所述稀释剂为乙腈或乙腈水溶液。
优选的，该检测方法包括如下步骤：
S1、取样；
S2、建立色谱条件：色谱参数包括Shim-pack C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：40 ℃，检测波长：292 nm，流速：1.0mL/min，流动相：乙腈-含0.1％乙酸血浆用10%乙腈水溶液稀释5倍，备用的水溶液 以90∶10，进样量：20μL；
S3、色谱实验：按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，结果腐植酸钠出峰时间为20min-25min之间；
S4、专属实验：用电子天平精密称取腐植酸钠17mg，置于50 mL量瓶中，加水30mL，超声 30 min，冷却至室温，在上述色谱条件下进行测定，记录色谱图，分析腐植酸钠出峰时间。
优选的，S2中流动相的流速为0.5-1.5ml/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过改变流动相和色谱条件进行高效液相色谱分析实验，建立了血浆中腐植酸钠的检测方法。该方法操作简便，结果准确，可用于腐植酸钠外用制剂在动物实验中是否进入血液进行判断，对于实现对腐植酸钠外用制剂安全性保证具有极其重要的意义。
附图说明
了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图1为采用本发明方法检测空白溶液的液相色谱图；
附图2为采用本发明方法检测对照品溶液的定位色谱图；
附图3为制剂组血浆检测与腐植酸钠定位比较的色谱图；
附图4为原料组血浆检测与腐植酸钠定位比较的色谱图；
附图5腐植酸钠的线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种血浆中腐植酸钠检测方法，其检测过程所需器具材料如下：Waters e2695高效液相色谱仪，电子天平，量瓶，稀释剂，流动相，腐植酸钠，乙腈。
具体的，所述流动相是由乙腈、含0.1％乙酸的水溶液以90∶10的比例混合制成。
具体的，所述稀释剂为乙腈或乙腈水溶液。
具体的，该检测方法包括如下步骤：
S1、取样：血浆用10%乙腈水溶液稀释5倍，备用；
S2、建立色谱条件：色谱参数包括Shim-pack C18柱色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：40 ℃，检测波长：292 nm，流速：1.0mL/min，流动相：乙腈-0.1％乙酸的水溶液(90∶10)，进样量：20μL；
S3、色谱实验：按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，结果腐植酸钠出峰时间为20min-25min之间；
S4、专属实验：
空白溶液：流动相
腐植酸钠对照品溶液：取腐植酸钠对照品约17mg，置50ml量瓶中，加水30ml，超声溶解，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
分别取上述溶液各20μL按含量方法进样分析，记录色谱图，试验结果见表1。
表1 系统适用性试验结果
Figure 908993DEST_PATH_IMAGE002
具体的，S2中流动相的流速为0.5-1.5ml/min。
本发明以乙腈-乙腈-0.1％乙酸的水溶液(90∶10)为流动相对腐植酸钠进行检测，用高效液相色谱法分析其出峰时间，可用于血浆中是否含有腐植酸钠的分析，该方法操作简单，专属性强，准确度高，在腐植酸钠外用制剂的动物实验中具有较强的实用性。
线性关系
线性储备液配制：称取腐植酸钠对照品约17mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加入水超声使溶解，然后用水定容，摇匀，即得（腐植酸钠浓度：约为250 µg/ml）。
线性溶液制备：按照表2，移取指定体积的腐植酸钠储备液至指定体积的容量瓶，用流动相定容，摇匀，得到各浓度的线性溶液。
表2 线性溶液
Figure 826133DEST_PATH_IMAGE004
分别精密量取20μl线性溶液按含量分析方法进样分析，计算峰面积与浓度的线性关系。
表3 含量的线性测定结果
Figure 668187DEST_PATH_IMAGE006
含量的线性关系图
Figure 63397DEST_PATH_IMAGE008
结果表明，在50%-150%浓度范围内，线性关系良好。
三、 准确度
对照品储备液配制：称精密取腐植酸钠对照品适量，置50ml容量瓶中，加入水超声使溶解，然后用水定容，摇匀，即得（腐植酸钠浓度：约为250 µg/ml）。
对照品溶液（2份）：精密移取对照品储备液5.0ml，置25ml容量瓶中，用稀释液定容，摇匀，即得（腐植酸钠浓度：约为50 µg/ml）。
含量测定中，腐植酸钠溶液中腐植酸钠的浓度约为50 µg/ml，准确度验证范围规定为80%，100%，120%三个级别。回收率溶液的制备如下：
取9个20ml容量瓶，编号为1~9#。
80%回收率溶液：称取腐植酸钠11.81mg、11.33mg、11.61mg,分别置100ml容量瓶中，加入少许水，超声使溶解，然后用水定容，摇匀，再取10ml置1~3#的20ml容量瓶中，按照含量分析方法中腐植酸钠溶液的制备方法进行处理，即得。
100%回收率溶液： 称取腐植酸钠14.35mg、14.17mg、13.90mg，分别置100ml容量瓶加入少许水，超声使溶解，然后用水定容，摇匀，再取10ml置4~6#的20ml容量瓶中，按照含量分析方法中腐植酸钠溶液的制备方法进行处理，即得。
120%回收率溶液： 称取腐植酸钠标准品16.69mg、17.31mg、16.88mg，分别置100ml容量瓶加入少许水，超声使溶解，然后用水定容，摇匀，再取10ml置7~9#的20ml容量瓶中，按照含量分析方法中腐植酸钠溶液的制备方法进行处理，即得。
对照品溶液及系统适应性溶液配制见含量分析方法。
回收率结果见表4。
表4 准确度结果
Figure 877769DEST_PATH_IMAGE010
3个不同等级浓度的回收率溶液的回收率均在98%~102%之间，结果表明，该方法准确度良好。
精密度
重复性
取腐植酸钠，按照含量分析方法制备6份腐植酸钠溶液。
按含量分析方法配制对照品溶液、系统适应性溶液。
按含量分析方法进样分析，记录色谱图与峰面积，按外标法计算腐植酸钠含量，计算RSD值。结果见表4。
表5 含量重复性试验
Figure 513281DEST_PATH_IMAGE011
中间精密度
同重复性的方法，由另一名实验人员同法操作，配制另外6份腐植酸钠溶液。结果见表5。
表6 中间精密度试验结果
Figure 780314DEST_PATH_IMAGE012
重复性的含量测定结果RSD为0.90%＜2.0%，与中间精密度含量检测结果共12组数据RSD为1.30%＜2.0%，表明该方法精密度良好。
溶液稳定性
取腐植酸钠，按照分析方法制备1份腐植酸钠溶液。
在0h，2h，4h，6h，8h，12h、24h后按含量分析方法进样分析，记录色谱图峰面积，计算上述峰面积的RSD，结果见表6。
表7含量溶液稳定性
Figure 979214DEST_PATH_IMAGE013
结果表明，含量测定项下腐植酸钠溶液在24小时内稳定，对照品溶液在24h内稳定。
过滤膜试验
取腐植酸钠，按照含量分析方法制备1份腐植酸钠溶液，用0.45um滤膜滤过，按表7收集滤液。
表8 滤液收集
Figure 648093DEST_PATH_IMAGE014
测定结果见表8
表9 含量过滤膜试验结果
Figure 703774DEST_PATH_IMAGE016
由上述数据可知弃去2ml后续滤液峰面积以及其余体积段续滤液的峰面积与弃去10ml后续滤液峰面积并无区别。
耐用性
更改表9中参数用于考察方法耐用性。
表10 耐用性参数选择
Figure 458103DEST_PATH_IMAGE018
耐用性结果见表10。
表11 含量耐用性考察结果总结
Figure 195115DEST_PATH_IMAGE020
含量分析方法在柱温、流速、pH、流动相比例微小变动情况下，腐植酸钠溶液的含量RSD为1.47%；该方法在耐用性良好。
八、检测限、定量限
取腐植酸钠的溶液适量逐级稀释，配成一系列浓度的溶液，在含量分析方法下进样分析，当稀释至各组分峰S/N≈3时为检测限（以最小的主峰计）；稀释至腐植酸钠峰S/N≈10时为定量限，试验结果见表11。
表12检测限和定量限。
Figure 531549DEST_PATH_IMAGE022
九、血浆制备
选择清洁级SD大鼠，适应性喂养1天，经水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg）,5%硫化钠脱毛，用75%酒精棉球消毒后，用打孔器制作成直径1.0cm，深约3mm的创面，形成机械损伤。所有大鼠单笼喂养，自由充分饮水。
将SD大鼠分为空白组、原料组和制剂组，每组三只；原料组创伤部位涂抹腐植酸钠水溶液（100%）10ml，给药组在创伤部位涂抹腐植酸钠凝胶（不用包扎）。涂药后于1h、3h、6h、12h静脉取血1ml，取完用脱脂棉压迫止血，血浆在4℃，10000r/min条件下离心，去上清液血浆喂样品，样品放入冻存管中，并进行标记、检测。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种血浆中腐植酸钠检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：S1、取样：血浆用10％乙腈水溶液稀释5倍；S2、建立色谱条件：色谱参数包括C18色谱柱：250mm×4.6mm，5μm；柱温：40℃；检测波长：292nm；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈：含0.1％乙酸的水溶液，以90∶10的比例混合而成；进样量：20μL；S3、色谱实验：按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，结果：腐植酸钠出峰时间为20min-25min之间；S4、专属实验：用电子天平精密称取腐植酸钠17mg，置于50mL量瓶中，加水30mL，超声30min，冷却至室温。
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