CN111208214A

CN111208214A - 液相法检测药物制剂中吐温含量的方法

Info

Publication number: CN111208214A
Application number: CN201811387333.9A
Authority: CN
Inventors: 马永; 颜莎; 赵佳
Original assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Current assignee: ZONHON BIOPHARMA INSTITUTE Inc
Priority date: 2018-11-21
Filing date: 2018-11-21
Publication date: 2020-05-29
Anticipated expiration: 2038-11-21
Also published as: CN111208214B

Abstract

本发明涉及一种新的准确、快速、可靠和高灵敏度的检测药物制剂中吐温含量的液相检测方法，采用体积排阻色谱柱，示差折光为检测器。该方法适用性高，在宽泛的色谱条件下，本发明的SEC‑HPLC‑RI液相法均可以良好的分离吐温，且适用于各类样品的检测，为吐温限度检测提供了一种适用性好、色谱条件简单易得、灵敏度高的液相方法。

Description

液相法检测药物制剂中吐温含量的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种吐温含量的液相检测方法。

背景技术

吐温又名聚山梨酯，是一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯，有异臭、微苦。在药物制剂中通常作为辅料添加，以改善有效成分的溶解性；同是还可以抑制大分子蛋白药物的聚合，提高稳定性。随着近年来国内外研究的深入和一系列不良事件的披露，如多西他赛注射液和鱼腥草注射液事件，发现山梨酯类可能会引起过敏等不良反应，它能诱导细胞产生脱颗粒作用，引起过敏活性物质的释放，其本身的不饱和脂肪酸也十分容易氧化降解而产生多种有毒有害物质。因此，为确保药物使用安全，检测其中吐温含量显得尤为重要。

目前现有的聚山梨酯类检测方法主要有：分光光度法、水解法、液相色谱-质谱联用法、液相色谱-蒸发光散射法，其中分光光度法和水解法操作繁琐、灵敏度差，而且大部分方法均用于聚山梨酯80的检测，曲佳等人报道中，采用分子排阻-蒸发光散射(SEC-ELSD)法测定中药注射液中吐温80的含量，其检测限为10μg，灵敏度较低，难以满足含量较低的残留检测需求。朱文漓等人公开了反相高效液相色谱法联用蒸发光散射检测器测定康柏西普眼用注射液中辅料吐温20的分析方法，但对反相柱要求较高，对样品有较多的限制，如检测大分子蛋白药物，需使用孔径较大的反相柱，否则容易堵塞柱子。

综上所述，建立一种准确、快速、可靠和适用性广的检测药物制剂中吐温含量的液相方法显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明目的在于提供了一种新的准确、快速、可靠和高灵敏度的检测药物制剂中吐温含量的液相检测方法。

本发明提供的液相法检测吐温含量的方法，采用体积排阻色谱柱，示差折光检测器。

所述体积排阻色谱柱的孔径选择与蛋白药物及吐温的分子量有关，以能够较好将蛋白药物和吐温分离为准。本领域技术人员根据蛋白药物及吐温的分子量，通过常规技术手段可以筛选出适合的色谱柱孔径。

所述吐温是一系列聚氧乙烯去水山梨醇的部分脂肪酸酯，包括但不限于吐温20、吐温40、吐温60、吐温80等。

作为优选，以磷酸盐缓冲液为流动相。

作为优选，流动相pH值为6.0-8.0。

作为优选，柱温及流通池温度为30℃-40℃。

本发明液相法检测吐温含量方法，具体描述如下：采用体积排阻色谱柱(SEC)，以磷酸盐缓冲液为流动相，示差折光作为检测器；配制吐温的标准品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，绘制吐温的标准曲线；供试品按照相同的检测条件进行检测，根据标准曲线计算供试品中吐温的含量。

本发明在SEC的分离原理和示差折光检测器的基础上(即SEC-HPLC-RI)，优化了吐温含量检测方法的色谱分离条件，发现该方法适用性高。在多种磷酸盐缓冲液的流动相条件下，在不同孔径的SEC色谱柱下，以及不同温度条件下等较宽泛的色谱条件下，SEC-HPLC-RI液相法均可以良好的分离吐温，且适用于各类样品的检测。为吐温含量检测提供了一种适用性好、色谱条件简单易得、灵敏度高的液相方法。

附图说明

图1实施例1不同pH值的磷酸缓冲液流动相下吐温-20的出峰情况

图2实施例1不同盐添加剂的流动相下吐温-20的出峰情况

图3实施例1不同柱温&流通池温度下吐温-20的出峰情况

图4实施例1不同孔径的SEC色谱柱下吐温-20的出峰情况

图5实施例2空白缓冲液、标准品溶液及样品的色谱图

图6实施例2梯度标准品溶液色谱图

图7实施例2标准曲线图

图8实施例2平行制备6份吐温-200标准品溶液的色谱图

图9实施例3吐温-80梯度标准品色谱图

图10实施例3标准曲线图

具体实施方式

实施例1不同色谱条件下SEC-HPLC-RI法检测吐温含量的适用性

1.不同流动相pH值

仪器：品牌型号：Waters AcquityUPLC H-class；bioQuaternary solventManager；BioSample Manager-FTN；RI Detector；Empower 3.0数据处理软件

色谱柱：Waters BEH 125A，1.7μm，4.6×300mm

流动相：①20mM pH6.0磷酸缓冲液；②20mM pH7.0磷酸缓冲液；③20mM pH8.0磷酸缓冲液；

流速0.2mL/min，柱温30℃，流通池温度30℃，进样量10μL，采集时间20min。

结果如图1所示，在pH6.0、7.0、8.0三种流动相条件下，吐温-20的峰形均较好。

2.不同盐添加剂

色谱柱：Waters BEH 125A，1.7μm，4.6×300mm

流动相：①0.1M Na₂SO₄的磷酸缓冲液(20mM pH7.0)；②0.1M NaCl的磷酸缓冲液(20mM pH7.0)；

结果如图2所示，分别在含Na₂SO₄和NaCl的流动相条件下，吐温-20的峰形均较好。

3.不同柱温&流通池温度

色谱柱：Waters BEH 125A，1.7μm，4.6×300mm

流动相：20mM pH7.0磷酸缓冲液；

流速0.2mL/min，进样量10μL，采集时间20min；

柱温&流通池温度：30℃、35℃、40℃。

结果如图3所示，在不同柱温&流通池温度条件下，吐温-20的峰形均较好。

4.不同孔径的SEC色谱柱

色谱柱：①Waters BEH 125A，1.7μm，4.6×300mm；②Waters BEH 200A，1.7μm，4.6×300mm；③Waters BEH 450A，1.7μm，7.8×300mm；

流动相：20mM pH7.0磷酸缓冲液；

结果如图4所示，不同孔径的SEC色谱柱条件下，其中在125A和200A孔径的色谱柱下，吐温-20的峰形均较好；但在450A孔径下，吐温-20出峰靠近溶剂峰，且峰形拖尾比较严重。色谱柱的孔径选择与蛋白药物及吐温-20的分子量有关，以能够较好将蛋白药物和吐温-20分离为准，200A孔径的色谱柱可以满足一般分子量的蛋白药物的检测。

实施例2方法验证

1.相关溶液的配制

1.1流动相的配制

含0.1M Na₂SO₄的磷酸缓冲液(20mM pH7.0)：用量筒分别量取61.0ml的0.1M磷酸氢二钠溶液(称取28.29g无水磷酸氢二钠，溶解并定容至1L即得)和39.0ml磷酸二氢钠溶液(称取24.0g无水磷酸二氢钠溶液，溶解并定容至1L即得)，均倒入1L的蓝口瓶中，并用超纯水润洗量筒2～3次，再称取14.2g Na₂SO₄，加适量超纯水溶解，采用5M NaOH或50％磷酸溶液调节pH值至7.0，过滤并超声脱气10min，待用。

1.2缓冲液：20mM pH7.0磷酸缓冲液

用量筒分别量取61.0ml的0.2M磷酸氢二钠溶液和39.0ml磷酸二氢钠溶液，均倒入1L的蓝口瓶中，并用超纯水润洗量筒2～3次，采用5M NaOH或50％磷酸溶液调节pH值至7.0，过滤并超声脱气10min，待用。

1.3吐温-20标准品溶液

精密移取10.0ml的吐温-20，加入适量超纯水溶解，并定容至100ml，得到10％的吐温-20标准品溶液，再用超纯水稀释得到0.3％、1％、2％、4％、6％、8％的梯度标准品溶液。

2.仪器及参数

2.1 UPLC(含示差折光器)

品牌：Waters，型号：H-Class；

2.2色谱柱

品牌：Waters，型号：BEH SEC125A，1.7μm，4.6×300mm；

2.3色谱条件

以含0.2M Na₂SO₄的磷酸缓冲液(20mM pH7.0)为流动相，流速为0.2ml/min，示差折光作为检测器，柱温为30℃，流通池温度为30℃，上样量为10μl，采集时间为20min。

3.方法验证

3.1专属性

按上述液相条件，分别注入四种蛋白样品、空白缓冲液(20mM pH7.0磷酸缓冲液)和1％吐温-20标准品溶液，结果如图5所示：吐温-20在9.5min处出峰，空白和四种蛋白样品对吐温-20出峰无干扰；其中样品3可以看到有吐温-20残留，样品1、2、4在纯化工艺中去除吐温比较干净，未检测到残留。

3.2 LOD&LOQ

将吐温-20标准品溶液不断稀释后，注入液相色谱检测，结果如下：

表1 LOD&LOQ进样的液相分离相关参数结果

由上表可知，当吐温-20标准品稀释至0.2％进样检测时，其S/N值为3.76，故其LOD为0.02μg；当吐温-20标准品稀释至0.3％进样检测时，其S/N值为9.62，其上样量为10μl，故其LOQ为0.03μg，远低于文献报道，该方法灵敏度较高。

3.3线性

将上述制备的0.3％、1％、2％、4％、6％、8％、10％的梯度标准品溶液，依次注入液相色谱检测，结果如图6、表2、图7所示。

表2梯度标准品溶液的液相分离相关参数结果

如图7所示，回归方程为：y＝1231905.3506x-648398.3532，R²＝0.9946，大于0.990，吐温-20在0.3％～10％的范围内，呈线性关系。

3.4精密度

平行制备6份吐温-200标准品溶液，进样检测，结果如图8、表3所示：

表3精密度考察结果

从上表可知，重复进样6次，保留时间和峰面积的RSD值分别为0.03％和1.88％；均不超过2％，方法精密度良好。

3.5准确度

取适量样品1蛋白溶液(上述未检测到吐温残留的样品)分别与不同浓度的吐温-20溶液(4％、10％、18％)等体积混合，制成高中低三种不同浓度(2％、5％、9％)的样品溶液，每个浓度平行制备3份，依次注入液相色谱检测，结果如下：

表4准确度考察结果

由上表可得知，样品的回收率均在97.09～105.45％之内，回收率RSD值为2.51％，小于5％，该方法准确度高。

3.6稳定性

吐温-20样品的稳定性考察，将4％吐温-20标准品溶液分别在室温下和2～8℃条件下放置一段时间，取样依次注入液相色谱检测，结果如下：

表5稳定性考察结果

由上表可得知，吐温-20标准品溶液在室温下放置8h，回收率为101.35％，放置24h时，回收率下降至95.34％，故不宜在室温下放置超过8h；在2～8℃条件下，相对比较稳定，放置24h，回收率仍在100±10％范围内。

实施例3检测吐温-80

1.相关溶液的配制

1.1流动相的配制

20mM pH7.0磷酸缓冲液：用量筒分别量取61.0ml的0.1M磷酸氢二钠溶液(称取28.29g无水磷酸氢二钠，溶解并定容至1L即得)和39.0ml磷酸二氢钠溶液(称取24.0g无水磷酸二氢钠溶液，溶解并定容至1L即得)，均倒入1L的蓝口瓶中，并用超纯水润洗量筒2～3次，加适量超纯水溶解，采用5M NaOH或50％磷酸溶液调节pH值至7.0，过滤并超声脱气10min，待用。

1.2吐温-80标准品溶液

精密移取10.0ml的吐温-80，加入适量超纯水溶解，并定容至100ml，得到10％的吐温-80标准品溶液，再用超纯水稀释得到0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、2％的梯度标准品溶液。

2.仪器及参数

2.1 UPLC(含示差折光器)

品牌：Waters，型号：H-Class；

2.2色谱柱

品牌：Waters，型号：BEH SEC125A，1.7μm，4.6×300mm；

2.3色谱条件

以含20mM pH7.0磷酸缓冲液为流动相，流速为0.2ml/min，示差折光作为检测器，柱温为30℃，流通池温度为30℃，上样量为10μl，采集时间为20min。

3.实验结果

3.1 LOD&LOQ

将吐温-80标准品溶液不断稀释后，注入液相色谱检测，结果如下：

表7 LOD&LOQ进样的液相分离相关参数结果

由上表可知，当吐温-80标准品稀释至0.1％进样检测时，其S/N值为3.44，其上样量为10μl，故其LOD为0.01μg；当吐温-80标准品稀释至0.2％进样检测时，其S/N值为9.52，其上样量为10μl，故其LOQ为0.02μg，方法灵敏度较高。

3.2线性

将上述制备的0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、2％的梯度标准品溶液，依次注入液相色谱检测，结果见图9、图10、表6。

表6梯度标准品溶液的液相分离相关参数结果

如图10所示，回归方程为：y＝882455.6721x-123792.3934，R²＝0.9995，大于0.990，吐温-80在0.2％～2％的范围内，呈线性关系。

本发明的液相检测法可适用于各类型的吐温含量的检测，通用性好。

Claims

1.一种液相法检测吐温含量的方法，其特征在于采用体积排阻色谱柱，示差折光检测器。

2.权利要求1所述的液相法检测吐温含量的方法，其特征在于体积排阻色谱柱的孔径选择与蛋白药物及吐温的分子量有关，以能够分离蛋白药物和吐温为准。

3.权利要求1所述的液相法检测吐温含量的方法，其特征在于所述吐温是吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。

4.权利要求1所述的液相法检测吐温含量的方法，以磷酸盐缓冲液为流动相。

5.权利要求1所述的液相法检测吐温含量的方法，流动相pH值为6.0-8.0。

6.权利要求1所述的液相法检测吐温含量的方法，柱温及流通池温度为30℃-40℃。