CN102692470B - 测定含雄黄的药物中可溶性砷和价态砷的含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种测定含雄黄的药物中可溶性砷含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：(1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性砷；(2)可选的对步骤(1)提取得到的溶液进行净化；(3)ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性砷的含量。本发明还公开一种测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量的方法。本发明通过采用模拟体内的提取方式以及采用ICP-MS和HPLC-ICP-MS建立了雄黄药效和毒性主要成分的测定方法，该方法灵敏、准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用仿生提取-ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性砷含量的方法，本发明也涉及一种采用仿生提取-HPLC-ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性价态砷含量的方法。
背景技术
雄黄为我国常用的矿物类中药，临床应用的历史已有几千年，最早入药的记载为《神农本草经》，可内服外用且用途广泛。传统医学认为雄黄具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟等功能。自20世纪50年代以来，国内医者将含雄黄的复方制剂或单方用于治疗血液系统疾病、恶性淋巴系统疾病甚至实体瘤，取得了明显的治疗效果。据初步统计，国家标准中收载的含有雄黄的中成药约200个。说明雄黄对于中药来说，有着极其重要的作用。雄黄中所含大量砷具有有效性和有毒性双重作用，但由于其用法用量缺乏科学依据，含其制剂中缺乏相关质控方法，导致了用药的安全性隐患和国际化认可的阻碍。
1、雄黄所含的砷具有有效性和有毒性两重作用，安全性限量的缺乏影响其用药安全。它作为复方药物的组成部分，既是药物的有效成分，也是有毒成分。由于缺乏用法用量的科学依据，其安全剂量难以合理评价，用药安全问题一直困扰着我国中药行业。
2、雄黄的药效、毒性的物质基础不明严重阻碍了其获得国际认可：
国际上难以认可高含量的砷中药。雄黄及其制剂若以总砷为标准，该类中药的含量将大大高于国际限度标准，使其应用受到限制，从而长期以来一直被国际上认为有毒而限制销售和进口。以砷总量作为控制标准缺乏合理性。研究表明，砷存在多种不同价态，其毒性存在较大的差异。雄黄现行质量标准中仅对总量砷进行控制，对可溶性砷及价态砷的含量未进行控制，不能反映雄黄在人体实际应用的情况，以元素的总量衡量是否安全是不合理的，也是不科学的。
3、雄黄的现有质量标准无法体现有效性和安全性，用法用量缺乏依据：
我国的2010年版《中国药典》雄黄项下仅收载了的氧化还原滴定法的含量测定方法；缺乏有效性成分的科学质控方法及有毒性成分的限量控制方法；并且其用法用量缺乏科学依据，急需进一步提高完善。
4、大量含雄黄的制剂缺乏相关研究和质控方法，导致实际应用的安全性问题：
现有的国家标准中收载了含雄黄朱砂的成方制剂约460种；目前中国药典2010年版一部中收录的含雄黄品种有10种、含雄黄和朱砂的品种有23个，未收载到中国药典2010年版一部的品种中，含雄黄的为72种，含雄黄和朱砂的有94种。其中小儿用药品种就有22种之多。如何做到对上述制剂的严格质控和安全使用，急需借鉴雄黄的质控方法。
根据《中国药典》2010年版一部，雄黄的主要成分为硫化砷(AsS)和四硫化砷(As4S4)计，还含有少量游离砷和可溶性砷盐，硫化砷和四硫化砷不溶于水，溶于碱，可被硝酸分解，极微溶于热二硫化碳和苯中。现有研究证明，雄黄在人工胃液、人工肠液中As(III)的溶出量大于水中的溶出量。随着人们对雄黄及含其制剂的日益重视，现通常认为雄黄的药效及毒性主要来自其所含的少量可溶性砷，故对雄黄中的可溶性砷的研究近来呈上升趋势。
为更好评价、雄黄的药效及毒性作用，有必要对其的可溶性砷进行研究。通过文献查阅，发现每篇文献报道的雄黄中可溶性砷方法基本相似，均采用人工胃液或人工肠液作为提取溶剂，但得到的可溶性砷含量相差较大。另雄黄饮片与复方制剂中的可溶性砷含量也不匹配，各文献结果也不全一致。分析原因，主要与样品处理方法有关，为能较好提取出雄黄中可溶性砷，有必要对供试品前处理方法进行详细的研究。
自然界的砷主要以金属砷、砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、二甲基砷、一甲基砷或砷酸根存在。可溶性砷及价态砷具有药效及毒性两方面作用，其砷存在的形式及价态对雄黄的毒性存在一定意义，因此需要对雄黄中所含的可溶性砷及价态砷的含量进行研究，以便控制雄黄的毒性。
因此对含雄黄的药物中可溶性砷和价态砷的含量的测定方法进行深入的研究，对保障用药安全和促进国际认可有极为重要的意义。
发明内容
鉴于现有技术的上述不足，本发明在明确了雄黄的基源及品种的基础上，对具相关性的药材、饮片和制剂进行研究，同时对雄黄药材及饮片建立了体现有效性和安全性的质量标准，对代表性制剂建立了科学的质控方法。在雄黄及含其制剂的质量控制方法和安全性研究方面取得了突破性的进展，为人民用药安全提供了保障。
本发明的第一个目的是测定含雄黄的药物中可溶性砷的含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：
(1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性砷；
(3)ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性砷的含量。
本发明中，术语“含雄黄的药物”是指含雄黄成分的药物。
本发明中，术语“ICP-MS法”是指电感耦合等离子体质谱法。
根据本发明的一个优选实施方式，所述含雄黄的药物选自雄黄药材、雄黄饮片和含雄黄的制剂。
根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(1)中的仿生溶剂选自人工胃液(胃蛋白酶活力大于等于1∶27000)、人工肠液或其组合；更优选地，仿生溶剂为人工肠液。
从模拟人体环境的角度而言，雄黄经胃肠进行吸收，人工胃液与人工肠液是与人体胃液与肠液相当的溶液，因此雄黄应先用人工胃液提取，再用人工肠液提取，两者结果相加才能体现雄黄在人体内的吸收情况。但具体实验时，因为分离雄黄颗粒有困难，因此操作性不强。如果分别用人工胃液和人工肠液提取的结果之和，与先用人工胃液提取，分离残渣再用人工肠液提取的结果之和相比，结果相当或较大，则可用前者代替后者，以保证试验的简便性及可操作性。本实验分别进行了这两种提取方法的比较，结果人工胃液(先)+人工肠液(后)与人工胃液+人工肠液的含量相差较大，后者含量普遍较前者高二倍，但人工胃液(先)+人工肠液(后)与人工肠液的含量基本相当，说明雄黄主要经胃吸收，到肠后吸收较少，因此可用人工肠液直接提取。因此根据本发明的一个优选的实施方式，用人工肠液提取，即可代表雄黄在体内的吸收量。
发明人对分别采用超声6小时、振摇24小时，不同转速溶出24小时的方法提取雄黄药材和饮片溶液，结果表明，超声提取的方法得到的可溶性砷含量最高，说明该方法可有效提取出可溶性砷。溶出是模拟人体环境最佳的方式，但由于雄黄密度较大，一直沉于瓶底，无法有效混悬，影响了溶出了效果。从结果可显示，每分钟250转的结果高于每分钟100转的结果。振摇提取出的可溶性砷含量较少，主要原因也是由于雄黄密度较大，振摇不完全。上述的溶出度方法和振摇的方法均无法有效代表雄黄在体内的吸收情况，超声的方法虽远较体内实际吸收方式剧烈，但其所测得的可溶性砷含量是雄黄在机体所能吸收的最大可溶性砷量，能科学的反映出雄黄中实际存在的可溶性砷含量，从而排除了因为病理、生理、人种、年龄、性别等各种因素带来的误差，使雄黄能在同一条件下进行质量比较，最大限度体现了雄黄产生可溶性砷的含量，对雄黄的药效及毒性能从根本上进行认识。
因此，本发明可以采用超声的提取方式。37℃超声时间为2小时后，可溶性砷的含量基本趋于稳定，从简化实验操作考虑，超声2小时可以满足目前提取效率的要求。但需注意超声时应每隔10-15分钟振摇1次，以避免细小雄黄颗粒粘附于瓶壁，无法完全超声。
根据本发明的另一个优选的实施方式，也可以采用磁力搅拌的方法，经试验，与超声处理结果一致。。
因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(2)中的超声处理/磁力搅拌为大于等于2小时。
雄黄样品经超声/磁力搅拌2小时后，混悬液体处于颗粒高度运动状态，若此时取样，溶液中充满未溶解的雄黄细小颗粒，测得的可溶性砷含量会偏高，不能准确代表实际溶剂中的可溶性砷。只有待混悬液中未溶解的雄黄细小颗粒全部沉降下来后，此时测得的可溶性砷含量才是实际溶出的量，因此优选地，超声/磁力搅拌后的雄黄提取物进一步进行净化处理。
因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述方法还包括步骤：
(2)对步骤(1)提取得到的溶液进行净化。
发明人推测溶液中砷可能有部分大分子化合物存在，净化方式不恰当会造成大分子砷化合物除去。因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(2)中采用(a)先静置，再用滤膜进行净化；或(b)采用静置进行净化。所述(a)中的静置时间为大于5小时，优选6-8小时；所述步骤(b)中的静置时间为大于18小时，优选20-24小时。
本发明人选择显微镜法进行雄黄样品溶液粒径的考察。采用OLYMPUSCHA显微镜进行测定，倍数为40×10倍。根据测得的结果，发现溶液中大多数粒子均在1μm左右，有个别大于1μm但均小于3μm，随着静置时间的增加，大粒子有减少的趋势，但趋势不甚明显。由此可判断，可溶性砷在溶液中以1μm左右的粒子形式存在，因此如果净化方式不当，即会造成含量数据的不准确和平行性较差。
根据本发明的一个优选实施方式，在静置一段时间后，选择孔径大小约为10～15μm+2～3μm的双层滤膜进行过滤，例如10μm+3μm和10μm+2μm孔径的滤膜，能兼顾净化和含量。为避免相互污染，滤膜应选用一次性的针头滤器。
根据本发明的一个优选实施方式，当采用静置方式对雄黄样品溶液进行净化时，静置时间为大于18小时，优选20-24小时。
根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(1)提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态。
因采用人工胃液或人工肠液提出的供试品溶液中可溶性砷含量较高，因此最好进一步稀释，以保证稀释溶液中可溶性砷的含量稳定。根据本发明的一个优选实施方式，用稀释溶剂稀释所述步骤(2)净化得到的溶液。进一步地，为了使大分子砷化合物完全解离，以便于ICP-MS能更加准确地测定，稀释后的溶液可进行消解处理。根据本发明一个特别优选的实施方式，将稀释后的溶液置顶空进样瓶中，加硝酸1.0～5.0ml、盐酸0～2ml，加盖密封，70℃～100℃水浴水解1～3小时，置量瓶中，用水稀释至刻度备用。
雄黄药材和饮片在人工胃液和人工肠液中，使用不同的稀释溶剂，结果趋势基本一致，在碰撞池模式下，盐酸对砷测定影响不明显，但浓度波动较大，应该避免使用。本发明所用人工胃液配制时采用了盐酸，最终选择盐酸系统溶液作为稀释溶剂。考虑到高浓度盐酸能加强仪器信号，且会产生ArCl，对砷的测定可能造成干扰，故在可能条件下，尽量选择较低浓度的盐酸溶液作为稀释溶剂。根据本发明一个优选的实施方式，选择0.125mol/L盐酸溶液作为稀释溶剂。
雄黄中可溶性砷的含量较小，因此采用灵敏度较高的电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行测定，因此根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(3)中ICP-MS法的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
本发明还研究了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定雄黄及雄黄粉中可溶性砷价态的含量测定方法。
自然界的砷主要以金属砷、砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、二甲基砷、一甲基砷或砷酸根存在。可溶性砷及价态砷具有药效及毒性两方面作用，其砷存在的形式对雄黄的毒性存在一定意义，因此需要对雄黄中所含的可溶性砷及价态砷含量进行研究，以便控制雄黄的毒性。
因此，本发明的另一个目的是提供一种测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)用仿生溶剂-超声处理和/或磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性价态砷；
(2)可选的对步骤(1)提取得到的溶液进行净化；
(3)HPLC-ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量。
本发明中，术语“HPLC-ICP-MS法”是指高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法。
本发明测定含雄黄的药物中可溶性价态砷含量的方法中的步骤(1)和(2)与本发明测定含雄黄的药物中可溶性砷含量的方法中的步骤(1)和(2)完全一致；即，对按照上述(1)提取得到的溶液，任选经过静置和稀释溶剂稀释后，再用HPLC-ICP-MS法测定其中可溶性价态砷的含量。
根据本发明的一个优选实施方式，所述可溶性价态砷选自砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、二甲基砷、一甲基砷或砷酸根。
根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的色谱条件为：色谱柱为HamiltonPRP-X100；以磷酸二氢铵溶液(调节pH值至8.0)为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱。
根据本发明的一个优选实施方式，所述流动相的流速为1.0ml/min；
所述磷酸二氢铵溶液的浓度为0.025mol/L。
根据本发明的一个优选实施方式，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
本发明测定含雄黄的药物中可溶性砷和价态砷含量的方法的优点如下：
1、采用模拟体内的提取方式，创建了可溶性砷与价态砷的通用提取方法，有效代表雄黄药效和毒性主要成分体内吸收量，为准确测定可溶性砷及价态砷提供可靠方法；
2、采用ICP-MS和HPLC-ICP-MS建立了雄黄药效和毒性主要成分的测定方法，方法灵敏、准确，填补了国内空白。
附图说明
图1为实施例1“雄黄药材中可溶性价态砷的含量测定”项下对照品(上图)和供试品(下图)的高效液相色谱图，其中AsC、AsB、As(III)、DMA、MMA、As(V)分别代表砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、二甲基砷、一甲基砷、砷酸根；
图2为实施例1测得的各批雄黄药材中可溶性砷的含量图；
图3为实施例2测得的各批雄黄饮片中可溶性砷的含量图；
图4为实施例1测得的各批雄黄药材中可溶性价态砷的含量图；
图5为实施例2测得的各批雄黄饮片中可溶性价态砷的含量图；
图6为实施例3测得的各批雄黄制剂中可溶性砷的含量图；
图7为实施例3测得的各批雄黄制剂中可溶性价态砷的含量图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步阐述本发明，但以下具体实施例不对本发明构成任何形式的限制。
实施例1
雄黄药材中可溶性砷的含量测定：按照电感耦合等离子体质谱法(中国药典2010年版一部附录XID)测定。
试药和仪器
美国Agilent公司7700ce型电感耦合等离子体质谱仪；必能信超声(上海)有限公司B9500S-DTH型超声波清洗机(功率300W，频率45kHz)；美国Millipore公司Milli-Q超纯水机。砷标准溶液(1000mg/L，批号HC961324)，购自Merk公司。
硝酸、盐酸均为优级纯(Merck公司)；胃蛋白酶为生化试剂，酶活力为1∶27000，批号为100710，购自上海惠兴生化试剂有限公司；胰酶为生化试剂，酪蛋白转化力≥25.0，批号为F20100714，购自国药集团化学试剂有限公司；水为经Milli-Q处理的去离子水。高纯液态氩气(纯度＞99.99％)和氦气(纯度为99.999％)由上海成功气体工业有限公司提供。
ICP-MS工作条件：
AgilentMicromistNebulizer同轴雾化器；石英一体化炬管，2.5mm中心通道；石英双通道型雾化室；八级杆碰撞反应池；piltier半导体控温于约2℃；镍采样锥和截取锥；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气作为反应气。7700ce型电感耦合等离子体质谱仪具体操作条件和采集参数见表1。
表1、Agilent7700CeICP-MS仪器工作参数
| 仪器参数 | 具体设定值 | 仪器参数 | 具体设定 |
| 射频功率 | 1500W | 分析模式 | 定量分析 |
| 采样深度 | 8.0mm | 数据采集模式 | 图谱模式 |
| 等离子气流量 | 15.0L·min-1 | 单位质量数采集点 | 3 |
| 载气流量 | 0.9L·min-1 | 数据采集重复次数 | 3 |
其中取浓度为2μg/L的对照砷溶液分别测定3～5次，测定值的RSD值应小于5％。
对照品储备溶液的制备：精密称取于100℃干燥2小时以上的三氧化二砷(AS2O3)0.1320g，置1000ml量瓶中，加10％氢氧化钠溶液10ml溶解后，再加10％硫酸10ml，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml相当于0.1mg的砷)。
对照品溶液的制备：精密量取对照品储备溶液适量，精置聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液制成每L含砷为1μg、5μg、10μg、20μg、50μg、100μg的溶液，即得。
内标溶液的制备：精密量取锗单元素对照溶液适量，置聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液制成每L含1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取雄黄药材(来源于湖南石门雄黄矿业，批号H2008081202)30mg，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，用人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置50ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml(其余溶液供可溶性砷价态使用)，置顶空进样瓶中，加硝酸2.0ml、盐酸0.5ml，加盖密封，80℃水浴水解1小时，置25ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用水稀释至刻度即得，同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。
测定：测定时选取的同位素为75As，以72Ge作为内标，选择碰撞池反应模式并根据不同仪器的要求选用适宜校正方程对测定的元素进行校正。
仪器的内标进样管在仪器分析工作过程中始终插入内标溶液中，依次将仪器的样品管插入各个浓度的对照品溶液中进行测定(浓度依次递增)，取每一浓度测得三次读数的平均值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制对照曲线。再将仪器的样品管插入供试品溶液中，测定，取三次读数的平均值。从对照曲线上读出供试品溶液中75As的浓度，扣除相应的试剂空白溶液的浓度，计算样品中砷元素的含量。
雄黄药材中可溶性砷含量结果的分析：
雄黄中可溶性砷的来源
雄黄为硫化物类矿物雄黄族雄黄，主含四硫化四砷(As4S4)和硫化砷(AsS)，现版药典写成了As2S2。药典中规定雄黄药材中As2S2不得少于90.0％。测定含量除药典规定的容量法外，还有原子吸收法，原子荧光法，电感耦合等离子体原子发射光谱法等，所有方法均以测定其中砷的含量，折算到As2S2的含量。由于雄黄为矿物药，随着产地、伴生矿不同，质地也不同，商品规格有雄精、腰黄、雄黄、明雄黄、刁雄、苏雄黄、苏尖和水窟雄黄。因此不排除雄黄中除主含四硫化四砷(As4S4)和硫化砷(AsS)化合物外，还可能含有其他微量含砷化合物，表2列出部分可能含有的含砷化合物。
表2、雄黄中可能含有的其他含砷化合物
| 名称 | 分子式 | 毒性 | 水中溶解性 |
| 三氧化砷 | AS2O3 | 剧毒 | 微溶 |
| 五氧化砷 | AS2O5 | 高毒 | 可溶 |
| 砷酸 | H3AsO4 | 剧毒 | 易溶 |
| 砷酸铅 | Pb3(AsO4)2 | 剧毒 | 微溶 |
| 砷酸钙 | Ca3(AsO4)2 | 剧毒 | 微溶 |
| 原砷酸钠 | Na2HAsO4 | 剧毒 | 可溶 |
| 偏亚砷酸钠 | NaAsO2 | 有毒 | 易溶 |
由上表可知，大多存在毒性的化合物均在水中有不同程度溶解度，这也间接说明了雄黄饮片水飞的重要性，水飞可去除有毒的含砷化合物，雄黄的主成分四硫化四砷(As4S4)和硫化砷(AsS)均不溶于水，当雄黄进入机体后，通过酶、酸等作用，四硫化四砷(As4S4)和硫化砷(AsS)可少量溶解，从而产生药理作用。这可能是雄黄可溶性砷的主要来源，另外不排除还有其他含砷化合物会带来一定的可溶性砷。
综上所述，采用本方法，除四硫化四砷(As4S4)和硫化砷(AsS)产生的可溶性砷外，雄黄药材中可溶性砷的来源复杂，具体可能因所含化合物的种类、含量不同而存在差异。
由于四硫化四砷(As4S4)和硫化砷(AsS)在人体溶解的过程可能是持续的动态过程，且受机体影响较大，在体外测定雄黄可溶性砷的时候，只能尽量做到极限量，代表人体能吸收的最大量，保证在同一水平进行比较。
本发明实施例1测定了19批雄黄药材，其中可溶性砷含量范围在2.84～5.50％。
雄黄药材中可溶性价态砷的含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)和电感耦合等离子体质谱法(附录XID)测定。
试药和仪器
美国Agilent公司7700ce型电感耦合等离子体质谱仪；美国Agilent公司1100型液相色谱仪；必能信超声(上海)有限公司B9500S-DTH型超声波清洗机(功率300W，频率45kHz)；美国Millipore公司Milli-Q超纯水机。
亚砷酸根溶液标准物质[As(III)，AsO33-1.011μmol/g，GBW08666，批号0901]；砷酸根溶液标准物质[As(V)，AsO43-＝0.233μmol/g，GBW08667，批号0901]；一甲基砷溶液标准物质[MMA，CH3AsO32-＝0.355μmol/g，GBW08668，批号0803]；二甲基砷溶液标准物质[DMA，CH3CH2AsO2＝0.706μmol/g，GBW08669，批号0803]；砷胆碱溶液标准物质[AsC，C5H14AsBrO＝0.374μmol/g，GBW08671，批号0803]、砷甜菜碱溶液标准物质[AsB，C5H11AsO2＝0.518μmol/g，GBW08670，批号0803]，均购于国家标准物质中心。三碘化砷标准品[AsI3，批号J14N53]、五氧化二砷标准品[As2O5，批号J16P58]，均购于AJohnsonMatthey公司。7Li、89Y、140Ce、205T1调谐液购于美国Agilent公司。
乙二胺四乙酸为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
硝酸、盐酸均为优级纯，购自德国Merck公司；半胱氨酸、醋酸铵、氨水均为优级纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；水为经Milli-Q处理的去离子水。高纯液态氩气(纯度＞99.99％)和氦气(纯度为99.999％)由上海成功气体工业有限公司提供。
HPLC-ICP-MS工作条件：
电感耦合等离子体质谱：
AgilentMicromistNebulizer同轴雾化器；石英一体化炬管，2.5mm中心通道；石英双通道型雾化室；八级杆碰撞反应池；piltier半导体控温于约2℃；镍采样锥和截取锥；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气作为反应气。7700x型电感耦合等离子体质谱仪具体操作条件和采集参数见表3。
表3、Agilent7700xICP-MS仪器工作参数
| 仪器参数 | 具体设定值 |
| 射频功率 | 1500W |
| 采样深度 | 8.0mm |
| 等离子气流量 | 15.0L·min-1 |
| 载气流量 | 0.9L·min-1 |
| 分析模式 | 定量分析 |
| 数据采集模式 | 时间分辨分析模式 |
高效液相色谱：
色谱柱为HamiltonPRP-X100(250×4.1mm；10μm)；以0.025mol/L磷酸二氢铵溶液(调节pH值至8.0)为流动相A，以水为流动相B，按表4进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min。
表4、砷价态的液相梯度洗脱程序
参比溶液的制备：取亚砷酸根(As(III))、砷酸根(As(V))、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱(AsB)对照品适量，用0.125mol/L盐酸溶液制成每1L各含50μg的混合溶液，即得。
对照品储备溶液的制备：精密量取亚砷酸根(As(III))、砷酸根(As(V))对照品适量，用0.125mol/L盐酸溶液制成每1L各含5mg的混合溶液，即得。
对照曲线溶液的制备：精密量取对照品储备溶液适量，分别用0.125mol/L盐酸溶液制成每L各含10μg、20μg、50μg、100μg、500μg的一系列对照溶液，即得。
供试品溶液的制备：取雄黄药材(来源于湖南石门雄黄矿业，批号H2008081202)30mg，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，用人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置50ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。
测定：吸取参比溶液20μl，注入液相色谱仪，六种不同形态的砷能完全分开，得到的图谱见附图1(上图)。
分别精密吸取一系列对照曲线溶液(浓度依次递增)与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，色谱柱流出液体直接进入电感耦合等离子体质谱仪的雾化器，选取同位素为75As，选择碰撞池反应模式并根据不同仪器的要求选用适宜校正方程对测定的元素进行校正。以各对照曲线溶液测得不同形态的砷峰面积值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制对照曲线。如供试品溶液中出现与对照曲线保留时间相同的色谱峰，则根据相应的对照曲线读出供试品溶液中的不同形态砷浓度，计算出样品中不同形态砷的含量，并折算成砷元素的含量。
检测限
以3倍信噪比计算检测限，亚砷酸根(As(III))、砷酸根(As(V))、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱(AsB)的检测限分别为0.0034％、0.0025％、0.0039％、0.0042％、0.0029％和0.0029％。
雄黄中可溶性砷所含价态砷含量结果的分析
雄黄的可溶性砷中均检出了As(III)和As(V)，但均未检出其他4种成分，由于砷价态可能与雄黄的疗效与毒性有密切关系，因此需对其含量进行深入分析。本发明实施例1测定了19批雄黄药材，其中As(III)和As(V)含量范围在1.21～2.62％。
实施例2：
雄黄饮片中可溶性砷的含量测定：按照电感耦合等离子体质谱法(中国药典2010年版一部附录XID)测定。
将实施例1中的雄黄药材替换成雄黄饮片(来源于湖南石门雄黄矿业，由上海封浜中药饮片厂加工，批号H2008081202)，其余方法和过程均和实施例1相同。
溶液稳定性试验
取雄黄饮片，按实施例1“雄黄药材中可溶性砷的含量测定”制备供试品溶液的相同方法制备供试品溶液，于不同时间进样分析，测定可溶性砷的量，结果表明(见表5)，在0～24小时内供试品溶液中可溶性砷含量基本稳定。
表5、溶液稳定性试验(可溶性砷)
结果表明，溶液稳定性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
重复性试验
取雄黄饮片，按实施例1“雄黄药材中可溶性砷的含量测定”制备供试品溶液的相同方法制备供试品溶液，并按照相同条件测定，一式6份，结果见表6。
表6、重复性试验(可溶性砷)
结果表明，重复性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
准确度试验
精密称取已测定含量的雄黄饮片(可溶性砷的含量为53748mg/kg)15mg，一式九份，分别加入砷标准溶液(1.000g/L)350μl、700μl和1400μl(各3份)，分别按上述供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表7。
表7、准确度试验(可溶性砷)
准确率在90.69％～104.58％之间，RSD小于5.0％，结果表明，准确度试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
结果：本发明实施例2按照相同方法测定了13批雄黄饮片，其中可溶性砷含量范围在2.81～8.85％，差别明显，其中药材经炮制后，可溶性砷含量增大，12批同批号雄黄药材饮片趋势一致，可以证明雄黄水飞只是为了去除其中有毒的水可溶性含砷化合物，同时增加了四硫化四砷(As4S4)和硫化砷(AsS)中砷的溶出，这部分可能是雄黄发挥作用的有效成分，由于其在体内是缓慢释放的过程，一般毒性几较小。但水飞可能去除的水可溶性含砷化合物，一般毒性极强，如不水飞去除，可能会对人体造成危害，因此水飞是保证雄黄质量安全不可或缺的手段。
雄黄饮片中可溶性价态砷的含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)和电感耦合等离子体质谱法(附录XID)测定。
将实施例1中的雄黄药材替换成雄黄饮片(来源于湖南石门雄黄矿业，由上海封浜中药饮片厂加工，批号H2008081202)，其余方法和过程均和实施例1相同。
溶液稳定性试验
取实施例2“雄黄饮片中可溶性砷的含量测定”的准确度试验项下供试品溶液，于不同时间进样分析，测定不同价态砷的量，结果(见表8)表明，在0～24小时内供试品溶液中不同价态砷含量基本稳定。
表8、溶液稳定性试验(价态砷)
结果表明，溶液稳定性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
重复性试验
取雄黄饮片，按实施例1“雄黄药材中可溶性价态砷的含量测定”制备供试品溶液的相同方法制备供试品溶液，并按照相同条件测定，一式6份，结果见表9。
表9、重复性试验(价态砷)
结果表明，雄黄饮片样品中只检出了As(III)和As(V)，其重复性试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。
准确度试验
精密称取已测定含量的雄黄饮片(来源于湖南石门雄黄矿业，由上海封浜中药饮片厂加工，批号H2008081202，含As(III)的量为3.5436％、含As(V)的量为0.6624％)15mg，精密加入砷胆碱(AsC)溶液(29.1570mg/kg)、砷甜菜碱(AsB)溶液(21.1200mg/kg)、三碘化砷(As(III))溶液(63.3200mg/kg)、二甲基砷(DMA)溶液(19.9332mg/kg)、一甲基砷(MMA)溶液(21.0520mg/kg)、五氧化二砷(As(V)溶液(3.0869mg/kg)适量，按上述供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表10。
表10、准确度试验(价态砷)
结果表明，6种砷价态的加样回收率为90.98％～99.58％，RSD均小于10％。准确度试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。
结果：本发明实施例2按照相同方法测定了13批雄黄饮片，其中As(III)和As(V)含量范围在1.19～5.50％，差别明显，其中药材经炮制后，价态含量升高，提示水飞的作用实际是增加了As(III)和As(V)的溶出，可能与雄黄的疗效密切相关。
实施例3：
雄黄制剂中可溶性砷的含量测定：按照电感耦合等离子体质谱法(中国药典2010年版一部附录XID)测定。
供试品溶液的制备：取局方至宝散(武汉健民大鹏药业有限公司提供，批号4)150mg，研细，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，用人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置25ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml(其余溶液供可溶性砷价态使用)，置顶空进样瓶中，加硝酸2.0ml、盐酸0.5ml，加盖密封，80℃水浴水解1小时，置50ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用水稀释至刻度即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。
溶液稳定性试验
按照相同方法制备供试品溶液，于不同时间进样分析，测定可溶性砷的量，结果表明(见表11)，在0～24小时内供试品溶液中可溶性砷含量基本稳定。
表11、溶液稳定性试验(制剂)
| 时间(小时) | 0 | 6 | 18 | 24 | RSD值 |
| 可溶性砷含量(mg/kg) | 6232 | 6209 | 6090 | 6128 | 1.08％ |
结果表明，溶液稳定性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
重复性试验
取局方至宝散，按上述相同方法制备供试品溶液并按照相同条件测定，一式6份，结果见表12。
表12、重复性试验(制剂)
结果表明，重复性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
准确度试验
精密称取已测定含量的局方至宝散(可溶性砷含量为6486mh/kg)75mg，加入砷标准溶液(1.000g/L)750μl、500μl和250μl，均一式三份，按相同供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表13。
表13、准确度试验(制剂)
可溶性砷提取的准确率在91.3％～99.5％之间，RSD均小于15.0％。结果表明，准确度试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
按照相同方法测得9批局方至宝散的可溶性砷在0.46％～0.65％。制剂中可溶性砷的值与理论值相比，差异不明显。
雄黄制剂中可溶性价态砷的含量测定：按照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录VID)和电感耦合等离子体质谱法(附录XID)测定。
供试品溶液的制备：取局方至宝散(武汉健民大鹏药业有限公司提供，批号4)150mg，研细，精密称定，(1)置250ml玻璃量瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液定容至刻度，摇匀，密塞，称定重量，置37℃中超声处理(功率300W，频率45kHz)2小时，每隔10-15分钟振摇1次，或(2)置250ml～500ml具塞锥形瓶(先用20％盐酸溶液(v/v)浸泡过夜，再用去离子水洗净并晾干)中，加人工肠液250ml，摇匀，称定重量，置37℃水浴中磁力搅拌(调整转数，使溶液能完全涡旋)2小时，再称定重量，用人工肠液补足减失的重量，摇匀，取适量至50ml聚丙烯材料的离心管中，静置20～24小时，小心量取上层溶液约10ml至15ml聚丙烯材料的离心管中(量取时应避免带入颗粒)，精密量取5ml，置25ml聚四氟乙烯材料的量瓶中，用0.125mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。
其余方法和过程均和实施例1相同。
溶液稳定性试验
取“雄黄制剂中价态砷的含量测定”准确度试验项下的供试品溶液，于不同时间进样分析，测定不同价态砷的量，结果表明(见表14)，在0～24小时内供试品溶液中不同价态砷含量基本稳定。
表14、溶液稳定性试验(制剂中价态砷)
结果表明，溶液稳定性试验结果符合电感耦合等离子体质谱方法的要求。
重复性试验
取局方至宝散，按上述方法制备供试品溶液，一式6份，结果见表15。
表15、重复性试验(制剂中价态砷)
结果表明，局方至宝散中只检出了As(III)和As(V)，其重复性试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。
准确度试验
精密称取已测定含量的局方至宝散(含As(III)的量为1891mg/kg、含As(V)的量为825mg/kg)75mg，精密加入标准物质溶液砷胆碱(AsC)(29.1570mg/L)、砷甜菜碱(AsB)(21.1200mg/L)、三碘化砷(As(III))(63.3200mg/L)、二甲基砷(DMA)(19.9332mg/L)、一甲基砷(MMA)(21.0520mg/L)、五氧化二砷(As(V)(3.0869mg/L)，分高、中、低三种浓度，均一式三份，按正文供试品溶液的制备方法制备和测定，测定结果见表16。
表16、准确度试验(制剂中价态砷)
上述成分的平均准确度均在92.08～100.66％之间，RSD均小于10.0％。结果表明，准确度试验结果符合高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法的要求。
结果：制剂与雄黄药材和饮片的结果一致，只检出As(III)和As(V)，未检出其他成分。9批局方至宝散的As(III)和As(V)含量范围在0.14～0.28％。
制剂中价态砷的实测值较理论值大幅度下降，说明制剂中其他药味对价态砷的影响巨大，主要是其余药味中的成分可与价态砷结合所致。另外，价态砷的理论值各批差异较大，但实测值差异减小，说明通过其他药味的配伍，使得价态砷的质量趋同。
Claims (8)
1.测定含雄黄的药物中可溶性砷含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：
(1)用仿生溶剂-超声处理或仿生溶剂-磁力搅拌提取含雄黄的药物中可溶性砷，所述仿生溶剂选自人工胃液、人工肠液或其组合，所述超声处理或磁力搅拌为大于或等于2小时，且该步骤提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态；
(2)将步骤(1)提取得到的溶液静置20-24小时进行净化，用浓度为0.0125～0.250mol/L的盐酸溶液稀释净化得到的溶液并进行消解；
(3)ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性砷的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含雄黄的药物选自雄黄药材、雄黄饮片和含雄黄的制剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的仿生溶剂是人工肠液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中ICP-MS的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
5.测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量的方法，所述可溶性价态砷选自砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、二甲基砷、一甲基砷或砷酸根，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)用仿生溶剂-超声处理或仿生溶剂-磁力搅拌提取含雄黄的药物中的可溶性价态砷，所述仿生溶剂选自人工胃液、人工肠液或其组合，所述超声处理或磁力搅拌时间为大于或等于2小时，该步骤提取得到的溶液中存在小粒径悬浮颗粒、络合物和离子态三种状态；
(2)将步骤(1)提取得到的溶液静置20-24小时进行净化，用浓度为0.0125～0.250mol/L的盐酸溶液稀释净化得到的溶液；
(3)HPLC-ICP-MS法测定含雄黄的药物中可溶性价态砷的含量，
其中高效液相色谱：
色谱柱为250×4.1mm；10μm的HamiltonPRP-X100；以pH值为8.0的0.025mol/L磷酸二氢铵溶液为流动相A，以水为流动相B；流速为1.0ml/min；
可溶性价态砷的液相梯度洗脱程序为
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述含雄黄的药物选自雄黄药材、雄黄饮片和含雄黄的制剂。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的仿生溶剂是人工肠液。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中HPLC-ICP-MS法的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |