CN110045052A - 一种hplc-icp-ms联用测定虾中11种砷形态的方法 - Google Patents

一种hplc-icp-ms联用测定虾中11种砷形态的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HPLC‑ICP‑MS联用测定虾中11种砷形态的方法，(1)配制标准储备液和标准工作溶液；(2)配制蛋白酶提取液；(3)制备样品提取溶液；(4)制备样品加标溶液；(5)配置两种不同浓度的碳酸铵溶液作为流动相；(6)将标准工作溶液通过自动进样器注入高效液相色谱仪中，采用梯度洗脱的方式对11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行分析，得到每种砷物种的标准曲线；(7)采用梯度洗脱的方式对样品提取溶液和样品加标溶液中11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行检测，采用保留时间匹配和样品加标匹配相结合的方法，确定样品中砷形态的种类和含量。

Description

一种HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法
技术领域
本发明涉及元素形态分析领域，尤其涉及一种高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP-MS)联用测定虾中11种砷形态的方法。
背景技术
近几十年来，随着城市化建设和工业化的快速发展，带来越来越多的的化学污染，严重影响了我们周围的环境，破坏了生态系统。元素污染是环境污染的一种，其中重金属砷带来的污染引起越来越多学者的关注，砷有很多种形态，可以分为无机砷和有机砷，无机砷主要是三价砷和五价砷，有机砷有很多种如：砷甜菜碱、二甲基砷、砷胆碱、一甲基砷、阿散酸、卡巴砷、硝苯砷酸、4-羟基苯砷酸、洛克沙砷等。
砷的生物毒性和砷的形态有关，砷的毒性由于形态的不同，毒性相差几个数量级，无机砷的毒性较强，具有致癌性，三价砷的毒性最强，五价砷的毒性其次；有机砷的毒性较弱，经常被认为是低毒或者是无毒。目前国际组织IARC、FAO、WHO和EU发布的信息公布了砷的毒性和致癌作用，但是却没有具体规定每一种砷形态毒性及限量的法律依据。一般是对总砷的限量，缺乏每一种砷形态的限量范围。其中一个主要的原因是缺乏一种可以同时对多种砷形态进行准确定量的方法。目前，高效液相色谱(HPLC)联用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)已经成为元素形态分析最为准确、快捷、有效和常用的方法，液相色谱可以有效的对元素形态进行分离，同时ICP-MS可以快速而准确的对元素的无机和有机形态进行定量检测，与传统的原子光谱相比具有较低的检出限。
虾含有丰富的容易被人体所吸收的营养物质，是一种日常大量食用的食品，在世界上每天需要消耗大量的虾及虾制品，环境中的砷可以通过食物链到达虾体内，通过食物链到最终达人体内，对人的身体健康造成影响，由于不同砷形态对人体毒性的不同，所以对于虾不应当只是研究总砷的含量，而是应当研究虾中含有的砷形态，确定其含有砷形态的种类及其含量，是开展后续食品安全风险评估的基础。目前对于砷形态检测的研究很多，但是由于色谱柱和流动相的限制，检测通量有限，一般只能检测其中有限的几种，容易造成砷形态的误认。
发明内容
本发明提供了一种HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，以解决由于色谱柱和流动相的限制，导致的砷形态检测检测通量有限，容易造成砷形态的误认的问题。
本发明提供的HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，包括以下步骤：
(1)以砷甜菜碱、二甲基砷、亚砷酸、砷胆碱、一甲基砷、砷酸、4-硝基苯基胂酸、洛克沙砷、阿散酸、卡巴胂、对羟基苯胂酸的标准物质混合配制标准储备液，将标准储备液稀释成不同浓度梯度的标准工作溶液。
(2)配制提取液，称取4㎎蛋白酶溶解于0.75mL 0.5％HCl。
(3)剪掉虾头和虾尾，剥除虾壳，挑去虾线，将剩余的虾肉组织匀浆，称取匀浆后的样品0.5g于15mL的塑料离心管中，加入0.75mL提取液，用超纯水将样品定容至5mL，样品提取物涡旋，超声15min，将超声后的样品提取物置于恒温培养箱中37℃过夜，将样品提取物8000rpm离心，取上清液用0.22μm的滤膜过滤，得到样品提取溶液。
(4)称取匀浆后的样品0.5g于15mL的塑料离心管中，加入0.75mL提取液，并加入不同浓度梯度的标准工作溶液，用超纯水将样品定容至5mL，样品加标提取物涡旋，超声15min，将超声后的样品加标提取物置于恒温培养箱中37℃过夜，将样品加标提取物8000rpm离心，取上清液用0.22μm的滤膜过滤，得到样品加标溶液。
(5)配置两种不同浓度的碳酸铵溶液作为梯度洗脱的两种流动相。
(6)将标准工作溶液通过自动进样器注入高效液相色谱仪中，以两种不同浓度的碳酸铵溶液为流动相，采用梯度洗脱的方式对11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行分析，确定11种砷形态的保留时间及其分离度的脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度的积分为纵坐标，由仪器的计算机作线性拟合，得到每种砷物种的标准曲线。
(7)将样品提取溶液和样品加标溶液通过自动进样器注入高效液相色谱仪中，以两种不同浓度的碳酸铵溶液为流动相，采用梯度洗脱的方式对11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行检测，采用保留时间匹配和样品加标匹配相结合的方法，确定样品中砷形态的种类和含量。
可选地，电感耦合等离子质谱仪的设置条件为：
射频功率1500W；停留时间0.2s；纯度为99.99％氩气作为雾化气、辅助气、等离子气，雾化气流速1.0mL/min，辅助气流速0.8mL/min，等离子气流速14mL/min；采用KED模式，纯度为99.99％的氦气作为碰撞气，碰撞气流速4.7mL/min。
可选地，步骤(5)中，两种流动相包括：流动相A为400mmol/L碳酸铵溶液；流动相B为5mmol/L碳酸铵溶液。
可选地，高效液相色谱仪的设置条件如下：
选用阴离子交换柱AS7保护柱2×50mm，AS7分析柱2×50mm；
流速0.4mL/min，进样体积为5μL，柱温为20℃；
洗脱程序：0-2min，流动相A 0％，流动相B 100％；2.1-5.5min，流动相A 10％，流动相B 90％；5.6-8.6min，流动相A 25％，流动相B 75％；8.7-17min，流动相A 100％，流动相B 0％。
可选地，步骤(1)中，标准储备液浓度为1000μg/L，标准工作溶液浓度为1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100μg/L。
可选地，所述蛋白酶为protease。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，采用对十一种砷形态在17min内进行分离测定，大大提高了分离的效率，具备简便、快速、高灵敏度的优势。
(2)蛋白酶作为提取剂可实现高效提取并保持样品中砷形态保持不变。
(3)采用阴离子交换色谱柱进行梯度洗脱，以两种不同浓度的碳酸铵溶液为流动相进行分离，不需要调节流动相的PH值，简化分析的过程，降低了分析过程对外界环境的要求，提高了方法的耐受性。
(4)采用动能歧视模式(KED)消除离子干扰。KED可以有效地消除了来自75ArCl的干扰，有效提高检测的准确性。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为酶解提取加标回收结果；
图2为不同酶用量加标结果图；
图3为不同酸度加标结果图；
图4为本发明提供的HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法对11种砷形态进行分离结果色谱图，标准溶液范围为0.1-100μg L-1；
图5为柱温对分离度的影响结果图；
图6中图a是不选用KED模式下50mg/mL的Cl的HPLC-ICP-MS液相色谱图；图b是不选用KED模式下5μg/mL的AsⅤ和50mg/mL Cl混合液的HPLC-ICP-MS液相色谱图；图c是在KED模式下5μg/mL的AsⅤ和50mg/mL Cl混合液的HPLC-ICP-MS液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，以解决由于色谱柱和流动相的限制，导致的砷形态检测检测通量有限，容易造成砷形态的误认的问题。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一种HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法
1、仪器
选用高效液相色谱系统UltiMate 3000(Thermo Scientific Germany)对11中砷形态进行分离，为了高效的对多种砷形态进行有效的分离我们选用阴离子交换柱AS7保护柱(2*50mm)，AS7分析柱(2*50mm)(Thermo Fisher Scientific，Sunnyvale USA)。电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)(Thermo Scientific Germany)并配备石英的旋流雾化器和雾化室，用于砷形态和砷总量的检测，应用KED模式来消除砷形态测定过程中的干扰。实验过程中使用的水均来自配有Q-POD Element的Milli-Q超纯水系统(Millipore USA)。仪器使用参数见表1，梯度洗脱条件见表2。
表1高效液相色谱-质谱联用测定砷形态的优化参数
表2：梯度洗脱条件
A:400mmol/L碳酸铵溶液,B:5mmol/L碳酸铵溶液
2、标准物质
标准物质砷甜菜碱(AsB)、二甲基砷(DMA)、亚砷酸(AsⅢ)、砷胆碱(AsC)、一甲基砷(MMA)、砷酸(AsⅤ)标准溶液购于中国计量科学研究院。标准物质4-硝基苯基胂酸(NIT)、洛克沙砷(ROX)、阿散酸(ASA)购于Dr.Ehrenstorfer(奥格斯堡,德国)，卡巴胂(CA)购于国家食品药品监督管理所(北京,中国)，对羟基苯胂酸(NAPP)购于Chem Service(西切斯特，美国)。
以砷甜菜碱、二甲基砷、亚砷酸、砷胆碱、一甲基砷、砷酸、4-硝基苯基胂酸、洛克沙砷、阿散酸、卡巴胂、对羟基苯胂酸的标准物质混合配制标准储备液，将标准储备液稀释成不同浓度梯度的标准工作溶液。标准储备液浓度为1000μg/L，标准工作溶液浓度为1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100μg/L。
标准物质在使用前均保存在4℃冰箱中，配制的标准储备液及标准工作溶液在使用前也保存在4℃冰箱中。
3、试剂
碳酸铵溶液(Aladdin，Shanghai，China)作为分离砷形态的流动相，在使用前用0.22微米的滤膜进行过滤，最后储存于4℃的塑料瓶里。用来做日常仪器校正的Tune B来自于(热电公司，德国)，酶：protease(Sigma,USA)。
4、其他
纯度为99.99％氩气(德洋，济南，中国)作为ICP-MS的雾化器、辅助气、等离子气，纯度为99.99％的氦气(德洋，济南，中国)作为ICP-MS工作的碰撞气。
5、样品准备
样品从市场购买，剪掉虾头和虾尾，剥除虾壳，挑去虾线，将剩余的虾肉组织匀浆，并在-20℃下保存。
6、样品中砷形态的提取
配制提取液，称取40㎎蛋白酶溶解于0.75mL 0.5％HCl。
称取匀浆后的样品0.5g于15mL的塑料离心管中，加入0.75mL提取液，用超纯水将样品定容至5mL，样品提取物涡旋，超声15min，将超声后的样品提取物置于恒温培养箱中37℃过夜，将样品提取物8000rpm离心，取上清液用0.22μm的滤膜过滤，得到样品提取溶液，待HPLC-ICP-MS分析测定使用。
7、HPLC对砷形态的分离和ICP-MS对砷形态的测定
将标准工作溶液通过自动进样器注入高效液相色谱仪(表1)中，以两种不同浓度的碳酸铵溶液为流动相(流动相A为400mmol/L碳酸铵溶液；流动相B为5mmol/L碳酸铵溶液)，采用梯度洗脱的方式(表2)对11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行分析，确定11种砷形态的保留时间及其分离度的脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度的积分为纵坐标，由仪器的计算机作线性拟合，得到每种砷物种的标准曲线。在对样品进行分析之前，十一种砷形态标准曲线在0.1-100μg/L范围内进行标准曲线测试，得到每种砷物种的校正曲线。
将样品提取溶液和样品加标溶液通过自动进样器注入高效液相色谱仪(表1)中，以两种不同浓度的碳酸铵溶液为流动相(流动相A为400mmol/L碳酸铵溶液；流动相B为5mmol/L碳酸铵溶液)，采用梯度洗脱的方式(表2)对11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行检测，采用保留时间匹配和样品加标匹配相结合的方法，确定样品中砷形态的种类和含量。
前处理方式的选择
1、提取液的选择
采用HPLC-ICP-MS对样品中砷形态进行测定，必须要处理成溶液模式才能够进行测定，所以合适的前处理方式对于虾中砷形态的测定非常重要，前处理的方式必须是高效并保持样品中砷形态保持不变。通过对比水及酸性提取、有机溶剂提取、酶解提取等多种对砷形态的前处理方式，发现酶解提取的效果最好。进一步地，尝试采用酶解提取的方法对虾中无机砷的形态进行提取，采用两种蛋白酶和一种脂肪酶对样品进行处理，加入0.75mL的protease提取液(40mg protease in 0.75mL 0.5％HCl)、加入0.75mL的pepsin提取液(40mg pepsin in 0.75mL 0.5％HCl)、加入2mL的trypsin提取液(40mg trypsin in 2mL0.1M NH4HCO3)和0.5g的lipase，最终定容到5mL，使用HPLC-ICP-MS对样品提取溶液进行分析，分析结果显示，使用pepsin作为提取酶有5种砷形态的回收率在90％～110％之间，其它均在90％以下，使用trypsin作为提取酶时有5种砷形态的回收率在90％～110％之间，ASⅢ没有检出，使用protease作为提取酶时，11种砷形态的回收率在94％～106％之间。具体结果见图1。通过多种无机溶剂、有机溶剂和酶作为提取剂对虾肉中砷形态进行测定的回收率结果表明，使用protease作为提取剂取得良好的实验结果，因此优选地，使用protease作为提取溶剂。
2、酶用量和酸度的确定
由于酶的酶解作用受酸用量和酶用量的影响，需要对这两项指标进行了验证。
称取5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、80mg、100mg protease溶解至0.75mL0.25％HCl中作为提取液使用。分析结果显示，当酶的加入量为5mg时NIT(83.1％)、ROX(87.2％)明显偏低，随着酶的加入量增加CA、NIT、NAPP和ROX的回收率都明显增加，但是当酶的加入量达到40mg时回收率均在93.9％～106％之间，已经达到良好的实验结果，酶量继续增加对实验结果影响不大，所以优选地，酶的加入量为40mg。具体结果见图2。
为了验证酸度对前处理的影响，我们称取40mg蛋白酶分别加入0、0.025、0.05、0.1、0.125、0.25、0.75、1、1.5、2、3、4、4.5mL 0.5％HCl使用超纯水定容至5mL，作为提取液，实验结果显示，随着HCl的加入量在0-0.25mL，随着酸用量的增加，DMA、As III、AsC、ROX和NIT回收率缓慢增加，当HCl的使用量为0.5mL时，As III、AsC回收率增加，但是，增加速率缓慢。当加入量大于0.75mL时ASA、NIT、CA和ROX的回收率会降低，当酸的加入量大1.5mL时有6种砷形态的加标回收率降低到90％以下，当酸的加入量为4mL时NIT的加标回收率已经降低到67.9％，所以优选地，酸的加入量为0.75mL，具体见过见图3。
色谱条件的选择
1、流动相的选择
砷形态的分离过程中，一般选取多种化合物配制多种流动相，而且需要调节PH值至一个准确的数值，但是容易受外界环境的影响，而导致PH值的变化，影响分离的效果和砷形态的保留时间，方法曲线范围窄，检测的操作繁琐，耐受性差。在对砷元素进行形态进行分离时，一般选取离子交换柱进行分离，以往的研究均需要调节不同的PH值，有的分离方法双相流动相都需要调节不同的PH值，但是流动相在配制完成后PH容易受外界环境的影响而导致PH值的变化，影响分离的效果和砷形态的保留时间，这些砷形态的分离方法操作繁琐，而且容易受外界环境的影响，方法的耐受性较差。本发明只需要采用碳酸铵这单一物质作为流动相，而且并不需要调节流动相的PH值，简化分析的过程，降低了分析过程对外界环境的要求，提高了方法的耐受性。进一步地，使用梯度洗脱的目的是在较短的时间内实现多种元素形态的分离，提高分离的效率。11种砷形态随着流动相中碳酸铵浓度的增加，除了砷甜菜碱其他10中砷形态的保留时间都会提前，这11种砷形态的保留强度为：ROX＞NAPP＞NIT＞CA＞AsⅤ＞ASA＞MMA＞AsC＞AsⅢ＞DMA＞AsB。本发明提供的分离程序可使得11种砷形态均达到理想的分离结果。以前的研究一般只能分析最多7种砷形态，而我们的分离程序可以实现11种砷形态的分离，大大提高了分离的效率。分离结果见图4。
2、柱温的影响
在进行液相色谱进行分离时，色谱柱的温度会对目标物质的分离时间和分离度造成影响，因此通过调整柱温考察在16℃-32℃时，温度的变化对分离效果的影响，实验结果表明随着色谱柱温度的升高，在16℃-20℃范围内11中砷形态的保留时间变化不大，从22℃-32℃只有AsB和AsC的保留时间没有变化，其他9中砷形态的保留时间随着温度的升高而变长，由于DMA和ASⅢ保留时间比较接近，而DMA随着柱温变化保留时间变化的速率比AsⅢ的变化速率快，从而导致它们的分离度变差，DMA和AsⅢ分离度变化如图5，所以优选地，本方法分离最终选用的温度为20℃。
质谱条件的选择
ICP-MS检测元素的准确性较高，但是ICP-MS在检测过程中会存在干扰，因此ICP-MS在检测过程中应当选择一种去除干扰的模式，可以调节检测的灵敏度和联机的背景波动，ICP-MS对某种元素的测定时根据其特定的质量数来定性和定量的，例如75As在检测过程中需要选择75的质量数，但是75As在75这个质量数下会存在一定的干扰，例如75ArCl(Ar的质量数为40-40Ar，Cl的质量数为35-35Cl)，因为氩气是ICP-MS必需使用的气体，而氯是在环境和样品中大量存在的元素，所以说这种干扰一般是无法避免的，在以前的研究过程中人们虽然对砷的形态进行测定，但是没有关注35Cl在砷形态的测定中对结果造成的影响，所以在HPLC-ICP-MS的测定过程中选择一种去除干扰的方法是非常必要的，本方法在检测过程中采取KED模式去除干扰。
离子75As与干扰分子离子75ArCl相比具有更小的碰撞截面，因此碰撞气体He与75ArCl碰撞频率更高，75ArCl的动能降低较多，而75As的碰撞频率较少，仍保持较高动能，四级杆的势能较高，使得只有75As进入四级杆，而75ArCl的动能不足，则完全无法进入。
为了验证采取KED的方式的效果，参见图6，首先用检测35Cl,确定它的出峰时间及可能对哪种砷形态可能造成干扰，并分别选取KED模式和不选取KED模式来对检测的结果进行比较。实验的结果表明，35Cl的出峰时间和AsⅤ的出峰时间相近，在不选取KED模式的检测发现在AsⅤ峰的前端，35Cl出峰时间的位置存在明显的干扰，而在选取KED模式时，AsⅤ峰的前端位置干扰消失，所以，选取KED模式可以完美的去除35Cl对75As的干扰。
方法评价
评价一个方法的重要的因素是分析结果的可靠性，能否正确的反映样品中的真正含量。为了验证分析结果的准确性我们对方法的以下参数进行了评价：选择性、线性、检出限、定量限、重复性和精密度，实验结果见表3。
表3实验结果
1、选择性和线性
色谱分离的效果采用分离度来表示，按照K.L.Ackley and J.A.Caruso的方法来计算分离度。对含有十一种砷形态的在5μg/L的标准工作溶液进行分析(n＝3，即重复3次实验取平均)，根据保留时间的峰宽来计算分离度。此外，基于标准物质和真实样品的色谱图，比较分析物和干扰离子确定准确的保留时间。使用曼德尔拟合试验对校准曲线线性进行数学验证，对每种砷形态进行直线回归模型的标准误差与二阶多项式回归模型的标准误差做比较。实验结果表明，砷形态的保留时间稳定，分离良好。采用外标法进行定量分析，利用信号强度的平均值，在0.1～100μg/L浓度范围内建立标准曲线，在该浓度范围内，线性度良好(0.9993～0.9999)。
2、重复性
根据国际协调会议的推荐方法对重复性进行评价，对真实的虾类样品进行11中砷形态的加标试验，加标量为50、100、500mg/kg(n＝5)，根据每种砷形态的峰面积来计算每种砷形态的测定重复性，实验结果表明样品中11种砷形态的测定重复性在1.6％–4.7％之间。
3、检出限和定量限
根据背景波动的三倍的标准偏差来计算方法的检出限，定量限为三倍的检出限。由于砷形态结构不同以及在分离时流动相浓度不同所造成的，检出限的范围为0.11–0.56μg/kg，定量限的范围为0.34–1.67μg/kg。
4、准确性
形态分析的困难之一是确认结果的准确性，这是因为元素形态存在稳定性的问题，因此在分析化学领域元素形态的标准物质是非常有限的。最常用的确定准确性的方法是标准加入回收实验。通过优化提取分离条件，消除基体干扰，我们工作中加标回收的结果在91％～104％。
虾类样品中含有大量的有机物，在对样品进行砷形态的提取时，容易造成砷形态的损失和存基质干扰等问题。(1)采用水、酸、有机溶剂、酶对虾类样品中的砷形态记性提取，经过比对发现，蛋白酶protease作为提取剂可以取得最优的提取效果。(2)对影响蛋白酶提取效果的酸和酶用量进行研究，确定最优酸的用量和酶的用量，加标回收率在94-106％。(3)选择碳酸铵作为流动相，克服了以前研究中需要精确调节PH的缺点，简化了分离程序，提高了方法的耐受性。(4)确定柱温20℃为最佳分离温度。(5)氦气作为KED模式中选取的碰撞气，可以有效的去处75ArCl的干扰，提高了分析的准确性。(6)为了验证分析结果的准确性我们对方法的：选择性、线性、检出限、定量限、重复性和精密度等下参数进行了评价，评价结果表明方法的准确性和可靠性。
以上所述的本发明实施方式并不构成对本发明保护范围的限定。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

Claims (6)

1.一种HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以砷甜菜碱、二甲基砷、亚砷酸、砷胆碱、一甲基砷、砷酸、4-硝基苯基胂酸、洛克沙砷、阿散酸、卡巴胂、对羟基苯胂酸的标准物质混合配制标准储备液，将标准储备液稀释成不同浓度梯度的标准工作溶液；
(2)配制提取液，称取4㎎蛋白酶溶解于0.75mL0.5％HCl；
(3)剪掉虾头和虾尾，剥除虾壳，挑去虾线，将剩余的虾肉组织匀浆，称取匀浆后的样品0.5g于15mL的塑料离心管中，加入0.75mL提取液，用超纯水将样品定容至5mL，样品提取物涡旋，超声15min，将超声后的样品提取物置于恒温培养箱中37℃过夜，将样品提取物8000rpm离心，取上清液用0.22μm的滤膜过滤，得到样品提取溶液；
(4)称取匀浆后的样品0.5g于15mL的塑料离心管中，加入0.75mL提取液，并加入不同浓度梯度的标准工作溶液，用超纯水将样品定容至5mL，样品加标提取物涡旋，超声15min，将超声后的样品加标提取物置于恒温培养箱中37℃过夜，将样品加标提取物8000rpm离心，取上清液用0.22μm的滤膜过滤，得到样品加标溶液；
(5)配置两种不同浓度的碳酸铵溶液作为梯度洗脱的两种流动相；
(6)将标准工作溶液通过自动进样器注入高效液相色谱仪中，以两种不同浓度的碳酸铵溶液为流动相，采用梯度洗脱的方式对11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行分析，确定11种砷形态的保留时间及其分离度的脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度的积分为纵坐标，由仪器的计算机作线性拟合，得到每种砷物种的标准曲线；
(7)将样品提取溶液和样品加标溶液通过自动进样器注入高效液相色谱仪中，以两种不同浓度的碳酸铵溶液为流动相，采用梯度洗脱的方式对11种砷形态进行分离，再用电感耦合等离子质谱仪对11种砷形态进行检测，采用保留时间匹配和样品加标匹配相结合的方法，确定样品中砷形态的种类和含量。
2.根据权利要求1所述的HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，其特征在于，电感耦合等离子质谱仪的设置条件为：
射频功率1500W；停留时间0.2s；纯度为99.99％氩气作为雾化气、辅助气、等离子气，雾化气流速1.0mL/min，辅助气流速0.8mL/min，等离子气流速14mL/min；采用KED模式，纯度为99.99％的氦气作为碰撞气，碰撞气流速4.7mL/min。
3.根据权利要求1所述的HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，其特征在于，步骤(5)中，两种流动相包括：流动相A为400mmol/L碳酸铵溶液；流动相B为5mmol/L碳酸铵溶液。
4.根据权利要求3所述的HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，其特征在于，高效液相色谱仪的设置条件如下：
选用阴离子交换柱AS7保护柱2×50mm，AS7分析柱2×50mm；
流速0.4mL/min，进样体积为5μL，柱温为20℃；
洗脱程序：0-2min，流动相A 0％，流动相B 100％；2.1-5.5min，流动相A 10％，流动相B90％；5.6-8.6min，流动相A 25％，流动相B 75％；8.7-17min，流动相A 100％，流动相B0％。
5.根据权利要求1所述的HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，其特征在于，步骤(1)中，标准储备液浓度为1000μg/L，标准工作溶液浓度为1、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100μg/L。
6.根据权利要求1所述的HPLC-ICP-MS联用测定虾中11种砷形态的方法，其特征在于，所述蛋白酶为protease。
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