CN106950328B - 一种用于检测发酵茶中真菌毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测发酵茶中真菌毒素的方法，将发酵茶试样经极性溶液溶、解盐析后，先后进行离心、过滤，最终置于1290/6460超高效液相色谱‑三重四极杆串联质谱仪中分析，在分析过程中采用流动相为(0.1％甲酸‑5mmol/L乙酸铵‑水)‑甲醇，且流动相A为0.1％甲酸‑5mmol/L乙酸铵‑水，流动相B为甲醇，并采用逐步提高流动相B的浓度的梯度洗脱方式进行分离，为此，使得发酵茶试样中的真菌毒素在短时间内达到基线分离，解决了发酵茶中多种真菌毒素的有效提取和测定，可同时快速地检测出多种真菌毒素，具有检测高效、环境污染小、步骤操作简便、易于推广使用的特点。

Description

一种用于检测发酵茶中真菌毒素的方法

【技术领域】

本发明涉及真菌毒素的检测方法，尤其是一种用于检测发酵茶中真菌毒素的方法。

【背景技术】

普洱茶是黑茶中备受人们喜爱的茶叶品种，普洱茶在制作过程中有一道特殊的工序是“渥堆”，它是形成普洱茶品质特征最关键的一步，在这一工序中微生物发挥着重要作用。这个过程是环境中的微生物自然接种或人工添加优势菌种进行到渥堆的茶叶上去。研究已经证实，普洱茶中渥堆发酵中的微生物主要为：黑曲霉、棒曲霉、灰绿曲霉(Aspergillus及酵母等。这些微生物在普洱茶渥堆发酵过程主要有两方面的作用：①形成普洱茶良发好的品质特征，甘滑、醇厚和陈香等特点；②代谢有益物质于普洱茶中增强普洱茶保健功效，形成茶类中的特色茶。

发酵茶除农药残留、重金属污染外，其危害因子可能还来自其在渥堆或存储过程中来自真菌产生的真菌毒素。真菌毒素是一些真菌在生长过程中产生的生物毒素，目前已知的真菌毒素有200余种，真菌毒素毒性谱较广，如抑制免疫系统、造血系统、导致神经内分泌紊乱、及肝肾损伤等。有时其毒性作用表现为地方病，更为严重的是，部分真菌毒素已被证实具有致癌、致畸和致突变作用。普洱茶由于其生产加工过程采用的渥堆发酵工艺适于真菌毒素生长，因而存在真菌毒素污染的可能。特别某些采用湿仓存储的普洱茶也同样存在被真菌毒素污染的潜在风险。

目前国内外对茶叶的卫生质量问题的研究大多集中在重金属检测、稀土检测和农药残留检测等方面，对茶叶中功能性成分的抗氧化、抑菌作用以及抗癌等活性作用研究较多。随着国内外对普洱茶等发酵茶中真菌毒素污染情况调查研究的深入，发现此类产品中可能存在的真菌毒素的污染情况多种多样，不是简单的被少数一种或两种毒素污染的情况，各种真菌毒素都有可能对普洱茶等造成污染，从而产生潜在食品安全危险。目前国内外对一些食品中有关的黄曲霉菌B₁(AFB₁)、赭曲霉菌A(OTA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、展青霉素(PAT)等真菌毒素污染情况的检测分析较多，但是缺乏对普洱茶等多种发酵茶中10种或10以上真菌毒素同时检测的研究，同时也缺乏不同类型发酵茶中真菌毒素风险评价的系统研究。

综上所述，目前国内外对普洱茶、广西六堡茶等发酵茶中多种真菌毒素的检测方法，操作繁琐，效率低，且不能实现10种或10种以上真菌毒素的高通量检测，本发明即针对上述问题而研究提出。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测发酵茶中真菌毒素的方法，将发酵茶试样经极性溶液溶解盐析后，先后进行离心、过滤，最终置于1290/6460超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中分析，在分析过程中采用流动相为(0.1％甲酸-5mM乙酸铵-水)-甲醇，且流动相A为0.1％甲酸-5mM乙酸铵-水，流动相B为甲醇，并采用逐步提高流动相B的浓度的梯度洗脱方式进行分离，为此，使得发酵茶试样中的真菌毒素在短时间内达到基线分离，解决了发酵茶中多种真菌毒素的有效提取和测定，可同时快速地检测出多种真菌毒素，具有检测高效、环境污染小、步骤操作简便、易于推广使用的特点。

为解决上述技术问题，本发明一种用于检测发酵茶中真菌毒素的方法,包括

A、选样：选择发酵茶，并将发酵茶试样进行粉碎；

B、称样：称取粉碎的发酵茶试样，并加入极性溶液和盐析剂，得混合液a，所述极性溶液为乙腈-水溶液或者乙酸-乙腈-水溶液，所述盐析剂为硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和二水结晶盐、柠檬酸氢二钠合一个半水结晶盐的混合盐；

E、振荡离心：将步骤B所得混合液a先后分别进行涡旋、超声提取、离心，得到上清液b；

F、过滤，将上清液b置于有机滤膜中过滤，得到目标检测液；

G、分析：将目标检测液置于1290/6460超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中分析，并处理数据。

所述G步骤采用流动相为(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇，且流动相A为0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水，流动相B为甲醇，采用逐步提高流动相B的浓度的梯度洗脱方式进行分离，且所述梯度洗脱方式为：0-1.5min，90％A和10％B；1.5-5.0min，45％A和55％B；5.0-7.5min，10％A和90％B，7.5-8.0min，45％A和55％B，8.0-8.5min，90％A和10％B。

所述G步骤中采用色谱柱为SB-C18柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，柱温：35℃；进样体积：2μL；流速：0.3mL/min。

所述G步骤中离子源为鞘流电喷雾离子源，扫描方式先后按正、负离子扫描；检测方式为多反应监测；鞘气温度：310℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：500V(ESI⁺)/-1000V(ESI^-)；雾化气压力：45psi；毛细管电压：4000V(ESI⁺)/3500V(ESI^-)；离子驻留时间：20ms。

步骤E和步骤F之间还包括净化步骤，即将上清液b通过净化管A净化，且所述净化管A具体参数为：含400.1mgPSA、400.1mgC18、45.0mgBulkCarbogragh、1199.8mg硫酸镁。

步骤B所述乙腈-水溶液中乙腈和水的体积配比为84：16，乙酸-乙腈-水溶液中乙腈和水的体积配比为84：16，其中乙酸在乙酸-乙腈-水溶液的比例为1％；步骤F所述有机滤膜的孔径为0.22μm；步骤E中超声提取时间为10min，并在1000r/min的条件下离心5min。

【附图说明】

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明，其中：

图1为标准品中黄曲霉毒素B₁的分子结构图；

图2为标准品中黄曲霉毒素B₂的分子结构图；

图3为标准品中黄曲霉毒素G₁的分子结构图；

图4为标准品中黄曲霉毒素G₂的分子结构图；

图5为标准品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分子结构图；

图6为标准品中3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分子结构图；

图7为标准品中玉米赤霉烯酮的分子结构图；

图8为标准品中T-2毒素的分子结构图；

图9为标准品中HT-2毒素的分子结构图；

图10为标准品中赭曲霉毒素A的分子结构图；

图11为采用(0.1％甲酸-5mM乙酸铵-水)-乙腈作为流动相的分离效果图；

图12为采用(0.01％甲酸-0.05％氨水-水)-甲醇作为流动相的分离效果图；

图13为采用(0.1％甲酸-水)-甲醇作为流动相的分离效果图；

图14为采用(0.1％甲酸-10mmol/L乙酸铵-水)-甲醇作为流动相的分离效果图；

图15为采用(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇作为流动相的分离效果图；

图16为10种真菌毒素在优化的色谱和质谱条件下的总离子色谱图；

图17为真菌毒素混合工作溶液中AFB₁在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图18为真菌毒素混合工作溶液中AFB₂在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图19为真菌毒素混合工作溶液中AFG₁在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图20为真菌毒素混合工作溶液中AFG₂在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图21为真菌毒素混合工作溶液中DON在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图22为真菌毒素混合工作溶液中3-AcDON在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图23为真菌毒素混合工作溶液中ZEN在ESI^-条件下的MRM定量离子色谱图；

图24为真菌毒素混合工作溶液中T-2在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图25为真菌毒素混合工作溶液中HT-2在ESI⁺条件下的MRM定量离子色谱图；

图26为真菌毒素混合工作溶液中OTA在ESI^-条件下的MRM定量离子色谱图。

【具体实施方式】

1.实验材料与方法

(1)仪器、试剂与材料

1290/6460超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪(UPLC-MS/MS)；高速冷冻离心机；MILLI-Q纯水机；Mycospin400净化柱、盐析剂(含4g硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸三钠和二水结晶盐以及0.5g柠檬酸氢二钠合一个半水结晶盐)、净化管A(含400.1mgPSA、400.1mgC18、45.0mgBulkCarbogragh、1199.8mg硫酸镁)、净化管B(含149.9mgPSA、900.1mg硫酸镁)、净化管C(含147.7mgPSA、15.1mgBulkCarbogragh、887.2mg硫酸镁)。

毒素标准品：黄曲霉毒素B₁(AFB₁，1162-65-8)、黄曲霉毒素B₂(AFB₂，7220-81-7)、黄曲霉毒素G₁(AFG₁，1165-39-5)、黄曲霉毒素G₂(AFG₂，7241-98-7)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON，51481-10-8)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON，50722-38-8)、玉米赤霉烯酮(ZEN，17924-92-4)、T-2毒素(T-2，21259-20-1)、HT-2毒素(HT-2，26934-87-2)、赭曲霉毒素A(OTA，303-47-9)，标准品的分子结构如图1-图10所示；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯。发酵茶包括普洱茶、湖南黑茶、广西六堡茶、湖北老青茶，在超市或茶叶店购买。

(2)色谱条件

色谱柱：AgilentZorbaxRrhdSB-C₁₈柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；柱温：35℃；进样体积：2μL；流速：0.3mL/min；流动相：A为0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水，B为甲醇，梯度洗脱程序：0-1.5min，90％A和10％B；1.5-5.0min，45％A和55％B；5.0-7.5min，10％A和90％B，7.5-8.0min，45％A和55％B，8.0-8.5min，90％A和10％B。

(3)质谱条件

离子源为鞘流电喷雾离子源(JetESI)，扫描方式先正离子扫描，后负离子扫描；检测方式为多反应监测(MRM)；鞘气温度：310℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：500V(ESI⁺)/-1000V(ESI^-)；雾化气压力：45psi；毛细管电压：4000V(ESI⁺)/3500V(ESI^-)；离子驻留时间(Dwelltime)：20ms。其他质谱参数采集条件见表1，其中标注*为定量离子。

表1

(4)标准储备液及工作液的配置

用乙腈将各真菌毒素标准品配置成500μg/L的单标储备液，于-20℃中保存，可在冰箱中保存。取适量的各真菌毒素单标储备液，用20％甲醇-水溶液配成真菌毒素混合标准溶液，其中AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的浓度为均25μg/L，且DON、3-AcDON、HT-2、T-2、OTA、ZEN的浓度均为100μg/L。配制标准工作曲线时，将单标储备液用流动相稀释成不同浓度，现配现用。

(5)样品处理方法

方法一：准确称取2g粉碎的发酵茶试样(精确到0.01g)，置于50mL离心管中，加入10mL乙腈+水溶液(按体积配比84：16)，得到混合液a；将混合液a分别先后涡旋3min，超声提取10min，于4℃下10000r/min离心5min，过滤得到上清液b；取1mL上清液b过MycoSpin400多功能净化柱，再经过孔径为0.22μm有机滤膜过滤，得到目标检测液，将目标检测液置于1290/6460超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中分析。

方法二：准确称取2g粉碎的发酵茶(精确到0.01g)，置于50mL离心管中，加入10mL1％的乙酸-乙腈-水溶液(按体积配比84：16)，得到混合液a；将混合液a分别先后涡旋3min，超声提取10min，并在离心管中加入盐析剂，涡旋3min后，于10000r/min离心5min，过滤得到上清液b，取5mL上清液b至15mL净化管，混匀，涡旋3min，于10000r/min离心5min，过滤得到上清液b'，再取1mL上清液b'经过孔径为0.22μm有机滤膜过滤，得到目标检测液，将目标检测液置于1290/6460超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中分析。

(6)基质效应分析

以不含目标真菌毒素的茶叶样品，按上述前处理方法处理后得到的溶液为基质空白，向基质空白中加入一定浓度的真菌毒素混合标准溶液，得到真菌毒素混合工作溶液，经1290/6460超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪分析后，比较其与相同浓度水平的单标储备液(以20％甲醇-水溶液作为溶剂)的质谱响应情况，计算各毒素在真菌毒素混合工作溶液与单标储备液中峰面积的差异，以评价各种茶叶的基质效应。若两者的峰面积之比在80-120％之间，表明基质效应不明显；反之，表明基质效应显著。

2.成果取得

(1)质谱条件的优化

AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、DON、3-AcDON、HT-2和T-2含有C＝O或甲氧基(CH₃O^-)，易得到氢离子，正电离模式下可呈现较好的响应；OTA和ZEN分子中则含有羟基(-OH)、酚羟基等，易失去氢离子，在负电离模式下可以得到较好的响应。因此，依据洗脱顺序设定先为正离子模式后为负离子模式，为此，即可实现这10种真菌毒素的同时检测。依据10种真菌毒素的出峰分离情况，可以分为两个时间段进行检测，第一时间段在正离子模式下检测AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、DON、3-AcDON、HT-2和T-2，第二时间段在负离子模式下检测OTA和ZEN。经过优化后10种真菌毒素化合物中，AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂DON、3-AcDON6种毒素均以[M+H]⁺形成母离子、T-2以[M+Na]⁺形成母离子、HT-2以[M+NH₄]⁺形成母离子，而ZEN和OTA两种毒素则以[M-H]^-方式形成母离子，具体见表1所示。针对每个母离子选取两个子离子用以对化合物进行定性和定量分析。且本试验最终确定的各种真菌毒素在MRM模式下信号采集的特征离子对、碰撞能等参数条件见表1所示。

(2)液相色谱条件的优化

流动相种类和比例是本发明的处理因素。本发明分别考察了(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-乙腈、(0.01％甲酸-0.05％氨水-水)-甲醇、(0.1％甲酸-水)-甲醇、(0.1％甲酸-10mmol/L乙酸铵-水)-甲醇和(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇作为流动相的效果，其效果图如图11-图15所示。试验结果表明，(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-乙腈作为流动相时，峰型较差，T-2、ZEN响应值较低，且AFB₂、AFG₁未能分开，3-AcDON、HT-2、OTA未出峰；(0.01％甲酸-0.05％氨水-水)-甲醇作为流动相时响应略低，T-2、OTA未分开；(0.1％甲酸-水)-甲醇和(0.1％甲酸-10mmol/L乙酸铵-水)-甲醇作为流动相时，峰形较好，但部分的毒素响应值较低。只有当流动相为(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇时，以上10种毒素的质谱信号和灵敏度明显比其他高，且峰形对称，有利于定量分析。因此优选采用(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇作为流动相。

为了使10种真菌毒素在短时间内达到基线分离，本发明方法采用逐步提高流动相中甲醇的浓度的梯度洗脱方式进行分离。结果显示，初始甲醇比例越大，出峰越快，待分析物可在6.5min内出峰完毕。如图16所示，10种真菌毒素在优化的色谱和质谱条件下的总离子色谱图，其中，AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的浓度为均25μg/L，DON、3-AcDON、HT-2、T-2、OTA、ZEN的浓度均为100μg/L。各真菌毒素的出峰保留时间依次为：DON2.67min、3-AcDON3.22min、AFG₂3.44min、AFG₁3.63min、AFB₂4.05min、AFB₁4.33min、HT-25.85min、T-26.09min、OTA6.21min、ZEN6.25min。真菌毒素混合工作溶液中各个真菌毒素在ESI⁺和ESI^-条件下的MRM定量离子色谱图，如图17-图26所示。

(3)样品提取条件的优化

要快速对发酵茶中的多种真菌毒素进行同时筛查，不仅需要提高提取效率，而且同时还要把不同样品中目标化合物损失降到最小。因此，食品中有毒化合物前处理方法的关键是选择提取效率良好的提取溶剂和高效的净化方法。

1)提取剂的选择

本发明真菌毒素的提取采用极性溶液进行，现有技术中乙腈-水体系是使用最为广泛的提取溶剂。然而单一乙腈作为提取液对pH值、极性范围敏感的真菌毒素的提取效果较差，为此，还需要在乙腈中添加辅助试剂(包括乙酸、甲酸和甲醇)作为提取液，以增强联合提取的效果。本发明在提取剂中加入1％的乙酸的情况下，比较了不同比例的乙腈-水溶液及甲醇-水溶液的提取效果。在乙腈-水溶液提取溶剂中，还比较了乙腈的浓度(体积比)分别为50％、79％、84％、100％时的提取效果。结果表明，随着乙腈浓度的提高，目标分析物的提取回收率也逐步提高，当乙腈浓度为84％时，各种毒素的提取回收率最高，回收率在79.9％～100.3％之间，10种真菌毒素在不同提取剂下的回收率比较(％)，如表2所示。因此，本发明优选采用含1％乙酸的乙腈/水(体积比为84:16)作为提取剂。同时在提取过程中向样品的乙腈溶液中加入盐析剂，所述盐析剂为硫酸镁、氯化钠等，进一步利于目标化合物向乙腈相中转移。

表2

2)净化方式的选择

由于直接用提取剂提取，其基质效应比较强，导致色谱峰不好，而且对色谱柱和仪器的损坏较大。本发明采用基质固相分散的提取净化方法，即将样品的分散、萃取及净化一次完成，具有省时省力，操作方便特点，同时有效保护了色谱柱和仪器。

本发明发明对不同成分组成的净化管的净化效果进行了比较，10种真菌毒素在不同净化处理下的回收率比较(％)，如表3所示。经过净化管A净化后，多数真菌毒素的回收率较高。与净化管A净化相比，Mycospin400净化柱净化后，除DON、T-2外，大部分目标分析物的回收率也较高。综合考虑后，本发明优选用BondElut的净化管A(含400.1mgPSA、400.1mgC18、45.0mgBulkCarbogragh、1199.8mg硫酸镁)，其回收率在73.1％～101.6％之间。由此可见，本发明优选“样品前处理方法”中的“方法二”作为本发明样品前处理方法，可以获得较高的回收率。

表3

(4)基质效应分析

试验中以阴性空白样品提取液基质作为溶剂，配制混合标准溶液(AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的浓度为10μg/L，DON、3-AcDON、HT-2、T-2、OTA、ZEN的浓度均为50μg/L)，测定各真菌毒素的峰面积(A)。接着以20％甲醇水为溶剂配制相应浓度的混合标准溶液，测定其峰面积(B)。则有：

基质效应ME(％)＝B/A×100

经定量测定表明，AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂、3-AcDON、HT-2、T-2和ZEN的基质效应为82.6％～117.3％，表示8种毒素受基质效应影响不大，抑制不明显。但DON、OTA的基质效应明显，峰面积之比均不在80～120％区间。其中，DON在普洱茶中为129.3％，在湖南黑茶中为133.0％，在广西六堡茶中为72.6％，在湖北老青茶为124.7；OTA在普洱茶中为135.8％，在湖南黑茶中为128.1％，在广西六堡茶中为112.5％，在湖北老青茶为146.8％。为了同时准确地测定这上述10种真菌毒素，因此选用基质添加曲线作为定量曲线。

(5)方法的线性范围与定量限

配制标准溶液系列后采用上述优化的条件进行进样分析。以定量离子对的响应值(y)及其对应的质量浓度(x)作线性回归，考察标准溶液曲线的线性范围和相关系数。结果表明，10种真菌毒素在ESI模式下均呈良好的线性关系，相关系数(r)≥0.9995，10种真菌毒素的标准曲线、线性范围和定量限(LOQ，S/N＝10)，具体如表4所示。

根据10种真菌毒素在质谱MRM模式下响应的不同，将其配制成不同浓度的混标溶液，在空白样品中添加目标化合物，按照样品处理方法进行前处理，上机测定，以10倍信噪比(S/N)对应的添加水平作为方法的定量限(LOQ)，计算得出10种真菌毒素的LOQ分别为0.1～10μg/kg。

表4

表5％

表5续％

(6)方法的回收率和精密度

以不含毒素的发酵茶作为空白样品，分别添加低(加标1)、中(加标2)和高(加标3)三个水平的毒素，计算方法的加标回收率和精密度，每个添加浓度做3个平行。其中，加标1、加标2和加标3分别为各毒素定量限的1倍、10倍和100倍。发酵茶中10种真菌毒素的回收率(％)及相对标准偏差(n＝3)，如表5所示，10种真菌毒素的回收率为61.9％～120.3％，相对标准偏差(RSD)为3.2％～16.1％。

3.总结

本发明方法通过对质谱、色谱及样品前处理条件的优化，建立了针对黄曲霉毒素B₁(AFB₁)、黄曲霉毒素B₂(AFB₂)、黄曲霉毒素G₁(AFG₁)、黄曲霉毒素G₂(AFG₂)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2毒素(T-2)、HT-2毒素(HT-2)、赭曲霉毒素A(OTA)等10种真菌毒素的快速定量分析方法，具有如下优点：

(1)实验设备简单。

(2)试剂使用量少，在全部提取净化步骤中，有机试剂使用量大约在5～25mL之间，废弃液在15mL以内，对环境污染小。

(3)前处理步骤少，整个提取净化操作是在重复振荡—离心—再振荡中完成，操作技术难度低，适宜推广。

(4)处理时间短，全部提取净化步骤可在30min内完成，适合批量分析。

(5)实现多组分提取净化，通过设计提取液配方，选择适宜盐析剂和净化剂，可实现多真菌毒素的联合提取，提高分析效率；

(6)操作人员暴露风险低。

另外，本发明方法采用超高效液相色谱系统(UPLC)，其提供了更高的效率，因而具有更好的分离度、样品通量和灵敏度，可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果：(1)高分离度：在对普洱茶等渥堆发酵茶中多种真菌毒素的检测过程中，能够分离出更多的色谱峰，将各种不同真菌毒素分离开来，避免相互之间干扰；(2)高样品通量：缩短检测周期，分离速度成倍提高；(3)高灵敏度：由于食品中的真菌毒素限量大多为ppb级，能够得到更高的柱效、更窄的色谱峰宽从而有更加高的灵敏度，可以满足各种真菌毒素的检测要求；(4)UPLC与质谱(MS)联用，可以实质性地改善质谱检测结果的质量。UPLC的超强分离能力有助于目标化合物与之竞争电离的杂质的分离，从而可以使质谱检测器的灵敏度因离子抑制现象的减弱或克服而得到进一步的提高。

Claims (1)

1.一种用于检测发酵茶中真菌毒素的方法,检测发酵茶中真菌毒素包括：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素、赭曲霉毒素A，其特征在于包括:

A、选样：选择发酵茶，并将发酵茶试样进行粉碎；

B、称样：称取粉碎的发酵茶试样，并加入极性溶液和盐析剂，得混合液a，所述极性溶液为乙腈-水溶液或者乙酸-乙腈-水溶液，所述盐析剂为硫酸镁、氯化钠、柠檬酸三钠和二水结晶盐、柠檬酸氢二钠合一个半水结晶盐的混合盐；

E、振荡离心：将步骤B所得混合液a先后分别进行涡旋、超声提取、离心，得到上清液b；

F、过滤：将上清液b置于有机滤膜中过滤，得到目标检测液；

G、分析：将目标检测液置于1290/6460超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪中分析，并处理数据；

所述G步骤采用流动相为(0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水)-甲醇，即流动相A为0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵-水，流动相B为甲醇，采用逐步提高流动相B的浓度的梯度洗脱方式进行分离，且所述梯度洗脱方式为：0-1.5min，90％A和10％B；1.5-5.0min，45％A和55％B；5.0-7.5min，10％A和90％B，7.5-8.0min，45％A和55％B，8.0-8.5min，90％A和10％B；

所述G步骤中采用色谱柱为SB-C18柱,规格为2.1mm×100mm，填料粒径为1.8μm，柱温：35℃；进样体积：2μL；流速：0.3mL/min；

所述G步骤中离子源为鞘流电喷雾离子源，扫描方式先后按正、负离子扫描；检测方式为多反应监测；鞘气温度：310℃；鞘气流量：11L/min；喷嘴电压：500V ESI⁺/-1000V ESI^-；雾化气压力：45psi；毛细管电压：4000V ESI⁺/3500V ESI^-；离子驻留时间：20ms；

步骤E和步骤F之间还包括净化步骤，即将上清液b通过净化管A净化，且所述净化管A具体参数为：含400.1mg PSA、400.1mg C18、45.0mg Bulk Carbogragh、1199.8mg硫酸镁；

步骤B所述乙腈-水溶液中乙腈和水的体积配比为84：16，乙酸-乙腈-水溶液中乙腈和水的体积配比为84：16，其中乙酸在乙酸-乙腈-水溶液的比例为1％；步骤F所述有机滤膜的孔径为0.22μm；步骤E中超声提取时间为10min，并在1000r/min的条件下离心5min。

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