CN112763599A - 一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素a的检测方法 - Google Patents

一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素a的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法，属于分析检测技术领域。本发明的检测方法采用甲醇水溶液进行提取，能够将饲料样品中的大部分玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A释放到提取液；无水硫酸镁和氯化钠产生盐析效应，使提取液中亲水成分的溶解度降低，促使有机相和水相分离，提高提取率；N‑丙基乙二胺吸附脂肪酸、部分色素和糖，C18净化剂能够吸附油脂和非极性物质，达到净化作用。本发明的检测方法的平均回收率为75～127％，平均相对标准偏差均在15％以内；对玉米赤霉烯酮的检出限为1.48μg/kg，定量限为4.95μg/kg；赭曲霉毒素A的检出限为0.68μg/kg，定量限为2.26μg/kg。

Description

一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮又名F-2毒素，是一种主要由镰刀菌产生的高毒性次级代谢产物。玉米赤霉烯酮化学结构性质稳定，难溶于水，易溶于甲醇、氯仿等有机溶液；高温下不易分解，在加工过程中不易被破坏。玉米赤霉烯酮具有强烈的雌激素活性，对人类健康有巨大威胁。玉米赤霉烯酮在人体内的积累会导致激素平衡紊乱，影响生殖系统、损害肝脏系统和破坏免疫系统。
赭曲霉毒素是一类由曲霉属和青霉属产生的次级代谢产物，其中赭曲霉毒素A产毒量最高，毒性最强，具有肾毒性、致畸性和致癌性。赭曲霉毒素A结构稳定，耐热性强，进入人体后不易被代谢，严重损害人体健康。
玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的污染范围很广，主要存在于玉米、小麦、燕麦和其他谷物中；而这些谷物是饲料的重要原料之一，因此，饲料有潜在的受污染风险。两种毒素可通过食物链富集在动物和人体内，损害人体健康。
现行饲料真菌毒素的检测方法中，玉米赤霉烯酮使用的是薄层色谱法和酶联免疫吸附测定法，上述方法的前处理较为繁琐，并且方法的灵敏度和精确度都较低，不适用于真菌毒素的痕量检测。赭曲霉毒素A使用的是免疫亲和柱净化-高效液相色谱法，上述方法的定量限为5μg/kg能够达到检测要求，但是净化过程操作复杂、成本高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法，本发明提供的检测方法净化操作简单、前处理操作简单，且对玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A检测灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法，包括以下步骤：
将饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；
在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠混合，依次进行盐析、第一离心，收集上清液；
将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，依次进行净化、第二离心，得到待测液；
将所述待测液进行HPLC-MS/MS测定，得到待测液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积；
将所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积分别代入玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线，得到所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的含量；
所述HPLC-MS/MS包括色谱参数和质谱参数：
所述色谱参数包括：色谱柱为XR-ODSⅢC18，尺寸为75mm×2.0mm，1.6μm；流动相A为甲酸-乙酸铵-水混合溶液，所述流动相A中，甲酸的体积浓度为0.02％，乙酸铵的浓度为2mmol/L；流动相B为乙腈；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL；梯度洗脱程序为：
0～0.5min：10％B；
0.5～5min：10～95％B；
5～7min：95％B；
7～7.1min：95～10％B；
7.1～10min：10％B；
所述质谱参数包括：离子源：电喷雾离子源；模式为：多反应监测模式；离子源接口温度为300℃；脱溶剂温度为250℃；加热块温度为400℃；雾化气流速为3L/min；加热气流速为10L/min；干燥气流速为10L/min；玉米赤霉烯酮前体离子317.10，定量离子131.05，碰撞电压30eV，定性离子175.1，碰撞电压24eV；赭曲霉毒素A前体离子404.00，定量离子239.00，碰撞电压-25eV，定性离子221.00，碰撞电压-34eV。
优选地，所述饲料样品的粒径≤1.0mm。
优选地，所述甲醇水溶液的体积浓度为80％，所述饲料样品和甲醇水溶液的用量比为5g：10～25mL。
优选地，所述提取在超声的条件下进行，所述超声的频率为4000Hz，时间为5～30min。
优选地，所述饲料样品、无水硫酸镁和氯化钠的质量比为5g：(1～4)g：1g。
优选地，所述上清液、N-丙基乙二胺和C18的用量比为2mL：0.15g：0.15g。
优选地，所述玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线由包括以下步骤的方法制备得到：
吸取玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准溶液，用乙腈配制成玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A浓度均为1mg/kg的混合标准溶液；
将未受污染的饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠，进行盐析、第一离心，收集上清液；将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，进行净化、第二离心，收集上清液作为基质溶液；
采用所述基质溶液稀释混合标准溶液，得到玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的梯度浓度为1～100μg/kg的基质标准溶液；
采用HPLC-MS/MS对所述基质标准溶液进行测定，得到基质标准溶液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的系列峰面积；
将玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A相应浓度和对应的峰面积进行回归分析，得到玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线。
本发明提供了一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法，包括以下步骤：将饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠混合，进行盐析、第一离心，收集上清液；将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，进行净化、第二离心，得到待测液；将所述待测液进行HPLC-MS/MS检测，得到待测液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积；将所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积分别代入玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线，得到所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的含量。
本发明采用甲醇水溶液对饲料样品进行提取，能够将饲料样品中的大部分玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A释放到提取液；无水硫酸镁和氯化钠能够产生盐析效应，使提取液中亲水成分的溶解度降低，促使有机相和水相分离，提高提取效率；N-丙基乙二胺具有弱的阴离子交换能力，可吸附脂肪酸、部分色素和糖，而C18净化剂能够吸附油脂和非极性物质，起到净化的作用。本发明提供的检测方法中的前处理操作，能够实现饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的大量释放，且能够充分净化提取物，提高待测物的可检测性。本发明提供的检测方法的平均回收率为75～127％，平均相对标准偏差均在15％以内；对玉米赤霉烯酮的检出限为1.48μg/kg，定量限为4.95μg/kg；对赭曲霉毒素A的检出限为0.68μg/kg，定量限为2.26μg/kg；均比现行国标GB/T 19540-2004(饲料中玉米赤霉烯酮的测定)和GB/T 30957-2014(饲料中赭曲霉毒素A的测定)的定量限更低；说明本发明提供的检测方法灵敏度高。
附图说明
图1为地区一玉米赤霉烯酮(ZEA)含量最高的饲料样品的色谱图；
图2为地区一赭曲霉毒素(OTA)含量最高的饲料样品的色谱图；
图3为地区二玉米赤霉烯酮(ZEA)含量最高的饲料样品的色谱图；
图4为地区二赭曲霉毒素(OTA)含量最高的饲料样品的色谱图；
图5为地区三玉米赤霉烯酮(ZEA)含量最高的饲料样品的色谱图；
图6为地区三赭曲霉毒素(OTA)含量最高的饲料样品的色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法，包括以下步骤：
将饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；
在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠混合，进行盐析、第一离心，收集上清液；
将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，进行净化、第二离心，得到待测液；
将所述待测液进行HPLC-MS/MS检测，得到待测液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积；
将所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积分别代入玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线，得到所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的含量。
本发明将饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液。在本发明中，所述饲料样品的粒径优选≤1.0mm；所述甲醇水溶液的体积浓度优选为80％；所述饲料样品和甲醇水溶液的用量比优选为5g：(10～25)mL，进一步优选为5g：20mL。在本发明中，饲料样品和甲醇水溶液的混合优选在振荡的条件下进行，所述振荡的转速优选为1000rpm，时间优选为30min。在本发明中，所述提取优选在超声的条件下进行，所述超声的频率优选为4000Hz，时间优选为5～30min，进一步优选为30min。在本发明中，以甲醇水溶液为提取剂，在超声条件下，使饲料样品组织发生变形，释放待测物质到提取剂中。
得到提取液后，本发明在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠混合，进行盐析、第一离心，收集上清液。在本发明中，所述饲料样品、无水硫酸镁和氯化钠的质量比优选为5g：(1～4)g：1g，进一步优选为5g：4g：1g。在本发明中，所述盐析优选在振荡的条件下进行，所述振荡的转速优选为1000rpm，时间优选为1min。在本发明中，所述第一离心的转速优选为4500rpm，时间优选为1min。在本发明中，无水硫酸镁和氯化钠能够产生盐析效应，促使有机相和水相分离，提高提取效率。
得到上清液后，本发明将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，进行净化、第二离心，得到待测液。本发明中，所述N-丙基乙二胺的粒径优选为40μm；所述C18净化剂的粒径优选为40～60μm；所述C18净化剂优选购自广州太玮生物科技有限公司。在本发明中，所述上清液、N-丙基乙二胺和C18的用量比优选为2mL：0.15g：0.15g。在本发明中，所述净化优选在振荡的条件下进行，所述振荡的转速优选为1000rpm，时间优选为1min。在本发明中，所述第二离心的转速优选为4500rpm，时间优选为5min。收集上清液后，本发明优选还包括将所得上清液过0.22μm的有机滤膜。在本发明中，所述N-丙基乙二胺具有弱的阴离子交换能力，可吸附脂肪酸、部分色素和糖，而C18净化剂能够吸附油脂和非极性物质，起到净化的作用。
得到待测液后，本发明将所述待测液进行HPLC-MS/MS检测，得到待测液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积。在本发明中，所述HPLC-MS/MS包括色谱参数和质谱参数。
在本发明中，所述色谱参数包括：
色谱柱：XR-ODSⅢC18，尺寸为75mm×2.0mm，1.6μm；
流动相A：甲酸-乙酸铵-水混合溶液，所述流动相A中，甲酸的体积浓度为0.02％，乙酸铵的浓度为2mmol/L；
流动相B：乙腈；
流速：0.4mL/min；
柱温：40℃；
进样量：2μL；
梯度洗脱程序为：
0～0.5min：10％B；
0.5～5min：10～95％B；
5～7min：95％B；
7～7.1min：95～10％B；
7.1～10min：10％B。
在本发明中，所述质谱参数包括：
离子源：电喷雾离子源；
模式：多反应监测模式；
离子源接口温度：300℃；
脱溶剂温度：250℃；
加热块温度：400℃；
雾化气流速：3L/min；
加热气流速：10L/min；
干燥气流速：10L/min；
玉米赤霉烯酮前体离子317.10，定量离子131.05，碰撞电压30eV，定性离子175.1，碰撞电压24eV；
赭曲霉毒素A前体离子404.00，定量离子239.00，碰撞电压-25eV，定性离子221.00，碰撞电压-34eV。
得到待测液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积后，本发明将所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积分别代入玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线，得到所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的含量。
在本发明中，所述玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线优选由包括以下步骤的方法制备得到：
吸取玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准溶液，用乙腈配制成玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A浓度均为1mg/kg的混合标准溶液；
将未受污染的饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠，进行盐析、第一离心，收集上清液；将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，进行净化、第二离心，收集上清液作为基质溶液；
采用所述基质溶液稀释混合标准溶液，得到玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的梯度浓度为1～100μg/kg的基质标准溶液；
采用HPLC-MS/MS对所述基质标准溶液进行测定，得到基质标准溶液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的系列峰面积；
将玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A相应浓度和对应的峰面积进行回归分析，得到玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线。
在本发明中，所述基质溶液的获取过程的参数优选与上述技术方案中饲料样品制备待测液的参数一致，在此不再赘述。
在本发明中，所述HPLC-MS/MS的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
本发明对所述回归分析的方法不做具体限定，采用本领域技术人员熟知的操作即可。
下面结合实施例对本发明提供的饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例所采用的HPLC-MS/MS参数包括：
色谱参数：色谱柱为XR-ODSⅢC18(75mm×2.0mm，1.6μm)；流动相A：甲酸-乙酸铵-水混合溶液，流动相A中，甲酸的体积浓度为0.02％，乙酸铵的浓度为mmol/L；流动相B为乙腈；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL。
流动相梯度洗脱程序如表1所示。
表1流动相梯度洗脱程序
Figure BDA0002855237760000071
Figure BDA0002855237760000081
质谱参数：离子源为电喷雾离子源；模式为多反应监测模式；离子源接口温度300℃；脱溶剂温度为250℃；加热块温度为400℃；雾化气流速为3L/min；加热气流速为10L/min；干燥气流速为10L/min；多反应检测参数如表2所示.表2多反应检测参数
Figure BDA0002855237760000082
*定量离子
实施例1线性实验
混合标准溶液的配制：吸取1mL浓度为10mg/kg的赭曲霉毒素A标准溶液和200μL浓度为50mg/kg的玉米赤霉烯酮标准溶液到10mL容量瓶中，用乙腈定容到10mL；得到浓度为1mg/kg的混合标准溶液。
基质溶液的配制：选取5.0g(精确到0.01g)未受污染的饲料样品至50mL离心管中，加入20mL体积浓度为80％的甲醇水溶液，于1000rpm、振荡混合30min后，于4000Hz下超声提取30min，得到提取液；向提取液中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，以1000rpm振荡1min后，于4500rpm离心5min，收集上清液；取2mL上清液至15mL离心管中，加入0.15gN-丙基乙二胺粉末和0.15g C18粉末，以1000rpm振荡1min后，于4500rpm离心5min，吸取离心后的液体过0.22μm有机滤膜，作为基质溶液，备用。
基质标准溶液：用移液器枪吸取1、2、5、10、20、50、100μL混合标准溶液于1.5mL的离心管中，再吸取适量的基质溶液补足至1mL，得到浓度梯度为1、2、5、10、20、50、100μg/kg的基质标准溶液，涡旋1min混匀后过0.22μm有机滤膜待测；
利用HPLC-MS/MS对基质标准溶液进行测定，以峰面积对赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮浓度作回归分析，得到回归方程，如表3所示。
表3赭曲霉毒素A基质标准曲线和玉米赤霉烯酮基质标准曲线
Figure BDA0002855237760000091
从表3可以看出：玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A在1～100μg/kg范围内线性关系良好。
实施例2检出限和定量限
检测不同浓度玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的基质标准溶液，以最低浓度基质标准溶液色谱峰以3倍信噪比计算检出限，以10倍信噪比计算定量限。结果如表4所示。
表4玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检出限和定量限结果
Figure BDA0002855237760000092
实施例3回收率和精确度
称取5.0g饲料样品，用移液器移取25、50、125μL混合标准溶液(1mg/kg)，得到添加水平为5、10、25μg/kg三个水平的样品，每个添加水平6个平行，重复提取、盐析和净化，进行加标回收实验。加标回收率和相对标准偏差结算结果如表5所示。
表5加标回收率和相对标准偏差结果
Figure BDA0002855237760000101
从表5可以看出：本发明提供的检测方法平均回收率在75～127％之间，平均相对标准偏差均在15％以内，说明本发明提供的检测方法回收率较高，重复性好。
实施例4
抽取了我国华南地区的饲料样品共计515份；其中，地区一共收集了168个饲料样品，地区二共收集了147个饲料样品，地区三共收集200个饲料样品；每份样品称取约200g，粉碎后混匀，装入保鲜袋中。
称取5.0g(精确到0.01g)饲料样品至50mL离心管中，加入20mL体积浓度为80％的甲醇水溶液，于1000rpm、振荡混合30min后，于4000Hz下超声提取30min，得到提取液；
向提取液中加入4g无水硫酸镁和1g氯化钠，以1000rpm振荡1min后，于4500rpm离心5min，收集上清液；
取2mL上清液至15mL离心管中，加入0.15gN-丙基乙二胺粉末和0.15g C18粉末，以1000rpm振荡1min后，于4500rpm离心5min，吸取离心后的液体过0.22μm有机滤膜，得到待测液。
采用上述的HPLC-MS/MS进行检测。
结果为：地区一采集的168个饲料样品中，只有1个样品未检出玉米赤霉烯酮，检出率为99.4％；113个样品未检出赭曲霉毒素，检出率为32.7％。图1为地区一玉米赤霉烯酮(ZEA)含量最高的饲料样品的色谱图；图2为地区一赭曲霉毒素(OTA)含量最高的饲料样品的色谱图。
地区二采集的147个饲料样品中，所有样品均检出玉米赤霉烯酮，检出率100.0％；62个样品未检出赭曲霉毒素，检出率为57.8％。图3为地区二玉米赤霉烯酮(ZEA)含量最高的饲料样品的色谱图；图4为地区二赭曲霉毒素(OTA)含量最高的饲料样品的色谱图。
地区三收集的200个饲料样品中，所有样品均检出玉米赤霉烯酮，检出率100.0％；142个样品未检出赭曲霉毒素，检出率为29.0％。图5为地区三玉米赤霉烯酮(ZEA)含量最高的饲料样品的色谱图，图6为地区三赭曲霉毒素(OTA)含量最高的饲料样品的色谱图。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种饲料中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；
在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠混合，依次进行盐析、第一离心，收集上清液；
将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，依次进行净化、第二离心，得到待测液；
将所述待测液进行HPLC-MS/MS测定，得到待测液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积；
将所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的峰面积分别代入玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线，得到所述玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的含量；
所述HPLC-MS/MS包括色谱参数和质谱参数：
所述色谱参数包括：色谱柱为XR-ODSⅢC18，尺寸为75mm×2.0mm，1.6μm；流动相A为甲酸-乙酸铵-水混合溶液，所述流动相A中，甲酸的体积浓度为0.02％，乙酸铵的浓度为2mmol/L；流动相B为乙腈；流速为0.4mL/min；柱温为40℃；进样量为2μL；梯度洗脱程序为：
0～0.5min：10％B；
0.5～5min：10～95％B；
5～7min：95％B；
7～7.1min：95～10％B；
7.1～10min：10％B；
所述质谱参数包括：离子源：电喷雾离子源；模式为：多反应监测模式；离子源接口温度为300℃；脱溶剂温度为250℃；加热块温度为400℃；雾化气流速为3L/min；加热气流速为10L/min；干燥气流速为10L/min；玉米赤霉烯酮前体离子317.10，定量离子131.05，碰撞电压30eV，定性离子175.1，碰撞电压24eV；赭曲霉毒素A前体离子404.00，定量离子239.00，碰撞电压-25eV，定性离子221.00，碰撞电压-34eV。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述饲料样品的粒径≤1.0mm。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的体积浓度为80％，所述饲料样品和甲醇水溶液的用量比为5g：10～25mL。
4.根据权利要求1或2或3所述的检测方法，其特征在于，所述提取在超声的条件下进行，所述超声的频率为4000Hz，时间为5～30min。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述饲料样品、无水硫酸镁和氯化钠的质量比为5g：(1～4)g：1g。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述上清液、N-丙基乙二胺和C18的用量比为2mL：0.15g：0.15g。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线由包括以下步骤的方法制备得到：
吸取玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A标准溶液，用乙腈配制成玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A浓度均为1mg/kg的混合标准溶液；
将未受污染的饲料样品和甲醇水溶液混合，进行提取，得到提取液；在所述提取液中加入无水硫酸镁和氯化钠，进行盐析、第一离心，收集上清液；将所述上清液、N-丙基乙二胺和C18净化剂混合，进行净化、第二离心，收集上清液作为基质溶液；
采用所述基质溶液稀释混合标准溶液，得到玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的梯度浓度为1～100μg/kg的基质标准溶液；
采用HPLC-MS/MS对所述基质标准溶液进行测定，得到基质标准溶液中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的系列峰面积；
将玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A相应浓度和对应的峰面积进行回归分析，得到玉米赤霉烯酮基质标准曲线和赭曲霉毒素A基质标准曲线。
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