CN110187014A - 一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素A的方法。所述方法包括如下步骤：利用QuEChERS法处理待测食品得待测食品样品，然后利用液质联用法对待测食品样品进行检测；色谱条件如下：流动相：流动相A为乙酸铵水溶液，流动相B为乙酸铵甲醇溶液；洗脱条件：0→0.5→4→5.1→7.5→8→10min，流动相B的体积分数为18％→35％→55％→90％→95％→18％→18％。本发明采用QuEChERS样品处理与液质联用法联用方法检测食品中的赭曲霉毒素A，可对样品进行定量、半定量分析，使结果具有更高的准确度。本发明提供的方法具有高通量、快速、安全、低成本等特点，可实现食品中赭曲霉毒素A的高效检测。

Description

一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素A的方法
技术领域
本发明属于食品化学检测领域，具体涉及一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素A的方法。
背景技术
近年来，全球食用和饲用农产品受真菌毒素污染日趋严重。如我国出口欧盟食品违例事件中，真菌毒素超标占30％左右，高于重金属、食品添加剂、农药残留等因素。真菌毒素是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，按其主要产毒菌种可分为曲霉菌毒素，如赭曲霉毒素A(ochratoxin A)等。赭曲霉毒素是一种广泛存在于食品中的生物毒素，是动植物和微生物中存在的某种对其他生物物种有毒害作用的、非营养性天然物质成分，或因贮存方法不当，在一定条件下产生的有毒成分。它是由曲霉菌和青霉菌产生的次级有毒代谢产物，包含7种结构类似的化合物；其中赭曲霉毒素A(在自然界中分布最广泛,毒性最强，对人类和动植物影响最大。赭曲霉毒素OTA是一种稳定的无色结晶化合物，具有耐热性，易溶于稀的碳酸氢钠溶液和极性有机溶剂，微溶于水，在紫外照射下呈绿色荧光。研究表明，OTA不仅具有免疫毒性、肾毒性和肝毒性，还有致畸、致突变和致癌作用，国际癌症研究机构已将其定义为Group 2B类致癌物。赭曲霉毒素A以污染粮谷类农作物为主，我国2013年在对食品安全国家标准《食品中真菌毒素限量》(GB 2761-2011)中OTA指标的补充完善中提出了我国食品中赭曲霉毒素A限量标准(5ug/Kg)。
赭曲霉毒素A的分子结构
目前，对生物毒素检测分析技术主要包括薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫吸附法、质谱法、实时聚合酶链反应法、高效毛细管电泳法、压电免疫传感法、极谱法等。薄层色谱法是较早用于毒素检测的一种方法，但是该方法灵敏度相对较差，所需试剂繁多、检测周期长、重现性不好等,已远远不能满足现代检测要求。ELISA是一种免疫化学检测方法，它具有灵敏、快速、简便的特性，适合于大批量样本的检测,但由于存在交叉反应而易造成假阳性，因此需要用其他的方法来验证。HPLC是目前最常用于赭曲霉毒素A检测的方法，检测结果准确、可靠、灵敏度高、重现性好，但由于食品中的OTA含量较低，考虑到其成分复杂,前处理往往需要价格比较昂贵的免疫亲和柱。近年来，在众多的分析测试方法中，质谱技术因为良好的定性确证和定量功能而被越来越多地用于科研和检测领域，尤其是液质联用技术以其同时具备高特异性和高灵敏度的特点而被广泛应用于生物毒素研究领域。液质联用技术技术在保留了传统技术高分离度的同时,还兼备高选择性、高灵敏度、能提供化合物分子质量及结构信息等优点，从分析检测效率及结果看来，是微量样品中痕量组分分析的最好选择。现有的传统真菌毒素分析方法大多是借助免疫亲和柱固相萃取法净化，后续采用高效液相色谱法或液质联用法检测来进行。这种检测方式效率低，成本较高。因此，亟须建立一种食品中低成本、准确、快速的大批量测定方法。
发明内容
本发明的目的在于克服传统真菌毒素分析方法效率低，成本较高的缺陷或不足，提供一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素A的方法。本发明采用QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged and safe)样品处理与液质联用法联用方法检测食品中的赭曲霉毒素A，可对样品进行定量、半定量分析，使结果具有更高的准确度。本发明提供的方法具有高通量、快速、安全、低成本等特点，可实现农作物、饲料等食品中赭曲霉毒素A的高效检测。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素A的方法，包括如下步骤：
利用QuEChERS法处理待测食品得待测食品样品，然后利用液质联用法对待测食品样品进行检测；其中，色谱条件如下：
流动相：流动相A为乙酸铵水溶液，流动相B为乙酸铵甲醇溶液；
洗脱条件：0→0.5min→4min→5.1min→7.5min→8min→10min，流动相B的体积分数为18％→35％→55％→90％→95％→18％→18％。
本发明采用QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged and safe)样品处理对待测食品进行样品前处理。
另外，本发明的发明人通过对色谱条件的优化，得到了合适的流动相条件和洗脱条件。
本发明提供的方法采用QuEChERS样品处理与液质联用法联用方法检测食品中的赭曲霉毒素A，可对样品进行定量、半定量分析，使结果具有更高的准确度。本发明提供的方法具有高通量、快速、安全、低成本等特点，可实现农作物、饲料等食品中赭曲霉毒素A的高效检测。
优选地，所述待测食品为农作物或饲料中的一种或几种。
更为优选地，所述农作物为大米、豆类、玉米或小麦中的一种或几种；所述饲料为以大米、豆类、玉米或小麦中的一种或几种为基料的饲料。
优选地，所述豆类为黄豆、绿豆或黑豆中的一种或几种。
优选地，所述QuEChERS法的过程如下：将待测食品研磨为粉末，加水震荡均匀后加入含乙酸的乙腈溶液，震荡均匀，再加入盐类震荡，离心，取悬浮液即得所述待测食品样品。
优选地，所述乙腈溶液中乙酸的质量分数为1％。
优选地，所述盐类为硫酸镁或乙酸钠中的一种或几种。
具体的，所述QuEChERS法的过程如下：将待测食品样品研磨为粉末，置于离心管中，加入水，震荡均匀；加入质量分数为1％乙酸的乙腈溶液，震荡均匀；加入含有硫酸镁和乙酸钠，震荡2分钟，于4000rpm下高速离心5分钟，缓慢倾倒悬浮液即得。
优选地，所述乙酸铵水溶液中乙酸铵的浓度为1～10mmol/L；所述乙酸铵甲醇溶液中乙酸铵的浓度为1～10mmol/L。
更为优选地，所述乙酸铵水溶液中乙酸铵的浓度为5mmol/L；所述乙酸铵甲醇溶液中乙酸铵的浓度为5mmol/L。
为了正离子质子化，维持样品在流动相中的电离状态，流动相中可添加甲酸。
优选地，所述流动相A和流动相B中均添加有甲酸。
更为优选地，所述流动相A和流动相B中甲酸的质量分数均为0.01％。
优选地，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18RRHT 2.1×50mm，1.8μm。
优选地，保护柱为Agilent ZORBAX Eclipse plus-C18Narrow Bore GuardColumn。
优选地，流速为0.3mL/min。
优选地，进样量为2μL。
优选地，质谱条件为：母峰：m/z：404；碎裂峰m/z：239和358。
优选地，所述方法在检测待测食品样品前还包括配置标准工作液和内标工作液，得到标准曲线的步骤。
优选地，所述标准工作液中赭曲霉毒素A的浓度为0、5、10、15、20ng/mL。
优选地，所述内标工作液中选用13C20-赭曲霉毒素A为内标物。
更为优选地，所述内标工作液中内标物的浓度为0、0.5、1、5、20ng/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用QuEChERS样品处理与液质联用法联用方法检测食品中的赭曲霉毒素A，可对样品进行定量、半定量分析，使结果具有更高的准确度。该发明具有高通量、快速、安全、低成本等特点，实现农作物、饲料等食品中赭曲霉毒素A的高效检测。
附图说明
图1为赭曲霉毒素A的LC-MSMS(MRM)工作曲线；
图2为赭曲霉毒素A工作曲线LC-MSMS(MRM)谱图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素A的方法。包括如下步骤。
(1)溶液配制
10ug/mL赭曲霉毒素A乙腈溶液(分析纯)；流动相A：5mmol/L乙酸铵(0.01％甲酸)水溶液，流动相B：5mmol/L乙酸铵(0.01％甲酸)甲醇溶液；赭曲霉毒素A标准品的配制：浓度分别为20ng/mL，5ng/mL，1ng/mL，0.5ng/mL为标准品曲线。
(2)样品的准备：
1.称取粉末样品(面粉类)或研磨样品(米和豆类)3～5g与50mL离心管中。
2.加入15mL水，盖上盖子，震荡均匀。
3.加入15mL含1％乙酸的乙腈溶液，盖上盖子，震荡均匀。
4.加入一包QuEChERS(6g硫酸镁，1.5g乙酸钠)，强烈震荡2分钟。
5.高速离心(4000RPM)5分钟
6.缓慢倾倒悬浮液备用。
(3)液质联用参数：
HPLC柱子：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18RRHT 2.1×50mm，1.8um。
保护柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus-C18Narrow Bore Guard Column。
温度：60℃。
加样体积：2uL(injection with needle wash，wash vial:methanol)。
流速：0.3mL/min。
检测时间：10分钟。
检测器：MS/MS。
检测方法：MRM(母峰：m/z：404；碎裂峰m/z：239和358)。
HPLC流动相梯度如表1。
表1HPLC流动相梯度
时间(min) 流向相B(％)
0 18
0.5 35
4 55
5.1 90
7.5 95
8 18
10 18
工作曲线浓度，如表2：
表2工作曲线浓度
样品号 浓度ng/mL
1 0
2 0.5
3 1
4 5
5 20
内标物选用13C20-赭曲霉毒素A，其浓度为0、0.5、1、5、20ng/mL。
分析计算：
LC-MS/MS色谱用MassHunter定量分析，标准工作曲线计算样品中赭曲霉毒素A含量。
计算如下：
其中：Amt：工作曲线中得到浓度(ng/ml)；
Vf：样品最终体积(mL)；
Mx＝样品质量(g)。
如图1和图2，分别为为赭曲霉毒素A的LC-MSMS(MRM)工作曲线和赭曲霉毒素A工作曲线LC-MSMS(MRM)谱图，经拟合，得到标准曲线方程y＝85.9733x-1.5246，R2＝0.9999。
利用上述条件对进行如下检测。
一、检测大米中赭曲霉毒素A
其中样品1中大米的质量为3.147g，样品2中大米的质量为3.247g。检测结果如表3。
表3大米中赭曲霉毒素A的检测结果
二、检测大豆中赭曲霉毒素A
其中样品1中大豆的质量为3.893g，样品2中大豆的质量为3.547g。检测结果如表4。
表4大豆中赭曲霉毒素A的检测结果
三、检测玉米中赭曲霉毒素A
其中样品1中玉米的质量为3.364g，样品2中玉米的质量为3.198g。检测结果如表5。
表5玉米中赭曲霉毒素A的检测结果
从上述测试结果可知，本发明提供的方法具有高通量、快速、安全、低成本等特点，可实现农作物、饲料等食品中赭曲霉毒素A的高效检测。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种液质联用检测食品中赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
利用QuEChERS法处理待测食品得待测食品样品，然后利用液质联用法对待测食品样品进行检测；其中，色谱条件如下：
流动相：流动相A为乙酸铵水溶液，流动相B为乙酸铵甲醇溶液；
洗脱条件：0→0.5min→4min→5.1min→7.5min→8min→10min，流动相B的体积分数为18％→35％→55％→90％→95％→18％→18％。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述待测食品为农作物或饲料中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述农作物为大米、豆类、玉米或小麦中的一种或几种；所述饲料为以大米、豆类、玉米或小麦中的一种或几种为基料的饲料。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述QuEChERS法的过程如下：将待测食品研磨为粉末，加水震荡均匀后加入含乙酸的乙腈溶液，震荡均匀，再加入盐类震荡，离心，取悬浮液即得所述待测食品样品。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述乙酸铵水溶液中乙酸铵的浓度为1～10mmol/L；所述乙酸铵甲醇溶液中乙酸铵的浓度为1～10mmol/L。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述流动相A和流动相B中均添加有甲酸。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse PlusC18RRHT 2.1×50mm，1.8μm；保护柱为Agilent ZORBAX Eclipse plus-C18Narrow BoreGuard Column；流速为0.3mL/min；进样量为2μL。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，质谱条件为：母峰：m/z：404；碎裂峰m/z：239和358。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法在检测待测食品样品前还包括配置标准工作液和内标工作液，得到标准曲线的步骤。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述内标工作液中选用13C20-赭曲霉毒素A为内标物。
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