CN108593811B - 一种测定生物体液中百草枯和敌草快含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及一种测定生物体液中百草枯和敌草快含量的方法，该方法包括以下步骤：取体液样品，依次加入Triton X‑114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X‑114的终浓度为0.0545～0.109g/mL，NaCl的终浓度为0.0165～0.0495g/mL，甲酸的终浓度为15～30μL/mL；然后震荡，超声水浴处理，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；取与体液样品同体积的不同浓度的标准溶液制得一系列浓度标准品进样液；将上述制取的待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液用液相离子对色谱法进行检测，得到待测样品和标准品的液相色谱图，再将两者的图谱进行比较确定特征峰，然后根据峰面积以随行标准曲线计算检测样品中百草枯或敌草快的含量。
Description
技术领域
本发明涉及借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料，具体涉及一种测定人体组织中联吡啶类化合物含量的方法。
背景技术
百草枯(paraquat)和敌草快(diquat)同属于联吡啶类化合物,属于非选择性触杀型除草剂，对人、畜毒性较强，目前无特效解毒方法，我国百草枯中毒患者死亡率已高达85％～90％。研究表明，百草枯和敌草快可经皮肤、黏膜、呼吸道、消化道等进入人体，在心、肝、脑、肾等脏器均有分布，其中以肺部分布最多，损伤最大，肺纤维化伴呼吸衰竭是患者中毒后期死亡的主要原因。现代医学普遍认为通过掌握患者就诊时的血药浓度及中毒时间即可评估患者预后情况。临床显示，及时准确地早期诊断中毒并对中毒患者体液毒物浓度(尤其是全血或血浆)进行检测，对于临床制定合理的治疗方案，提高患者的治愈率，降低死亡率都有重要的意义。
目前，百草枯和敌草快的生物样品前处理方法以处理血浆为主，常见方法包括沉淀蛋白法和固相萃取法，但处理过程步骤繁杂，耗时较长，试剂用量较大，不利于临床多样本快速准确的测定。临床上百草枯及敌草快的生物样本检测方法以液相色谱法和液质联用法为主。液相色谱法检测成本较液质联用法低，在临床上应用更广泛，但相对液质联用法，液相色谱法的选择性小、灵敏度低。其中大体积进样液相色谱法与常规液相色谱相比选择性和灵敏度更高。实际生活中生物样品目标物浓度分析往往达到痕量水平，大体积进样液相色谱法在常规液相色谱无法准确定量的水平下仍可发挥作用，甚至在某些组分分析上可作为液质联用分析的代替法。百草枯和敌草快结构相近不易分离，同时常因内源性化合物干扰出现假阳性结果和检测限较高出现假阴性结果，采用液质联用法选择性和灵敏度高，但常需要亲水相互作用色谱柱，仪器耗材的检测和保养成本高，难以在临床上普及应用。因此建立一种选择性高、灵敏度高、检测成本低、检测程序简便易于推广应用的百草枯和敌草快含量的检测方法，对实际临床应用和相关毒理学研究具有重要意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种测定生物体液中百草枯和敌草快含量的方法，该方法具有成本低廉和灵敏度高的优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案是：
一种测定生物体液中百草枯和敌草快含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)制取待测样品进样液：取体液样品，依次加入Triton X-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X-114的终浓度为0.0545～0.109g/mL，NaCl的终浓度为0.0165～0.0495g/mL，甲酸的终浓度为15～30μL/mL(即每毫升样品混合溶液中含甲酸15～30μL)；震荡，40℃超声水浴处理4min，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；
(2)制取标准品进样液：取百草枯和敌草快分别加入体积浓度为0.1％的甲酸水溶液稀释，得到浓度为0～5μg/mL的一系列百草枯标准品溶液和敌草快标准品溶液；按体液样品的体积，分别取每一浓度值的百草枯标准品溶液和敌草快标准品溶液，依次加入TritonX-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X-114的终浓度为0.0545～0.109g/mL，NaCl的终浓度为0.0165～0.0495g/mL，甲酸的终浓度为15.2～30.3μL/mL(即每毫升标准品混合溶液中含甲酸15～30μL)；震荡，40℃超声水浴处理4min，离心，取上清液，过滤，得到一系列浓度标准品进样液；
(3)将所制取的待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液分别用液相离子对色谱法进行如下检测：按进样量为50～500μL，对规格为250mm×4.6mm i.d.,4μm或5μm的液相C12或C18色谱柱进样，控制柱温度为35～45℃，接着用由体积配比为A相91～95％和B相5～9％组成的流动相以1.2～1.4mL/min的流速进行等度洗脱，获得待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液的液相色谱图；其中，所述的流动相的A相由以下方法制成：准确称量0.649～1.730g辛烷磺酸钠放入1000mL容量瓶中，用200mL水溶解后加入2～6mL磷酸,再加入二乙胺调节pH值为3.0～4.0，定容至1000mL，然后抽滤、超声脱气；所述的流动相的B相是乙腈或甲醇；
(4)将待测样品进样液的液相图谱与每一浓度标准品进样液的液相图谱比较，与标准品进样液的液相图谱中保留时间相同的相应成分的特征峰即是与该成分相同物质的特征峰；根据特征峰峰面积以随行标准曲线计算待测样品进样液中百草枯和敌草快的含量。
本发明所述的测定生物体液中百草枯和敌草快含量的方法，其中所述的体液样品为全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、精液、唾液或汗液。
本发明还提供一种实施本发明所述的测定生物体液中百草枯和敌草快含量的方法的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括：
试剂A：浓度为0.14g/mL的Triton X-114水溶液；
试剂B：浓度为0.1308g/mL的NaCl水溶液；
试剂C：甲酸；
试剂D：体积浓度为0.1％的甲酸水溶液；
试剂E：辛烷磺酸钠-磷酸水溶液，该辛烷磺酸钠-磷酸水溶液由以下方法制成：准确称量0.649～1.730g辛烷磺酸钠放入1000mL容量瓶中，用200mL水溶解后加入2～6mL磷酸,再加入二乙胺调节pH值为3.0～4.0，定容至1000mL，然后抽滤、超声脱气；
试剂F：乙腈或甲醇。
本发明采用步骤(1)所述试剂和方法将体液样品中复杂的干扰基质分离，兼容液相离子对色谱大体积进样分析，标准品进样液的制备无需使用基质空白样品或添加内标物，因此较现有技术具有抗干扰能力强、成本低廉和灵敏度高的显著效果。
附图说明
图1为下述具体实施方式中的制取生物体液样品进样液的反应过程及机理图解。
图2为下述具体实施方式百草枯含量检测结果的色谱图，图中“1”所示特征峰为百草枯，a为样品背景，b为待测样品进样液，c为百草枯标准品进样液。
图3为下述具体实施方式敌草快含量检测结果的色谱图，其中“2”所示特征峰为敌草快，a为样品背景，b为待测样品进样液，c为敌草快标准品进样液。
具体实施方式
实施例1(测定方法例)
1.仪器、试剂与样品
1.1.仪器：Vortex-Genie可调涡旋混合器；舒美KQ-500DB型数控超声波清洗器；微量移液器；MiLLi-Q ELement超纯水处理系统；1/1000电子天平；G13U台式离心机；LC-20A高效液相色谱仪(SPD-M20A二极管阵列检测器)；Phenomenex Synergi Max-RP 80A-C12色谱柱(250×4.6mm,4μm)。
1.2.试剂：Triton X-114；NaCl(色谱纯)；甲酸(色谱纯)；辛烷磺酸钠(色谱纯)；磷酸；二乙胺；乙腈(色谱纯)。
配制0.14g/mL Triton X-114溶液：取100mL容量瓶，用1/1000电子天平称量去皮，加入14g Triton X-114，用超纯水定容至刻度线，震荡摇匀后放入-4℃冰箱冷藏4h，取出恢复至室温备用。
配制0.1308g/mL NaCl溶液：准确称量6.54g NaCl固体放入50mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，震荡摇匀后静置备用。
配置体积浓度为0.1％的甲酸溶液：取100μL甲酸加入10mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线，震荡摇匀后静置备用。
1.3.样品
体液样品：采集疑似或确诊百草枯、敌草快中毒患者的血液样本，样本量大于300μL，加入肝素钠抗凝。特殊情况下，可采集尿液、脑脊液等其他生物体液样品。将收集的体液样本于-20℃保存送往南方医科大学卫生监测中心，对样本进行百草枯、敌草快含量检测。
标准品：百草枯(100ng/μL),购自德国Dr Ehrenstorfer公司，批号CAS:1910-42-5；敌草快(100ng/μL),购自德国Dr Ehrenstorfer公司，批号CAS：6385-62-2。
2.方法
2.1.制取待测血液进样液
取300μL冷藏血液样本，待恢复常温后涡旋30s；依次加入800μL浓度为0.14g/mL的Triton X-114溶液、270μL浓度为0.1308g/mL的NaCl溶液和30μL甲酸，此时TritonX-114终浓度为0.08g/mL，NaCl终浓度为0.0252g/mL，甲酸终浓度为21.4μL/mL；震荡涡旋10s，40℃超声水浴处理4min，12000rpm离心3min，取上清液800μL，过0.22μm滤膜，得到待测样品进样液；上述方法的反应过程和机理如图1所示。
2.2.制取标准品进样液
取百草枯、敌草快标准品分别加入体积浓度为0.1％的甲酸溶液配制成浓度为：0、30、100、200、500、1500和5000ng/mL的百草枯标准品溶液和敌草快标准品溶液；分别取每一浓度值的百草枯标准品溶液和敌草快标准品溶液各300μL(与血液样本的体积相等)，依次加入800μL浓度为0.14g/mL的Triton X-114溶液、270μL浓度为0.1308g/mL的NaCl溶液和30μL甲酸，此时Triton X-114终浓度为0.08g/mL，NaCl终浓度为0.0252g/mL，甲酸终浓度为21.6μL/mL；震荡涡旋10s，40℃超声水浴处理4min，12000rpm离心3min，取上清液800μL，过0.22μm滤膜，得到一系列浓度标准品进样液；
2.3.高效液相色谱检测
流动相：按体积比，流动相由92.5％的A相和7.5％的B相组成。其中，B相为乙腈，A相为5mmol/L辛烷磺酸钠水溶液(含0.4％磷酸)，A相由以下方法制得：用1/1000电子天平称量1.081g辛烷磺酸钠放入1000mL容量瓶中，用200mL水溶解后加入4mL磷酸,再加入二乙胺调节pH值为3.5，然后定容至1000mL抽滤后超声脱气备用。
高效液相色谱检测条件：流速1.3mL/min，进样量250μL，柱温40℃。百草枯检测波长为260nm，敌草快检测波长为309nm。
2.4.检测数据处理
系统平衡后，取待测血液样品进样液、一系列浓度的标准品进样液，分别进样，记录血液样品进样液和标准品进样液的色谱图，该色谱图如图2、图3所示。
以各标准品进样液所测峰面积为纵坐标，标准品进样液浓度为横坐标，分别作出百草枯和敌草快的标准品进样液的散点图，然后对所得到的散点图进行关于各标准品进样液的峰面积和浓度值的两变量线性回归分析，得到标准曲线方程y＝ax+b，其中，x为标准品进样液浓度(μg/mL或ng/mL)，y为峰面积(mAU)，a和b为常数；根据标准品进样液出峰的保留时间确认实际进样血液样品进样液的出峰位置，将进样血液样品所测峰面积代入上述相关方程中进行计算，得出待测样品进样液中百草枯、敌草快含量。
上述方法所得到的百草枯的标准曲线为y＝137.11x-1244.8，其线性范围为30～5000ng/mL，R2＝0.9999；将待测血液样品进样液的峰面积代入方程，计算待测血液样品进样液中百草枯的浓度。
上述方法所得到的敌草快的标准曲线为y＝93.28x-1474.9，其线性范围为30～5000ng/mL，R2＝0.9999；将待测血液样品进样液的峰面积代入方程，计算待测血液样品进样液中敌草快的浓度。
3.结果待测血液样品中百草枯的含量为1476.8ng/mL，敌草快的含量为1466.3ng/mL。
4.检测方法验证
方法可行性验证：正常人体的生物体液样本中不含百草枯、敌草快。通过添加定量已知浓度的标准混标溶液，以加标回收率作指标，分低加标浓度、中加标浓度和高加标浓度三个浓度组，从选择性、准确性、精密性、提取回收率4个方面验证方法可行性。
4.1.选择性：采集6个来自不同地区的健康受试者的血液、血浆和尿液，制备各类型样本以检测样本色谱图，样本本底测定结果显示在出峰位置均为噪声响应，无内源性物质干扰。样品背景色谱图与标准品色谱图对照如图2、图3示例。
4.2.准确性：以加标回收率(％)反映准确性，结果显示百草枯低、中、高浓度的加标回收率
分别为93.2％±1.9％、94.2％±1.7％、96.9％±1.3％，敌草快低、中、高浓度的加标回收率分别为94.6％±1.6％、96.3％±1.4％、97.7％±2.0％。所测得结果均在实际加标浓度值的±10％之内。
4.3.精密性：采用1天内一次测定6个相同加标浓度的样本，计算这6个样本中百草枯、敌草快的变异系数作为批内变异；每天1次测定5个样本，连续5天，计算这5天的百草枯、敌草快的变异系数作为批间变异，用变异系数CV(％)＝100*均值/标准差。结果显示百草枯在低、中、高浓度的批内变异分别为：1.4％、1.4％、1.8％，敌草快在低、中、高浓度的批内变异分别为：2.9％、1.7％、1.5％；百草枯在低、中、高浓度的批间变异分别为：1.1％、2.6％、1.4％，敌草快在低、中、高浓度的批内变异分别为：0.7％、2.0％、0.1％。各变异结果均在3％内。
4.4.提取回收率：不同浓度水平的百草枯回收率为93.2％～96.9％范围内，敌草快回收率为94.6％～97.7％范围内。
4.5.无基质效应验证
分别以全血基质和超纯水按上述2.1、2.2所述方法制取待测样品进样液和标准品进样液，检测后以各标准品进样液的峰面积和相应的加标浓度作出标准曲线，比较全血标准曲线和超纯水标准曲线方程的斜率。
4.6.结果
以全血为基质作出的标准曲线，百草枯斜率为137.44±1.28
敌草快斜率为92.68±0.12；以超纯水作出的标准曲线，百草枯斜率为137.4±0.28，敌草快斜率为93.07±0.46。分析可知百草枯平均斜率之比(全血/超纯水)为1.00，敌草快平均斜率之比(全血/超纯水)为1.00；全血斜率与超纯水百草枯斜率的差值的95％可信区间为(-2.07,2.15)，全血斜率与超纯水敌草快斜率的差值的95％可信区间为(-1.15,0.37)，两可信区间均包含0值。因此，不能认为全血基质的斜率与超纯水的斜率存在统计学差异。同时，全血和超纯水斜率的平均值的比值均十分接近1，可认为本方法不存在基质效应，可用超纯水替代基质样品制备标准曲线用于定量分析。
由于基质类型对本发明检测效果和结果无明显影响，可以通过采取对相同体积已知浓度的标准溶液进行相同的样本处理过程得到标准曲线，进而对待测样本中百草枯、敌草快进行定量分析。
实施例2(试剂盒产品例)
本实施例的试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E和试剂F，各试剂的制备方法如下所述。
试剂A：0.14g/mL Triton X-114溶液；制备方法如下，取Triton X-114 14.0g,加入纯水定容至100mL；
试剂B：0.1308g/mL NaCl溶液；制备方法如下，取NaCl 6.54g,加入纯水定容至50mL；
试剂C：甲酸5mL；
试剂D：0.1％甲酸溶液；制备方法如下，取100μL甲酸，加入纯水定容至100mL；
试剂E：5mmol/L辛烷磺酸钠水溶液(含0.4％磷酸)1000mL；制备方法如下，称量1.081g辛烷磺酸钠放入1000mL容量瓶中，用200mL水溶解后加入4mL磷酸,再加入二乙胺调节pH值为3.5，然后定容至1000mL抽滤后超声脱气；
试剂F：乙腈330mL。
本例所述试剂盒的使用方法可参照上述实施例1实施。
Claims (1)
1.一种测定血液中百草枯和敌草快含量的方法，该方法由以下步骤组成：
(1)制取待测样品进样液：取体液样品，依次加入Triton X-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X-114的终浓度为0.0545～0.109g/mL，NaCl的终浓度为0.0165～0.0495g/mL，甲酸的终浓度为15～30μL/mL；震荡，40℃超声水浴处理4min，离心，取上清液，过滤，得到待测样品进样液；
(2)制取标准品进样液：取百草枯和敌草快分别加入体积浓度为0.1％的甲酸水溶液稀释，得到浓度为0～5μg/mL的一系列百草枯标准品溶液和敌草快标准品溶液；按体液样品体积，分别取每一浓度值的百草枯标准品溶液和敌草快标准品溶液，依次加入Triton X-114水溶液、NaCl水溶液和甲酸，并使得Triton X-114的终浓度为0.0545～0.109g/mL，NaCl的终浓度为0.0165～0.0495g/mL，甲酸的终浓度为15.2～30.3μL/mL；震荡，40℃超声水浴处理4min，离心，取上清液，过滤，得到一系列浓度标准品进样液；
(3)将所制取的待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液分别用液相离子对色谱法进行如下检测：按进样量为50～500μL，对规格为250mm×4.6mm i.d.，4μm或5μm的液相Cl2色谱柱进样，控制柱温为35～45℃，接着用由体积配比为A相91～95％和B相5～9％组成的流动相以1.2～1.4mL/min的流速进行等度洗脱，获得待测样品进样液和一系列浓度标准品进样液的液相色谱图；其中，所述的流动相的A相由以下方法制成：准确称量0.649～1.730g辛烷磺酸钠放入1000mL容量瓶中，用200mL水溶解后加入2～6mL磷酸，再加入二乙胺调节pH值为3.0～4.0，定容至1000mL，然后抽滤、超声脱气；所述的流动相的B相是乙腈；
(4)将待测样品进样液的液相图谱与每一浓度标准品进样液的液相图谱比较，与标准品样液的液相图谱中保留时间相同的相应成分的特征峰即是与该成分相同物质的特征峰；根据特征峰峰面积以随行标准曲线计算待测样品进样液中百草枯和敌草快的含量。
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