CN111808975A - 一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对及其鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对，包括鹿科动物鉴别引物对DcF‑DcR以及鹿茸鉴定引物对Rdfp‑Rdrp；本发明还提供一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，包括以下步骤：S1制备样品的保藏液；S2提取DNA；S3鹿科动物鉴别程序鉴别组织样品；S4过茸鹿鉴定程序鉴定后测序测定，判断鹿茸产品具体的种属；本发明的有益效果是：通过鹿科动物鉴别引物对和茸鹿鉴定引物对，实现鹿科动物和鹿茸产品的一体化准确鉴定；通过对鹿科动物基因组序列大数据分析，提高了鉴定鹿茸产品的准确性；通过先进行鹿科动物的检测，后采用茸鹿鉴定程序，实现准确鉴定；通过设定多组对照，同时切胶回收纯化鉴定后的产物，再测序分析，实现准确鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及鹿茸产品的检测和鉴定领域，具体是一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对及其鉴别方法。
背景技术
中国药典规定梅花鹿和马鹿的鹿茸是传统名贵药材。鹿茸在中药材市场流通的主要产品形式是切片和粉末，导致鹿茸难以用肉眼区分。另外，不同鹿种来源(如：梅花鹿、马鹿、赤鹿和驯鹿)的鹿茸价格差别很大，由于利润的驱使，大量的新西兰赤鹿、北美和北欧驯鹿茸从国外流入我国，仿冒传统中药的梅花鹿和马鹿鹿茸片(粉)。
为将商品流通的梅花鹿、马鹿、赤鹿和驯鹿茸片(粉)鉴别区分，急需对传统中药梅花鹿和马鹿鹿茸产品的真伪鉴别。现有的检测涉及到多聚酶链式反应时，大多采用线粒体DNA(mt DNA)为模板进行筛选，但是在真核生物长期进化中，线粒体序列经常被转移到核基因组中，极易出现核线粒体假序列NUMTs，而由于NUMTs在相近物种之间具有保守性，因此，通过线粒体DNA进行PCR扩增鉴定鹿茸产品时，NUMTs片段也很容易被直接扩增，由于NUMTs片段大小与线粒体的同源片段大小相差不大，极易出现假阳性，也就是说，相近物种的扩增片段不一定是目标片段，可能是NUMTs序列，而在鹿基因组中，CEP295NL以单拷贝基因存在，PCR扩增不能出现类似假阳性情况，因此根据CEP295NL基因靶标设计两对引物经PCR检测，通过PCR产物电泳条带及特征，在通过测序及序列能实现鉴别鹿科动物及鹿种。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供是一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对及其鉴别方法，以至少达到鹿科动物和鹿茸产品的一体化准确鉴定的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对，包括鹿科动物鉴别引物对以及鹿茸鉴定引物对；所述的鹿科动物鉴别引物对为：
DcF 5’-ACGAGCGCCTTCCATGAAGACYGGT-3’(序列1)
DcR 5’-AGGTGGGCTTCCATCCCCGCTGAACTT-3’(序列2)；
对应的所述的茸鹿鉴定引物对为：
Rdfp 5’-CAGAGGCAAGCTCGTCTGGCTCAG-3’(序列3)
Rdrp 5’-GACTCTCACTTTTAACATATTTTCTGAAACTC-3’(序列4)。
优选的，为了进一步实现准确鉴定的目的，所述的鹿科动物鉴别引物对与鹿茸鉴定引物对均通过鹿科动物基因组序列大数据分析，以CEP295NL基因为靶标设计得到的；所述的大数据分析为，以不同鹿种之间存在不同保守程度的多个SNP位点为准进行筛选，确定CEP295NL基因在鹿基因组中以单拷贝基因状态存在；通过对鹿科动物基因组序列大数据分析，以不同保守程度的多个SNP位点进行筛选，从而筛选出单拷贝基因状态的CEP295NL基因，进而避免了线粒体DNA存在的假阳性的问题，提高了鉴定鹿茸产品的准确性。
本发明还提供一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，包括以下步骤：
S1将待检测的鹿茸组织样品用水清洗干净后，研磨成粉，再称取粉状样品，按比例与水混合后，于低温保藏，得到保藏液；
S2将得到的保藏液反复冻融后，取冻融后悬液，以苯酚-氯仿法提取DNA或商品化液体样品DNA提取试剂，得到提取后的DNA；
S3将提取后的DNA先经过鹿科动物鉴别程序鉴别后，确定检测的组织样品是否来源于鹿科动物，得到确定的组织样品；
S4将确定的组织样品经过茸鹿鉴定程序鉴定后，再经过测序测定，即可判断鹿茸产品具体的种属。
优选的，为了进一步实现准确鉴定的目的，所述的鹿科动物鉴别程序为，将提取后的DNA，通过鹿科动物鉴别引物对进行鹿科动物的PCR反应，依据扩增的537bp特异条带的有和无判断其是否来源于鹿科动物，其中有特异条带判定为产品来源鹿科动物，无特异条带判定不是鹿科动物；所述的鹿科动物的PCR反应为：预变性95℃，5min；扩增反应：变性95℃，40s，退火63℃，30s，扩增72℃，40s，35个循环；延伸72℃，5min，冷却10℃，1min；通过先对鹿茸组织样品进行鹿科动物的检测，防止不良厂家以其他动物的部位进行替换，同时以特异性的537bp特异条带的有无进行判断，能更直观的观察到鹿科动物鉴别结果，从而实现准确鉴定的目的。
优选的，为了进一步实现准确鉴定的目的，所述的茸鹿鉴定程序为，将确定属于鹿科动物的确定组织样品，通过茸鹿鉴定引物对进行茸鹿引物的PCR反应，依据扩增的242bp特异条带的有和无判种属，其中有含有特异条带的多个条带的为赤鹿，仅单一特异条带的为梅花鹿或马鹿，无特异条带的为其他种属的鹿科动物；所述的茸鹿引物的PCR反应为，预变性95℃，5min；扩增反应：变性95℃，40s，退火58℃，20s；扩增72℃，40s，32个循环；延伸72℃，5min，冷却10℃，1min；通过茸鹿鉴定程序进行确定属于鹿科动物的鹿茸组织样品进行检测，同时以242bp特异条带有无作为种属的确定标准，从而直观的观察茸鹿鉴定结果，实现准确鉴定的目的。
优选的，为了进一步实现鹿科动物和鹿茸产品的一体化的鉴定的目的，所述的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中，均设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中，用已知含鹿源性成分的样品作阳性对照，用已知不含鹿源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照；所述的测序测定为，在所述的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中，将待检测样品经过鉴别程序和鉴定程序后的特异条带，经过电泳后切胶回收纯化，纯化后的产物经过Sanger法测序后，与所述的已知含鹿源性成分的样品的参考序列比较，即可判断鹿茸产品具体的种属；通过在鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中设定多组对照，同时切胶回收纯化鉴定后的产物，再测序分析，从而利用前期的鉴定分类出除去梅花鹿、马鹿和赤鹿的其他种属的鹿科动物，再利用测序分析，分析确定其他种属的鹿科动物的来源，从而体现鹿科动物和鹿茸产品的一体化鉴定的目的，同时最后采用的测序分析，能配合前期的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序，实现准确鉴定的目的。
本发明的有益效果是：
1.通过采用鹿科动物鉴别引物对和茸鹿鉴定引物对，从而先经过鹿科动物鉴别引物对鉴定是否属于鹿科动物，再经过茸鹿鉴定引物对进一步区分种属，从而能大范围的检测鹿产品的多鹿种来源，同时能对不同鹿种进行鉴别，从而实现鹿科动物和鹿茸产品的一体化准确鉴定的目的。
2.通过对鹿科动物基因组序列大数据分析，以不同保守程度的多个SNP位点进行筛选，从而筛选出单拷贝基因状态的CEP295NL基因，进而避免了线粒体DNA存在的假阳性的问题，提高了鉴定鹿茸产品的准确性。
3.通过先对鹿茸组织样品进行鹿科动物的检测，防止不良厂家以其他动物的部位进行替换，同时以特异性的537bp特异条带的有无进行判断，能更直观的观察到鹿科动物鉴别结果，从而实现准确鉴定的目的。
4.通过茸鹿鉴定程序进行确定属于鹿科动物的鹿茸组织样品进行检测，同时以242bp特异条带有无作为种属的确定标准，从而直观的观察茸鹿鉴定结果，实现准确鉴定的目的。
5.通过在鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中设定多组对照，同时切胶回收纯化鉴定后的产物，再测序分析，从而利用前期的鉴定分类出除去梅花鹿、马鹿和赤鹿的其他种属的鹿科动物，再利用测序分析，分析确定其他种属的鹿科动物的来源，从而体现鹿科动物和鹿茸产品的一体化鉴定的目的，同时最后采用的测序分析，能配合前期的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序，实现准确鉴定的目的。
附图说明
图1为鹿科动物鉴别程序鉴定出的鹿科和非鹿科的PCR产物电泳结果图，
图中，泳道1-梅花鹿，泳道2-马鹿，泳道3-赤鹿，泳道4-驯鹿，泳道5-牛，泳道6-羊，，泳道7-阴性对照；
图2为鹿科动物鉴别程序鉴定出的多个鹿种的PCR产物电泳结果图；
图中，泳道1～2为梅花鹿，泳道3～4为马鹿，泳道5-赤鹿，泳道6-驯鹿，泳道7-白唇鹿，泳道8-麋鹿，泳道9-坡鹿，泳道10-水鹿，泳道11-麂，12-空白对照；
图3为茸鹿鉴定程序鉴定的多个鹿种的PCR产物电泳结果图；。
图中，泳道1～2为梅花鹿，泳道3～4为马鹿，泳道5～6为赤鹿，泳道7-驯鹿，泳道8-白唇鹿，泳道9-麋鹿，泳道10-坡鹿，泳道11-麋鹿，12-空白对照
图4为直接采用茸鹿鉴定程序鉴定的鹿科和非鹿科的PCR产物电泳结果图，
图中，泳道1～2为梅花鹿，泳道3～4为马鹿，泳道5～6为赤鹿，泳道7-驯鹿，泳道8-白唇鹿，泳道9-麋鹿，泳道10-坡鹿，泳道11-麋鹿，泳道12-牛，泳道13-羊，泳道14-猪，泳道15-空白对照。
具体实施方式
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对，包括鹿科动物鉴别引物对以及鹿茸鉴定引物对；所述的鹿科动物鉴别引物对为：
DcF 5’-ACGAGCGCCTTCCATGAAGACYGGT-3’(序列1)
DcR 5’-AGGTGGGCTTCCATCCCCGCTGAACTT-3’(序列2)；
对应的所述的茸鹿鉴定引物对为：
Rdfp 5’-CAGAGGCAAGCTCGTCTGGCTCAG-3’(序列3)
Rdrp 5’-GACTCTCACTTTTAACATATTTTCTGAAACTC-3’(序列4)。
优选的，为了进一步实现准确鉴定的目的，所述的鹿科动物鉴别引物对与鹿茸鉴定引物对均通过鹿科动物基因组序列大数据分析，以CEP295NL基因为靶标设计得到的；所述的大数据分析为，以不同鹿种之间存在不同保守程度的多个SNP位点为准进行筛选，确定CEP295NL基因在鹿基因组中以单拷贝基因状态存在；通过对鹿科动物基因组序列大数据分析，以不同保守程度的多个SNP位点进行筛选，从而筛选出单拷贝基因状态的CEP295NL基因，进而避免了线粒体DNA存在的假阳性的问题，提高了鉴定鹿茸产品的准确性。
本发明还提供一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，包括以下步骤：
S1将待检测的鹿茸组织样品用水清洗干净后，研磨成粉，再称取200mg的粉状样品，按1mg样品加入2μL的比例与水混合后，于低温保藏，得到保藏液；
S2将得到的保藏液于-20℃冷冻再于室温完全解冻，如此反复冻融3次后，取冻融后悬液300μL于2mL离心管，以苯酚-氯仿法提取DNA，得到提取后的DNA；
S3将提取后的DNA先经过鹿科动物鉴别程序鉴别后，确定检测的组织样品是否来源于鹿科动物，得到确定的组织样品；
S4将确定的组织样品经过茸鹿鉴定程序鉴定后，再经过测序测定，即可判断鹿茸产品具体的种属。
为了进一步实现准确鉴定的目的，所述的鹿科动物鉴别程序为，将提取后的DNA，通过鹿科动物鉴别引物对进行鹿科动物的PCR反应，依据扩增的537bp特异条带的有和无判断其是否来源于鹿科动物，其中有特异条带判定为产品来源鹿科动物，无特异条带判定不是鹿科动物；结果如图1-2所示，鹿科动物在537bp上均存在有特异带，而其他非鹿科动物如牛、羊、阴性对照组均无明显的特异带；所述的鹿科动物的PCR反应为：预变性95℃，5min；扩增反应：变性95℃，40s，退火63℃，30s，扩增72℃，40s，35个循环；延伸72℃，5min，冷却10℃，1min；反应体系为：总量30μL，10×PCR缓冲液3uL、dNTP(5mmol/L)1.2μL、鹿科动物鉴别引物对序列1以及序列2(浓度各10mol/L)1.5μL、Ex-Taq DNA聚合酶1U、模板DNA为20ng；通过先对鹿茸组织样品进行鹿科动物的检测，防止不良厂家以其他动物的部位进行替换，同时以特异性的537bp特异条带的有无进行判断，能更直观的观察到鹿科动物鉴别结果，从而实现准确鉴定的目的。
为了进一步实现准确鉴定的目的，所述的茸鹿鉴定程序为，将确定属于鹿科动物的确定组织样品，通过茸鹿鉴定引物对进行茸鹿引物的PCR反应，依据扩增的242bp特异条带的有和无判种属，其中有含有特异条带的多个条带的为赤鹿，仅单一特异条带的为梅花鹿或马鹿，无特异条带的为其他种属的鹿科动物；结果如图3所示，其中两组梅花鹿的鹿茸样品和马鹿的鹿茸样品均在242bp出现明亮的特异带，而赤鹿则出现多条明亮的特异带，其他鹿科动物的鹿茸产品如驯鹿、白唇鹿、水鹿等，均在242bp上没有明亮的特异带；所述的茸鹿引物的PCR反应为，预变性95℃，5min；扩增反应：变性95℃，40s，退火58℃，20s；扩增72℃，40s，32个循环；延伸72℃，5min，冷却10℃，1min；反应体系为：总量30μL，10×PCR缓冲液3uL、dNTP(5mmol/L)1.2μL、茸鹿鉴定引物对序列3以及序列4(浓度各10mol/L)1.5μL、Ex-Taq DNA聚合酶1U、模板DNA为20ng；通过茸鹿鉴定程序进行确定属于鹿科动物的鹿茸组织样品进行检测，同时以242bp特异条带有无作为种属的确定标准，从而直观的观察茸鹿鉴定结果，实现准确鉴定的目的。
为了进一步实现鹿科动物和鹿茸产品的一体化的鉴定的目的，所述的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中，均设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中，用已知含鹿源性成分的样品作阳性对照，用已知不含鹿源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照；所述的测序测定为，在所述的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中，将待检测样品经过鉴别程序和鉴定程序后的特异条带，经过电泳后切胶回收纯化，纯化后的产物经过上海生工的Sanger法测序后，与所述的已知含鹿源性成分的样品的参考序列比较，即可判断鹿茸产品具体的种属；通过在鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中设定多组对照，同时切胶回收纯化鉴定后的产物，再测序分析，从而利用前期的鉴定分类出除去梅花鹿、马鹿和赤鹿的其他种属的鹿科动物，再利用测序分析，分析确定其他种属的鹿科动物的来源，从而体现鹿科动物和鹿茸产品的一体化鉴定的目的，同时最后采用的测序分析，能配合前期的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序，实现准确鉴定的目的。
实施例2
在步骤S2中，采用商品化液体样品DNA提取试剂如百奥莱博的BTN121001型的液体样品DNA提取剂进行提取，其余配方及步骤同实施例1。
对比例1
不采用鹿科动物鉴别程序，之间将待检测的鹿茸组织样品经过茸鹿鉴定程序，检测结果如图4所示，图中仅仅能观察到梅花鹿、马鹿和赤鹿的特异带，无法区分其他鹿科动物和非鹿科动物的组织样品。
将实施例1-2以及对比例1得到的检测样品梯度稀释后再进行各个鉴定程序，实施例1的检测样品的DNA下限为1ng；而实施例2由于采用了商品化液体样品DNA，其检测的下限能达到0.8ng；对比例1由于采用的直接茸鹿鉴定程序，其梅花鹿、马鹿和赤鹿的检测下限能达到1.2ng，而其他鹿科动物和非鹿科动物的鹿茸产品无法区分，因此检测下限无法确定。
同时针对实施例1记载的方法，在1000份已知的鹿源性的鹿茸产品中进行检测，可全部检测出具体的种属，其检测精度可以达到100％。
综上所述，当采用本发明的鹿科动物鉴别引物对以及茸鹿鉴定引物对，通过鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序，以及后续的测序测定，从而先将鹿科动物和非鹿科动物区分开，再鉴定出梅花鹿和马鹿，排除赤鹿以及其他鹿科动物，其检测样品下限为1ng，检测精度可以达到100％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 长春科技学院
<120> 一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对及其鉴别方法
<130> CEP295NL
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
acgagcgcct tccatgaaga cyggt 25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aggtgggctt ccatccccgc tgaactt 27
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cagaggcaag ctcgtctggc tcag 24
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gactctcact tttaacatat tttctgaaac tc 32
Claims (10)
1.一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对，其特征在于：包括鹿科动物鉴别引物对以及鹿茸鉴定引物对；所述的鹿科动物鉴别引物对为：
DcF 5’-ACGAGCGCCTTCCATGAAGACYGGT-3’(序列1)
DcR 5’-AGGTGGGCTTCCATCCCCGCTGAACTT-3’(序列2)；
对应的所述的茸鹿鉴定引物对为：
Rdfp 5’-CAGAGGCAAGCTCGTCTGGCTCAG-3’(序列3)
Rdrp 5’-GACTCTCACTTTTAACATATTTTCTGAAACTC-3’(序列4)。
2.根据权利要求1所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对，其特征在于：所述的鹿科动物鉴别引物对与鹿茸鉴定引物对，均通过鹿科动物基因组序列大数据分析，以CEP295NL基因为靶标设计得到的。
3.根据权利要求2所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对及其鉴别方法，其特征在于：所述的大数据分析为，以不同鹿种之间存在不同保守程度的多个SNP位点为准进行筛选，确定CEP295NL基因在鹿基因组中以单拷贝基因状态存在。
4.根据权利要求1所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1将待检测的鹿茸组织样品用水清洗干净后，研磨成粉，再称取粉状样品，按比例与水混合后，于低温保藏，得到保藏液；
S2将得到的保藏液反复冻融后，取冻融后悬液，以苯酚-氯仿法提取DNA或商品化液体样品DNA提取试剂，得到提取后的DNA；
S3将提取后的DNA先经过鹿科动物鉴别程序鉴别后，确定检测的组织样品是否来源于鹿科动物，得到确定的组织样品；
S4将确定的组织样品经过茸鹿鉴定程序鉴定后，再经过测序测定，即可判断鹿茸产品具体的种属。
5.根据权利要求4所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，其特征在于：所述的鹿科动物鉴别程序为，将提取后的DNA，通过鹿科动物鉴别引物对进行鹿科动物的PCR反应，依据扩增的537bp特异条带的有和无判断其是否来源于鹿科动物，其中有特异条带判定为产品来源鹿科动物，无特异条带判定不是鹿科动物。
6.根据权利要求5所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，其特征在于：所述的鹿科动物的PCR反应为：预变性95℃，5min；扩增反应：变性95℃，40s，退火63℃，30s，扩增72℃，40s，35个循环；延伸72℃，5min，冷却10℃，1min。
7.根据权利要求4所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，其特征在于：所述的茸鹿鉴定程序为，将确定属于鹿科动物的确定组织样品，通过茸鹿鉴定引物对进行茸鹿引物的PCR反应，依据扩增的242bp特异条带的有和无判种属，其中有含有特异条带的多个条带的为赤鹿，仅单一特异条带的为梅花鹿或马鹿，无特异条带的为其他种属的鹿科动物。
8.根据权利要求7所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，其特征在于：所述的茸鹿引物的PCR反应为，预变性95℃，5min；扩增反应：变性95℃，40s，退火58℃，20s；扩增72℃，40s，32个循环；延伸72℃，5min，冷却10℃，1min。
9.根据权利要求4所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，其特征在于：所述的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中，均设置阳性对照、阴性对照和空白对照，其中，用已知含鹿源性成分的样品作阳性对照，用已知不含鹿源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。
10.根据权利要求9所述的一种鹿茸产品的鹿种来源鉴别引物对的鉴别方法，其特征在于：所述的测序测定为，在所述的鹿科动物鉴别程序和茸鹿鉴定程序中，将待检测样品经过鉴别程序和鉴定程序后的特异条带，经过电泳后切胶回收纯化，纯化后的产物经过测序后，与所述的已知含鹿源性成分的样品的参考序列比较，即可判断鹿茸产品具体的种属。
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-
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