BR102016017282A2 - Método e kit para detecção de espécies em produtos de origem animal - Google Patents

Abstract

método e kit para detecção de espécies em produtos de origem animal a presente invenção refere-se a um teste de dna para a detecção, em produtos cárneos, de um painel de dez diferentes espécies animais: bovina, caprina, ovina, suína, bubalina, equina, canina, felina, de frango e peru. trata-se de uma alternativa rápida, confiável e pouco onerosa para a análise da composição de produtos alimentícios de base cárnea in natura ou processados, permitindo a garantia da autenticidade de produtos alimentícios. a presente invenção também se refere a um kit para realização do teste proposto.

Description

(54) Título: MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL (51) Int. Cl.: C12Q 1/68 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS, MYLEUS ANÁLISES GENÉTICAS S.A, MYLEUS PESQUISA E DESENVOLVIMENTO LTDA., FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE MINAS GERAIS - FAPEMIG (72) Inventor(es): MARCELA GONÇALVES DRUMMOND; RAFAEL MELO PALHARES; LILIAN VIANA TEIXEIRA; DENISE APARECIDA ANDRADE DE OLIVEIRA; LISSANDRA SOUSA DALSECCO; POLLYANA DE CARVALHO OLIVEIRA (57) Resumo: MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL A presente invenção refere-se a um teste de DNA para a detecção, em produtos cárneos, de um painel de dez diferentes espécies animais: bovina, caprina, ovina, suína, bubalina, equina, canina, felina, de frango e peru. Trata-se de uma alternativa rápida, confiável e pouco onerosa para a análise da composição de produtos alimentícios de base cárnea in natura ou processados, permitindo a garantia da autenticidade de produtos alimentícios. A presente invenção também se refere a um kit para realização do teste proposto.

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MÉTODO E KIT PARA DETECÇÃO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL [1] A presente invenção refere-se a um teste de DNA para a detecção, em produtos cárneos, de um painel de dez diferentes espécies animais: bovina, caprina, ovina, suína, bubalina, equina, felina, canina, de frango e peru. Trata-se de uma alternativa rápida, confiável e pouco onerosa para a análise da composição de produtos alimentícios de base cárnea in natura ou processados, permitindo a garantia da autenticidade de produtos alimentícios. A presente invenção também se refere a um kit para realização do teste proposto.

[2] A invenção proposta permite a detecção de uma grande variedade de espécies animais, incluindo as principais utilizadas na alimentação humana e animal e possíveis espécies utilizadas em fraudes por troca ou adição de espécies; permite a análise de misturas de duas ou mais espécies do painel em qualquer proporção; permite a análise tanto de produtos in natura quanto processados (hambúrgueres, linguiças, salsichas, nuggets, lasanhas, pastéis etc), além de permitir a análise de produtos que foram submetidos a qualquer tipo de processamento durante a fabricação, seja térmico, químico ou biológico (cozimento, defumação, cura, fermentação, pasteurização, desidratação, conservantes químicos, etc). O método proposto possui grande potencial de escalabilidade e praticidade por um preço competitivo comparado às outras tecnologias disponíveis.

[3] As fraudes alimentares sempre foram preocupações da indústria alimentícia, porém estão ganhando cada vez mais atenção, uma vez que têm sido consideradas como um risco econômico e de segurança alimentar emergente, especialmente quando se leva em consideração a natureza global e complexa da cadeia de produção de alimentos. As perdas econômicas provocadas por fraudes na indústria de alimentos foram estimadas entre 10 e 15 bilhões de dólares por ano em todo o mundo e o número de casos de fraude alimentar aumentou cerca de 60% entre anos de 2008 a 2010 (MANUFACTURERS ASSOCIATION GROCERY; A. T. KEARNEY. Consumer Product Fraud: Deterrence and Detection, 2010. Disponível:

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2/37 http://www.gmaonline.org/downloads/research-and- reports/consumerproductfraud.pdf. Acesso em 11 de julho de 2016 ).

[4] Nesse contexto, a presente invenção representa uma importante ferramenta para a detecção de fraudes alimentares e certificação de matérias-primas ou produtos de origem animal, sendo de grande valia tanto para entidades certificadoras como para órgãos fiscalizadores, bem como para as indústrias produtoras, em seus processos de controle. Assim, a invenção permite: (1) averiguar a autenticidade de produtos de origem animal por meio da detecção de substituições de uma espécie por outra; (2) detectar, em produtos processados, a presença indevida ou não declarada de material de determinada espécie; (3) atestar a espécie de origem das matérias-primas utilizadas na fabricação e/ou certificação de autenticidade do produto final.

[5] A adulteração de espécies em produtos alimentícios é um tipo comum de fraude alimentar, baseada na substituição parcial ou completa de matéria-prima autêntica de uma espécie por outra e praticada sempre sem o conhecimento do comprador (HRBEK, V.,et al. Authentication of milk and milk-based foods by direct analysis in real time ionization-high resolution mass spectrometry (DART-HRMS) technique: A criticai assessment. Food Control, v.36, p. 138-145, 2013). As substituições de espécies são realizadas com o objetivo principal de elevar o valor aparente de um produto e/ou de reduzir os custos de produção, podendo também ser impulsionadas por uma pressão da cadeia de produção de alimentos, quando, por exemplo, a oferta de um produto não consegue satisfazer a sua demanda (MANUFACTURERS ASSOCIATION GROCERY; A. T. KEARNEY. Consumer Product Fraud: Deterrence and Detection, 2010. Disponível em: http:// www.qmaonline.org/ downloads/ research-and-reports/ consumerproductfraud.pdf. Acesso em 11 de julho de 2016).

[6] Os consumidores modernos estão cada vez mais conscientes de sua saúde e estão exigindo informações mais completas sobre a origem, composição e segurança dos alimentos que consomem (CAWTHORN, D.,et al. A high incidence of

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3/37 species substitution and mislabelling detected in meat products sold in South Africa. Food Control., v.32, p.440-449, 2013). Grande atenção vem sendo dada para a rotulagem de alimentos, especialmente os processados, nos quais a identificação dos ingredientes é mais difícil devido a mudanças na aparência, cor, textura e sabor, e, dessa forma, a origem dos constituintes pode ser facilmente mascarada (BOTTERO, M.T. e DALMASSO, A. Animal species identification in food products: Evolution of biomolecular methods. Vet J., v.190, p.34-38, 2011; Cawthorn et al., 2013).

[7] A substituição de espécies em produtos de origem animal envolve questões econômicas, culturais e de saúde (AIDA, A.A., et al. Detection of pig derivatives in food products for halal authentication by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism. J. Sci. Food Agric., v.87, p.569-572, 2007). De maneira geral, a substituição não declarada de matéria-prima de uma espécie por outra faz com que consumidores paguem um preço maior por um produto de menor valor, além de submeter os produtores honestos a uma competição injusta (REID, L. M., et al. Recent technological advances for the determination of food authenticity. Trends Food Sci. Technol., v.17, p.344-353, 2006). As questões culturais ou religiosas da substituição de espécies em alimentos envolvem a restrição de alguns ingredientes a mercados consumidores específicos: no vegetarianismo, por exemplo, é indesejável a presença de ingredientes cárneos (BOTTERO, M.T. e DALMASSO, A. Animal species identification in food products: Evolution of biomolecular methods. Vet J., v.190, p.34-38, 2011), e no veganismo é indesejável qualquer ingrediente de origem animal. Entre os Hindus, a vaca é considerada um animal sagrado e, portanto, o consumo de sua carne é considerado tabu e até proibido em diversos locais da Índia (PREMANANDH, J. Horse meat scandal: A wake-up call for regulatory authorities. Food Control. v.34, p.568-569, 2013). Nas religiões islâmicas e judaicas é proibido o consumo de carne de porco ou de qualquer derivado suíno (SAKARIDIS, I., et al. A fast and accurate method for controlling the correct labeling of products containing buffalo meat using High Resolution Melting (HRM) analysis. Meat sci.,

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v.94, p.84-88, 2013). Dessa forma, os indivíduos com alguma restrição cultural em consumir determinado ingrediente precisam ter certeza de que os alimentos adquiridos contêm exatamente o que está sendo indicado no rótulo, e nada mais (CAWTHORN, D. et al. A high incidence of species substitution and mislabelling detected in meat products sold in South Africa. Food Control., v.32, p.440-449, 2013).

[8] Ainda, a substituição de espécies em alimentos caracteriza-se como um problema de saúde pública, pois pode ocultar ingredientes com potencial alergênico para indivíduos sensíveis. As alergias alimentares são classificadas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como o sexto maior problema na saúde humana, afetando cerca de 1 a 3% dos adultos e 4 a 6% das crianças em todo o mundo. Deste modo, boas práticas de rotulagem são necessárias para proteger consumidores alérgicos e facilitar o acesso aos ingredientes contidos em um determinado produto, evitando assim o consumo de alimentos perigosos (van HENGEL, A.J. Food allergen detection methods and the challenge to protect food allergic consumers. Anal. Bio. Chem., v.389, p.111-118, 2007).

[9] É grande o número de estudos que relatam a substituição fraudulenta de espécies em produtos comercializados em diversos países. Devido ao seu alto valor de mercado, os produtos cárneos são frequentemente alvos de substituição e adulteração de espécies. Casos típicos de adulteração intencional nesse tipo de produto envolvem a substituição ou adição de proteínas de origem animal (de espécies normalmente mais baratas) ou proteínas vegetais (como a soja) sem a sua declaração na lista de ingredientes (CAWTHORN, D., et al. A high incidence of species substitution and mislabelling detected in meat products sold in South Africa. Food Control., v.32, p.440-449, 2013; MOUSAVI, S.M.,et al. Applicability of speciesspecific polymerase chain reaction for fraud identification in raw ground meat commercially sold in Iran. J. Food Comp. Anal., v. 40, p.47-51, 2015).

[10] Em janeiro de 2013, a Autoridade de Segurança Alimentar da Irlanda (FSAI Food Safety Authority of Ireland) anunciou a descoberta de carne de cavalo e de suíno adicionadas de forma não declarada em produtos cárneos bovinos,

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5/37 desencadeando uma crise em toda a Europa em relação à autenticidade desse tipo de produto. À época, 85% dos produtos analisados pela FSAI, foram positivos para suíno e 37% para equino (Department of agriculture food and the marine. Equine DNA & Mislabelling of Processed Beef Investigation, 2013. 38p). Logo em seguida, no Reino Unido, uma investigação urgente realizada pela FSA (Food Standards Agency, 2013) encontrou vários produtos cárneos bovinos contendo carne de cavalo, resultando na remoção em larga escala de produtos de diversos varejistas e fornecedores do mercado Europeu (DEPARTMENT OF AGRICULTURE FOOD AND THE MARINE. Equine DNA & Mislabelling of Processed Beef Investigation, 2013. 38p). Embora não exista nenhum indicativo de que o consumo de carne de cavalo seja diretamente prejudicial à saúde humana, a sua presença indevida na cadeia de produção alimentar implica em falhas na garantia da origem da matéria-prima utilizada. Tais falhas abrem portas para questionamentos sobre segurança alimentar, já que carnes sem garantia de procedência ou impróprias para consumo humano podem entrar na cadeia de produção (JAKES, W., et al. Authentication of beef versus horse meat using 60 MHz 1H NMR spectroscopy. Food Chemistry, v.175, p.1-9, 2015).

[11] Devido a inúmeros escândalos alimentares já relatados em todo o mundo, o desenvolvimento de um método econômico e confiável para a detecção/identificação de espécies em produtos de origem animal tornou-se um grande desafio (FLOREN, C., et al. Species identification and quantification in meat and meat products using droplet digital PCR (ddPCR). Food Chem, v.173, p.1054-1058, 2015). Várias metodologias foram desenvolvidas ao longo dos últimos anos para a detecção de adulterações em produtos cárneos e lácteos. Muitos desses métodos são baseados na análise de lipídeos, proteínas e DNA para a identificação de misturas de carne ou leite de diferentes espécies. A detecção de lipídeos e de proteínas é realizada por meio de técnicas cromatográficas, imunoensaios ou espectrometria de massas (GUARINO, C.,et al. R. M. Peptidomic approach, based on liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, for detecting

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6/37 sheep’s milk in goat's and cow's cheeses. Rapid Communications in mass spectrometry: RCM, v.24 (6), p.705-713, 2010). No entanto, esses métodos são laboriosos, podem não ser adequados para discriminar espécies intimamente relacionadas e muitas vezes não são aplicáveis na rotina, uma vez que as proteínas podem ser desnaturadas pelo stress térmico, alta pressão, tratamentos químicos e por outras manipulações sofridas pelos alimentos durante o processamento (LÓPEZCALLEJA, I.,et al. Real-time TaqMan PCR for quantitative detection of cows' milk in ewes' milk mixtures. International Dairy Journal, v.17 (7), p.729-736, 2007; BALLIN, N. Z.; VOGENSEN, F. K.; KARLSSON, A. H. Species determination - Can we detect and quantify meat adulteration? Meat science, v.83 (2), p.165-174, 2009; SENTANDREU, M.A e SENTANDREU, E. Authenticity of meat products: Tools against fraud. Food Res. Int., v.60, p.19-29, 2014).

[12] Técnicas moleculares recentemente desenvolvidas têm superado os inconvenientes associados aos métodos convencionais e estão sendo cada vez mais utilizadas na detecção de espécies estranhas (não declaradas). Comparativamente, métodos baseados na detecção de DNA são mais práticos, sensíveis e robustos, permitindo a análise de alimentos processados (MAYER, H. Milk species identification in cheese varieties using electrophoretic, chromatographic and PCR techniques. International Dairy Journal, v.15 (6-9), p.595-604, 2005; ZHANG, C.,et al. A TaqMan real-time PCR system for the identification and quantification of bovine DNA in meats, milks and cheeses. Food Control, v.18 (9), p.1149-1158, 2007). Isso se deve principalmente à ubiquidade e alta estabilidade das moléculas de DNA (ROGBERG-MUNOZ, A.,et al. Recent patents for detecting the species of origin in animal feedstuff, and raw and processed meat products. Rec. Pat. Food, Nutr. Agric., v.5, p.3-8, 2013). Metodologias baseadas na detecção de DNA se valem de diferenças nas sequências dessas moléculas apresentadas em cada espécie, os chamados polimorfismos de DNA. Grande parte desses métodos consiste na amplificação de um ou mais fragmentos específicos de DNA por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR). A amplificação pela PCR é baseada na hibridação de

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7/37 pares de oligonucleotídeos específicos (iniciadores) e síntese in vitro de milhões de cópias do DNA alvo. A PCR pode ser utilizada em ensaios para indicar a presença ou ausência de uma espécie em determinado material.

[13] O teste proposto na presente invenção é baseado na utilização de iniciadores para a amplificação do DNA de um painel de dez espécies animais. Para que tenhamos uma alta capacidade no processamento de amostras, foi escolhida a metodologia de PCR em Tempo Real, em que as etapas de amplificação e verificação de resultados estão acopladas, permitindo uma maior velocidade nas análises. Ainda, as tecnologias utilizadas em PCR em Tempo Real são altamente robustas e sensíveis. Como uma possibilidade para realização de PCR em Tempo Real, pode-se citar o uso da tecnologia do MeltDoctor® High Resolution Melting (Thermo Fisher Scientific), que contém o agente fluorescente Syto9, extremamente sensível, permitindo a detecção de pequenas quantidades de DNA. A análise é realizada pela verificação da ausência ou presença de amplificação, aliada à análise das curvas de dissociação (curvas de melting) específicas geradas após a reação de amplificação do DNA.

[14] Diversos trabalhos publicados propõem o uso de métodos baseados em DNA para a identificação e detecção de espécies em produtos cárneos. No entanto, a grande maioria desses utiliza iniciadores específicos da (s) espécie (s) em análise em reações de amplificação por PCR convencional. Amaral e colaboradores (2014) descreveram um método de PCR convencional para identificação de carne bovina, suína, de coelho, de lebre e de veado, semelhante ao método descrito por Nejad e colaboradores (2014), para identificação de frango, jumento, camelo, ovino e bovino. Esses dois métodos envolvem uma etapa de eletroforese em gel, que os deixa mais demorados e laboriosos, além de apresentarem menor sensibilidade eenvolverem reagentes tóxicos e/ou luz UV, oferecendo riscos de saúde ao manipulador (AMARAL, J. S.,. et al. Authentication of a traditional game meat sausage (Alheira) by species-specific PCR assays to detect hare, rabbit, red deer, pork and cow meats. Food Res. Int., v.60, p.140-145, 2014; NEJAD, F.P.; TAFVIZI, F.; EBRAHIMI, M.T.;

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HOSSENI, S. E. Optimization of multiplex PCR for the Identification of animal species using mitochondrial genes in sausages. Eur Food Res Technol., v. 239, p.533-541, 2014). O método descrito por Kumar e colaboradores (2014), de PCR-RFLP, para identificação de carne bovina, ovina, caprina e suína, é realizado em três passos: PCR, digestão enzimática e eletroforese em gel, sendo menos prático e sensível (KUMAR, D.,et al. Authentication of beef, carabeef, chevon, mutton and pork by a PCR-RFLP assay of mitochondrial cytb gene. J Food Sci Technol., v. 51 (11), p.34583463, 2014).

[15] A PCR em Tempo Real permite análises de DNA qualitativas (presença/ausência) e quantitativas, oferecendo maior praticidade ao dispensar a etapa de eletroforese. Além disso, apresenta maior sensibilidade do que métodos convencionais de PCR, permitindo a detecção de quantidades muito pequenas (traços) de DNA em uma amostra. A amplificação de DNA por PCR em Tempo Real é feita combinando-se os iniciadores com sondas fluorescentes ou com agentes fluorescentes intercalantes de DNA.

[16] No estado da técnica existem alguns trabalhos de relevância que utilizam metodologias de análise de DNA utilizando PCR em Tempo Real para a detecção de espécie(s) de origem em produtos cárneos. Porém, a presente invenção mostra-se mais abrangente em relação ao número de espécies detectadas (dez espécies), além de ser a única tecnologia que combina iniciadores de mais de duas espécies e um agente fluorescente de alta resolução.

[17] Espineira e Vieites (2015) desenvolveram um método baseado em sondas TaqMan para PCR em Tempo Real e iniciadores específicos das espécies de cão e gato para a análise de produtos para alimentação animal. Embora seja um método prático e extremamente sensível, a necessidade do desenho e síntese de uma sonda fluorescente deixa o teste mais oneroso, especialmente quando o objetivo é apenas avaliar a presença ou ausência de uma determinada espécie (ESPINEIRA, M.e VIEITES, J. M. Detection of dog and cat traces in food, pet food and farm animal feed by real-time PCR. Eur Food Res Technol, v.241, p.233-238, 2015).

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9/37 [18] Os trabalhos publicados por Safdar e Junejo (2015), Soares e colaboradores (2013) e Cammà e colaboradores (2012) utilizam o agente fluorescente Sybr Green como uma alternativa de menor custo à utilização das sondas. O Sybr Green é um agente que se liga entre as fitas duplas de DNA na etapa de amplificação e emite uma fluorescência detectável pelo aparelho de PCR em Tempo Real. Por ser uma ligação inespecífica, é necessária uma segunda etapa, chamada curva de dissociação (ou curva de melting) para confirmar se o DNA amplificado corresponde ao fragmento esperado. O agente Sybr Green não é saturante de DNA, oferecendo menor precisão que agentes saturantes como o Syto9, utilizado na presente invenção (SAFDAR, M.; JUNEJO, Y. Development and validation of fast duplex realtime PCR assays based on SYBER Green florescence for detection of bovine and poultry origins in feedstuffs. Food Chemistry, v. 173, p. 660-664, 2015; SOARES, S.,et al. A SYBR Green real-time PCR assay to detect and quantify pork meat in processed poultry meat products. Meat Sci., v. 94, p. 115-120, 2013; CAMMÀ, C.,et al. Development and validation of fast Real-Time PCR assays for species identification in raw and cooked meat mixtures. Food Control, v.23, p.400-404, 2012).

[19] O Syto9 é um agente fluorescente intercalante de DNA da mesma forma que o Sybr Green, porém saturante, ou seja, ele preenche toda a fita dupla de DNA. A saturação do DNA permite uma alta resolução na etapa da curva de dissociação, dessa forma aumentando a precisão nas análises de detecção das espécies presentes em uma amostra.

[20] O trabalho publicado por Sakaridis e colaboradores (2013) é o único que utiliza o método das curvas de melting de alta resolução ou HRM (high resolution melting) utilizando o agente intercalante Syto9, como proposto na presente invenção. O método publicado por Sakaridis e colaboradores (2013) tem como objetivo a detecção da espécie bubalina. Para tanto, os autores sugerem a utilização de um conjunto de iniciadores para a amplificação específica da mesma. Ainda, os autores propõem a utilização de um conjunto de iniciadores universais para a detecção da adição de outras espécies a uma determinada amostra, o que é realizado por meio

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10/37 da análise de variações nas curvas de dissociação. Desta maneira, o método apenas sugere a adulteração dos produtos com carnes de outras espécies, porém sem identificar quais são as espécies adicionadas. Dito isso, o método publicado por Sakaridis e colaboradores (2013) se mostra essencialmente diferente do método aqui proposto.

[21] Na presente invenção é utilizado um par de iniciadores para cada espécie analisada. A presença ou ausência de uma determinada espécie é dada pela análise da amplificação do DNA específico, não sendo utilizada a análise de variações na curva de melting para a sugestão de qual espécie estaria presente. Desta maneira, é possível dizer exatamente qual espécie não esperada está contida em um determinao produto analisado.

[22] Os trabalhos publicados por Safdar e colaboradores (2014) e Safdar e Abasiyanik (2013) utilizam o agente fluorescente EvaGreen combinado com iniciadores espécie-específicos para identificação das espécies bovina e caprina / suína e de frango, respectivamente. O agente EvaGreen foi escolhido pelos autores por apresentar maior sensibilidade e menor efeito inibitório da PCR quando comparado ao agente Sybr Green. Apesar dos autores utilizarem um agente fluorescente com alta performace de forma semelhante à presente invenção, as metodologias desenvolvidas em ambos trabalhos se mostram incompletas em relação à presente invenção com relação ao número de espécies testadas (apenas duas). Além disso, uma diferença crucial é a análise dos resultados: enquanto a presente proposta utiliza a avaliação do evento de amplificação do DNA em reações singleplex, dado pelo Ct alcançado no ensaio, a metodologia proposta por esses autores utiliza a análise das curvas de melting para diferenciar as espécies detectadas em uma reação de amplificação duplex. Por fim, os trabalhos desenvolvidos por Safdar e colaboradores (2014) e Safdar e Abasiyanik (2013) são focados na análise de ração para ruminantes e alimentos para pet, respectivamente, não demonstrando a sua aplicabilidade na análises de produtos cárneos embutidos para consumo humano, como a presente invenção (SAFDAR M.,et al. Rapid Bovine

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11/37 and Caprine species Identification in Ruminant Feeds by Duplex Real-Time PCR Melting Curve Analysis Using EvaGreen Fluorescence Dye. Mol Biotechnol, v.56, p.770-776, 2014; SAFDAR M. e ABASIYANIK M.F. Simultaneous identification of pork and poultry origins in pet foods by a quick multiplex real-time PCR assay using EvaGreen florescence dye. Appl Biochem Biotech, v.171, p.1855-1864, 2013).

[23] Ainda, a presente invenção faz uso de um conjunto de iniciadores universais utilizados como controle interno para validação da eficiência da etapa de extração de DNA, o que não foi observado em nenhum trabalho encontrado no estado da técnica.

[24] Floren e colaboradores (2015) desenvolveram um método de PCR digital (droplet digital PCR) para identificação de carne bovina, equina e suína. Uma desvantagem dessa tecnologia é que o método necessita de duas etapas: PCR em tempo real seguida de PCR digital, o que depende do uso de dois equipamentos diferentes, além de ser mais demorado.

[25] Os documentos de patente que descrevem metodologias para identificação de espécies em produtos cárneos abrangem desde a identificação de uma única espécie até a identificação de dez espécies. Dentre as espécies animais incluídas no estado da técnica, a mais comumente observada foi a suína (Sus scrofa), seguida da espécie bovina (Bos taurus / Bos indicus) e da espécie de frango (Gallus gallus). A grande maioria dos pedidos de patente tem como finalidade a identificação/detecção de espécies em produtos cárneos, porém alguns pedidos encontrados também abrangem a identificação/detecção em rações.

[26] O documento de patente BR 10 2013 023269 6, intitulado “Processo e kit de identificação molecular, via PCR, de material biológico proveniente de piracanjuba (Brycon orbignyanus)’’, propõe o uso da metodologia de PCR convencional e eletroforese em gel, além de envolver a identificação de apenas uma espécie não relacionada à presente invenção. O documento de patente PI 0709619-4, intitulado “Métodos para extrair ácido nucleico de uma amostra, e para amplificar DNA em uma amostra difere-se da presente invenção pela utilização da tecnologia das sondas Taqman para PCR em Tempo Real e iniciadores para bovinos, ovinos, suínos,

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12/37 peixes e aves, não fazendo a distinção das espécies para esses dois últimos. O documento de patente PI 0701529-1, intitulado “Padrão de referência contendo seqüência nucleotídica, processo para a detecção e/ou quantificação de seqüências nucleotídicas, e kit”, propõe um padrão de referência para a detecção e quantificação de sequências nucleotídicas. Segundo os inventores, tal tecnologia pode ser utilizada para que as sequências de um determinado organismo sirvam de padrão para a quantificação do mesmo em tecidos, fluidos biológicos, alimentos e cosméticos. Apesar do documento abranger qualquer espécie e matriz, a tecnologia utilizada também é diferente da presente invenção. O documento de patente PI 1106427-7, intitulado: “Método e kit para quantificação de material de origem bovina e bubalina em produtos de origem animal”, faz o uso da tecnologia de PCR em Tempo Real para a detecção e quantificação das espécies bovina e bubalina em produtos alimentícios, não compreendendo o uso da metodologia de HRM e análise das curvas de dissociação, permitindo a detecção de um número reduzido de espécies (apenas duas). O documento de patente BR 10 2013 029633 3, intitulado “Processo, kit e pre-mix para determinação quantitativa e discriminativa de ácidos nucleicos, qdPCR; processo in vitro para diagnóstico quantitativo e discriminativo de entidades biológicas” propõe o uso de sondas TaqMan para PCR em Tempo Real para a detecção das espécies bovina e suína e utiliza a metodologia de HRM (agente fluorescente Syto13) combinado com iniciadores universais para amplificação do gene Cox1 apenas para detectar eventuais polimorfismos de DNA referentes a outras fontes animais (além de bovino e suíno), pórem sem identificar qual a origem (espécie) do material presente.

[27] Dessa forma, a presente invenção é inovadora, pois: (i) conta com o uso de um painel de iniciadores específicos para a amplificação de dez diferentes espécies, não encontrado em nenhum dos documentos descritos no estado da técnica, (ii) faz uso de um agente intercalante saturante de DNA, levando a uma análise de alta resolução, (iii) utiliza a análise da ausência ou presença de amplificação para atestar a presença ou ausência de determinada espécie em uma análise, (iv) faz uso de

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13/37 iniciadores universais utilizados como controle interno, garantindo a presença de DNA de alta qualidade proveniente da etapa de extração.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [28] A Figura 1 representa as curvas de melting e Tm média obtidas para os iniciadores específicos na amplificação do DNA proveniente das espécies bovina, suína, equina e de frango.

[29] A Figura 2 representa as curvas de melting e Tm média obtidas para os iniciadores específicos na amplificação do DNA proveniente das espécies caprina, ovina, bubalina, de peru, felina e canina.

[30] A Figura 3 representa as curvas de melting obtidas para os iniciadores universais CytBuF e CytBuR3 (utilizados como controle interno - CI) na amplificação do DNA proveniente das espécies bovina, suína, caprina, ovina, peru, frango, equina, bubalina, felina e canina.

[31] A Figura 4 representa as curvas de melting resultantes da amplificação específica de cada DNA alvo presente nas Misturas controladas de DNA. Cada curva específica foi obtida em uma reação de amplificação diferente. A - Mistura contendo DNA bovino, equino e suíno; B - Mistura contendo DNA bovino e equino; C - Mistura contendo DNA bovino e canino; D - Mistura contendo DNA bubalino e suíno. DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA [32] A presente invenção refere-se a um teste de DNA para a detecção, em produtos cárneos, de um painel de dez diferentes espécies animais: bovina, caprina, ovina, suína, bubalina, equina, canina, felina, de frango e peru. Trata-se de uma alternativa rápida, confiável e pouco onerosa para a análise da composição de produtos alimentícios de base cárnea in natura ou processados, permitindo a garantia da autenticidade de produtos alimentícios. A presente invenção também se refere a um kit para realização do teste proposto.

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14/37 [33] Mais especificamente, a presente invenção consiste em um processo de detecção por PCR em Tempo Real da presença do material genético (DNA) de dez espécies animais: bovina (Bos taurus / Bos indicus), suína (Sus scrofa), bubalina (Bubalus bubalis), caprina (Capra hircus), ovina (Ovis aries), frango (Gallus gallus), equina (Equus caballus), canina (Canis lupus), peru (Meleagris gallopavo) e felina (Felis catus). Para tanto, a invenção utiliza iniciadores específicos (Seq ID No 1 a 23) para a amplificação do DNA alvo de cada espécie. A amplificação pode ser realizada a partir do DNA extraído tanto de produtos in natura ou já processados, em matrizes simples ou complexas como hambúrgueres, almondegas e lasanhas. A amplificação do DNA dessas espécies indica a presença das mesmas naquele produto.

[34] O método proposto na presente invenção compreende os seguintes passos:

a) Amplificação do DNA extraído com iniciadores específicos das dez espécies, representados pelas SEQ ID N°s 1 a 20.

b) Amplificação, em paralelo, do DNA extraído com iniciadores universais representados pelas SEQ ID N°s 21 a 23.

c) Análise das curvas de dissociação geradas na amplificação, bem como os Cts resultantes da mesma, para a detecção da ausência/presença de uma determinada espécie.

[35] A utilização do teste permite dizer se uma amostra pura contém apenas carne de uma certa espécie esperada; se uma amostra composta por mais de uma espécie contém apenas carne das espécies esperadas; se uma amostra testada contém alguma(s) espécie(s) divergente da(s) esperada(s); se uma amostra testada não contém a(s) espécie(s) esperada(s).

[36] A invenção também se destaca pela presença do controle interno (CI) utilizando iniciadores universais representados pelas SEQ ID N°s 21 a 23. Os testes devem sempre conter amplificação do CI, afim de confirmar a presença de DNA amplificável, independente das espécies presentes em uma amostra, identificando assim possíveis falhas na etapa da extração de DNA. A amplificação do CI deve

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15/37 resultar em um Ct válido (inferior a 30) para garantir a segurança dos resultados espécie-específicos e excluir possíveis falso-negativos.

[37] O kit descrito na presente invenção compreende iniciadores específicos capazes de amplificar moléculas de DNA provenientes das espécies: bovina (Bos taurus/Bos indicus) SEQ ID N°s 1 e 2, suína (Sus scrofa) SEQ ID N°s 3 e 4, bubalina (Bubalus bubalis) SEQ ID N°s 5 e 6, caprina (Capra hircus) SEQ ID N°s 7 e 8, ovina (Ovis aries) SEQ ID N°s 9 e 10, frango (Gallus gallus) SEQ ID N°s 11 e 12, equina (Equus caballus) SEQ ID N°s 13 e 14, canina (Canis lupus) SEQ ID N°s 15 e 16, peru (Meleagris gallopavo) SEQ ID N°s 17 e 18 e felina (Felis catus) SEQ ID N°s 19 e 20; e iniciadores universais capazes de amplificar moléculas de DNA provenientes das espécies citadas anteriormente, representados pelas SEQ ID N°s 21 a 23.

[38] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos a seguir, não limitantes da tecnologia.

Exemplo 1 - Desenho de iniciadores para PCR em Tempo Real [39] Para a detecção do material genético das espécies contempladas na presente invenção, foram definidos iniciadores para a amplificação específica do DNA alvo de cada uma delas. Para a espécie bubalina foi utilizado o par de iniciadores (Bub2F e Bub2R) descritos por Drummond e colaboradores (DRUMMOND, M.; BRASIL, B.; DALSECCO, L. et al. A versatile real-time PCR method to quantify bovine contamination in buffalo products. Food Control, v.29, p.131-137, 2012), desenhados com base na sequência do gene mitocondrial 16S bubalino. Os iniciadores para detecção da espécie bovina (BosF e BosR) foram descritos por Zhang e colaboradores (2007). Para a amplificação específica do DNA das demais espécies, os iniciadores foram desenhados com base na sequência do gene mitocondrial do CytB das respectivas espécies. Os iniciadores foram desenhados com o auxílio da ferramenta Primer-blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e do programa Primer Express (Applied Biosystems, EUA). Os iniciadores foram desenhados de forma que as sequências obtidas na amplificação do material genético das diversas espécies

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16/37 tivessem tamanho e conteúdo G+C diferentes entre si. Assim, as sequências obtidas podem ser distinguidas entre si pela temperatura de melting (Tm) observada na etapa de curva de dissociação.

[40] Além dos iniciadores espécie-específicos, foram também desenhados três iniciadores universais (CytBuF, CytBuR2 e CytBuR3), capazes de amplificar o conjunto das dez espécies animais incluídas nesta tecnologia. Estes iniciadores foram desenhados com base nas regiões de alta similaridade entre as sequências dos genes Cytb das dez espécies, alinhadas utilizando o algoritmo MUSCLE (EDGAR, R. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Research, vol. 32, No. 5, 2004) no programa MEGA v.6 (TAMURA, K.; STECHER, G.; PETERSON, D.; FILIPSKI, A.; KUMAR, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol, v. 30 (12), p.2725-2729, 2013). O conjunto de iniciadores CytBuF e CytBuR3 foi desenhado com o objetivo de servir como um controle da etapa de extração de DNA das amostras. Estes iniciadores são sempre utilizados nas reações de amplificação por PCR em Tempo Real, em paralelo com os demais iniciadores. Já o conjunto de iniciadores CytBuF e CytBuR2 foi desenhado para amplificar um fragmento maior, de aproximadamente 650 pb. Tal fragmento foi utilizado nos experimentos de sequenciamento de DNA (método de Sanger: SANGER, F.; NICKLEN, S.; COULSON, A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc NatAca Sei, USA, v.74, p.5463-5467, 1977) das amostras usadas como padrão para o desenvolvimento do teste, a fim de garantir o controle da identidade das mesmas. A Tabela 1 lista todos os iniciadores da presente invenção.

Tabela 1: Sequência dos iniciadores utilizados para a padronização do teste

SEQ ID N°	Nome	Tipo	Sequência (5’ 3’)	Alvo
1	BosF	Forward	CGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT	CytB (Bos taurus / Bos indicus)

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2	BosR	Reverse	GGATTGCTGATAAGAGGTTGGTG	CytB (Bos taurus / Bos indicus)
3	Bub2F	Forward	TCAGCCCAAAGAAAAATAAACCA	16S (Bubalus bubalis)
4	Bub2R	Reverse	GTCACCCCAACCGAAACTGT	16S (Bubalus bubalis)
5	Sus2F	Forward	TATCCCTTATATCGGAACAGACCTC	CytB (Sus scrofa)
6	Sus2R	Reverse	GCTGCGAGGGCGGTAA	CytB (Sus scrofa)
7	Gal3F	Forward	TCCTTCAAAGACATTCTGGGCT	CytB (Gallus gallus)
8	Gal4R	Reverse	TGGGGGAGAATAGGGCTAGTG	CytB (Gallus gallus)
9	EquF	Forward	CCAACTGGCCTCAATCCTC	CytB (Equus caballus)
10	EquR	Reverse	GGTGCTTGCGAGTGGTATAAAA	CytB (Equus caballus)
11	Ovi2F	Forward	TATACCCCTCCTCCATACATCAAAG	CytB (Ovis aries)
12	Ovi3R	Reverse	TTGGTCGGAATATTATGCTCCGTT	CytB (Ovis aries)
13	CapF	Forward	CTCCTGCTCGCGACAATG	CytB (Capra hircus)
14	Cap2R	Reverse	GATTGCTGAAAGAAGATTAGTG	CytB (Capra hircus)
15	MelF	Forward	TGCCCTGACAATCCTCATAACA	CytB (Meleagris gallopavo)
16	MeIR	Reverse	TTGGGAGGTCGATTAATGAGTTGTTG	CytB (Meleagris gallopavo)
17	CanF	Forward	TCCACACATCTAAGCAACGCA	CytB (Canis familiaris)
18	CanR	Reverse	AGATTGAAGCGACTTGTCCGATAA	CytB (Canis familiaris)
19	FelF	Forward	ATCCTCACCGGCCTCTTTTTG	CytB (Felis catus)
20	FeIR	Reverse	AACTGATGAAAAGGCGGTTATTGTG	CytB (Felis catus)
21	CytBuF	Forward	CMTGRGGMCAAATRTCMTTYTGAG	CytB
22	CytBuR2	Reverse	GGGRTRWAGYTDTCTGGGTCYCC	CytB
23	CytBuR3	Reverse	ATCGKGTDAGRGTDGSKTTGTC	CytB

Exemplo 2 - Obtenção das amostras e Extração de DNA [41] Para o desenvolvimento, padronização, demonstração da eficácia e validação do método proposto na presente invenção, foram utilizadas amostras referência de carne (músculo) de dez espécimes animais: um bovino (Bos taurus / Bos indicus), um suíno (Sus scrofa), um bubalino (Bubalus bubalis), um caprino (Capra hircus), um

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18/37 ovino (Ov/s aries), um equino (Equus caballus), um canino (Canis familiaris), um frango (Gallus gallus), um peru (Meleagris gallopavo), e um felino (Felis catus).

[42] Para a confirmação da espécie de origem, todas as amostras referência utilizadas tiveram seu DNA sequenciado por metodologia de Sanger utilizando o par de iniciadores CytBuF e CytBuR2 (Tabela 1). As sequências obtidas foram comparadas com aquelas depositadas no banco de dados GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/qenbank/) utilizando a ferramenta BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (http://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi).

[43] A extração de DNA das amostras (carne in natura ou seus produtos derivados) foi padronizada por meio de uma adaptação do método de salting out, descrito por Aljanabi e Martinez (1997). Nesta técnica o DNA da amostra é extraído, após digestão com proteinase K, por meio do uso de solução de acetato de sódio 3M. 0 DNA então é precipitado e sua purificação é feita com etanol (ALJANABI,

S.M.; MARTINEZ, I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucl. Acids Res., v.25 (22), p.4692-4693, 1997).

[44] Todas as amostras de DNA foram analisadas em espectrofotômetro NanoDrop Lite (Thermo Scientific, EUA) para a determinação da qualidade (dada pela relação A260/280) e da concentração (ng/uL).

Exemplo 3 - Protocolo de Extração de DNA em tecidos cárneos [45] Para extração de DNA a partir de tecido cárneo, pode-se utilizar o seguinte protocolo, realizado em tubos de 2,0 mL:

1. Cortar pequenos pedaços de tecido (músculo) com o auxílio de tesoura e pinça. Colocar aproximadamente 5 mg de tecido no tubo juntamente com 500 pL de tampão TEN (Tris-HCI 1 M, EDTA 0,5 M, NaCI 5M).

2. Acrescentar 20 pL de proteinase K (10 pg/pL) e 100 pL de SDS 20%.

3. Incubar em estufa a 55 °C por 2 a 3 horas, ou até que todo o tecido esteja digerido.

Obs: a incubação pode ser realizada overnight à 37 °C.

4. Acrescentar 600 pL de acetato de sódio 3M.

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5. Centrifugar a 13.300 rpm por 30 minutos.

6. Remover cuidadosamente o sobrenadante e transferi-lo igualmente para 2 novos tubos de 1,5 mL (aproximadamente 600 pL em cada).

7. Acrescentar 450 pL de etanol P.A. gelado em cada tubo.

8. Incubar em freezer a - 20 °C por 3 a 4 horas.

Obs: a incubação a - 20 °C pode ser realizada overnight.

9. Centrifugar a 13.300 rpm por 10 minutos e descartar o sobrenadante.

10. Acrescentar 300 pL de etanol 70 % e centrifugar a 13.300 rpm por 10 minutos. Remover o etanol cuidadosamente por inversão.

Obs: o passo 10 poderá ser repetido, caso o precipitado apresente grande sujidade.

11. Secar o precipitado de DNA em estufa a 52 °C por 5 minutos.

12. Ressuspender o precipitado em 50 pL de tampão TE.

13. Incubar em estufa a 37 °C por 1 hora.

14. Agregar as duplicatas de cada extração em um mesmo tubo.

15. Quantificar o DNA extraído e diluir as amostras para a concentração ideal de análise utilizando tampão TE.

16. Manter o DNA congelado em freezer até o momento da sua utilização.

Exemplo 4 - Reações de PCR em Tempo Real [46] As diversas etapas de desenvolvimento, padronização e validação desta invenção foram realizadas em aparelho 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Todas as reações foram realizadas em duplicata em placas de 96 poços.

[47] As reações de amplificação foram realizadas em formato singleplex em um volume total de 12,0 pL contendo 6,0 pL de MeltDoctor™ HRM Master Mix (Thermo Fisher Scientific), 300 nM de cada iniciador, 2,0 pL do DNA alvo (as concentrações utilizadas variaram de acordo com o experimento em questão) e 3,4 pL de água MilliQ ou Ultrapura. As condições para amplificação estão descritas na Tabela 2. Todas

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20/37 as corridas foram feitas na função Expert Mode e utilizando apenas o filtro 1 do equipamento.

[48] Todas as análises realizadas contaram, em paralelo e para cada conjunto de iniciadores, com a amplificação de um controle negativo, sem a presença de DNA (NTC - No template contrai) e um controle positivo com DNA puro da referida espécie. As análises de misturas controladas de carnes e amostras comerciais, descritas abaixo, contaram também com a amplificação do gene CytB (utilizado como controle interno - Cl) pelo conjunto de iniciadores CytBuF e CytBuR3. A amplificação do Cl tem o objetivo de servir como um controle da etapa de extração de DNA das amostras.

Tabela 2 - Parâmetros de ciclagem utilizados para a reação de PCR no 7500 RealTime PCR System

ESTAGIO	PASSO	TEMPERATURA	TEMPO	RAMPA
Ativação	Ativação do AmpErase	50 °C	2 min	100%
	Ativação da enzima	95 °C	10 min	100%
Ciclagem (35 ciclos)	Desnatu ração	95 °C	15 seg	100%
Anelamento	58 °C	15 seg	100%
	Extensão	60 °C	1 min	100%
Curva de dissociação	Desnatu ração	95 °C	15 seg	100%
Anelamento	60 °C	1 min	100%
	Dissociação	95 °C	30 seg	1%
	Anelamento final	60 °C	15 seg	100%

[49] As reações foram controladas pelo 7500 Software (Thermo Fisher Scientific). As leituras foram feitas a cada ciclo e o logaritmo do incremento da fluorescência foi plotado contra o número do ciclo. A fluorescência basal (Baseline) foi ajustada para os ciclos 3 a 12. Os limites de fluorescência, denominados thresholds, foram fixados no valor de 150.000 para todos os conjuntos de iniciadores. O número de ciclos de PCR necessários para determinada amostra atingir o threshold, denominado Ct, foi computado. O valor de Ct é dado pela média dos Cts das duplicatas de cada reação,

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21/37 calculado automaticamente pelo 7500 Software e utilizado em todas as análises aqui descritas. Para todos os experimentos utilizando a metodologia aqui descrita, resultados de Ct maior ou igual a 30 foram considerados como negativos.

Exemplo 5 - Validação dos iniciadores e determinação da Tm específica [50] Para avaliar a capacidade de amplificação dos iniciadores espécie-específicos pela metodologia aqui proposta, foram realizadas reações contendo 20ng do DNA puro de cada espécie e os respectivos iniciadores específicos. As curvas de dissociação (melting), geradas após a amplificação de cada amostra, foram avaliadas quanto à presença de apenas uma curva por reação, em experimentos de PCR em Tempo Real (Figuras 1, 2 e 3). As temperaturas de melting (Tm) referentes a cada curva de dissociação foram determinadas automaticamente pelo programa 7500 Software e utilizadas no cálculo da Tm média, com seu respectivo desvio padrão, para cada espécie do painel. O cálculo foi realizado utilizando-se os valores de Tm obtidos em pelo menos sete reações de amplificação do DNA puro das amostras referência pelo respectivo conjunto de iniciadores específicos. Cada reação apresentou apenas um pico de melting referente à amplificação do DNA alvo. Para cada fragmento das reações espécie-específicas foi determinada a Tm (Temperatura de melting) média e o seu respectivo desvio padrão (Figuras 1 e 2).

[51] A capacidade de amplificação dos iniciadores universais utilizados como controle interno (CI) foi avaliada em reações contendo 20 ng do DNA puro de cada espécie e os iniciadores CytBuF e CytBuR3. As curvas de dissociação obtidas foram avaliadas quanto à presença de apenas uma curva por reação.

Exemplo 6 - Determinação da sensibilidade [52] Para a determinação da sensibilidade de amplificação e limites de detecção específica de cada um dos pares de iniciadores, foram realizadas curvas de diluição seriada (1:5) utilizando o DNA puro extraído de amostras de cada uma das espécies e seus respectivos iniciadores específicos. Os limites de detecção específica (dados em ng de DNA) das reações de PCR em Tempo Real foram observados. Utilizando o

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7500 Software, o número de ciclos necessários para determinada amostra atingir o limite estabelecido de fluorescência (threshold), denominado Ct, foi computado para cada uma das diluições. As curvas de dissociação, bem como os Cts, foram utilizadas para calcular as eficiências de amplificação e os limites de detecção de cada par de iniciadores. Resultados de Ct maior ou igual a 30 foram considerados como negativos.

[53] A sensibilidade de amplificação e os limites de detecção específica de cada conjunto de iniciadores foram avaliados utilizando as curvas de diluição seriada (1:5) do DNA puro de cada espécie e amplificação com os respectivos iniciadores específicos. Utilizando o 7500 Software, os Cts obtidos em cada diluição foram plotados em gráficos (dados não apresentados) de acordo com a quantidade inicial de DNA na reação. A inclinação das retas obtidas (Tabela 3) foram utilizadas para calcular a eficiência de amplificação de cada conjunto de iniciadores específicos (inclinação de -3,32 corresponde a 100% de eficiência). As eficiências obtidas foram satisfatórias, variando entre 96,7% e 103,6% (Tabela 3). Além disso, o coeficiente de correlação (R2), gerado pelo 7500 Software, foi utilizado como parâmetro para avaliar a adequação dos pontos medidos à equação da reta (quanto mais próximo o coeficiente é de 1, melhor é o ajustamento). Os valores de R2 obtidos nos experimentos de sensibilidade foram igualmente satisfatórios (acima de 0,99) para todos os conjuntos de iniciadores (Tabela 3), demostrando alta confiabilidade na eficiência calculada.

[54] Os limites de detecção de cada conjunto de iniciadores específicos (Tabela 3) foram calculados como sendo a quantidade de DNA (em nanogramas) correspondente ao menor ponto da curva de diluição que obteve valor de Ct < 30,0 na amplificação.

Tabela 3 - Dados dos experimentos de sensibilidade das reações de PCR espécieespecíficas

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Espécie	Quantidade inicial de DNA na reação (ng)a	Faixa de Ct	Inclinação	Eficiência (%)	R2	Limite de detecção (ng)b
Bos taurus	32 - 0,00041	15,0- 31,7	- 3,40	96,5	0,999	0,00205
Sus scrofa	32 - 0,00041	16,5 - 32,4	- 3,23	103,7	0,999	0,01024
Equus caballus	32 - 0,00041	15,7- 31,7	- 3,36	98,6	0,997	0,00205
Bubalus bubalis	32 - 0,00041	16,6 - 33,1	- 3,36	98,4	0,998	0,01024
Gallus gallus	32 - 0,00041	17,6- 34,3	- 3,13	108,8	0,997	0,01024
Capra hircus	32 - 0,00041	17,0 - 32,5	- 3,24	103,6	0,997	0,01024
Ovis aries	32 - 0,00041	17,5 - 33,8	- 3,37	97,9	0,998	0,01024
Meleagris gallopavo	32 - 0,00041	16,6 - 33,2	- 3,30	101,0	0,997	0,01024
Felis catus	32 - 0,00041	15,5- 31,7	- 3,35	98,8	0,999	0,00205
Canis familiaris	32 - 0,00041	14,0 - 29,9	- 3,29	101,3	0,997	0,00041

^aQuantidades de DNA específico utilizadas nas curvas de diluição seriadas (1:5). ^b Menor quantidade de DNA detectada em reações com Ct < 30,0.

Exemplo 7 - Determinação da especificidade [55] A especificidade dos iniciadores foi inicialmente testada in silico por meio da comparação de sua sequência com aquelas presentes na base de dados de sequências gênicas NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/), utilizando o algoritmo BLASTN (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearc h&LINK_LOC=blasthome). Foi observado o fato de que um determinado iniciador

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24/37 obtivesse similaridade apenas para a espécie alvo e não com as demais espécies presentes no teste. Além disso, a especificidade de cada um dos iniciadores foi testada experimentalmente realizando-se amplificações cruzadas em reações contendo determinado iniciador e o DNA puro (20 ng) extraído de amostras das outras espécies (não-alvo). As reações foram realizadas de acordo com a metodologia descrita no Exemplo 4. Resultados de Ct maior ou igual a 30 foram considerados como negativos.

[56] A especificidade de amplificação dos iniciadores foi avaliada utilizando o DNA puro de cada espécie em reações cruzadas utilizando os iniciadores para amplificação específica das demais espécies. A Tabela 4 apresenta os valores de Cts obtidos para cada DNA alvo utilizando os diversos conjuntos de iniciadores. As amplificações com Cts acima de 30 foram consideradas inespecíficas. Sendo assim, para fins de análise, as reações com valores obtidos de Ct superiores a 30 ou indeterminados (ind.) foram consideradas como “ausência de material genético da espécie alvo” ((-) ou negativo); e as reações com valores obtidos de Ct menores ou iguais a 30 foram consideradas como “presença de material genético da espécie alvo” ((+) ou positivo).

[57] Para as reações combinando um determinado DNA alvo e seu conjunto de iniciadores específicos foram observados valores de Ct entre 13,0 e 20,8. Para as reações combinando um determinado DNA alvo e os conjuntos de iniciadores específicos para as demais espécies foram observados Cts acima de 30 ou indeterminados.

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Tabela 4 - Valores de Cts obtidos nas amplificações cruzadas e específica do DNA puro de cada espécie. Valores de Ct marcados em verde representam amplificações específicas; “ind.” = Ct indeterminado (ausência de amplificação); (-) = ausência de material genético; (+) = presença de material genético.

DNA	BOS
Bovino	17.4 (+)
Suíno	ind.(-)
Equino	31.9(- )
Frango	ind.(-)
Caprino	ind.(-)
Ovino Bubalin o	34.1(- ) 33.3(- )
Peru	ind.(-)
Felino	31.7(- ) 31.9(- )
Canino

Conjuntos de iniciadores

SUS EQU GAL CAP OVI BUB MEL FEL ind. ()

17.0 (⁺)

32.5()

34.1()

34.0() ind.(-)

34.9() ind.(-)

30.8() ind.(-) ind.(-) ind.(-)

15.8 (⁺) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-)

32.3()

33.9() ind.(-)

34.8()

32.7()

19.0 (⁺) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-)

34.7() ind.(-) ind.(-)

34.6() ind.(-) ind.(-)

17.5 (⁺) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-)

32.6() ind.(-) ind.(-) ind.(-)

33.6()

18.1 (⁺) ind.(-) ind.(-)

34.2() ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-)

15.5 (⁺) ind.(-)

32.9() ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-)

21.0 (⁺) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-)

16.3 (⁺)

31.3()

CAN ind.(-)

34.5() ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-) ind.(-)

30.0()

14.8 (⁺)

Exemplo 8 - Validação do teste em misturas controladas e amostras comerciais [58] A eficácia da presente invenção em detectar corretamente todas as espécies presentes em amostras mistas foi testada utilizando-se diferentes misturas controladas. Tais amostras mistas foram construídas de duas diferentes maneiras: 1) misturando o DNA extraído de amostras de carne puras (Misturas controladas de DNA), ou 2) misturando as carnes puras das diferentes espécies, com a posterior extração de DNA (Misturas controladas de carnes).

[59] Foram primeiramente preparadas dez misturas contendo DNA de duas ou três espécies diferentes, em proporções equivalentes, totalizando 100 uL (na concentração final de 50 ng/uL), denominadas de “Misturas controladas de DNA”. As

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26/37 misturas foram amplificadas em reações contendo 2 uL da mistura (100 ng de DNA toral) e os iniciadores referentes às espécies presentes, a fim de se verificar a presença dos picos de melting específicos. As reações foram realizadas de acordo com a metodologia descrita no Exemplo 4.

[60] Da mesma maneira, foram preparadas vinte e uma misturas utilizando carne pura de mais de uma espécie em várias proporções, denominadas de “Misturas controladas de carne”. As misturas foram obtidas pesando-se, em balança analítica, carnes sabidamente puras das diferentes espécies em diversas proporções, em um total de 1 (um) grama. Em seguida, as misturas foram maceradas em cadinhos de porcelana e submetidas à extração de DNA seguindo o protocolo descrito no Exemplo 3 - Protocolo de extração de DNA de tecidos cárneos. As “Misturas controladas de carnes” foram amplificadas em reações contendo 20 ng do DNA extraído com o painel completo das dez espécies, assim como o controle interno, de acordo com a metodologia descrita no Exemplo 4.

[61] Em seguida, a validação do teste também foi realizada em amostras comerciais de cinco produtos cárneos adquiridos em mercados locais da cidade de Belo Horizonte - MG. As amostras foram submetidas à extração de DNA seguindo o protocolo descrito no Exemplo 3 e amplificadas em reações contendo 20 ng do DNA extraído com o painel das dez espécies e o controle interno, de acordo com a metodologia descrita no Exemplo 4.

[62] Com o objetivo de avaliar a veracidade do método proposto na presente invenção, os experimentos das “Misturas Controladas de Carnes” e da validação em amostras comerciais foram realizados em paralelo no Laboratório de Genética da Escola de Veterinária da UFMG (LGEV) e no Laboratório da empresa Myleus Biotecnologia. As misturas e as amostras comerciais foram extraídas de forma independente seguindo o protocolo descrito no Exemplo 4 e testadas separadamente nos dois laboratórios. Os ensaios realizados no LGEV utilizaram os parâmetros definidos anteriormente para a realização dos testes.

Petição 870160039156, de 26/07/2016, pág. 76/95

27/37 [63] Já no Laboratório da empresa Myleus Biotecnologia, os testes das “Misturas Controladas de Carnes” foram realizados em reações contendo 12,5 ng de DNA e os testes das amostras comerciais em reações contendo 6,25 ng de DNA, de acordo com dosagem em Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific, EUA). O threshold foi fixado no valor de 200.000 para todos os ensaios no aparelho 7500 Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific) do laboratório. Os demais parâmetros de amplificação e análise das curvas de dissociação foram os mesmos utilizados no LGEV, definidos nas seções anteriores.

[64] Os resultados obtidos em ambos laboratórios foram comparados primeiramente quanto às espécies detectadas nas misturas. Em seguida, foi calculada a correlação entre os valores de Cts obtidos nos dois laboratórios utilizando-se o cálculo do coeficiente de correlação de Pearson.

[65] Misturas controladas de DNA: as diversas misturas controladas foram testadas apenas com os conjuntos de iniciadores específicos para as espécies presentes. As reações com valores obtidos de Ct superiores a 30 ou indeterminados (ind.) foram consideradas como “ausência de material genético da espécie alvo” ((-) ou negativo); e as reações com valores obtidos de Ct menores ou iguais a 30 foram consideradas como “presença de material genético da espécie alvo” ((+) ou positivo).

[66] O teste das “Misturas controladas de DNA” apresentou amplificação específica para os DNAs alvo presentes nas misturas (Tabela 5). Foi observada a presença das curvas de melting com as respectivas temperaturas de melting (Tm) esperadas para cada fraude como exemplificado na Figura 4.

Tabela 5 - Valores de Cts obtidos na amplificação das Misturas Controladas de DNA; (+) = presença de material genético; “X” = experimento não realizado

CONJUNTOS DE INICIADORES

Espécies (e BOS EQU BUB SUS MEL GAL CAN FEL proporções) presentes na mistura

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28/37

33% suíno + 33% peru + 33% frango	X	X	X	16,1 (+)	17,4 (+)	17,3 (+)	X	X
33% bovino + 33%	14,5	16,2	X	15,9	X	X	X	X
equino + 33% suíno	(+)	(+)		(+)
50% bovino + 50%	14,7	14,7	X	X	X	X	X	X
equino	(+)	(+)
50% bovino + 50% suíno	14,4	X	X	15,7	X	X	X	X
	(+)			(+)
50% bovino + 50%	14,6	X	X	X	X	X	14,1	X
canino	(+)						(+)

50% bovino + 50% felino	14,3 (+)	X	X	X	X	X	X	15,6 (+)
50% bubalino + 50%	14,2	X	16,5	X	X	X	X	X
bovino	(+)		(+)
50% bubalino + 50%	X	X	16,8	15,8	X	X	X	X
suíno			(+)	(+)
50% equino + 50%	X	15,1	16,7	X	X	X	X	X
bubalino		(+)	(+)
50% bovino + 50%	14,5	X	X	X	X	17,2	X	X
frango	(+)					(+)

[67] Misturas controladas de carnes: os resultados dos experimentos das “Misturas controladas de carnes” estão apresentados na Tabela 6. As diferentes espécies presentes em cada mistura foram sempre detectadas pelo uso dos seus iniciadores específicos com um Ct < 30. As curvas de melting e respectivas Tm foram obtidas conforme esperado para cada mistura. As reações com conjuntos de iniciadores específicos para espécies ausentes de determinada mistura apresentaram Cts > 30 ou indeterminado, indicando ausência de material genético da espécie na fraude. As reações de controle interno demonstraram Cts entre 19,7 e 27,7.

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29/37 [68] A amplificação específica de espécies presentes em determinada mistura na proporção de 1% mostra a sensibilidade da técnica. Assim, a metodologia aqui descrita é capaz de detectar espécies presentes em uma proporção de até 1% em uma determinada amostra. Não foram analisadas misturas com proporção de espécies menor que 1%.

Tabela 6 - Valores de Cts obtidos na amplificação das Fraudes Controladas de Carnes com o painel completo das espécies e o controle interno (CI). Ensaios realizados no Laboratório de Genética da Escola de Veterinária da UFMG. Valores de Ct marcados em verde representam amplificações específicas; “ind”. = Ct indeterminado; (-) = ausência de material genético; (+) = presença de material genético.

Petição 870160039156, de 26/07/2016, pág. 79/95

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CONJUNTO DE INICIADORES

ESPÉCIES (E PROPORÇÕES) PRESENTES NA MISTURA	Cl	BOS	SUS	EQU	GAL	CAP	OVI	BUB	MEL	FEL	CAN
33% PERU +	23,6	ind.	27,6	ind.	23,3	ind.	ind.	ind.	21,1	ind.	ind.
33% FRANGO + 33% SUÍNO	(+)	(-)	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)
33% BOVINO +	21,6	24,4	23,2	18,7	ind.	ind.	33,8	ind.	ind.	ind.	ind.
33% EQUINO + 33% SUÍNO	(+)	(+)	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +	19,7	20,6	34,5	19,4	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	34,8	ind.
50% EQUINO	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
99% BOVINO +	22.4	20,2	ind.	24,1	ind.	33,6	ind.	34,1	ind.	ind.	ind.
1% EQUINO	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +	25,7	17,8	20,4	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.
50% SUÍNO	(+)	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
99% BOVINO +	23,6	16,4	24,4	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.
1% SUÍNO	(+)	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +	24,6	26,4	ind.	ind.	22,1	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.
50% FRANGO	(+)	(+)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
99% BOVINO +	27,7	19,8	ind.	ind.	26,7	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.
1% FRANGO	(+)	(+)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% PERU +	24,9	ind.	ind.	ind.	22,3	ind.	ind.	ind.	26,7	ind.	ind.
50% FRANGO	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)

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31/37

99% PERU +	25,8	32,7	ind.	ind.	27,0	ind.	ind.	ind.	25,9	ind.	ind.
1% FRANGO	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)
50% BOVINO +	22.4	17,2	ind.	33,4	ind.	33,7	ind.	ind.	ind.	18,4	ind.
50% GATO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)
50% BOVINO +	24,5	17,3	ind.	34,6	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	ind.	15,0
50% CÃO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)
99% BOVINO +	24,0	17,2	ind.	34,9	34,6	ind.	34,6	ind.	ind.	ind.	20,4
1% CÃO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)
50% BOVINO +	22,8	17,7	ind.	ind.	34,7	ind.	34,7	19,9	ind.	ind.	32,7
50% BÚFALO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
1% BOVINO +	20,9	22,2	ind.	ind.	ind.	ind.	32,3	16,6	ind.	ind.	34,8
99% BÚFALO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
50% SUÍNO +	25,6	34,3	21,7	ind.	ind.	ind.	ind.	19,0	ind.	ind.	ind.
50% BÚFALO	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
1% SUÍNO +	24,0	34,3	24,2	32,7	ind.	32,8	ind.	17,8	ind.	ind.	ind.
99% BÚFALO	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +	23,3	18,3	ind.	ind.	ind.	18,1	ind.	32,6	ind.	ind.	34,6
50% CAPRINO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
1% BOVINO +	22,5	23,8	ind.	33,7	ind.	16,8	ind.	ind.	ind.	ind.	34,6
99% CAPRINO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +	22,5	18,5	ind.	ind.	ind.	34,0	20,6	33,6	ind.	32,9	32,9
50% OVINO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)

Petição 870160039156, de 26/07/2016, pág. 81/95

32/37

25% BOVINO + 20,5 19,6 21,6 33,1 ind. 20,1 21,5 ind. ind. ind. ind.

25% SUÍNO + (+) (+) (+) (-) (-) (+) (+) (-) (-) (-) (-)

25% OVINO +

25% CAPRINO [69] Validação em Amostras Comerciais: na última etapa da validação do teste “Método e Kit para detecção de espécies em produtos de origem animal”, foram analisadas amostras de produtos cárneos adquiridos comercialmente, seguindo toda a metodologia definida para extração e amplificação com o painel completo das dez espécies e o Cl. As reações com valores de Ct > 30 ou indeterminados foram consideradas como “ausência de material genético da espécie alvo” e as reações com valores de Ct < 30 foram consideradas como “presença de material genético da espécie alvo” (Tabela 7).

[70] O teste detectou corretamente a presença material genético da espécie informada na composição dos produtos e ainda a presença da espécie bovina nas amostras MY315.1 e MY315.4 (Tabela 7), cuja adição não foi declarada na rotulagem. Esses resultados indicam possíveis fraudes por adição de material bovino em produtos que seriam exclusivamente de carne ovina.

Tabela 7 - Detecção de espécies em amostras comerciais. Ensaios realizados no Laboratório de Genética da Escola de Veterinária da UFMG.

AMOSTRA	NOME DO PRODUTO	COMPOSIÇÃO INFORMADA (ORIGEM ANIMAL)	PRESENÇA DE MATERIAL GENÉTICO DA(S) ESPÉCIE(S)
MY315.1	Hamburguinho - carne de cordeiro	Carne ovina	Ovina e bovina
MY315.2	SteakBurger de costela	Carne bovina	Bovina
MY315.3	MaxBurger carne bovina	Carne bovina	Bovina
MY315.4	Linguiça - carne de Cordeiro	Carne ovina	Ovina e bovina
MY315.5	CowBurguerhamburguer de carne bovina	Carne bovina	Bovina

Petição 870160039156, de 26/07/2016, pág. 82/95

33/37

Exemplo 9: Comparação Interlaboratorial [71] A veracidade do método proposto na presente invenção foi avaliada comparando-se os resultados dos experimentos de amplificação das “Misturas Controladas de Carnes” realizados no Laboratório de Genética da Escola de Veterinária da UFMG (Tabela 7) com os experimentos realizados no Laboratório da empresa Myleus Biotecnologia, apresentados abaixo na Tabela 8. Todas as misturas controladas tiveram suas espécies detectadas igualmente nos dois laboratórios, de acordo com o esperado para cada uma das misturas conhecidas. Ainda, os valores de Cts obtidos demonstraram alta correlação entre os dois laboratórios, dada pelo coeficiente de correlação de Pearson = 0,91 (coeficiente igual a 1 indica uma correlação perfeita). Para o cálculo da correlação foram utilizados todos os valores de Cts obtidos na amplificação das Misturas Controladas de Carnes com os 11 conjuntos de iniciadores (iniciadores espécie-específicos e CI) (Tabelas 7 e 8), inclusive valores acima de 30 (considerados como ausência de material genético), totalizando 88 pares de observações (n = 88).

Tabela 8 - Valores de Cts obtidos na amplificação das Fraudes Controladas de Carnes com o painel completo das espécies e o controle interno (CI). Ensaios realizados no Laboratório da empresa Myleus Biotecnologia. Valores de Ct marcados em verde representam amplificações específicas; “ind.” = Ct indeterminado; (-) = ausência de material genético; (+) = presença de material genético.

CONJUNTOS DE INICIADORES
ESPÉCIES (E PROPORÇÕES) PRESENTES NA MISTURA	CI	BOS	SUS	EQU	GAL CAP OVI BUB	MEL	FEL	CAN
33% PERU + 33% FRANGO + 33% SUÍNO	16,7 (+)	34,4 (- )	17,7 (+)	33,0 (- )	17,5 ind. ind. ind. (+) (-) (-) (-)	18,9 (+)	ind. (-)	ind. (-)

Petição 870160039156, de 26/07/2016, pág. 83/95

34/37

33% BOVINO + 33% EQUINO + 33% SUÍNO	16,0 (+)	17,0 (+)	+ 00 o	15,7 (+)	33,4 (-)	ind. (-)	31,4 (-)	ind. (-)	ind. (-)	ind. (-)	34,4 (-)
50% BOVINO +	15,7	16,2	33,1	15,4	ind.	33,1	ind.	34,1	ind.	32,3	ind.
50% EQUINO	(+)	(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
99% BOVINO +	18,2	15,7	ind.	21,2	ind.	33,8	ind.	33,9	ind.	ind.	ind.
1% EQUINO	(+)	(+)	(-)	(+) (+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +	19,9	17,4	18,7	33,5	34,9	ind.	ind.	34,1	ind.	ind.	ind.
50% SUÍNO	(+)	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
99% BOVINO +	19,3	16,8	23,7	32,6	ind.	ind.	ind.	34,5	34,5	ind.	ind.
1% SUÍNO	(+)	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +	16,3	16,5	32,9	34,7	17,0	33,9	32,0	33,9	ind.	ind.	ind.
50% FRANGO	(+)	(+)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
99% BOVINO +	18,0	15,5	33,4	33,8	21,9	33,5	31,8	33,6	ind.	34,5	ind.
1% FRANGO	(+)	(+)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
50% PERU +	16,8	32,9	33,9	ind.	17,0	ind.	ind.	ind.	18,5	ind.	ind.
50% FRANGO	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)
99% PERU + 1%	20,0	34,1	ind.	34,3	22,8	ind.	ind.	32,2	17,9	ind.	34,8
FRANGO	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)
50% BOVINO +	18,3	16,2	34,5	33,2	34,7	31,2	ind.	33,9	ind.	17,3	30,3
50% GATO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)
50% BOVINO +	17,2	15,9	33,6	ind.	ind.	ind.	ind.	34,2	ind.	ind.	15,1
50% CÃO	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)

Petição 870160039156, de 26/07/2016, pág. 84/95

35/37

99% BOVINO + 1% CÃO	18,1 (+)	15,4 (+)	32,9 (-)	ind. (-)	ind. (-)	32,0 (-)	32,7 (-)	33,0 (-)	ind. (-)	34,7 (-)	20,3 (+)
50% BOVINO +		18,2	16,7	ind.	ind.	ind.	34,1	34,6	17,7	ind.	ind.	ind.
50% BÚFALO		(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
1% BOVINO +		17,6	21,4	ind.	34,8	ind.	31,3	31,0	16,1	ind.	33,4	ind.
99% BÚFALO		(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
50% SUÍNO +		18,3	31,2	17,1	ind.	33,4	ind.	ind.	17,5	ind.	ind.	ind.
50% BÚFALO		(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
1% SUÍNO +		17,3	30,2	22,5	31,1	ind.	ind.	ind.	16,0	ind.	34,8	33,3
99% BÚFALO		(+)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)
50% BOVINO +		18,4	16,7	ind.	ind.	ind.	17,8	33,9	30,3	34,7	ind.	32,9
50% CAPRINO		(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-)
1% BOVINO +		18,9	22,3	ind.	34,2	ind.	16,7	33,7	ind.	ind.	ind.	ind.
99% CAPRINO		(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(-) ()
50% BOVINO +		17,7	16,4	ind.	34,6	ind.	30,9	17,8	32,8	ind.	32,2	32,2
50% OVINO		(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)
25% BOVINO	+	18,7	17,6	19,5	32,9	34,6	18,0	19,4	33,5	ind.	ind.	34,6
25% SUÍNO	+	(+)	(+)	(+)	(-)	(-)	(+)	(+)	(-)	(-)	(-)	(-)
25% OVINO 25% CAPRINO	+

[72] A etapa de comparação interlaboratorial também foi realizada com as amostras comerciais MY315.1 a MY315.5, analisadas de forma idependente em ambos laboratórios e seguindo os mesmos critérios para presença/ausência de material genético das espécies. Os resultados foram idênticos nos dois laboratórios,

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36/37 com a detecção correta da espécie informada na composição dos produtos e a detecção de material espécie bovina nas amostras MY315.1 e MY315.4 (Tabela 9).

Tabela 9 - Detecção de espécies em amostras comerciais. Ensaios realizados no Laboratório da empresa Myleus Biotecnologia.

AMOSTRA	NOME DO PRODUTO	COMPOSIÇÃO INFORMADA (ORIGEM ANIMAL)	PRESENÇA DE MATERIAL GENÉTICO DA(S) ESPÉCIE(S)
MY315.1	Hamburguinho - carne de cordeiro	Carne ovina	Ovina e bovina
MY315.2	SteakBurger de costela	Carne bovina	Bovina
MY315.3	MaxBurger carne bovina	Carne bovina	Bovina
MY315.4	Linguiça - carne de Cordeiro	Carne ovina	Ovina e bovina
MY315.5	CowBurguer- hamburguer de carne bovina	Carne bovina	Bovina

[73] Dessa forma, a veracidade do método proposto na presente invenção foi atestada pelos experimentos de validação interlaboratorial, em que todas as misturas controladas tiveram suas espécies detectadas corretamente em ambos laboratórios, com forte correlação dos valores de Cts entre os dois laboratórios, demonstrando alta consistência dos resultados. Os resultados indicam que o teste é seguramente reproduzível, podendo ser inclusive expandido a outros laboratórios. Esta é uma etapa muito importante na validação de testes analíticos, porém muitas vezes ausentes em grande parte das metodologias atualmente disponíveis.

[74] O teste de amostras comerciais, além de confirmar a veracidade do presente teste nos experimentos de comparação interlaboratorial, revelou inconformidades em produtos cárneos disponíveis aos consumidores: foi detectado material da espécie

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37/37 bovina em duas das cinco amostras analisadas, cuja presença não estava declarada na rotulagem dos produtos. Esses resultados reforçam a demanda e a urgência pela disponibilização de testes que visam a detecção de fraudes por adição/substituição de espécies em produtos alimentícios, garantindo a qualidade e a segurança destes produtos para toda a indústria alimentícia, comerciantes e consumidores.

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1/2

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1) MÉTODO PARA DETECÇAO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PELA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL, caracterizado por utilizar iniciadores específicos capazes de amplificar moléculas de DNA provenientes de um painel de 10 espécies: bovina (Bos taurus/ Bos indicus) SEQ ID N°s 1 e 2, suína (Sus scrofa) SEQ ID N°s 3 e 4, bubalina (Bubalus bubalis) SEQ ID N°s 5 e 6, caprina (Capra hircus) SEQ ID N°s 7 e 8, ovina (Ovis aries) SEQ ID N°s 9 e 10, frango (Gallus gallus) SEQ ID N°s 11 e 12, equina (Equus caballus) SEQ ID N°s 13 e 14, canina (Canis lupus) SEQ ID N°s 15 e 16, peru (Meleagris gallopavo) SEQ ID N°s 17 e 18 e felina (Felis catus) SEQ ID N°s 19 e 20.
2. 2) MÉTODO PARA DETECÇAO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PELA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar controle interno de amplificação (CI) para garantir a segurança dos resultados espécie-específicos e excluir possíveis falso-negativos, por meio do uso de iniciadores universais capazes de amplificar moléculas de DNA provenientes das 10 espécies do painel, representados pelas SEQ ID N°s 21 a 23.
3. 3) MÉTODO PARA DETECÇAO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PELA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por detectar a presença/ausência de espécies por meio da análise de curvas de melting.
4. 4) MÉTODO PARA DETECÇAO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PELA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por detectar a presença/ausência de espécies por meio da análise dos resultados de Ct.
5. 5) MÉTODO PARA DETECÇAO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PELA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar o sistema MeltDoctor® High

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   2/2

   Resolution Melting, agente fluorescente Syto 9, em aparelho de PCR em Tempo Real.
6. 6) KIT PARA DETECÇAO DE ESPÉCIES EM PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL PELA TÉCNICA DE PCR EM TEMPO REAL, caracterizado por compreender os seguintes componentes:

   a. iniciadores específicos capazes de amplificar moléculas de DNA provenientes das espécies: bovina (Bos taurus/ Bos indicus) SEQ ID N°s 1 e 2, suína (Sus scrofa) SEQ ID N°s 3 e 4, bubalina (Bubalus bubalis) SEQ ID N°s 5 e 6, caprina (Capra hircus) SEQ ID N°s 7 e 8, ovina (Ovis aries) SEQ ID N°s 9 e 10, frango (Gallus gallus) SEQ ID N°s 11 e 12, equina (Equus caballus) SEQ ID N°s 13 e 14, canina (Canis lupus) SEQ ID N°s 15 e 16, peru (Meleagris gallopavo) SEQ ID N°s 17 e 18 e felina (Felis catus) SEQ ID N°s 19 e 20; e iniciadores universais capazes de amplificar moléculas de DNA provenientes das espécies: bovina (Bos taurus / Bos indicus), suína (Sus scrofa), bubalina (Bubalus bubalis), caprina (Capra hircus), ovina (Ovis aries), frango (Gallus gallus), equina (Equus caballus), canina (Canis lupus), peru (Meleagris gallopavo) e felina (Felis catus), representados pelas SEQ ID N°s 21 a 23.

   Petição 870160039156, de 26/07/2016, pág. 89/95

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   DESENHOS

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