CN116606849A - 一种用于生物样本一步法核酸快速提取方法与配套装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于生物样本一步法核酸快速提取方法与配套装置。通过将生物样本加入到核酸释放试剂中，在加热条件下得到裂解反应液，最后利用配套提取配套装置获得含有病原体核酸的样本释放液以用于核酸扩增。所述的核酸释放试剂中包含有TCEP·HCl，EDTA，树脂，表面活性剂等。本发明还提供一种用于该核酸快速提取方法的配套装置，是由两个腔体组成的注射器装置，包含注射用活塞、推杆、微孔过滤膜、加样出液口、密封盖。本发明的技术方案在于无需复杂样本处理过程和仪器设备，利用一步法实现对样本核酸提取并用于下游的聚合酶链式反应或等温核酸扩增，操作过程简单方便，操作时间短，尤其适合呼吸道和肠道等致病病原体的检测。

Description

一种用于生物样本一步法核酸快速提取方法与配套装置

技术领域

本发明属于核酸提取领域，具体涉及一种用于生物样本一步法快速提取方法与配套装置，是一种快速从生物样本中获得病原体核酸的提取方法与配套装置。

背景技术

利用核酸诊断技术进行病原体检测是一种重要的病原诊断手段，尤其在传染性疾病的诊断中有着广泛应用。

生物样本前处理和核酸提取是核酸诊断的首要步骤。当前基于柱膜法或磁珠法的传统核酸提取方案种类繁多，但是一般需要进行样本均质化，样本裂解、核酸结合、漂洗和洗脱等步骤，大大增加了人工操作难度和检测时间。尽管将传统核酸提取方法结合自动化方式可以有效降低人力成本，但是自动化仪器往往价格昂贵，无法大规模推广应用，不利于迫切需要核酸检测诊断的基层医疗单位及地处偏远、医疗资源匮乏的经济欠发达地区开展。

除此之外，无论是纯手工操作还是自动化提取，样本前处理、样本裂解、核酸结合、漂洗和核酸洗脱等步骤需要在开放环境中进行转移操作，一旦操作环境存在污染或者操作不当，都可能造成检测结果失真。

针对上述技术问题，本领域目前主要对核酸提取方法以及核酸提取装置等方面进行优化，以期在保证核酸产物质量的前提下，尽可能简化操作步骤和降低样本前处理和核酸提取时间。然而现有大多很难在操作简便与核酸产物质量上同时获得理想的结果。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于生物样本一步法核酸快速提取方法，通过以下步骤实现：将生物样本由第二独立腔体后端加入含有核酸释放试剂的配套装置中的第二腔体中，充分混匀，或者先将生物样本与核酸释放试剂充分混匀后，再加入第二独立腔体，连接第一腔体和第二腔体，在加热条件下得到裂解反应液，最后由配套装置中的多孔滤膜过滤，除去不溶物杂质，获得含有病原体核酸的核酸释放液(包括DNA和RNA)，获得的裂解液可用于DNA和RNA核酸的释放，用于后期核酸检测。

当生物样本为干拭子等固体形态时，可利用适量核酸释放试剂直接液化处理样本；当生物样本为液体状态时，可将释放剂与待测样本以体积比为1:1-5的比例混合均匀。

优选的，将待测干拭子等固体生物样本加入核酸释放试剂溶液中液化处理后加热至75℃-95℃，保温时间3-5分钟，即可将核酸释放出来。

优选的，将液态生物样本由第二独立腔体后端加入到核酸释放试剂中，并混合均匀，使核酸释放试剂-液态生物样本终体积比为1:1-5，之后加热至75℃-95℃，保温时间3-5分钟，即可将病原体核酸释放出来。

本发明所述的配套装置，其整体结构为注射器结构，所述的配套装置主要由第一腔体和第二腔体两个独立腔体组成，其中第一腔体1和第二腔体2连接端的直径相同，通过连接固定件3密封连接，第一腔体1的另一端设有推杆5(为整个配套装置的尾端)，第二腔体2的另一端为置有微孔过滤膜4的梯形，梯形出口为出液口6，出液口6套有密封盖7，用于防止液体从出液口流出，核酸释放试剂8置于第二腔体2内。活塞推进器手推处为后端，

连接固定件3为卡压式连接结构或螺纹连接结构，在加样时候，可将第一腔体和第二腔体分离，暴露第二腔体后端，用于将生物样本或者生物样本-核酸释放试剂混合液加入到第二腔体中，加样后可将两个腔体结构通过连接固定件3紧密连接成一个完整的提取用配套装置。

所述微孔过滤膜孔径尺寸为0.2μm-10μm，所述微孔过滤膜为聚酰胺纤维膜、聚醚砜膜或硝酸纤维素膜中的一种或多种膜复合，厚度2mm–5mm。

所述的核酸释放试剂，包括以下原料：TCEP·HCl(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)、EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、Chelex-100树脂、乙醇、鼠李糖脂、SDS(十二烷基磺酸钠)和水。

优选的TCEP·HCl浓度为1mM-50mM，EDTA浓度为1mM-50mM，Chelex 100树脂的质量浓度1％-10％，乙醇体积比为0.1％-1.0％，鼠李糖脂的质量浓度为0.001％-0.1％，SDS的质量浓度为0.001％-0.1％。

优选的，所述核酸释放试剂由上述原料中至少三种或以上组合。

优选的，所述核酸释放试剂pH值为3.0-5.0。

优选的，所述的核酸释放试剂可选择通过预埋入第二腔体中，体积为1.0mL-3.0mL。

优选的，在核酸提取过程中，可先将装载有核酸释放试剂的第二腔体放置在金属浴加热装置上，加热至预定温度75℃-95℃。

优选的，将拭子等固化生物样本或液化生物样本加入到第二腔体中，通过振荡均质样本与核酸释放试剂。

优选的，也可将生物样本与预热到设定温度75℃-95℃的核酸释放试剂先进行混匀，之后由第二独立腔体后端加入到配套装置第二独立腔体中。

优选的，所述配套装置，加入样本后的第二腔体与第一腔体通过衔接装置连接一体，将第二腔体部分放置在金属浴加热装置上继续加热至预定时间3-5分钟。

优选的，在加热完成后，打开密封盖7，利用第一腔体内的推杆推压产生的压力，将混合溶液经过微孔过滤膜，除去不溶物杂质，得到含有病原体核酸的裂解混合溶液，完成样本的核酸提取过程。

本发明方法所述的样本选自分泌液、体液、清洗液或排泄物；所述分泌液选自口腔黏膜、咽部、阴道、前列腺分泌液、唾液或者痰液，所述的体液选自脑脊液或组织液；所述清洗液选自口腔、伤口、脓疮的清洗液。

本发明的核酸快速提取方法，在结合本发明的核酸快速提取配套装置结构改进和核酸快速释放试剂的成分优化而实现的快速提取方案，可以有效裂解多种生物标本，在尽可能去除核酸扩增抑制物的同时，充分释放病原体核酸，提高核酸获得质量与核酸提取效率。因此，本发明从核酸提取方法和配套装置的结构等方面入手，开发，替一种更加简便、快速、高效的样本前处理与核酸提取方法，实现了更加快速的核酸检测目的。所述的后期核酸检测包括微生物检测、基因突变检测、单核苷酸多态性检测等。

有益效果：与传统的柱膜法或磁珠法等核酸提取相比，本申请无需复杂样本前处理过程和特殊仪器设备与操作，一步操作即可对生物样本中的核酸进行提取，并用于下游PCR或者恒温核酸扩增等。此外独特的提取配套装置可以保证样本前处理与核酸提取全过程封闭操作，避免了样本前处理过程中样本交叉污染和环境污染问题；同时加热过程可以有效用于病原体的灭活，降低了操作人员的生物安全风险；可以实现床旁，小型诊所和野外的实时核酸检测过程，广泛应用于病原体筛查，基因分型，临床与疾控等领域的现场检测。整个操作过简单，快速，容易掌握。

本发明中用于生物样本的所一步法核酸快速提取方法与配套装置所应用的生物样本广泛，可以用于各类干拭子，痰液，尿液，粪便，各类组织细胞，细菌，全血，血清，血浆，肺部灌洗液，脑脊液，分泌液等。同时，75℃-95℃样本加热过程，通过高温，有效灭活生物样本中潜在的病原体，降低后续操作生物安全。

Chelex-100和EDTA为基础的螯合材料，利用聚合物所含的配对亚氨基二乙酸离子作为螯合基团，可以有效螯合多价金属离子，结合具有正电基团的非核酸有机物，有效减少样本中对后续核酸扩增可能存在的抑制剂或杂质。

TCEP.HCl为核酸释放试剂提供弱碱性环境，促进细胞和病原体裂解，同时抑制多种核酸酶等组分。

鼠李糖脂和SDS分别作为天然生物表面活性剂和人工合成表面活性剂，可有效促进原核生物胞体的裂解，释放出核酸。

附图说明

图1是本发明优选实施例提供的一步法快速核酸提取配套装置结构示意图。

图2是利用本发明提取的甲型流感病毒咽拭子样本核酸后荧光定量PCR结果，与磁珠法提取相比无明显差异。

图3是本发明提取的A组轮状病毒(RVA)粪便样本核酸后荧光定量PCR结果，与柱膜法提取相比，粪便标本裂解法扩增Ct值小于柱膜法扩增Ct值，表明其核酸提取效果优于市售柱膜法提取试剂盒。

图4利用本发明一步法提取解脲脲原体(UU)病毒尿道拭子样本核酸后进行重组酶聚合酶恒温扩增结果，与市售直接裂解法核酸提取对比无明显差异。

具体实施方式

以下将结合发明实施例及附图，对本发明实施中的技术方案，进行清楚和完整的描述。显而易见地，下面所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例。本发明中的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不做出创造性劳动成果的前提下，还可以根据这些实施例获得其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1一种一步法核酸快速提取配套装置

参见图1，为本发明优选实施例提供的核酸快速提取配套装置结构示意图。如图1所示，本发明优选实施例提供的配套装置为可以行使注射器功能的装置，包括第一独立腔体1、第二独立腔体2两个主要部分构成，其中：第一腔体1和第二腔体2连接端的直径相同，第一腔体1和第二腔体2通过衔接固定件3连接，第一腔体1的另一端设有推杆5，推杆5与第一腔体1的连接方式与目前临床使用的普通注射器的推杆与注射筒的连接相同，第二腔体2的另一端为置有微孔过滤膜4的梯形结构，梯形出口为出液口6，出液口6套有密封盖7，当加样或出液时打开密封盖7，用于防止液体从出液口6流出，核酸释放试剂8置于第二腔体2内。

第一腔体1是圆柱形，与第二腔体2圆柱状直径相同。整个筒体材料可用塑料材料制成。

所述微孔过滤膜4的孔径尺寸为0.2μm-10μm，所述微孔过滤膜为聚酰胺纤维膜、聚醚砜膜、硝酸纤维素膜中的一种或多种膜复合，厚度2mm-5mm；密封套7为橡胶材料制成，可紧密封闭出液口6，防止液体外漏。

衔接固定件3采用插入或螺纹式结构，保证密封。

实施例2一种一步法核酸快速提取方法，用于生物样本一步法核酸快速提取(包括RNA和DNA)。

将装载有核酸释放试剂的第二腔体放置在金属浴加热装置上，加热至预定温度75℃-95℃。

打开衔接固定件3，将含有病原体的生物样本通过第二腔体后端放入第二腔体内，加入预热到设定温度的核酸释放试剂中，预设温度为75℃-95℃；

然后将第一腔体与第二腔体通过衔接固定件3密封固定，将生物样本与核酸释放试剂充分混匀，然后将第二腔体部分置于金属浴加热，加热3-5分钟，在加热条件下得到裂解混合溶液。

打开密封盖7，最后通过推杆5的推压产生的压力，将混合后的裂解混合溶液经过微孔过滤膜，除去不溶物杂质，获得含有病原体核酸的核酸释放液。

所述的生物样本包括固体和液体，主要有各类干拭子，痰液，尿液，粪便，各类组织细胞，细菌，全血，血清，血浆，肺部灌洗液，脑脊液，分泌液等。

所述的核酸扩增反应包括聚合酶链式反应扩增和重组酶聚合酶恒温扩增等恒温扩增反应。

经过本发明提取配套装置提取获得的核酸(RNA或DNA)释放液，可用于后续微生物检测、基因突变检测、单核苷酸多态性检测等涉及核酸的下游实验。

本发明核酸提取的基本原理是，提取配套装置中的核酸释放试剂在加热条件下，可对生物样本进行充分裂解并释放核酸，之后将含有核酸释放试剂中的杂质，通过微孔过滤膜过滤后即可快速去除，剩余含有核酸的释放液即可用于后期核酸扩增检测。本发明只需“两加一推”，即可完成所有操作。其中“两加一推”为，“一加”：将样本加入到释放液中；“二加”：将样本加热处理；“一推”:利用组装的注射器装置，通过推动装置推杆，对样本释放液产生压力，将样本释放液中的杂质经过微孔过滤膜过滤除掉，从而完成了从生物样本中快速提取核酸成分；

本发明提供的核酸提取方法使用以上的核酸提取配套装置，所述的一步法核酸快速提取的核酸释放试剂包括1mM-50mM的TCEP·HCl，1mM-50mM的EDTA浓度，1％-10％的Chelex 100树脂，0.1％-1.0％的乙醇，0.001％-0.1％的鼠李糖脂，0.001％-0.1％的SDS中的至少三种。

实施例3：检测来自鼻咽拭子样品中甲型流感病毒的PCR结果，步骤如下：

一步法核酸释放：一步法核酸快速提取的核酸释放试剂包括以下原料：TCEP·HCl，EDT，Chelex 100树脂，乙醇，鼠李糖脂，SDS和水。

优选的，核酸释放液为0.1％的乙醇，0.01％的鼠李糖脂，50mM的TCEP·HCl，10mM的EDTA浓度，1％的Chelex 100树脂。

样本处理与核酸释放：将带有甲型流感病毒的鼻咽拭子样品浸入装置有1.2mL核酸释放液的注射器腔体中，将鼻咽拭子振荡后95℃加热5分钟，利用提取配套装置过滤后得到流感病毒RNA释放液。

磁珠法核酸提取：将鼻咽拭子样本利用生理盐水振荡10s时间进行水化，取300uL样本保存液，利用磁珠法核酸提取试剂提取，并将纯化的核酸溶解到50uL的洗脱液中(之江)。

核酸扩增：应用PCR扩增试剂(II One Step RT-PCR Kit)分别扩增提取的RNA，其中磁珠法洗脱液取最终样本5uL，或一步法核酸释放液取5μL加入到PCR反应体系，具体如表1。

表1 PCR扩增体系

试剂名称	用量
		2×PCR反应缓冲液	12.5μL
酶混合液	1.0μL
		上游引物(10μM)	1.0μL
下游引物(10μM)	1.0μL
		RNase-Free ddH2O	4.50μL
模板RNA	5.0μL
		总体积	25.0μL

PCR扩增反应条件如下表2。

表2

结果检测：利用荧光定量PCR仪对扩增产物进行实时监测，结果如图2和下表。图2和下表中Ct值结果显示，阳性咽拭子样本经扩增后检测结果均为阳性，且磁珠法与一步法核酸提取效率没有明显差别，表明磁珠法获得的RNA和核酸释放液中的RNA可用于病原体核酸诊断。

实施例4：粪便中A型轮状病毒一步法核酸释放试剂提取核酸后的PCR扩增应用实例

一步法核酸释放：一步法核酸快速提取的核酸释放试剂包括以下原料：TCEP·HCl，EDT，Chelex 100树脂，乙醇，鼠李糖脂，十二烷基苯磺酸钠(SDS)和水。

优选的，核酸释放液为0.01％的乙醇，0.01％的鼠李糖脂，25mM的TCEP·HCl，10mM的EDTA浓度，2％的Chelex 100树脂和0.001％的SDS。

粪便样本处理：优选的，将适量的粪便利用生理盐水充分振荡混匀，离心获得上清用于下游核酸提取。

优选的，将100μL上清与核酸释放液以1:1体积比例混合，将混合液振荡后，加入到注射器腔体中，核酸释放液温度为85℃，将鼻咽拭子振荡后85℃加热5分钟，利用提取配套装置过滤后得到A型轮状病毒RNA释放液。

磁珠法核酸提取：取300uL上清样本，利用磁珠法核酸提取试剂提取，并将纯化的核酸溶解到50uL的洗脱液中(上海之江生物磁珠法提取试剂盒)；

应用PCR扩增试剂(II One Step RT-PCR Kit)分别扩增提取的RNA，其中磁珠法洗脱液取最终样本5uL，或一步法核酸释放液取5μL加入到PCR反应体系，具体如表3。

表3

试剂名称	用量
		2×PCR反应缓冲液	12.5μL
酶混合液	1.25μL
		上游引物(10μM)	1.0μL
下游引物(10μM)	1.0μL
		RNase-Free ddH2O	4.25μL
模板RNA	5.0μL
		总体积	25.0μL

PCR扩增反应条件如下表4。

表4

结果检测：利用荧光定量PCR仪对扩增产物进行实时监测，结果如图3。图3结果显示，粪便液化后的上清样本，经过一步法核酸提取和PCR扩增检测后结果均为阳性，且一步法核酸提取后PCR扩增的Ct值要小于磁珠法提取后的PCR扩增Ct值，表明本发明一步法在对粪便样本中的A型轮状病毒RNA核酸提取中非常有效，可用于该类样本类型病原体的核酸诊断。

实施例5：解脲脲原体(UU)一步法核酸提取释放恒温扩增应用实例

一步法核酸释放：一步法核酸快速提取的核酸释放试剂包括以下原料：TCEP·HCl，EDT，Chelex 100树脂，乙醇，鼠李糖脂，十二烷基苯磺酸钠(SDS)和水。

优选的，核酸释放液为0.01％的乙醇，0.01％的鼠李糖脂，25mM的TCEP·HCl，10mM的EDTA浓度，2％的Chelex 100树脂。

尿道拭子样本处理：优选的，将尿道拭子利用2.5mL的生理盐水充分振荡混匀液化。

优选的，将液化样本与一步法核酸释放液100uL：100μL体积比例混合，并加入到注射器腔体中，核酸释放液温度为75℃，将鼻咽拭子振荡后75℃加热5分钟，利用提取配套装置过滤后得到解脲脲原体核酸释放液。

取100uL上清样本，利用直接核酸裂解试剂(圣湘生物)，根据产品说明书进行操作处理样本，获得核酸释放液。

恒温核酸扩增体系，应用RAA扩增试剂(江苏奇天生物科技有限公司)分别扩增提取的DNA，其中一步法核酸释放液取5μL，或核酸裂解试剂处理样本获得最终样本5.0uL，加入到恒温扩增反应体系，具体扩增体系为：基础缓冲液25.0μL，10.0μM引物F为1.2μL，10μM引物1.2μL，10μM探针为0.6μL，水14.5μL，乙酸镁2.5μL，DNA模板5.0μL；恒温扩增温度为39℃，时间为30分钟。

实验结果：利用恒温荧光核酸扩增仪对扩增产物进行实时检测，结果如图4。图4结果显示，经过一步法核酸提取和圣湘公司直接裂解法提取的核酸检测后结果均为阳性，且一步法核酸提取后恒温扩增起峰时间与直接裂解法提取后的恒温扩增起峰时间无明显差异，表明本例可以用于尿道拭子中解脲脲原体(UU)DNA提取以及后续重组酶聚合酶恒温扩增检测。

Claims (10)

1.一种用于生物样本一步法核酸快速提取方法，其特征在于，将生物样本加入含有核酸释放试剂的配套装置中的第二腔体中，然后将第一腔体和第二腔体密封连接，将生物样本与核酸释放试剂充分混匀后，在加热条件下得到裂解反应液，最后由配套装置中的多孔滤膜过滤，除去不溶物杂质，获得含有RNA和DNA的病原体核酸的核酸释放液。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，或者先将生物样本与核酸释放试剂充分混匀后再加入到配套装置中的第二腔体中，然后将第一腔体和第二腔体密封连接，在加热条件下得到裂解反应液，最后由配套装置中的多孔滤膜过滤，除去不溶物杂质，获得含有病原体核酸的核酸释放液。

3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述加热条件是75℃-95℃，保温时间3-5分钟。

4.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，在加热完成后，打开密封盖(7)，利用第一腔体(1)内的推杆(5)推压产生的压力，将混合溶液经过微孔过滤膜(4)，除去不溶物杂质，得到含有病原体核酸的裂解混合溶液，完成样本的核酸提取过程。

5.一种一步法核酸快速提取配套装置，其特征在于，所述的配套装置由第一腔体(1)和第二腔体(2)两个独立腔体组成，其中第一腔体(1)和第二腔体(2)连接端的直径相同，并通过连接固定件(3)密封连接，第一腔体(1)的另一端设有推杆(5)，第二腔体(2)的另一端为置有微孔过滤膜(4)的梯形的加样出液口(6)，加样出液口(6)套有密封盖(7)。

6.根据权利要求5所述的配套装置，其特征在于，连接固定件(3)为卡压式连接结构或螺纹连接结构。

7.根据权利要求5所述的配套装置，其特征在于，所述微孔过滤膜(4)的孔径为0.2μm-10μm，所述微孔过滤膜的材料选为聚酰胺纤维膜、聚醚砜膜或硝酸纤维素膜中的一种或多种膜复合，厚度2mm–5mm。

8.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述的核酸释放试剂由三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、乙二胺四乙酸二钠、Chelex-100树脂、乙醇、鼠李糖脂、十二烷基磺酸钠和水中至少三种或以上组合；所述核酸释放试剂pH值为3.0-5.0。

9.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述三(2-羰基乙基)磷盐酸盐浓度为1mM-50mM，乙二胺四乙酸二钠浓度为1mM-50mM，Chelex 100树脂的质量浓度1％-10％，乙醇体积比为0.1％-1.0％，鼠李糖脂的质量浓度为0.001％-0.1％，十二烷基磺酸钠的质量浓度为0.001％-0.1％。

10.根据权利要求8所述的提取方法，其特征在于，所述的核酸释放试剂选择通过预埋入第二腔体中，体积为1.0mL-3.0mL。