AT501380B1

AT501380B1 - Verfahren zur reinigung der dna/rna von proteinen und zellulären reststoffen im zellenlysat

Info

Publication number: AT501380B1
Application number: AT1952005A
Authority: AT
Inventors: Vitali Dipl Ing Dshemelinski
Original assignee: Vitali Dipl Ing Dshemelinski
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2005-02-07
Publication date: 2007-11-15
Also published as: AT501380A1; EP1904633A1; WO2006081597A1

Description

2 AT 501 380 B1 1. Beschreibungseinleitung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat. 2. Stand der Technik

Verfahren I: Anwendung von organischen Lösungsmitteln

Es werden zwei Lösungsmittel in der bestimmten Reihenfolge angewendet: Phenol und Chloroform.

Dieses Verfahren hat folgende Nachteile: (1) Phenol und Chloroform spalten DNA/RNA; (2) einen zeitaufwendigen Vorgang in sechs Schritten: (i) drei Schritte für Extrahierungen mit Phenol/Chloroform; und (ii) drei Schritte für Trennungen der Lösungsphasen; (3) eine nicht vollkommene Reinigung und Verluste bei der Trennung der Lösungsphasen; (4) einen notwendigen Schritt für Ethanolfällung der DNA/RNA, wegen der Reste von Phenol und/oder Chloroform in der Lösung; (5) Phenol und Chloroform sind gesundheitsschädliche krebserregende Chemikalien.

Verfahren II: Anwendung von DNA/RNA bindenden Stoffen

Es werden verschiedene Oberflächen mit den positiven Ladungen, wie Silikatgel, Tonsand, Kieselgel, Anionensäule u.s.w. angewendet.

Dieses Verfahren hat folgende Nachteile: (1) es wird unreine und mit den Proteinen verbundene DNA/RNA aus dem Zellenlysat an die Oberfläche gefällt oder positioniert; Das verursacht Zerreißung, Spaltung und Kreuz-Verbindungen an dem DNA/RNA-Strang; (2) ein komplexer Waschvorgang in drei Schritten: (i) Zwei Schritte des Waschvorgangs für Proteine und Reststoffen; und (ii) Ein Schritt des Waschvorgangs für der DNA/RNA; (3) eine solche bindende Konstruktion verursacht Mehrkosten.

Verfahren III: Fällung

Es werden zwei verschiedene Methoden angewandt: (i) DNA/RNA wird mit Salzen gefällt, Proteine und Reststoffe bleiben in der Lösung; oder (ii) Proteine, Reststoffe werden mit Salzen gefällt und DNA/RNA bleibt in der Lösung.

Dieses Verfahren hat folgende Nachteile: (1) Im ersten Fall: (i) die DNA/RNA ist unrein, weil Proteine nicht vollkommen abgetrennt sind; und (ii) die DNA/RNA ist unrein, weil Fällungsbedingungen der DNA/RNA, der Proteine und Reststoffe sich überschneiden; (2) im zweiten Fall: (i) die DNA/RNA ist unrein, weil Proteine sind nicht vollkommen abgetrennt; und (ii) die Ausbeute klein ist, weil Fällungsbedingungen der Proteine, Reststoffe und der DNA/RNA sich überschneiden. 3 AT 501 380 B1 3. Aufgabe der Erfindung.

Aufgabe 1: Bindung der DNA/RNA in der Lösung bei niedrigem pH-Wert.

Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure, mit anerkannten Namen DNA und RNA, sind lange Ketten und bestehen aus Nucleosiden, die über ihre Zucker zwischen den 5'- und 3'-Hydroxylgruppen durch eine Phosphatdiesterbindung verknüpft sind. DNA/RNA sind Polyanio-nen durch negativ geladene Phosphorgruppen. RNA hat auch polare Hydroxylgruppen. Löslichkeit der DNA/RNA bei niedrigem pH-Wert steigt.

Aufgabe 2: Entfaltung bis Primärstruktur und Ladungsänderung der Proteine durch eine Anwendung der Zusammensetzung aus: (1) dem ionischen Tensid (Natriumlaurylsulfat); (2) dem nichtionischen Tensid (Polyethylenglykol Triton X-100, n=~10, mit dem Molekulargewicht von ca. 625 Gramm/Mol); (3) dem Puffer mit niedrigem pH-Wert (3,0<pH-Wert<5,0); und (4) der Disulfidbrücken spaltender Substanz (2-Merkaptoethanol).

Proteine sind Polypeptidketten mit negativ, positiv geladenen und hydrophoben Gruppen, durchschnittlich ca. 1000 Aminosäuren lang. Es sind vier Stufen der Zusammenfaltung des Proteins bekannt: Primärstruktur, Sekundärstruktur, Tertiärstruktur und Quartärstruktur.

Aufgabe 3: Trennung von der DNA/RNA und Solubilisierung von Proteinen in der Lösung durch: (1) Protonen, bei niedrigem pH-Wert (3,0<pH-Wert<5,0); (2) Negativ geladene und hydrophobe Gruppen mit der Zusammensetzung aus dem ionischen Tensid (Natriumlaurylsulfat) und nichtionischen Tensid (Polyethylenglykol Triton X-100, n=~10, mit dem Molekulargewicht von ca. 625 Gramm/Mol).

Proteine der Histone sind allgemein, auch besonders an den Bindungsstellen, positiv geladen und bilden mit der DNA sogenannte Nukleosomen mit dem Anteil von ca. 100 % der Proteine, dauerhaft verbundenen mit der DNA. Verhältnisse zwischen positiv und negativ geladenen Gruppen bei diesen Proteinen sind: H1: 5,4; H2A: 1,4; H2B: 1,7; H3: 1,8; H4: 2,5. Proteine der Histone haben von 200 bis 280 Aminosäuren und sind bei niedrigem pH-Wert, ab einer bestimmter Grenze, positiv geladen. DNA/RNA ist weniger negativ geladen, bei niedrigem pH-Wert.

Aufgabe 4: Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen ohne der Beteiligung der DNA/RNA durch die Aufgabe 3 und eine Anwendung der Zusammensetzung aus: (1) den Polyanionen (Poly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit dem Molekulargewicht 10,7x-1CPx1CP Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol); und (2) den Polymeren mit negativ geladenen und hydrophoben Gruppen (Poly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit dem Molekulargewicht 10,7x1 (fxlO3 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol).

Proteine haben bei niedrigem pH-Wert nur positive und hydrophobe Gruppen offen und bilden die Flocken durch eine Zusammenlagerung mit den zugefügten Polymeren.

Aufgabe 5: Intensivierung des Prozesses und Bildung der großen schweren Flocken durch eine Anwendung der Mikropartikel mit der dreidimensionalen Polymer-Matrix aus negativ geladenen und hydrophoben Gruppen (Poly(acrylamid-co-N'N'-methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat) mit der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol). Eine Bildung durch Verbindungen zwischen den stark negativ geladenen Flocken und den Polykationen (Poly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylam- 4 AT 501 380 B1 monium-ethylacrylat)-chlorid mit dem Molekulargewicht 6,00x103x103 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol) zu größeren, schwereren, mechanisch abtrennbaren Konglomeraten. 4. Lösung der gestellten Aufgabe

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass die Reinigung mittels gesteuerter selektiver Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen mit der Anwendung: (1) der Polymere mit den negativ, positiv geladenen und hydrophoben Gruppen ((Po-ly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit dem Molekulargewicht 10,7x103x103 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol), (Poly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid mit dem Molekulargewicht 6,00x103x103 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol) und (Poly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit dem Molekulargewicht 10,7x103x103 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol)); (2) der Mikropartikel mit der dreidimensionalen Polymer-Matrix aus negativ geladenen und hydrophoben Gruppen (Poly(acrylamid-co-N'N'-methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat) mit der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol); (3) der Zusammensetzung aus dem ionischen Tensid (Natriumlaurylsulfat), dem nichtionischem Tensid (Polyethylenglykol Triton X-100, n=~10, mit dem Molekulargewicht ca. 625 Gramm/Mol), der Disulfidbrücken spaltender Substanz (2-Merkaptoethanol), dem Puffer mit niedrigem pH-Wert (3,0<pH-Wert<5,0); durchgeführt wird und die nachfolgenden Schritte umfasst: a. eine Zugabe der Zusammensetzung A zum Zellenlysat, wobei die Zusammensetzung A (a) einen Puffer mit niedrigem pH, (b) ein ionisches Tensid, (c) ein nichtionisches Tensid und (d) eine Disulfidbrücken spaltende Substanz enthält; b. eine Zugabe der Zusammensetzung B zu der Lösung, wobei die Zusammensetzung B (a) Polyanionen, (b) Polymere mit negativ geladenen und hydrophoben Gruppen und (c) Mikropartikel mit der dreidimensionalen Polymer-Matrix aus negativ geladenen und hydrophoben Gruppen enthält; c. eine Zugabe Polykationen zur Lösung; d. eine Zentrifugierung. 5. Effekte der Erfindung und Unteransprüche Die Effekte der Erfindung sind: 1. eine reine DNA/RNA, die durch eine bessere Trennung und Entfernung von Proteinen, zellulären Reststoffen in Folge einer bestimmten Reihenfolge von den Schritten und ein besonderes Flockungsprozess entsteht; 2. eine intakte hochmolekulare DNA/RNA, durch fehlende Operationen mit der DNA/RNA; 3. eine große Ausbeute der DNA/RNA, durch ausreichende, nicht überschneidende Trennungsbedingungen für Proteine und DNA/RNA, betreffend Löslichkeit bei der Zentrifugierung; 4. eine minimale Anzahl von Schritten, kurze Behandlungszeiten; 5. das Verfahren ist geeignet für alle Zellenlysate, aus allen möglichen Quellen und nach einer, speziellen für jede Probe/Quelle, Vorstufe: Menschliche und tierische Gewebe; Zellkulturen; Blut; Bakterien; Viren; Hefen; Bakteriafagen; Pilzen; Pflanzen; Nahrungsmittel; 6. das Verfahren ist anwendbar in verschiedenen Bereichen: Transgenommics; Genotypisierung; der genetische Fingerabdruck im Täter- und Vaterschaftsnachweis; Diagnose von erblich bedingter Krankheiten; Infektions-Diagnose; Züchtungsanalyse und Qualitätskontrolle in der Nahrungsmittelindustrie; 7. das Verfahren ist geeignet für alle Downstream Applikationen: SNP-Analyse;

Claims

5 AT 501 380 B1 Southem-Blots; PCR; Real-Time PCR; DNA-Arrays und Seqenzierung; 8. das Verfahren hat durch handlichen und umweltfreundlichen Ablauf der Verzicht auf gesundheitsschädliche oder krebserregende Chemikalien; 9. das Verfahren ist kostengünstig durch eine Verwendung der weitverbreiteten preisgünstigen Reagenzien. Reagenzien: 1. Natriumlaurylsulfat, CH3(CH2)11 S04Na, Molekulargewicht 288,4 Gramm/Mol. 2. 2-Merkaptoethanol, HSCH2CH20H, Molekulargewicht 78,1 Gramm/Mol.
3. Polyethylenglykol Triton X-100, 4-(C8H17)C6H4(OCH2CH2)nOH, n=~10, Molekulargewicht ca. 625 Gramm/Mol.
4. Poly(acrylamid-co-Natrium-acrylat), Molekulargewicht 10,7x101 2x102 Gramm/Mol, Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol.
5. Poly(acrylamid-co-Natrium-acrylat), Molekulargewicht 10,7x102x102 Gramm/Mol, Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol.
6. Poly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid, Molekulargewicht 6,00x 102x102 Gramm/Mol, Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol.
7. Polyiacrylamid-co-N'N'-methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat), Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet, dass es die nachfolgenden Schritte umfasst: a. eine Zugabe der Zusammensetzung A zum Zellenlysat, wobei die Zusammensetzung A enthält (a) einen Puffer mit niedrigem pH-Wert, (b) ein ionisches Tensid, (c) ein nichtionisches Tensid und (d) eine Disulfidbrücken spaltende Substanz. b. eine Zugabe der Zusammensetzung B zu der Lösung, wobei die Zusammensetzung B enthält (a) Polyanionen, (b) Polymere mit negativ geladenen und hydrophoben Gruppen und (c) Mikropartikel mit der dreidimensionalen Polymer-Matrix aus negativ geladenen und hydrophoben Gruppen, was zusammen führt zu: (1) Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen durch eine Zusammenlagerung mit Polyanionen, Polymeren und Mikropartikel; (2) selektiver Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen, getrennt von der DNA/RNA. c. eine Zugabe von Polykationen zur Lösung, was durch Verbindungen zwischen den stark negativ geladenen Flocken und Polykationen, zu der Bildung von größeren, schwereren, mechanisch abtrennbaren Konglomeraten führt; d. eine Zentrifugierung, was zu der Abtrennung der Konglomerate führt. 1 Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen in Schritt b. durch eine Anwendung (i) der Polyanionen Poly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit dem Molekulargewicht 10,7x102x102 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 2 60 %/Mol und (ii) Poly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit dem Molekulargewicht 10,7x 102x102 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol, als Polymer mit negativ geladenen und hydrophoben Gruppen, durchgeführt wird. 6 AT 501 380 B1 3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen in Schritt b. durch eine Anwendung von Polyfacrylamid-co-N'N'-methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat) mit der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol, als Mikropartikel mit der dreidimensionalen Polymer-Matrix aus negativ geladenen und hydrophoben Gruppen, durchgeführt wird. 4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung A aus: (i) dem ionischen Tensid Natriumlaurylsulfat; (ii) dem nichtionischen Tensid Polyethylenglykol Triton X-100, n=~10, mit dem Molekulargewicht von ca. 625 Gramm/Mol; (iii) der Disulfidbrücken spaltenden Substanz 2-Merkaptoethanol; und (iv) dem Puffer mit niedrigem pH-Wert von 3,0<pH-Wert<5,0 besteht. 5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bildung und Abtrennung der Konglomerate in den Schritten c. und d. durch: (i) eine Anteilnahme der Mikropartikel; (ii) eine Anwendung der Polykationen Polyiacrilamid-co-N.N.N.-trimetylammonium-ethyl-acrylat)-chlorid mit dem Molekulargewicht 6,00x103x103 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol; und (iii) eine abschließende Zentrifugierung geschieht. Keine Zeichnung