AT501380A1 - Verfahren zur reinigung der dna/rna von proteinen und zellulären reststoffen im zellenlysat - Google Patents

Verfahren zur reinigung der dna/rna von proteinen und zellulären reststoffen im zellenlysat Download PDF

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Description

Beschreibung 1. Beschreibungseinleitung.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat 2. Stand der Technik.
Es sind drei Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären
Reststoffen im Zellenlysat am Weltmarkt existent
Verfahren I: Anwendung von organischen Lösungsmitteln.
Es werden zwei Lösungsmittel in bestimmter Reihenfolge angewendet: Phenol, Chloroform. Nachteile: 1. Phenol/Chloroform spaltet DNA/RNA; 2. Zeitaufwendige Vorgang mit drei Stufen Phenol/Chloroform Extragierung und Trennung der Lösungsphasen; 3. Nicht vollkommene Reinigung und Verluste bei Trennung der Lösungsphasen; 4. Notwendige Stufe der Ethanolfällung der DNA/RNA wegen Resten von Phenol und/oder Chloroform in der Lösung; 5. Phenol und Chloroform sind gesundheitsschädliche krebserregende Chemikalien. Verfahren II: Anwendung von DNA bindenden Stoffen.
Es werden verschiedene Oberflächen mit positiven Ladungen angewendet: 1. Silikatgel; 2. Tonsand, Kieselgel; 3. Anionensäule. Nachteile: 1. Es wird unreine, mit Proteinen verbundene, DNA/RNA aus dem Zellenlysat an Oberfläche gefällt oder positioniert und das verursacht Zerreißung, Spaltung und Kreuz-Verbindungen an dem DNA/RNA-Strang; 2. Komplexe Waschvorgang in drei Schritten: zwei Stufen Proteinen/Reststoffen- und eine Stufe DNA/RNA-Auswaschen; 3. Anwendung von DNA/RNA bindenden Konstruktionen verursacht Mehrkosten.
Verfahren III: Fällung.
Es wird DNA/RNA mit Salzen gefällt und Proteinen/Reststoffen bleiben im Lösung oder Proteinen/Reststoffen werden mit Salzen gefällt und DNA/RNA bleibt im Lösung. Nachteile der DNA/RNA Fällung: DNA ist unrein, weil Proteinen sind nicht vollkommen abgetrennt von DNA und Fällungsbedingungen von DNA/RNA und Proteinen/Reststoffen sich überschneiden. Nachteile der Proteinen/Reststoffen Fällung: DNA ist unrein, weil Proteinen sind nicht vollkommen abgetrennt von DNA und Ausbeute ist klein weil Fällungsbedienungen von Proteinen/Reststoffen und DNA/RNA sich überschneiden. 3. Aufgabe der Erfindung.
Aufgabe 1: Bindung DNA/RNA im Lösung durch niedrige pH (3,o<pH<5,o).
Desoxyribonukleinsäure und Ribonukleinsäure mit anerkannten Namen DNA und RNA sind lange Ketten und bestehen aus Nucleosiden, die über ihre Zucker zwischen den 5und 3'-Hydroxylgruppen durch eine Phosphodiesterverbindung verknüpft sind. DNA/RNA sind
Polyanionen durch negativ geladene Phosphorgruppen. RNA hat auch polare Hydroxylgruppen.
Aufgabe 2: Entfaltung Proteinen bis Primärstruktur durch Anwendung der Zusammensetzung aus der ionischen (Natriumlaurylsulfat) und nichtionischen (Triton x-100) Tensiden im Puffer mit niedriger pH (3,o<pH<5,o) und SS Brücken spaltender Substanz (2-Merkaptoethanol).
Proteinen sind Polypeptidketten mit negativ, positiv geladenen und gydrophoben Gruppen, durchschnittlich ca. 1000 Aminosäuren lang. Es wird vier Stufen der Zusammenfaltung von Proteinen bekannt: Primärstruktur, Sekundärstruktur, Tertiärstruktur und Quartärstruktur. Aufgabe 3: Trennung von DNA und Solubilisierung von Proteinen im Lösung durch: Protonen, bei niedriger pH (3,o<pH<5,o), negativ geladenen und gydrophoben Gruppen der Zusammensetzung aus der ionischen (Natriumlaurylsulfat) und nichtionischen (Triton x-100) Tensiden. Proteinen-Hystonen sind allgemein, auch besonders an Bindungsstellen, positiv geladen und bilden mit der DNA sog. Nukleosomen mit der Anteil von ca. 100% von Proteinen dauerhaft verbundenen mit der DNA Verhältnis positiv geladenen Gruppen zu negativ geladenen Gruppen bei diesem Proteinen sind: Hi: 5,4, H2A: 1,4, H2B: 1,7, H3:1,8, H4:2,5. Hystonen haben von 200 bis 280 Aminosäuren und sind bei niedriger pH, ab bestimmter Grenze, positiv geladen. DNA/RNA ist, bei niedriger pH, weniger negativ geladen.
Aufgabe 4: Selektive Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen ohne Involwierung der DNA/RNA mit Aufgabe 3 und Anwendung der Zusammensetzung aus der Polymeren mit negativ geladenen Gruppen (Polly(acrylamid-co-Natrium-acryiat)mit LD: 50-60 mol-%) und Polymeren mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Polly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: 2-4 mol-%) durch die Übernahme von Proteinen und zellulären Reststoffen großteils von, fungirenden als Vermittlern, ionischen (Natriumlaurylsulfat) und nichtionischen (Triton x-100) Tensiden.
Hystonen, als lange Polypeptidketten, haben bei niedriger pH nur positive und gydrophobe Gruppen offen und bilden mit zugefügten Polymeren die Flocken.
Aufgabe 5: Intensivierung des Prozesses und Bildung großen schweren Flocken durch die Anwendung von Mikropartikel aus dem dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen, gydrophoben Gruppen (Polly(acrylamid-co-N’N’-methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%) im zweiten und Polykationen (Polly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid mit LD: 50-60 mol-%) im drittem letzten Schritt. Polykationen binden jetzt nur sehr stark negativ geladene Flocken zu noch größeren Konglomeraten. 4. Lösung der gestellten Aufgabe.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass Reinigung wird mittels gesteuerter selektiven Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen durch die Anwendung der Zusammensetzung aus der Polymeren mit negativ, positiv geladenen und gydrophoben Gruppen ((Polly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit ID: 50-60 mol-%), (Poüy(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid mit LD: 50-60 mol-%) und (Polly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit ID: 2-4 mol-%)), Mikropartikel aus dem dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Polly(acrylamid-co-N’N’-methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%), der Zusammensetzung aus dem ionischen (Natriundauiylsulfat) und nichtionischem (Triton X-100) Tensiden und SS Brücken spaltender Substanz (2-Merkaptoethanol) im Puffer mit niedriger pH (3,o<pH<5,o) in der Zugabereihenfolge: a. Puffer mit niedriger pH (3,o<pH<5,o), ionischer ( Natriumlauiylsulfat) und nichtionischer (Triton x-100) Tensiden, SS Brücken spaltende Substanz (2-Merkaptoethanol); b. Die Zusammensetzung aus der Polyanionen, Polymeren mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen ((PoUy(acjylamid-co-Natrium-aciylat) mit LD: 50-60 mol-%) und (PoUy(aciylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: 2-4 mol-%)), Mikropartikel aus dem dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Poüyfaciylamid-co-N’N’-methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%); c. Polykationen (Polly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylaciylat)-chlorid mit LD: 50-60 mol-%) mit der anschließender Zentrifugierung, durchgefiihrt. 5. Effekte der Erfindung und Unteransprüche. 1. Reine DNA/RNA durch bessere Trennung von Proteinen und bessere Entfernung von zellulären Reststoffen gelöst durch bestimmte Reihenfolge von Schritten, besonderes Flockungsprozess. 2. Intakte, hochmolekulare DNA/RNA durch fehlende Operationen mit der. 3. Große Ausbeute der DNA/RNA durch ausreichende Trennungsbedienungen bei Zentrifugierung. 4. Minimale Anzahl von Schritten, kurze Behandlungszeiten. 5. Verfahren ist geeignet für Zellenlysate aus allen möglichen Quellen nach der speziellen für jede Probe/Quelle Vorstufe: menschliche und tierische Gewebe, Zellkulturen und Blut, Bakterien, Viren, Hefen und Bakteriafagen, Pilzen, Pflanzen, Nahrungsmittel sowie von Plasmid-, Cosmid- und BAC-DNA in verschiedenen Bereichen: Transgenommics, Genotypisierung, der genetische Fingerabdruck im Täter- und Vaterschaftsnachweis, in Diagnosen erblich bedingter Krankheiten, Infektions-Diagnose, die Züchtungsanalyse und Qualitätskontrolle in der Nahrungsmittelindustrie für alle Downstream Applikationen: SNP-Analyse, Southem-Blots, PCR, Real-Time PCR, DNA-Arrays und Seqenzierung. 6. Handliche und umweltfreundliche Ablauf durch verzieht auf gesudheitschädliche oder krebserregende Chemikalien. 7. Verfahren ist kostengünstig durch Verwendung von breitverwendbaren preisgünstigen Stoffen. 6. Patentansprüche. 1. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet, dass Reinigung wird mittels gesteuerter selektiven Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen durch die Anwendung der Zusammensetzung aus der Polymeren mit negativ, positiv geladenen und gydrophoben Gruppen ((Polly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: 50-60 mol-%), (Polly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid mit LD: 50-60 mol-%) und (Polly(acrylamid-co-Natrium-aciylat) mit LD: 2-4 mol-%)), Mikropartikel aus dem dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (PollyCacrylamid-co-NTST-methylenbisaciylamid-co-Natrium-aciylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%), der Zusammensetzung aus der ionischen (Natriumlaurylsulfat) und nichtionischen (Triton X-100) Tensiden und SS Brücken spaltender Substanz (2-Merkaptoethanol) im Puffer mit niedriger pH (3,o<pH<5,o) in der Zugabereihenfolge: a. Puffer mit niedriger pH (3,o<pH<5,o), ionischen ( Natriumlaurylsulfat) und nichtionischen (Triton X-100) Tensiden, SS Brücken spaltende Substanz (2-Merkaptoethanol); b. Die Zusammensetzung aus der Polyanionen (PoUy(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: 50-60 mol-%), Polymeren mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Poüy(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: 2-4 mol-%), Mikropartikel aus dem dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Pollyfacrylamid-co-N’N’-methylenbisacrylamid-co-Natrium-aciylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%); c. Polykationen (Polly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethyiacrylat)-chlorid mit LD: 50-60 mol-%) mit der anschließender Zentrifugierung, durchgeführt. 2. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet, dass Proteinen und zellulären Reststoffen werden geflockt. 3. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet, dass Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen wird durch Anwendung der Zusammensetzung aus der Polymeren mit negativ, positiv geladenen und gydrophoben Gruppen ((Polly(aciylamid-co-Natrium-aaylat) mit LD: 50-60 mol-%), (Polly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid mit LD: 50-60 mol-%) und (Polly(aciylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: 2-4 mol-%)) durchgeführt 4. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet dass Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen wird durch Anwendung von Mikropartikel aus dem dreidimensionalem Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (PoHyfacrylamid-co-NTT-methylenbisaciylamid-co-Natrimn-acrylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%) durchgeführt.
5. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zelluläre Reststoffen im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet, dass durch Anwendung der Zusammensetzung aus dem ionischen (Natriumlauiylsulfat) und nichtionischen (Triton X-ioo) Tensiden, SS Brücken spaltender Substanz (2-Merkaptoethanol) im ersten und der Zusammensetzung aus der Polyanionen (Polly(acrylamid-co-Natrium-acrylat) mit LD: 50-60 mol-%), Pollymeren mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Polly(aciylamid-co-Natrimn-acrylat) mit LD: 2-4 mol-%), Mikropartikel aus dem dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (PoUyfacrylamid-co-N’N’-methylenbisacrylarnid-co-Natrium-acrylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%) im zweiten Schritt, im Puffer mit niedriger pH (3>o<pH<5,o), nur Proteinen und zellulären Reststoffen werden selektiv geflockt, DNA/RNA aber nicht. 6. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zelluläre Reststoffe n im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Anwendung von Mikropartikel aus dem dreidimensionalem Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Polly(acrylamid-co-NTSP-methylenbisaciylamid-co-Natrium-aciylat) mit LD: von 2 bis 4 mol-%) im zweiten und Polykationen ((PoUy(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid) mit LD: 50-60 mol-%)) im dritten Schritt werden Flocken genug groß und schwer für die sichere Trennung, von der bleibenden im Losung DNA/RNA, bei der abschließender Zentrifugierung.

Claims (5)

  1. * · · ······ · • · · · · · · ·· ·· · »· • · · · • · · ·· · • · ···· Patentansprüche 1. Verfahren zur Reinigung der DNA/RNA von Proteinen und zellulären Reststoffen im Zellenlysat, dadurch gekennzeichnet, dass es die nachfolgenden Schritte umfasst: a. eine Zugabe zum Zellenlysat der Zusammensetzung A, wobei die Zusammensetzung A enthalt (a) ein Puffer mit niedrigem pH-Wert, (b) ein ionisches Tensid, (c) ein nichtionisches Tensid und (d) eine, Disulfidbrücken spaltende, Substanz, was zusammen fuhrt zu: (i) der Steigerung der Löslichkeit der DNA/RNA; (ii) der Entfaltung und der Ladungsänderung von Proteinen; und (iii) der Bindung von Proteinen und zellularen Reststoffen an Tensiden; b. eine Zugabe zu der Lösung der Zusammensetzung B, wobei die Zusammensetzung B enthält (a) Polyanionen, (b) Polymere mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen und (c) Mikropartikel aus der dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen, was zusammen führt zu: (1) Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen durch eine Zusammenlagerung mit Polyanionen, Polymeren und Mikropartikel; (2) selektiver Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen, getrennt von der DNA/RNA durch: (i) einen Ladungsunterschied zu der DNA/RNA bei niedrigem pH-Wert; (ii) eine Zusammenwirkung der gydrophoben Gruppen; und (iii) eine Übernahme von Proteinen und zellulären Reststoffen von Tensiden und zusammen mit Tensiden; c. eine Zugabe Polykationen zur Lösung, was zu der Bildung, durch Verbindungen zwischen den stark negativ geladenen Flocken und Polykationen, größeren, schwereren, mechanisch abtrennbaren Konglomeraten führt; d. eine Zentrifugierung, was zu der Absetzung der Konglomeraten in Bodensatz führt
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen in Schritt b. durch eine Anwendung (i) der Polyanionen (Poly(aciylamid-co-Natrium-acrylat) mit dem Molekulargewicht io,7xiosxio3 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol), (ii) der Polymere mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Poly(acrylamid-co-Natrium-aciylat) mit dem Molekulargewicht io,7xio3xio3 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol) durchgeführt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Flockung von Proteinen und zellulären Reststoffen in Schritt b. durch eine Anwendung der Mikropartikel aus der dreidimensionalen Polymer-Matrix mit negativ geladenen und gydrophoben Gruppen (Polyiacrylamid-co-N’N’- methylenbisacrylamid-co-Natrium-acrylat) mit der Ladungsdichte von 2 bis 4 %/Mol)_ durchgeführt wird. NACHGEREICHT
  4. 4- Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung A aus: (i) dem ionischen Tensid (Natriumkurylsulfat); (ii) dem nichtionischen Tensid (Polyethylenglykol Triton X-ioo, n=~io, mit dem Molekulargewicht von ca. 625 Gramm/Mol); (iii) der, Disulfidbrücken spaltender, Substanz (2-Merkaptoethanol); und (iv) dem Puffer mit niedrigem pH-Wert (3,o<pH-Wert<5,o) besteht
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bildung und Absetzung der Konglomerate in den Schritten c. und d. durch: (i) eine Anteilnahme der Mikropartikel; (ii) eine Anwendung der Polykationen (Poly(acrilamid-co-N,N,N,-trimetylammonium-ethylacrylat)-chlorid mit dem Molekulargewicht 6,ooxio3xio3 Gramm/Mol und der Ladungsdichte von 50 bis 60 %/Mol); und (iii) eine abschließende Zentrifugierung geschieht. NACHGEREIC: T ' -------. I
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