DE69928230T2 - Elektrophoretisches nukleinsäure-aufreinigungsverfahren - Google Patents

Elektrophoretisches nukleinsäure-aufreinigungsverfahren Download PDF

Info

Publication number
DE69928230T2
DE69928230T2 DE69928230T DE69928230T DE69928230T2 DE 69928230 T2 DE69928230 T2 DE 69928230T2 DE 69928230 T DE69928230 T DE 69928230T DE 69928230 T DE69928230 T DE 69928230T DE 69928230 T2 DE69928230 T2 DE 69928230T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
nucleic acid
electrophoresis
well
matrix
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69928230T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69928230D1 (de
Inventor
Gary Slater
William J. Efcavitch
Guy Drouin
Pascal Mayer
Jean Rousseau
Yan Hong ZHOU
Claudia Chiesa
Robert Ruhfel
Roger O'neill
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OTTAWA OTTAWA ONTARIO CA, University of
Applied Biosystems LLC
Original Assignee
University of Ottawa
Applera Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Ottawa, Applera Corp filed Critical University of Ottawa
Publication of DE69928230D1 publication Critical patent/DE69928230D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69928230T2 publication Critical patent/DE69928230T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Elektrophorese. Insbesondere betrifft diese Erfindung elektrophoretische Verfahren und Vorrichtungen, die zur Aufreinigung von Nukleinsäuren verwendbar sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Analyse der Nukleinsäurestruktur ist zum Mittelpunkt in der modernen Biologie, Biotechnologie und Medizin geworden. Moderne Nukleinsäureanalysetechniken, wie PCR, Fragment-Längen-Polymorphismus-Analyse und DNA-Sequenzierung stellen Informationen zur Verfügung, die für eine Vielzahl von Applikationen verwendbar sind, einschließlich der Diagnose einer Krankheit, der Identifikation eines Organismus und der Nachverfolgung von evolutionären Verwandtschaftsverhältnissen. Ein notwendiger erster Schritt in jedem Nukleinsäureanalyseverfahren ist die Herstellung einer Nukleinsäure, die frei von Kontaminanten ist, die mit Enzymen, die in diesen Techniken verwendet werden, z.B. Kontaminanten, interferieren kann, die Polymerase-Enzyme inaktivieren kann, die in PCR und DNA-Sequenzierungsverfahren verwendet werden.
  • Eine große Vielfalt von Nukleinsäureaufreinigungstechniken ist verfügbar, die auf einer Reihe von unterschiedlichen physikalischen und chemischen Prinzipien basieren. Die üblichsten Nukleinsäureaufreinigungsverfahren umfassen die organische/wässrige Flüssig-Flüssig-Extraktion, Festphasenadsorption, Präzipitation, Dichtegradienten-Zentrifugation und präparative Elektrophorese. Elektrophoretische Verfahren sind besonders bevorzugt, da sie eine Nukleinsäure mit einer hohen Reinheit und einem großen Molekulargewicht hervorbringen.
  • Beispielsweise ist eine Druck-modulierte Nukleinsäureaufreinigung von Komplex-Gemischen von Nichtnukleinsäurebestandteilen in der internationalen Patentanmeldung WO 99/22868 beschrieben. Es wird hierzu ein elektrophoretischer Schritt zum Abfangen und Konzentrieren der Nukleinsäuren verwendet. Eine Nukleinsäureaufreinigung durch eine bidirektionale Elektrophorese ist in der internationalen Patentanmeldung WO 86/00989 beschrieben.
  • Jedoch leiden konventionelle präparative Elektrophorese-Verfahren an wesentlichen Defiziten, die deren praktische Einsetzbarkeit insbesondere im Zusammenhang mit Anwendungen mit hohem Durchsatz beschränken. Ein besonders problematischer Aspekt von konventionellen präparativen Elektrophorese-Verfahren ist die Art und Weise, auf der eine aufgereinigte Nukleinsäure von einem Elektrophorese-Medium entfernt wird, z.B. einem Elektrophorese-Gel. In einer Klasse von Probenentfernungsprozessen wird die gereinigte Nukleinsäure von dem Elektrophorese-Gel manuell ausgeschnitten. Diese Proben-Ausschneideverfahren sind nachteilig, da die Nukleinsäure und das Gel-Material nach dem Ausschneiden der Probenbande voneinander getrennt werden müssen, die Prozedur einen wesentlichen manuellen Eingriff erfordert und die gereinigte Nukleinsäure vor dem Ausschneiden sichtbar gemacht werden muss, und die gewünschte Probenbande muss vor dem Ausschneiden sichtbar gemacht werden, um lokalisiert zu werden. In einer zweiten Klasse von Probenentfernungstechniken wird die gereinigte Probe von dem Elektrophorese-Gel in einen Gel-freien Puffer heraus eluiert. Jedoch erfordern Elutionsverfahren, dass mehrere Fraktionen gesammelt werden müssen, die gereinigte Probenbande sichtbar gemacht werden muss und/oder die Elutionseigenschaften der gewünschten Nukleinsäure bekannt sein müssen.
  • WO 99/22868 beschreibt Verfahren und einen Apparat zur Aufreinigung von Nukleinsäuren aus einer Probe, welches das Aussetzen der Probe gegenüber einem hohen Druck umfasst. Das Verfahren umfasst die Schritte des In-Kontakt-Bringens der Probe mit einer Phase eines Druck-Modulationsapparates bei einem Anfangsdruck, wobei die Phase eine Phase ist, die an Nukleinsäuren mit höherer Affinität nicht spezifisch bindet als an Nicht-Nukleinsäurebestandteile der Probe; den elektrophoretischen Transport der Nicht-Nukleinsäurebestandteile zu einer Elektrode, das Modifizieren des Druckes auf eine Höhe, die ausreicht, um die Bindung der Nukleinsäuren an die Phase zu unterbrechen und den elektrophoretischen Transport der Nukleinsäuren zu einer zweiten Elektrode.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung einer Klasse von neuen präparativen Elektrophorese-Verfahren, die zur Aufreinigung von Nukleinsäuren verwendbar sind. Diese Verfahren sind insbesondere für die Aufreinigung von Nukleinsäureproben vor der Behandlung mit Enzymen verwendbar, z.B. in einer Sanger-Typ-Sequenzierung, Oligonukleotid-Ligations-Assays und PCR.
  • In einem ersten Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Aufreinigung einer Nukleinsäureprobe umfassend die Schritte (1) Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe, die eine gewünschte Nukleinsäure und ein oder mehrere Kontaminanten umfasst, (2) Bereitstellen einer Elektrophorese-Matrix mit einer Ladevertiefung und einer darin ausgebildeten Entnahmevertiefung, Platzieren der Nukleinsäureprobe in die Ladevertiefung, (3) Durchführen einer ersten Elektrophorese, die die Elektrophorese der Nukleinsäureprobe für eine erste Zeitdauer umfasst, die wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure aus der Ladevertiefung und in die Elektrophorese-Matrix zu transportieren, (4) Durchführen einer zweiten Elektrophorese, die die Elektrophorese der Nukleinsäureprobe für eine zweite Zeitdauer umfasst, die wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure aus der Elektrophorese-Matrix und in die Entnahmevertiefung zu transportieren, (5) wobei die erste und zweite Elektrophorese wirksam sind, um die Konzentration der Kontaminanten relativ zu der Konzentration der gewünschten Nukleinsäure zu verringern, um dadurch eine gereinigte Nukleinsäure hervorzubringen und (6) Entfernen der gereinigten Probe aus der Entnahmevertiefung, mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäuren nicht durch Modifizieren des Druckes aufgereinigt werden. In dem Verfahren können die Ladevertiefung und die Entnahmevertiefung dieselbe Vertiefung oder verschiedene Vertiefungen sein.
  • In einer ersten bevorzugten Ausführungsform von diesem Aspekt der Erfindung, der hier als "Trag-Modus" der Erfindung bezeichnet wird, sind die Ladevertiefung und die Entnahmevertiefung räumlich überlappende Vertiefungen und die Elektrophorese-Matrix umfasst einen Hauptmassenteil, einen Vertiefung-Matrix-Zwischenteil und die Matrix ist wirksam, um die gewünschte Nukleinsäure in dem Vertiefung-Matrix-Zwischenteil derart einzufangen, dass die gewünschte Nukleinsäure wesentlich daran gehindert wird, in den Hauptmassenteil der Matrix einzudringen.
  • In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform von dem ersten Aspekt, die als "Kontaminantenverdünnungsmodus" der Erfindung bezeichnet wird, sind die Ladevertiefung und die Entnahmevertiefung räumlich überlappende Vertiefungen und die erste Elektrophorese reicht aus, um einen Teil der Kontaminanten aus der Ladevertiefung über die Elektrophorese-Matrix und in ein Kontaminantenverbindungsreservoir zu transportieren, wobei das Reservoir ein Puffervolumen enthält, das ausreicht, um die Kontaminanten, die in das Reservoir eindringen, wesentlich zu verdünnen.
  • In einer dritten Ausführungsform des ersten Aspekts der Erfindung, die hier als "LITAC-Rückwärtsfeld-Modus" bezeichnet wird, sind die Ladevertiefung und die Entnahmevertiefung räumlich überlappende Vertiefungen, wobei die erste Elektrophorese ein elektrisches DC-Feld einsetzt und die zweite Elektrophorese ein elektrisches LITAC-Feld einsetzt.
  • In einer vierten bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung sind die Lade- und Entnahmevertiefungen räumlich getrennte Vertiefungen und die erste Elektrophorese setzt ein elektrisches DC-Feld ein und die zweite Elektrophorese setzt ein elektrisches LITAC-Feld ein.
  • In einer fünften bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung sind die Lade- und Entnahmevertiefungen räumlich voneinander getrennt und die erste Elektrophorese umfasst die Elektrophorese einer gewünschten Nukleinsäure in einer ersten Richtung und die zweite Elektrophorese umfasst die Elektrophorese der gewünschten Nukleinsäure in einer zweiten Richtung, die sich von der ersten Richtung unterscheidet.
  • In einem zweiten Aspekt besteht die vorliegende Erfindung aus einem Verfahren zur Elektrophorese einer Nukleinsäureprobe, die in einer Elektrophorese-Matrix vorliegt, umfassend das Aussetzen der Nukleinsäureprobe gegenüber einem elektrischen LITAC-Feld, das ein elektrisches Vorwärtsfeld EF und ein elektrisches Rückwärtsfeld ER umfasst.
  • In einem dritten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Elektrophorese einer Nukleinsäureprobe, die in einer Elektrophorese-Matrix vorliegt, umfassend das Aussetzen der Nukleinsäureprobe gegenüber einem elektrischen Siedefeld, das ein elektrisches Vorwärtsfeld EF und ein elektrisches Rückwärtsfeld ER umfasst.
  • Die verschiedenen Aspekte und/oder Ausführungsformen der oben beschriebenen Erfindung besitzen einen oder mehrere der folgenden wichtigen Vorteile gegenüber bekannten elektrophoretischen Aufreinigungsverfahren: (1) Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren besteht keine Notwendigkeit Probenbanden aus einem Elektrophorese-Gel nach der elektrophoretischen Auftrennung physikalisch zu entfernen, stattdessen ist die aufgereinigte Probe in einer Gel-freien Entnahmevertiefung lokalisiert und ist in einem Puffer gelöst, der für eine nachfolgende enzymatische Behandlung geeignet ist, wobei dadurch die Automatisierung der Probenentnahme nach der Aufreinigung zum großen Teil ermöglicht wird; (2) bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren besteht keine Notwendigkeit mehrere Fraktionen, die von einem Elutionsprozess nach der Elektrophorese stammen, einzusammeln, stattdessen ist die aufgereinigte Probe in einer Gel-freien Entnahmevertiefung lokalisiert und wird in einem Puffer gelöst, der für eine nachfolgende enzymatische Behandlung geeignet ist, wobei dadurch die Menge der Probenverdünnung verringert wird, es ist nicht mehr notwendig, mehrere Fraktionen zu sammeln und es ist nicht mehr erforderlich ein vorheriges Wissen bezüglich des Migrationverhaltens einer gewünschten Nukleinsäure zu besitzen; (3) bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren besteht keine Notwendigkeit, die gewünschte Nukleinsäure nach der elektrophoretischen Auftrennung sichtbar zu machen, um deren Entnahme zu bewirken, stattdessen ist die aufgereinigte Probe nach der Elektrophorese in einer Gel-freien Entnahmevertiefung lokalisiert; (4) bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren besteht keine Notwendigkeit, eine Elektrophorese-Matrix von einer aufgereinigten Nukleinsäure abzutrennen und (5) bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Nukleinsäure zu einer ausreichenden Reinheit aufgereinigt, um eine wirksame PCR-Amplifikation in einem einzelnen Schritt zu ermöglichen, ohne dass eine Zentrifugation und Ethanolpräzipitation notwendig ist, um die gereinigte Nukleinsäure zu konzentrieren.
  • Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende Beschreibung, Zeichnungen und anhängenden Patentansprüche besser verstanden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A–1E zeigen eine schematische Darstellung der Kontaminantenverdünnungsausführungsform der Erfindung.
  • 2A–2D zeigen eine schematische Darstellung einer Trap-Ausführungsform der Erfindung.
  • 3A–3C zeigen eine schematische Darstellung einer LITAC-Rückwärtsfeld-Ausführungsform der Erfindung.
  • 4A–4D zeigen eine schematische Darstellung einer Einzelrichtungsmultivertiefungsausführungsform der Erfindung.
  • 5A–5D zeigen eine schematische Darstellung einer multidirektionalen Multivertiefungsausfürungsform der Erfindung.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
  • Es wird im Detail auf die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung Bezug genommen, wobei Beispiele zu dieser in den anhängenden Zeichnungen veranschaulicht sind. Während die Erfindung in Zusammenhang mit den bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wird, soll klar sein, dass diese nicht den Umfang der Erfindung auf diese Ausführungsformen beschränken sollen. Im Gegenteil, die Erfindung soll Alternativen, Modifikationen und Äquivalente einschließen, die von der Erfindung umfasst sein können, wie sie durch die anhängenden Patentansprüche definiert wird.
  • Im Allgemeinen bewirken die erfindungsgemäßen Verfahren die Auftrennung einer Nukleinsäureprobe in zwei Fraktionen: eine erste Fraktion, die Nukleinsäuremoleküle umfasst, die kleiner sind als eine kritische Größe M* und Kontaminanten, die mit der enzymatischen Behandlung einer gereinigten Nukleinsäure interferieren und eine zweite Fraktion, die Nukleinsäuremoleküle umfasst, die größer sind als M*, wobei solche Moleküle hier als "gewünschte Nukleinsäure" bezeichnet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen im Allgemeinen folgende sechs Verfahrensschritte: (1) Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe, die eine gewünschte Nukle insäure und eine oder mehrere Kontaminanten umfasst, (2) Bereitstellen einer Elektrophorese-Matrix mit einer Ladevertiefung und einer darin ausgebildeten Entnahmevertiefung, (3) Platzieren der Nukleinsäureprobe in die Ladevertiefung, wobei die Lade- und Entnahmevertiefungen dieselbe Vertiefung oder unterschiedliche Vertiefungen sein können, Platzieren der Nukleinsäureprobe in die Ladevertiefung, (4) Durchführen einer ersten Elektrophorese, bei der die Nukleinsäureprobe für eine erste Zeitdauer einer Elektrophorese unterzogen wird, die wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure aus der Ladevertiefung zu transportieren, (5) Durchführen einer zweiten Elektrophorese, bei der die Nukleinsäureprobe für eine zweite Zeitdauer einer zweiten Elektrophorese unterzogen wird, die wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure in die Entnahmevertiefung zu transportieren, und (6) Entfernen der gereinigten Probe aus der Entnahmevertiefung, mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäuren nicht durch Modifizieren des Druckes aufgereinigt werden. Die ersten und zweiten Elektrophorese-Schritte sind wirksam, um die Konzentration von Kontaminanten relativ zu der Konzentration der gewünschten Nukleinsäure in der Nukleinsäureprobe zu verringern, um dadurch eine gereinigte Nukleinsäure herzustellen.
  • Um die Diskussion zu vereinfachen, werden die erfindungsgemäßen Verfahren in zwei Kategorien eingeteilt: Einzelvertiefungsverfahren, bei denen die Ladevertiefung und die Entnahmevertiefung dieselbe Vertiefung sind und Multivertiefungsverfahren, in denen die Lade- und Entnahmevertiefungen räumlich voneinander getrennt sind.
  • I. ALLGEMEINE ERWÄGUNGEN
  • A. Nukleinsäureprobe
  • Die erfindungsgemäße Nukleinsäureprobe kann von einem beliebigen lebenden oder toten biologischen Organismus stammen. Beispielhafte Quellen von Probennukleinsäuren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Zellen, Mikroorganismen, Gewebe, Blut und Viren.
  • Die erfindungsgemäße Nukleinsäureprobe umfasst im Allgemeinen drei Bestandteile: (1) eine gewünschte Nukleinsäure, (2) eine oder mehrere Nukleinsäure-Kontaminanten und (3) eine oder mehrere Nicht-Nukleinsäure-Kontaminanten. Die gewünschte Nukleinsäure ist dadurch charakterisiert, dass sie eine Größe aufweist, die größer ist als eine kritische Größe M*, wobei die Höhe von M* eine Funktion der Anzahl von experimentellen Parametern ist, einschließlich der Konzentration und Art der Elektrophorese-Matrix, der Art und die Stärke des verwendeten elektrischen Feldes, der Pufferzusammensetzung und Ionenstärke. In der Praxis ist M* typischerweise kleiner als ungefähr 20 kbp.
  • Umgekehrt sind Nukleinsäurebestandteile Nukleinsäuremoleküle, z.B. RNA oder DNA, die dadurch charakterisiert sind, dass sie eine Größe besitzen, die geringer ist als die kritische Größe M*.
  • Nicht-Nukleinsäure-Kontaminanten umfassen eine beliebige Spezies, die zum Interferieren mit einer enzymatischen Behandlung der gewünschten Nukleinsäure nach der Aufreinigung fähig ist, z.B. einer Behandlung mit einer Polymerase, einer Ligase oder anderen Enzymen, die ein Nukleinsäuresubstrat verwerten. Beispielhafte Kontaminanten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Proteine, Peptide, hochkonzentrierte Salze und Häm.
  • Oftmals ist es vor dem Aussetzen einer Nukleinsäureprobe gegenüber den erfindungsgemäßen Aufreinigungsverfahren notwendig, die Nukleinsäure von einem Nukleinsäure enthaltenden Ausgangsmaterial zu isolieren. Solche Ausgangsmaterialien können in vielfältiger Form vorliegen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf 20 Millionen Jahre alte fossilierte Pflanzen, menschliche Überreste, Haare, Paraffin-eingebettete Biopsieproben, Bernstein verkrustete Insekten, Zellen, Blut und Gewebeproben und dergleichen. Vorzugsweise ist das Ausgangsmaterial Vollblut. Es ist klar, dass solche unterschiedlichen Ausgangsmaterialien bestimmte Anforderungen und Erfordernisse für das zur Nukleinsäureisolierung verwendete Verfahren stellen. Jedoch müssen im Allgemeinen solche Isolationsprozeduren zumindest dazu dienen, teilchenförmige Kontaminanten von der Nukleinsäureprobe substantiell zu entfernen und die Nukleinsäureprobe substantiell löslich zu machen.
  • Im Allgemeinen umfassen geeignete Isolationsprozeduren das Aufbrechen von Zellen durch mechanische oder chemische Mittel mit einer anschließenden Behandlung mit proteolytischen Enzymen, um Proteine zu verdauen oder andere zelluläre Makrostrukturen aufzubrechen. Zum Beispiel können zur Isolation einer Nukleinsäureprobe aus Blut zwei Arten von Extraktionsansätzen verwendet werden: "Komplexe" Verfahren, die auf einer intensiven DNA-Aufreinigung basieren und "einfache" Verfahren, die weniger Frobenhandhabungen erfordern.
  • "Komplexe Verfahren" basieren im Allgemeinen auf einem Proteinase-K-Verdau oder einer Proteinaussalzung gefolgt von einer Chloroform-/Phenolextraktion (oder DNA-Adsorption an Silicapartikel) durch Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Sambrook et al., Hrsg., CSH Press (1989)). Solche Protokolle liefern gewöhnlicherweise große Mengen von relativ reiner DNA. Jedoch erfordern solche Verfahren typischerweise eine relativ große Probengröße, z.B. 10 ml Blut, die Verwendung von toxischen, leicht flüchtigen und/oder explosiven Reagenzien, z.B. Phenol und Chloroform, und basieren auf relativ zeitaufwändigen und laborintensiven Protokollen, bei denen es schwierig ist, diese zu automatisieren. Die intensive Probenhandhabung erfordert auch Zunahmen der Möglichkeit einer Kontamination und DNA-Scherung. In einigen Fällen werden weiße Blutzellen oder nukleare Isolationsschritte benötigt, um eine PCR-Inhibition gering zu halten. Diese Schritte sind gewöhnlicherweise schwierig durchführbar, wenn weniger als 300 μl Blut für die Extraktion vorhanden sind, da die Pelletgröße klein ist und schwierig von dem Überstand effizient zu isolieren ist. Es kann auch eine misslungene DNA-Ethanolpräzipitation vorkommen. Auch ist ein vollständiges Lösen von Ethanol-präzipitierter DNA zeitaufwändig und schwierig zu erreichen. Diese Schwierigkeit eines erneuten Lösens trifft auch für Protokolle zu, welche eine DNA-Bindung an einen Festträger vorsehen, z.B. Silica- oder Glas-Beads, Glasfaserscheiben oder Harze und magnetische Beads. Allen DNA-Träger-Bindeverfahren ist gemein, dass die Gefahr eines Template-Verlustes aufgrund einer unvollständigen Bindung, Verzögerung während des Waschens und Desorption bestehen.
  • Zum größten Teil sind "einfache" Protokolle wie DNA-Aufreinigung mittels magnetischen Beads oder "boil and go"-Verfahren schnell und leicht durchzuführen und benötigen gewöhnlicherweise lediglich 10 bis 50 μl Probenvolumen und eine geringe Handhabung (Dynabeads DNA Direct Kit from Dynal, Inc.: Walsh et al., Biotechniques, 10: 506 (1991)). Jedoch besitzen die durch dieses Verfahren erhaltenen DNA-Proben typischerweise eine geringe Qualität, d.h. sie sind durch ein relativ niedriges 260/280-Absorptionsverhältnis, z.B. 1,2 zu 1,4, geringen PCR-Ausbeuten, z.B. 10 bis 30%, charakterisiert. Bei "boil and go"-Protokollen ist die für eine erfolgreiche Extraktion benötigte Temperatur, z.B. oberhalb von 95°C, gewöhnlicherweise nicht mit der Gewinnung von fragiler DNA, z.B. der fragilen X-Region des humanen Genoms, kompatibel und bewirkt eine DNA-Denaturierung. Eine solche Denaturierung der gereinigten Nukleinsäure ist problematisch, wenn ein weiterer enzymati scher Verdau der gereinigten Nukleinsäure gewünscht ist, da einzelsträngige DNA nicht ein Ziel für viele übliche Restriktionsendonukleasen darstellt.
  • In einem wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues DNA-Isolationsverfahren beschrieben, das auf der Behandlung von Vollblut mit proteolytischen Enzymen basiert, um Proteine zu verdauen oder andere zelluläre Makrostrukturen aufzubrechen. Dieses Verfahren ist besonders bevorzugt, da lediglich eine geringe Konzentration von proteolytischen Enzymen im Vergleich zu konventionellen Verfahren verwendet wird, so dass dadurch die Notwendigkeit entfällt, das Enzym vor der PCR-Analyse zu entfernen. Daher besteht bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kein Bedarf an "Hitze-kill"-Behandlungen, Zentrifugationen und/oder Präzipitation der Nukleinsäureprobe, um restliches Enzym zu entfernen. Da keine Bearbeitung der Probe erforderlich ist, kann größtenteils intakte hochmolekulare doppelsträngige DNA unter Verwendung des betreffenden Verfahrens gewonnen werden. Da dieses Protokoll eine minimale Manipulation der Probe und keine Zentrifugation erfordert, ist es daher leicht für eine Automatisierung anpassbar.
  • Gemäß der Isolationsprozedur der Erfindung wird ein Blut-/Lyse-Puffergemisch gebildet, indem 1 Volumen frisches Blut mit 6 Volumen Lyse-Puffer und 0,4 Volumen einer Proteinase-K-Lösung vermischt werden (z.B. ungefähr 20 mg/ml). Vorzugsweise beträgt das Grundvolumen von frischem Blut ungefähr 10 bis 20 μl. Eine bevorzugte Lyse-Pufferzusammensetzung mit 1,4 ml Lyse-Puffer besteht aus 1 ml 110 mM Tris-HCl (pH 8,3), 250 mM NaCl, 10 mM Sarkosyl-Detergenz, 0,05% Nonidet P-40 und 0,4 ml 2-Pyrrolidinon. Das Blut-/Lyse-Puffergemisch wird dann bei 65°C für ungefähr 35 Minuten inkubiert.
  • B. Elektrophorese-Matrix
  • Die in der Erfindung verwendete Elektrophorese-Matrix kann unter Verwendung einer beliebigen von einer Reihe konventioneller Techniken gebildet werden. Im Allgemeinen ist die Elektrophorese-Matrix wirksam, um die elektrophoretische Migration einer gewünschten Nukleinsäure relativ zu deren Migration in einem Matrix-freien Medium zu verzögern. Darüber hinaus muss die Matrix eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität zwischen der gewünschten Nukleinsäure und den Kontaminanten gewährleisten. Zusätzlich muss die Integrität der Gel-Matrix bei erhöhten Temperaturen sichergestellt werden, die während der Elektrophorese auftreten kön nen. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung muss die Matrix auch Nukleinsäuren mit einer Größe von mehr als M* substantiell ausschließen und/oder eine vom elektrischen Feld abhängige elektrophoretische Mobilität der gewünschten Nukleinsäure gewährleisten.
  • Die Elektrophorese-Matrix kann in einem konventionellen "Nass-Gel"-Format oder einem "Trocken-Gel"-Format ausgebildet sein. In einem Nass-Gel-Format sind die Elektroden, die verwendet werden, um die Elektrophorese zu bewirken, in einem Puffer-Reservoir platziert und in einem Laufpuffer eingetaucht und die elektrische Bindung zwischen den Elektroden und der Matrix wird über den Laufpuffer hergestellt. Zusätzlich ist bei der Nass-Gel-Konfiguration eine obere Oberfläche der Matrix mit einem dünnen Film des Laufpuffers bedeckt, z.B. mit mindestens ungefähr 5 mm Tiefe.
  • Andererseits gibt es in einem Trocken-Gel-Format keine Puffer-Reservoirs. Stattdessen sind die Elektroden in direktem Kontakt mit der Matrix. Es können mehrere alternative Trocken-Gel-Elektroden-Konfigurationen verwendet werden. Beispielhafte Trocken-Gel-Elektroden-Konfigurationen umfassen eine flache Metallplatte, ein Gitter aus Metalldrähten und eine Reihe von Metallnadeln, die in den Korpus des Gels eindringen. Vorzugsweise ist das zur Bildung der Elektroden verwendete Metall Platin oder ein anderer ähnlich chemisch passiver Stoff. Vorzugsweise ist ein Puffer-gesättigtes Schwamm-Material zwischen den Elektroden und der Elektrophorese-Matrix angeordnet, um eine elektrische Verbindung zwischen den Elektroden und der Matrix herzustellen, ohne dass die Matrix in der Nähe der Elektrode zum Schmelzen gebracht wird, auf eine Art, welche die Schrumpfung der Matrix unterbringt und um als Reservoir für den Elektrophorese-Puffer zu dienen. Im Allgemeinen müssen geringere Feldintensitäten bei einem Trocken-Gel verwendet werden, um die Gel-Integrität zu erhalten. Unter Umständen kann das Gel in der Nähe der Elektroden zu schmelzen beginnen, wenn eine höhere Feldintensität verwendet wird. Zusätzlich ist die geringe Puffermenge, die innerhalb des Gels eingebunden ist, im Allgemeinen nicht ausreichend, um den Strom und die Leitfähigkeit während der Elektrophorese zu stabilisieren. Ein Ionenverlust ist ein übliches Phänomen. Als Konsequenz davon ist der Widerstand zeitabhängig und hängt oft von der Polarität des Feldes ab, insbesondere nach mehreren Minuten. Dicke Gele, d.h. Gele mit einer Dicke von zwischen ungefähr 5 und 10 mm, verringern diese Probleme etwas.
  • In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, dass die Matrix einen substantiellen elektroosmotischen Fluss zustande bringt, z.B. mehr als 2,0 × 10–4 cm2/V s. Ein solcher elektroosmotischer Fluss kann dazu dienen, Kontaminanten aus der Ladevertiefung herauszuleiten, während die gewünschte Nukleinsäure in der Vertiefung verbleibt. Im Allgemeinen werden Matrices, die geladene Gruppen umfassen, einen elektroosmotischen Fluss fördern, z.B. bestimmte Agarose-Matrices, z.B. "High EEO"-Agarosematerialien, wie sie von dem Chemie-Unternehmen Sigma bereitgestellt werden.
  • Beispielhafte Elektrophorese-Matrices umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Agarose und kreuzvernetztes Polyacrylamid. Vorzugsweise ist die Matrix eine gelierte Agarose. Bevorzugter ist die Agarose eine hochschmelzende Agarose mit einer Schmelztemperatur oberhalb ungefähr 85°C.
  • Lade- und Entnahmevertiefungen sind Matrix-freie Bereiche, die in der Elektrophorese-Matrix ausgebildet sind, und die eine Pufferlösung enthalten. Eine Probennukleinsäure wird in die Ladevertiefung vor der Aufreinigung gegeben und es wird eine gereinigte Nukleinsäure von der Entnahmevertiefung nach der Aufreinigung gewonnen. Die Lade- und Entnahmevertiefungen können dieselbe Vertiefung oder unterschiedliche Vertiefungen sein. Da es keine Matrix in den Vertiefungen gibt, kann eine Platzierung der Probennukleinsäure und die Entnahme der gereinigten Nukleinsäure ohne Ausschneiden der gereinigten Nukleinsäure aus einer Gel-Matrix durchgeführt werden. Die Form der Vertiefungen ist willkürlich, allerdings ist bevorzugt, dass die Vertiefungen der Erfindung einen im Wesentlichen flachen Boden und eine im Wesentlichen flache Wand in die Elektrophorese-Richtung aufweisen, da nicht-flache Böden das elektrische Feld in der Nähe der Vertiefungen negativ beeinflussen können und nicht-flache Wände in der Elektrophorese-Richtung können die Form einer Probenbande während der Elektrophorese nachteilig beeinflussen. Darüber hinaus sollte die Tiefe der Vertiefungen geringer sein als die Dicke der Elektrophorese-Matrix, d.h. der Boden der Vertiefungen sollte von der Matrix gebildet werden, und nicht von einem Matrix-Trägermittel.
  • Die Kapillarwirkung kann bewirken, dass sich die Elektrophorese-Matrix, die in Kontakt mit den Kämmen ist, die verwendet werden, um die Lade- und Entnahmevertiefungen zu bilden, an den Kämmen anhebt, wenn die Matrix hergestellt wird, z.B. wenn ein Agarose-Gel gegossen wird. Dieser kapillare Anstieg kann bewirken, dass die Stärke des Gels zwischen zwei benachbarten Vertiefungen größer ist als in dem Korpus des Gels. Diese erhöhte Stärke kann bewirken, dass ein elektrisches Feld in der Nähe der Vertiefungen inhomogen wird. Es wurde festgestellt, dass eine Vermeidung eines solchen inhomogenen elektrischen Feldes wichtig ist, um reproduzierbare Ergebnisse und eine maximale Ausbeute an gereinigter Nukleinsäure sicherzustellen. Dieses Problem kann gelöst werden, indem ein Kamm verwendet wird, der aus einem Material hergestellt wurde, das keine Kapillarwirkung hervorruft oder indem Gel, das um die Vertiefungen hervorsteht, mittels einer Rasierklinge abgeschnitten wird, um so ein Gel mit einer oberen Oberfläche zu erzeugen, die einheitlich flach ist.
  • Der verwendete Elektrophorese-Puffer kann ein beliebiger konventioneller Elektrophorese-Puffer sein. Vorzugsweise hat der Puffer eine niedrige elektrische Leitfähigkeit, so dass dadurch die Joule-Menge an Hitze, die während der Elektrophorese erzeugt wird, verringert wird, und mit den Nukleinsäuren nicht schädlich interagiert. Zusätzlich sollte der Puffer mit einer nachfolgenden enzymatischen Behandlung der gereinigten Nukleinsäure kompatibel sein, z.B. mit dem PCR-Prozess kompatibel sein. Daher hat der Entnahmevertiefungspuffer vorzugsweise eine geringe Salzkonzentration und eine geringe Ionenstärke, z.B. TAE-Puffer, der aus 0,04 M Tris, 0,04 M Essigsäure und 0,002 M EDTA besteht.
  • Die Elektrophorese-Matrix kann eine horizontale oder vertikale Orientierung haben. In der horizontalen Orientierung verläuft die Elektrophorese-Richtung in einer horizontalen Richtung, während in der vertikalen Orientierung die Elektrophorese-Richtung in einer vertikalen Richtung verläuft. Im Allgemeinen ist die horizontale Orientierung bevorzugt, wenn ein Nass-Gel-Format verwendet wird, sowie in Multivertiefungsverfahren (siehe unten).
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Matrix wird eine Matrix konstruiert, indem eine Gel-/Kunststoffzusammensetzung gebildet wird, die aus einem mit Agar imprägnierten behandelten Kunststoff besteht. Diese Matrices sind bevorzugt, da sie im Vergleich zu nicht-unterstützten Gel-Materialien eine höhere strukturelle Integrität gewährleisten.
  • Beispielhafte gesinterte Kohlenstoffe, die in den erfindungsgemäßen Gel-/Kunststoffbestandteilen verwendbar sind, werden von mehreren Herstellern hergestellt, z.B. Porex Technology, Inc., und GenPore, Inc. Im Allgemeinen sind diese gesinterten Kunststoffe durch ein inneres Netzwerk von offenzelligen omnidirektionalen Po ren charakterisiert. Diese Poren, die in durchschnittlichen Porengrößen im Bereich von 7–250 Mikrometer hergestellt werden können, geben den porösen Kunststoffen deren strukturelle Stärke. Es werden mehrere Polymerarten in Kombination verwendet, um die behandelten Kunststoffe herzustellen, z.B. Polyethylen mit hoher Dichte (HDPE), ultrahochmolekulares Polyethylen (UHMW), Polypropylen (PP), Polyvinylidenfluorid (PVDF), Polytetrafluorethylen (PTFE), Nylon 6 (N6), Polyethersulfon (PES) und Ethylvinylacetat (EVA).
  • Um die Zusammensetzungen zu bilden, wird eine Platte des gesinterten Kunststoffes, z.B. Polypropylen POREXTM mit einer Porengröße von 250 μm (12 in. × 12 in. × ¼ in .) zu den gewünschten Abmessungen ausgeschnitten, z.B. mit einer Länge von 3 cm und einer Breite von 11,7 cm. Flachbödige Vertiefungen werden dann in den Kunststoff gebohrt, z.B. mit einer Tiefe von ungefähr 3 mm bis 5 mm und einem Durchmesser von 5 mm. Die Vertiefungen sollten nicht bis zur unteren Oberfläche der Kunststoffplatte hindurchdringen. Um die Hydrophilizität des Kunststoffes zu erhöhen, wird dann das poröse Kunststoffstück in ein Befeuchtungsmittel eingetaucht, z.B. 70% Ethanol oder mittels einer Hochspannungsplasmabehandlung behandelt, die hydrophile Gruppen auf der Oberfläche des Kunststoffes einführt (-OH, -COOH oder -NH), z.B. wie bereitgestellt von MetroLine Industries Inc. Wenn der gesinterte Kunststoff behandelt worden ist, um ihn ausreichend hydrophil zu machen, wird er mit geschmolzener Agarose zusammengeführt, z.B. in kochende Agarose gegeben (0,8% bis 3,0% gelöst in 0,2X TAE-Puffer). Der Agarose wird es ermöglicht zu erstarren und die erstarrte Agarose, die an der äußeren Oberfläche des Kunststoffs klebt, wird mechanisch entfernt. Der mit Agar imprägnierte Kunststoff wird dann in eine Elektrophorese-Kammer gegeben und mit Elektrophorese-Puffer bedeckt, z.B. bis zu einer Tiefe von 5 mm. Die Elektrophorese wird auf dieselbe Weise durchgeführt wie bei Nichtverbundsmatrices, außer dass die Spannung im Allgemeinen wesentlich verringert ist als vergleichsweise Nichtverbindungsmatrices.
  • C. ELEKTRISCHE FELDER
  • Die Höhe des elektrischen Feldes, das in den verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, allerdings wird im Allgemeinen die maximal mögliche Feldstärke verwendet, um die zur Probenaufreinigung benötigte Zeit zu verringern. Der Wert des maximalen Feldes wird durch die Fähigkeit der Elektrophorese-Matrix beschränkt, den erhöhten Temperaturen, die durch die Joule-Hitze, die während der Elektrophorese er zeugt wird, verursacht werden, zu widerstehen. Die Joule-Menge an Hitze, die durch die Elektrophorese erzeugt wird, wird durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt, einschließlich der Dicke der Elektrophorese-Matrix, der Ionenstärke und der elektrischen Leitfähigkeit des Elektrophorese-Puffers, der Stärke des elektrischen Feldes und der Ionenstärke und der elektrischen Leitfähigkeit der Nukleinsäureprobe. Der Wert des minimalen Feldes wird durch die Fähigkeit des Feldes beschränkt, die Bestandteile und/oder die gewünschte Nukleinsäure aus und/oder in die Ladevertiefung zu transportieren. Vorzugsweise werden elektrische Felder zwischen 5 und 15 V/cm in der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden zeitabhängige elektrische Felder verwendet, um die differenzielle Migration zwischen einer gewünschten Nukleinsäure und Kontaminanten und die effiziente Gewinnung einer gereinigten Nukleinsäure zu erhöhen. Eine erste Art eines zeitabhängigen elektrischen Feldes wird hier als "liquid-trapping-alternating-current field" oder "LITAC"-Feld bezeichnet. Unter dem Einfluss eines LITAC-Feldes hat eine gewünschte Nukleinsäure eine begrenzte Vorwärtsladung in einer Elektrophorese-Matrix und besitzt eine Nettoladung von Null in freier Lösung, d.h. in den Lade- und Entnahmevertiefungen. Zusätzlich besitzen die Kontaminanten unter dem Einfluss eines elektrischen LITAC-Feldes eine Nettoladung von Null sowohl in der Matrix als auch in freier Lösung. Diese Eigenschaft einer LITAC-induzierten Migration dient mehreren nützlichen Zwecken, die weiter im Detail unten beschrieben werden.
  • Im Allgemeinen ist ein LITAC-Feld durch eine Vorwärtszeit tF, ein elektrisches Vorwärtsfeld EF, eine Rückwärtszeit tR und ein elektrisches Rückwärtsfeld ER charakterisiert. Insbesondere ist ein LITAC-Feld durch die folgenden Beziehungen zwischen tF, EF, tR und ER spezifiziert: (1) das Produkt der Vorwärtszeit und des elektrischen Rückwärtsfeldes ist gleich dem Produkt der Rückwärtszeit und des elektrischen Rückwärtsfeldes, d.h. TF·EF = tR·ER;
  • (2) das elektrische Vorwärtsfeld ist größer als das elektrische Rückwärtsfeld und (3) die Zeiten tF und tR sind so gewählt, dass jede von ihnen geringer ist als die Zeit, die benötigt wird, um die gewünschte Nukleinsäure in eine Entnahmevertiefung zu transportieren, z.B. ungefähr 30 Sekunden und mehr als die Orientierungszeit der gewünschten Nukleinsäure, z.B. ungefähr eine Sekunde. Vorzugsweise beträgt EF/ER zwischen ungefähr 2 und 3, mehr bevorzugt ist das Verhältnis ungefähr 2,4. Um den Prozess zu beschleunigen, wird der Wert von EF so gewählt, dass es dem maximalen elektrischen Feld entspricht, das mit dem Elektrophorese-System kompatibel ist, d.h. das maximale Feld, das die Gel-Matrix nicht schmilzt oder auf andere Weise zersetzt.
  • Eine zweite Art eines zeitabhängigen elektrischen Feldes; das im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, wird hier als ein Null-integriertes Geschwindigkeits-Elektrophorese-Feld oder ZIVE bezeichnet. Im Gegensatz zu einem LITAC-Feld besitzt unter dem Einfluss eines ZIVE-Feldes in der Elektrophorese-Matrix die gewünschte Nukleinsäure eine Netto-Migrationsgeschwindigkeit von Null, während die Kontaminanten eine begrenzte Nettovorwärtsgeschwindigkeit besitzen.
  • Im Allgemeinen ist ein ZIVE-Feld durch eine Vorwärtszeit tF, ein elektrisches Rückwärtsfeld EF, eine Rückwärtszeit tR, ein elektrisches Rückwärtsfeld ER, eine elektrophoretische Vorwärtsgeschwindigkeit unter dem Einfluss des elektrischen Vorwärtsfeldes VF und einer elektrophoretischen Rückwärtsgeschwindigkeit unter dem Einfluss des elektrischen Rückwärtsfeldes VR charakterisiert. Insbesondere ist ein ZIVE-Feld durch die folgenden Beziehungen zwischen tF, EF, tR, ER, VF und VR spezifiziert: (1) das Produkt der Vorwärtszeit und die Vorwärtsgeschwindigkeit ist gleich dem Produkt der Rückwärtszeit und der Rückwärtsgeschwindigkeit, d.h. tF·VF = tR·VR;
  • (2) das elektrische Vorwärtsfeld wird auf einen Maximalwert gesetzt, wie oben für das LITAC-Feld beschrieben; (3) das elektrische Rückwärtsfeld ist geringer als das elektrische Vorwärtsfeld, wobei EF/ER vorzugsweise zwischen ungefähr 2 und 3 und mehr bevorzugt ungefähr 2,4 ist; (4) tF wird so ausgewählt, dass es größer ist als die Reorientierungszeit der gewünschten Nukleinsäure und weniger als die Zeit, die die gewünschte Nukleinsäure benötigt, um aus der Matrix herauszuwandern. Vorzugsweise ist die Vorwärtszeit größer als ungefähr 5 Sekunden und bevorzugter zwischen ungefähr 5 Sekunden und 5 Minuten.
  • II. AUFREINIGUNGSVERFAHREN
  • A. Einzelvertiefungsverfahren
  • Einzelvertiefungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind durch eine Ladevertiefung und eine Entnahmevertiefung charakterisiert, die derselben Vertiefung entsprechen, d.h. die Nukleinsäureprobe wird in dieselbe Vertiefung geladen, aus der die gereinigte Nukleinsäure gewonnen wird. Einzelvertiefungsverfahren haben mehrere Vorteile gegenüber Multivertiefungsverfahren, einschließlich den folgenden: (1) es können große genomische Nukleinsäuren, die normalerweise nicht in das Elektrophorese-Medium eintreten, gewonnen werden; (2) die gereinigte Probe braucht nicht in eine zweite Vertiefung aufgefangen zu werden und (3) es können mehrere Proben in einer gegebenen Menge von Elektrophorese-Medium verarbeitet werden, da nur eine einzige Vertiefung pro Probe benötigt wird. Die Probe ist ein signifikanter Nachteil von Einzelvertiefungsverfahren, das nicht-bewegliche Kontaminanten, z.B. neutrale Kontaminanten und große Aggregate nicht von der gewünschten Nukleinsäure aufgetrennt werden können.
  • Kontaminantenverdünnungsmodus. Ein erstes Einzelvertiefungsverfahren, das hier als "Kontaminantenverdünnungsmodus" bezeichnet wird, ist schematisch in den 1A–E dargestellt. In dieser Ausführungsform wird eine Probennukleinsäure einer ersten Elektrophorese unter dem Einfluss eines ersten elektrischen DC-Feldes mit einer Stärke von E1 für eine Dauer t1 ausgesetzt. Die erste Elektrophorese reicht aus, um eine gewünschte Nukleinsäure 30 mit einer kritischen Größe größer als M*, um eine Strecke von weniger als L* zu transportieren, und um die beweglichen Kontaminanten 5 aus einer Lade-/Entnahme-(L/R) Vertiefung 10 über eine Elektrophorese-Matrix 15 und in ein Kontaminantenverdünnungsreservoir 20 zu transportieren (siehe 1A–D). Wenn ein ausgewählter Teil der beweglichen Kontaminanten aus der Matrix in das Kontaminantenverdünnungsreservoir herausgelaufen ist und dadurch verdünnt wurde 25, wird die Probennukleinsäure einer zweiten Elektrophorese unter dem Einfluss eines zweiten elektrischen DC-Feldes mit einer Stärke E2 für eine Dauer t2 ausgesetzt, wobei E1 und E2 gleich oder unterschiedlich sein können. Diese zweite Elektrophorese reicht aus, um die gewünschte Nukleinsäure 30 zurück in die Lade-/Entnahmevertiefung 10 zu transportieren (siehe 1D–E).
  • Das Kontaminantenverdünnungsreservoir enthält ein Puffervolumen, das ausreicht, um die Kontaminanten, die in das Reservoir eintreten, relativ zu ihrer Konzentration in der Nukleinsäureprobe substantiell zu verdünnen. Vorzugsweise ist das Kontaminantenverdünnungsreservoir ein Elektrodenpufferreservoir, das ein Puffervolumen enthält, das mindestens sechsmal dem Volumen der Elektrophorese-Matrix entspricht.
  • Um die Gewinnung der gewünschten Nukleinsäure zu ermöglichen, hat das zweite elektrische Rückwärtsfeld üblicherweise dieselbe Stärke und Dauer, aber eine gegensätzliche Polarität als das erste elektrische Vorwärtsfeld. Weiter kann durch Anpassung der Dauer der ersten Elektrophorese der Aufreinigungsgrad und die Entnahmeeffizienz der gewünschten Nukleinsäure verändert werden. Das bedeutet, dass eine längere t1 im Allgemeinen eine höhere Reinheit der gewünschten Nukleinsäure bewirkt, aber zu einer geringeren Entnahmeeffizienz führt. Vorzugsweise sind gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung die ersten und zweiten elektrischen Felder DC-Felder mit einer Feldstärke von ungefähr 10 bis 12 V/cm.
  • Trap-Modus. Ein zweites Einzelvertiefungsverfahren, das hier als der "Trap-Modus" bezeichnet wird, ist schematisch in den 2A–D gezeigt. Dieser Modus erfordert eine Elektrophorese-Matrix, die einen Hauptmassenbereich und einen Vertiefung-Matrix-Zwischenbereich umfasst, wobei der Vertiefung-Matrix-Zwischenbereich wirksam ist, um eine gewünschte Nukleinsäure einzufangen, um dadurch zu verhindern, dass eine solche Nukleinsäure in den Hauptmassenbereich der Matrix eindringt. Eine solche Matrix kann unter Verwendung einer hohen Konzentration eines Matrixpolymers gebildet werden, z.B. 30 mg/ml Agarose.
  • In dieser Ausführungsform wird die Probennukleinsäure einer ersten Elektrophorese unter dem Einfluss eines ersten elektrischen DC-Feldes mit einer Stärke E1 für eine Dauer t1 ausgesetzt. Diese erste Elektrophorese reicht aus, um die beweglichen Kontaminanten 5 aus einer Lade-/Entnahmevertiefung 10 und in eine Elektrophorese-Matrix 15 zu transportieren und die gewünschte Nukleinsäure 30 aus der Lade-/Entnahmevertiefung und in den Vertiefung-Matrix-Zwischenbereich der Matrix zu transportieren (siehe 2A–B). Wenn die Kontaminanten aus der Lade-/Entnahmevertiefung in die Elektrophorese-Matrix transportiert wurden, gibt es mehrere Alternativen, um die gewünschte Nukleinsäure zurück in die Lade/Entnahmevertiefung zu transportieren.
  • In einer ersten Alternative wird die gewünschte Nukleinsäure von der Lade-/Entnahmevertiefung 10 nach Beendigung der ersten Elektrophorese ohne weitere Elektrophorese-Schritte entfernt. Gemäß dieser Alternative wird die gewünschte Nukleinsäure aus dem Vertiefung-Matrix-Zwischenbereich durch eine einfache Diffusion und/oder durch leichte Bewegung des Puffers, der in der Lade-/Entnahmevertiefung vorhanden ist, gewonnen (siehe 2C).
  • In einer zweiten Alternative wird die gewünschte Nukleinsäure von dem Zwischenbereich entfernt und zurück in die Lade-/Entnahmevertiefung 10 transportiert, indem die Probennukleinsäure einer zweiten Elektrophorese unter dem Einfluss eines zweiten elektrischen DC-Feldes mit einer Stärke E2 für eine Dauer t2 ausgesetzt wird, wobei t2 « t1 (siehe 2D). Die Dauer t2 muss signifikant geringer sein als die Dauer t1, was folgende zwei Gründe hat. Erstens, wenn t2 zu lange dauert, wird die gewünschte Nukleinsäure aus dem Zwischenbereich über die Lade-/Entnahmevertiefung und in die gegenüberliegende Wand der Lade-/Entnahmevertiefung transportiert, und macht dadurch die gewünschte Nukleinsäure für eine nachfolgende Gewinnung unverfügbar. Zweitens, wenn t2 zu lange dauert, werden die Kontaminanten zurück in die Lade-/Entnahmevertiefung transportiert, wobei dadurch die gewünschte Nukleinsäure erneut kontaminiert wird. Zum Beispiel beträgt t1 typischerweise 15 bis 30 Minuten, während t2 ungefähr 30 Sekunden beträgt.
  • In einer Variante der zweiten alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Trap-Modus wird ein Teil oder die gesamte erste und/oder zweite Elektrophorese unter Verwendung eines LITAC-Feldes anstelle eines DC-Feldes durchgeführt. Bei Verwendung eines LITAC-Feldes zum Transportieren der gewünschten Nukleinsäure zurück in die Lade-/Entnahmevertiefung liefert mehrere Vorteile, einschließlich den folgenden: (1) die beweglichen Kontaminanten können nicht in die Lade-/Entnahmevertiefung unter dem Einfluss des LITAC-Feldes zurückkehren und (2) die gewünschte Nukleinsäure kann nicht aus der Lade-/Entnahmevertiefung herauswandern, wenn sie zu der Vertiefung zurückgekehrt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei der ersten Elektrophorese ausschließlich ein DC-Feld eingesetzt und in der Rückwärts-Elektrophorese werden sowohl DC- als auch LITAC-Felder eingesetzt.
  • LITAC-Rückwärtsfeld-Modus. Ein drittes Einzelvertiefungsverfahren, das hier als "LITAC-Rückwärtsfeld-Modus" bezeichnet wird, ist schematisch in den 3A–C dargestellt. In diesem Modus wird die Probennukleinsäure einer ersten Elektro phorese unter dem Einfluss eines ersten elektrischen DC-Feldes mit einer Stärke E1 für eine Dauer t1 ausgesetzt. Diese erste Elektrophorese reicht aus, um die gewünschte Nukleinsäure 30 und die beweglichen Kontaminanten 5 aus einer Lade-/Entnahmevertiefung 10 und in eine Elektrophorese-Matrix 15 zu transportieren (siehe 3A–B). Wenn die gewünschte Nukleinsäure und die Kontaminanten in die Elektrophorese-Matrix transportiert worden sind, wird die Probennukleinsäure unter dem Einfluss eines elektrischen LITAC-Feldes einer zweiten Elektrophorese ausgesetzt, das ausreicht, um die gewünschte Nukleinsäure 30 zurück in die Lade-/Entnahmevertiefung 10 zu transportieren und die Kontaminanten in der Matrix zu immobilisieren (siehe 3B und C).
  • C. MULTIVERTIEFUNGSVERFAHREN
  • Multivertiefungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind durch eine Ladevertiefung und eine Entnahmevertiefung charakterisiert, die räumlich voneinander getrennt sind, d.h. die Nukleinsäureprobe wird in eine andere Vertiefung geladen, von der die gereinigte Nukleinsäure isoliert wird. Multivertiefungsverfahren haben den Vorteil, dass die gewünschte Nukleinsäure von nicht-beweglichen Kontaminanten getrennt werden kann, d.h. neutralen Kontaminanten oder großen Aggregaten. Jedoch leiden Multivertiefungsverfahren an mehreren Nachteilen, einschließlich dem folgenden: (1) eine große genomische Nukleinsäure, die nicht in das Elektrophorese-Medium eintritt, kann nicht gewonnen werden, (2) die elektrophoretische Laufbahn der gewünschten Nukleinsäure muss vorsichtig kontrolliert werden, so dass die gereinigte Nukleinsäure in eine Entnahmevertiefung aufgefangen wird, und (3) es können weniger Proben in einem gegebenen Gebiet eines Elektrophorese-Mediums verarbeitet werden, da mehrere Vertiefungen pro Probe benötigt werden.
  • Einzelrichtungsmultivertiefungsmodus. Ein erstes Multivertiefungsverfahren, das hier als "Einzelrichtungsmultivertiefungsmodus" bezeichnet wird, ist schematisch in den 4A–D gezeigt. In dieser Ausführungsform wird die Probennukleinsäure einer ersten Elektrophorese unter dem Einfluss eines ersten elektrischen DC-Feldes mit einer Stärke E1 für eine Dauer t1 ausgesetzt. Diese erste Elektrophorese reicht aus, um die gewünschte Nukleinsäure 30 und die beweglichen Kontaminanten 5 aus der Ladevertiefung 11 und über eine Elektrophorese-Matrix 15 herauszutransportieren (siehe 4A–C). Die Dauer der ersten Elektrophorese wird so ausgewählt, dass sie ausreicht, um die Kontaminanten über die Entnahmevertiefung 12 an eine Stelle hinter der Entnahmevertiefung 12 zu transportieren und die gewünschte Nukleinsäure im oder in der Nähe der Entnahmevertiefung 12 zu transportieren (4C–D). Das Platzieren der gewünschten Nukleinsäure in die Entnahmevertiefung kann unter Verwendung eines von zwei Verfahren bewirkt werden. In einem ersten Verfahren wird die gewünschte Nukleinsäure in die Entnahmevertiefung eingeführt, indem die Migrationgeschwindigkeit der gewünschten Nukleinsäure und die Entfernung zwischen den Lade- und Entnahmevertiefungen bekannt sind, und die Migrationzeit so angepasst wird, dass die gewünschte Nukleinsäure nach der ersten Elektrophorese in die Entnahmevertiefung gelangt. Dieses "Zeit-basierende" Verfahren ist weniger bevorzugt, da es ein vorheriges Wissen über die Migrationseigenschaften der gewünschten Nukleinsäure unter den jeweiligen experimentellen Bedingungen erfordert. In einem bevorzugteren Verfahren zur Gewinnung der gewünschten Nukleinsäure aus einer Entnahmevertiefung wird ein LITAC-Feld verwendet, wenn die Kontaminanten über die Entnahmevertiefung geleitet worden sind, um die gewünschte Nukleinsäure von einer Stelle zwischen der Lade- und Entnahmevertiefungen in die Entnahmevertiefung zu transportieren. Indem ein LITAC-Feld während dieses Schrittes verwendet wird, wird die gewünschte Nukleinsäure in die Entnahmevertiefung transportiert und verbleibt dort auf unbestimmte Zeit.
  • Multirichtungsmultivertiefungsmodus. Ein zweites Multivertiefungsverfahren, das hier als der "Multirichtungsmultivertiefungsmodus" bezeichnet wird, ist schematisch in den 5A–D gezeigt. In bestimmten Situationen ist der Multirichtungsmultivertiefungsmodus mehr bevorzugt als der Einzelrichtungsmultivertiefungsmodus, da in dem ersteren Modus die beweglichen Kontaminanten nicht über die Entnahmevertiefungen geleitet werden. In dieser Ausführungsform wird die Nukleinsäureprobe einer ersten Elektrophorese unter dem Einfluss eines ersten elektrischen DC-Feldes bei einer Stärke E1 für eine Dauer t1 ausgesetzt. Diese erste Elektrophorese reicht aus, um die gewünschte Nukleinsäure 30 zu transportieren, und einen wesentlichen Teil der beweglichen Kontaminanten 5 aus einer Ladevertiefung 11 und durch eine Elektrophorese-Matrix 15 zu transportieren. Die gewünschte Nukleinsäure wird an einen Zwischenort transportiert, der mit einer Entnahmevertiefung 12 ausgerichtet ist. Als nächstes wird die Nukleinsäureprobe einer zweiten Elektrophorese ausgesetzt, die ausreicht, um die gewünschte Nukleinsäure in oder in der Nähe der Entnahmevertiefung 12 zu transportieren. Die gewünschte Nukleinsäure gelangt dann in die Entnahmevertiefung, indem entweder das Zeitverfahren oder ein LITAC-Feld, wie oben beschrieben, verwendet wird.
  • III. BEISPIELE
  • Die Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erklärt, die für die Erfindung lediglich exemplarisch sind und diese nicht auf irgendeine Weise in ihrem Umfang beschränken sollen.
  • BEISPIEL 1
  • Aufreinigung von λDNA durch eine präparative Kontaminantenverdünnungs-Elektrophorese
  • Nukleinsäureprobe
  • Die Nukleinsäure, die aufgereinigt werden soll, besteht aus unverdauter λDNA (48,5 kb) und DNA-Fragmenten, die nach Verdau der λDNA mit dem HindIII-Restriktionsenzym erhalten wurden, d.h. Fragmente mit einer Länge von 0,6, 2,0, 2,3, 4,4, 6,6, 9,4 und 32,1 kb. Die Nukleinsäureprobe, die einer Elektrophorese ausgesetzt wurde (Gesamtvolumen von 40 μl), wurde präpariert, indem 20 μl (1,66 μg) der HindIII-verdauten λDNA, 10 μl (0,42 μg) unverdauter λDNA und 11 μl Wasser vermischt wurden.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die Elektrophorese wurde in einer horizontalen Orientierung durchgeführt. Die verwendete Elektrophorese-Matrix bestand aus einem 0,8% Agarose-Gel, das mit einem Molekularbiologie-Grad-Agarose, wie sie von Promega verkauft wird, hergestellt wurde. Das Gel war 3,0 cm lang und 11,7 cm breit. Jedes war ungefähr 1 cm von dem oberen Rand des Gels gelegen, wobei dadurch 2,0 cm des Gels in der Elektrophorese-Richtung gewonnen werden. Die Vertiefungen waren ungefähr 2,5 mm voneinander entfernt. Sowohl der Gel- als auch Kammerpuffer waren 0,2 X TAE, wobei 1 X TAE 0,04 M Tris, 0,04 M Essigsäure und 0,002 M EDTA ist. Die Vertiefungen besaßen eine Tiefe von 5 mm, eine Breite von 1 mm und eine Länge von 3,8 mm.
  • Die Elektrophorese wurde in einer H5-Gelelektrophorese-Kammer mit einer Breite 27,2 × 12 cm (Gibco BRL, Life Technologies) durchgeführt. Sowohl die elektrischen Vorwärts- als auch Rückwärtsfelder hatten eine Stärke von 10,6 V/cm. Das elektrische Feld über das Gel und die Temperatur des Kammerpuffers wurden mit Hilfe eines Multimeters von dem Modell 2706 (BK Precision, Chicago, IL) kontrolliert. 864 ml Puffer wurden zu der Kammer zugegeben, in einer Menge, die ausreicht, um das Gel mit einer Pufferschicht von 5 mm zu überdecken.
  • Elektrophorese-Protokoll
  • Die oben präparierte Nukleinsäureprobe wurde in eine Lade-/Entnahmevertiefung geladen und es wurde eine Vorwärts-Elektrophorese für einen Zeitraum von 28 Minuten durchgeführt. Das elektrische Feld wurde dann abgeschalten und es wurde eine Probe mit 120 μl von der Lade-/Entnahmevertiefung entnommen (Probenzeit von 0 Minuten Rückwärtsfeld). Als nächstes wurde das elektrische Feld umgedreht und es wurden Proben mit 120 μl von der Lade-/Entnahmevertiefung jeweils eine Minute danach (ohne das elektrische Feld auszuschalten) für die nächsten 27 Minuten gesammelt, was zu einer Sammlung von insgesamt 28 Proben führte. Die Tatsache, dass Proben mit 120 μl von einer Vertiefung gesammelt wurden, die anfangs lediglich 40 μl Probe enthielten, war auf die Tatsache zurückzuführen, dass das Gel mit 5 mm Puffer überlagert war und dass eine größere Menge Flüssigkeit von der Vertiefung hätte eingesammelt werden müssen, um sicherzustellen, dass die meiste DNA in der Vertiefung bei einer gegebenen Zeit eingesammelt worden ist. 20 μl der jeweils 27 gesammelten Proben (entsprechend den Proben, die 1 bis 27 Minuten der reversen Elektrophorese gesammelt wurden) wurden dann einer analytischen Elektrophorese ausgesetzt, um die Menge und Größe der gereinigten Nukleinsäure zu bestimmen.
  • Die analytische Elektrophorese zeigte, dass die Probe bei t = 0 eine relativ große Menge unverdauter 48,5 kb DNA enthielt (geschätzte Konzentration von ungefähr 9 μg/ml), während die Probe, die bei t = 1 Minute gesammelt wurde, ungefähr 5mal mehr des 48,5 kb DNA-Fragments enthielt. Im Gegensatz dazu enthielt die Probe, die nach 20 Minuten eingesammelt wurde, ungefähr 50% weniger des 48,5 kb-Fragments als die Probe, die nach einer Minute gesammelt wurde. Die Proben, die zu den Zeitpunkten 2 bis 18 Minuten gesammelt wurden, enthielten jeweils kleine aber steigende Mengen des 48,5 kb DNA-Fragments. Die Probe, die nach 19 Minuten gesammelt wurde, enthielt auch eine kleine Menge des 23,1 kb DNA-Fragments sowie kleinere Mengen der 9,4, 6,6 und 4,4 kb DNA-Fragmente. Die Menge dieser vier kleineren DNA-Fragmente erhöhte sich progressiv bei einer Probe, die nach 19 Minuten entnommen wurde, bis zu der Probe, die nach 24 Minuten entnommen wurde, und war am höchsten in der Probe, die nach 24 Minuten entnommen wurde, war leicht vermindert in der Probe, die nach 25 Minuten entnommen wurde, war weiter vermindert in der Probe, die nach 26 Minuten entnommen wurde und war praktisch nicht-detektierbar in der Probe, die nach 27 Minuten entnommen wurde. Basierend auf einer visuellen Untersuchung des Gels (d.h. durch Vergleichen der relativen Intensität der Probe, die nach 24 Minuten entnommen wurde mit dem λDNA-Standard, der auf diesem Gel geladen war), wurde geschätzt, dass die Probe, die nach 24 Minuten entnommen wurde, ungefähr 25% der DNA enthielt, die anfangs auf das Gel geladen wurde.
  • Basierend auf den oben genannten experimentellen Entdeckungen, können mehrere Beobachtungen gemacht werden. Die Tatsache, dass das 48,5 kb-Fragment in der t = 0-Probe festgestellt wurde, ist ein Hinweis, das einige der 48,5 kb-DNA-Fragmente nicht in das Gel eingetreten sind, selbst nach 28 Minuten Vorwärts-Elektrophorese. Die Tatsache, dass eine größere Menge des 48,5 kb-Fragmentes in der Probe festgestellt wurde, die nach einer Minute Rückwärts-Elektrophorese gesammelt wurde, zeigt, dass eine relativ große Fraktion des 48,5 kb-DNA-Fragments kaum in das Gel nach 28 Minuten Vorwärts-Elektrophorese eingetreten ist, während eine Rückwärts-Elektrophorese von einer Minute ausreichte, um die DNA in die Lade/Entnahmevertiefung zurückzutransportieren. Die Tatsache, dass eine kleine (und ansteigende) Menge des 48,5 kb-Fragmentes in den Proben festgestellt wurde, die nach 2 bis 18 Minuten Rückwärts-Elektrophorese entnommen wurde, ist ein Hinweis, dass DNA in das Gel mit verschiedenen Mengen eingetreten ist. Die Tatsache, dass DNA-Fragmente, die kleiner als 4,4 kb waren, festgestellt wurden (d.h. 2,2- und 2,0 kb-Fragmente), ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass sie aus dem Gel in das Probenverdünnungsvolumen eluiert wurden, d.h. in das Puffergefüllte Elektrodenreservoir. Die Tatsache, dass die DNA-Fragmente eine unterschiedliche elektrophoretische Mobilität in den Vorwärts- und Rückwärts-Richtungen besaßen, d.h. Fragmente, die für 28 Minuten nach vorne migrierten, weniger als 28 Minuten brauchten, um in die ursprüngliche Vertiefung zurückzukehren, weist darauf hin, dass die Temperatur des Gels während der Elektrophorese erhöht war (Joule-Effekt).
  • BEISPIEL 2
  • Aufreinigung von λDNA durch eine präparative Multirichtungsmultivertiefungs-Elektrophorese
  • Nukleinsäurenrobe
  • Die Nukleinsäureprobe war dieselbe wie in Beispiel 1 oben beschrieben.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die Elektrophorese wurde in einer horizontalen Richtung durchgeführt. Die verwendete Elektrophorese-Matrix bestand aus einem 0,8% Agarose-Gel, das mit einer Molekularbiologie-Grad-Agarose hergestellt wurde, die von Promega verkauft wurde. Das Gel hatte eine Länge von 3,5 cm und eine Breite von 11,7 cm und wurde von einem 11,7 × 11,7 cm-Schlitten getragen. Um eine Elektrophorese in mehrere Richtungen zu ermöglichen, besaß der Schlitten keine Seitenglieder. Stattdessen umfasste der Gelschlitten einen Elektrodenstift an jeder der vier Ecken. Um ein Verkleben der Elektrophorese-Stifte durch das Agarose-Gel zu vermeiden, wurde ein Isolierband um diese vier Stifte während der Herstellung des Gels gewickelt und das Klebeband wurde vor der Elektrophorese entfernt. Die Ladevertiefung hatte eine rechteckige Form, eine Tiefe von 2 mm und eine Breite von 4 mm und war ungefähr 1 cm von dem oberen Rand des Gels entfernt. Die Entnahmevertiefung hatte auch eine rechtwinklige Form und hatte eine Dicke von 5,3 mm und eine Breite von 3 mm. Die Entnahmevertiefung war 6 mm vor der Startvertiefung und 2,3 mm links neben der Startvertiefung lokalisiert (wenn man auf das Gel mit den Vertiefungen von oben schaut). Sowohl der Gel- als auch der Kammerpuffer waren 0,2 X TAE.
  • Die Elektrophorese wurde in einer 27,2 × 12 cm H5-Gelelektrophorese-Kammer durchgeführt (Gibco BRL, Life Technologies). Sowohl die elektrischen Vorwärts- als auch die elektrischen Umkehrfelder hatten eine Stärke von 11,5 V/cm. Das elektrische Feld über das Gel und die Temperatur des Kammerpuffers wurden unter Verwendung eines Multimeters des Modells 2706 kontrolliert (BK Precision, Chicago, IL). 870 ml Puffer wurden zu der Kammer zugegeben, eine Menge, die ausreicht, um das Gel mit einer Schicht von 5 mm Puffer zu überlagern.
  • Elektrophorese-Protokoll
  • Die Nukleinsäureprobe wurde in die Ladevertiefung geladen und es wurde eine Vorwärts-Elektrophorese für 16 Minuten durchgeführt. Das elektrische Feld wurde dann ausgeschalten und das Gel wurde manuell um 90° gewendet, und dann wurde das elektrische Umkehrfeld angeschalten. 100 μl-Proben wurden einmal jede Minute aus der Entnahmevertiefung ab einem Zeitpunkt von 3 Minuten nach Beginn des elektrischen Umkehrfeldes bis zu einem Zeitpunkt von 10 Minuten nach Beginn des elektrischen Umkehrfeldes gesammelt (ohne das elektrische Feld abzuschalten). Es wurden insgesamt 8 Proben gesammelt. 20 μl von jeder der acht gesammelten Proben (entsprechend den Proben, die 3 bis 10 Minuten nach der Einleitung der Umkehr-Elektrophorese gesammelt wurden) wurde dann einer analytischen Elek trophorese unterzogen, um die Menge und Größe der gewonnenen DNA zu bestimmen.
  • Die analytische Elektrophorese zeigte, dass Proben, die zu den Zeitpunkten 3, 4 und 5 Minuten nach dem Start der Umkehr-Elektrophorese entnommen wurden, Teile der detektierbaren DNA enthielt. Die Probe, die nach 6 Minuten gesammelt wurde, enthielt einige der 48,5, 23,1, 9,4, 6,6 und 4,4 kb DNA-Fragmente. Die Probe, die nach 7 Minuten gesammelt wurde, enthielt etwas mehr von denselben fünf DNA-Fragmenten als die Probe, die nach 6 Minuten gesammelt wurde, während die Proben, die nach 8, 9 und 10 Minuten entnommen wurden, progressiv abfallende Mengen dieser 5 DNA-Fragmente enthielten. Basierend auf der visuellen Untersuchung des analytischen Gels (d.h. durch Vergleichen der relativen Intensität der Probe, die nach 7 Minuten entnommen wurde, mit einem internen λDNA-Standard) wurde geschätzt, dass die Probe, die nach 7 Minuten entnommen wurde, ungefähr 10 % der DNA enthielt, die anfangs auf das präparative Gel geladen wurde.
  • Basierend auf den oben genannten experimentellen Entdeckungen wurden mehrere Beobachtungen gemacht. Die Tatsache, dass mehr DNA in der Probe vorhanden war, die nach 7 Minuten entnommen wurde, als in den Proben, die entweder vor oder nach dieser Zeit entnommen wurden, zeigt, dass vor dem Zeitpunkt von 7 Minuten die DNA-Moleküle noch nicht die Entnahmevertiefung erreicht haben und dass nach 7 Minuten die DNA, die in der Entnahmevertiefung war, anfing, die Vertiefung zu verlassen. Die Tatsache, dass DNA-Fragmente, die kleiner als 4,4 kb waren (d.h. die 2,2 und 2,0 kb-Fragmente), nicht nachgewiesen wurden, deutet darauf hin, dass sie verloren gingen, da sie über den Punkt hinaus wanderten, bei dem die Umkehr-Elektrophorese das Material in die Entnahmevertiefung transportieren würde, d.h. die Entnahmevertiefung lag während der Umkehr-Elektrophorese nicht in der Laufbahn der kleineren Fragmente.
  • BEISPIEL 3
  • Aufreinigung von genomischer DNA aus Blut durch eine präparative Einzelrichtungsmultivertiefungs-Elektrophorese
  • Nukleinsäureprobe
  • Um die Blutprobe zur Aufreinigung zu präparieren, wurde die Blutprobe mit einem Lyse-Puffer vermischt und dann wurde das Blut-/Lyse-Puffergemisch bei einer erhöhten Temperatur inkubiert. Das Blut-/Lyse-Puffergemisch wurde gebildet, indem 10 μl frisches Blut, d.h. eines, das weniger als ein Monat alt war, mit 30 μl Lyse-Puffer und 3,6 μl Proteinase K (20 mg/ml) vermischt wurden, worin 1,4 ml Lyse-Puffer aus 1 ml 110 mM Tris-HCl (pH 8,3), 250 mM NaCl, 19 mM Sarkosyl-Detergenz, 0,05 % NonidetTM P-40 und 0,4 ml 2-Pyrrolidinon bestand. Das Blut-/Lyse-Puffergemisch wurde dann bei 65°C für 35 Minuten in 0,5 ml-Gefäßen inkubiert.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die Elektrophorese-Matrix bestand aus einem 0,8 % Agarose-Gel und wurde wie oben beschrieben hergestellt. Das Gel war 2,2 × 11,7 cm. Die Ladevertiefungen waren 1 mm dick und 5 mm breit. Die Entnahmevertiefungen waren 5 mm von den Ladevertiefungen entfernt. Sowohl der Gel- als auch Kammerpuffer waren 0,2 X TAE.
  • Die Elektrophorese wurde in einer 27,2 × 12 cm H5-Gel-Elektrophoresekammer (Gibco BRL, Life Technologies) durchgeführt und das elektrische Vorwärtsfeld hatte eine Stärke von 10,6 V/cm. Das elektrische Feld über das Gel und die Temperatur des Gel-Kammer-Puffers wurde unter Verwendung eines Multimeters des Modells 2706 gemessen (BK Precision, Chicago, IL). 870 ml des Puffers wurden zu der Kammer zugegeben, eine Menge, die ausreichte, um das Gel mit einer 5 mm Pufferschicht zu überlagern.
  • Elektrophorese-Protokoll
  • Drei Nukleinsäureproben (jeweils 20 μl lysiertes und verdautes Blut) wurden in eine erste Gruppe von drei benachbarten Ladevertiefungen geladen. Es wurde eine Vorwärts-Elektrophorese (bei 10,6 V/cm) für eine Minute durchgeführt, nach dieser Zeit wurde das elektrische Feld unterbrochen und es wurde eine zweite Gruppe von drei DNA-Proben in einer zweiten Gruppe von drei benachbarten Ladevertiefungen geladen. Weitere drei Gruppen mit drei DNA-Proben wurden jeweils in drei weitere Gruppen von drei Ladevertiefungen auf dieselbe Weise geladen, so dass insgesamt 15 DNA-Proben erhalten wurden, die in Intervallen von einer Minute geladen wurden. Es wurde eine Elektrophorese (bei 10,6 V/cm) für 16 Minuten nach dem Beladen der letzten Probengruppe durchgeführt. Diese fünf Gruppen von drei Proben entsprachen daher jeweils den Proben, die für 20, 19, 18, 17 bzw. 16 Minuten migriert sind.
  • Nach der anfänglichen Vorwärts-Elektrophorese wurde das Gel mit EtBr gefärbt und visuell untersucht. Diese Untersuchung ergab, dass die meiste DNA, die in den Proben vorlag, die für 16, 17 und 18 Minuten migriert sind, nicht deren entsprechenden Entnahmevertiefungen erreicht hatten und dass die DNA, die in den Proben vorhanden waren, die für 19 Minuten migriert sind, nicht deren entsprechende Entnahmevertiefungen erreicht haben und dass die DNA, die in den Proben vorlagen, die für 20 Minuten migriert sind, durch deren entsprechende Entnahmevertiefungen für 20 Minuten durchgewandert sind.
  • Basierend auf den oben beschriebenen experimentellen Befunden können mehrere Feststellungen gemacht werden. Erstens gibt es eine optimale Migrationzeit, die vorsichtig kontrolliert werden muss, damit dieses Verfahren erfolgreich ist, d.h. die DNA wird nicht die Entnahmevertiefung erreichen, wenn die Elektrophorese-Dauer zu kurz ist und die DNA wird an der Entnahmevertiefung vorbei migrieren, wenn die Elektrophorese-Dauer zu lang ist. Zweitens ist die Ausbeute von gewonnener gereinigter Nukleinsäure sehr gering (ungefähr 15 %). Da selbst bei der optimalen Dauer, z.B. 19 Minuten in diesem Beispiel, ein Großteil der DNA noch in dem Gel zwischen der Lade- und Entnahmevertiefungen lokalisiert ist. Ein weiterer Faktor, der für die niedrige Ausbeute verantwortlich ist, ist, dass ein großer Anteil (vermutlich bis zu 50%) der DNA, die in der Ladevertiefung geladen ist, niemals die Ladevertiefung verlassen wird. Dies ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass diese unbewegliche DNA zu groß ist, um in das Gel einzutreten. Ein noch weiterer Faktor, der für die geringe Ausbeute verantwortlich ist, ist, dass der Spiegel des Puffers in der Gel-Elektrophorese-Kammer nicht niedriger wurde, so dass der Puffer nicht länger das Gel überlagerte.
  • BEISPIEL 4
  • Aufreinigung von genomischer DNA aus Blut durch eine präparative Einzelrichtungsmultivertiefungs-Elektrophorese unter Verwendung eines elektrischen LITAC-Feldes
  • Nukleinsäureprobe
  • Die Nukleinsäureprobe wurde, wie in Beispiel 3 oben beschrieben, präpariert.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die Elektrophorese-Matrix, die Geometrie der Vertiefung und die Lokalisation sowie der Gel-Box-Apparat waren so wie in Beispiel 3 oben beschrieben. Das Profil des elektrischen LITAC-Feldes wird unmittelbar unten beschrieben.
  • Elektrophorese-Protokoll
  • Sechzehn Nukleinsäureproben (20 μl lysiertes und verdautes Blut, das jeweils 80 ng humaner genomischer DNA enthielt) wurden in benachbarte Vertiefungen geladen. Es wurde eine DC-Vorwärts-Elektrophorese bei 13,2 V/cm für einen Zeitraum von 17 Minuten durchgeführt, nach der Zeit das elektrische Vorwärtsfeld sich von einem DC-Feld in ein LITAC-Feld umwandelte. Das LITAC-Profil umfasste einen Vorwärtsteil mit einer Dauer von 40 Sekunden und eine Feldstärke von –6,9 V/cm und einen Rückwärtsteil mit einer Dauer von 20 Sekunden und einer Feldstärke von 13,8 V/cm. Dieses LITAC-Regime wurde für eine Gesamtzeit von 150 Minuten angewendet. 100 μl gereinigter Nukleinsäureproben wurden von jeder der Entnahmevertiefungen bei 10 Minuten-Intervallen nach der Einleitung der LITAC-Elektrophorese gesammelt.
  • Die sechzehn gereinigten 100 μl Nukleinsäureproben wurden lyophilisiert und in 21 μl Wasser resuspendiert. Die Proben, die den LITAC-Zeiten von 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120 und 140 Minuten entsprachen, wurden einer analytischen Elektrophorese ausgesetzt, um die Menge und Größe der gewonnenen gereinigten Nukleinsäure zu bestimmen. Diese analytische Elektrophorese zeigte, dass Proben, die bei LITAC-Zeiten von 0 und 20 Minuten entnommen wurden, nicht genug humaner genomischer DNA enthielten, die auf einem EtBr-gefärbten Gel sichtbar sind, und dass die Probe, die bei einer LITAC-Zeit von 40 Minuten entnommen wurde, eine kaum sichtbare Menge (ungefähr 1 ng) humaner genomischer DNA enthielt und dass Proben, die bei LITAC-Zeiten von 60, 80, 100, 120 und 140 Meter entnommen wurden, jeweils ungefähr 20 ng humaner genomischer DNA enthielten. Alle gereinigten DNA-Moleküle waren größer als 48,5 kb.
  • Die LITAC-Impulse, die hier verwendet wurden, stellen eine signifikante Verbesserung gegenüber dem in Experiment 3 oben beschriebenen Verfahren dar, da DNA, die die Entnahmevertiefung erreicht, in der Entnahmevertiefung gehalten wird und nicht durch die Vertiefung hindurchwandert. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Proben, die bei den LITAC-Zeiten von 60, 80, 100, 120 und 140 Minuten entnommen wurden, alle ungefähr dieselbe Menge DNA enthielten. Die Ausbeute von gereinigter Nukleinsäure ist immer noch relativ gering, d.h. ungefähr 25% in diesem Beispiel, da ein größerer Anteil (vermutlich bis zu 50 %) der DNA, die in der Ladevertiefung geladen ist, niemals diese Vertiefung verlassen wird. Dies ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass diese DNA zu groß ist, um in das Gel einzutreten.
  • BEISPIEL 5
  • Aufreinigung von genomischer DNA aus Blut durch eine präparative Trapping-Elektrophorese unter Verwendung eines elektrischen LITAC-Rückwärtsfeldes
  • Nukleinsäureprobe
  • Die Nukleinsäureprobe wurde im Wesentlichen, wie oben in Beispiel 3 beschrieben, präpariert, außer dass 10 μl frisches Blut mit 60 μl Lyse-Puffer anstelle von 30 μl Lyse-Puffer vermischt wurden und der Lyse-Puffer 125 mM NaCl enthielt anstelle von 250 mM NaCl.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die Elektrophorese-Matrix bestand aus einem 2,0 % Agarose-Gel und wurde mit einer Molekularbiologie-Grad-Agarose von Promega hergestellt. Das Gel war 2,2 × 11,7 cm und umfasste eine einzelne Gruppe von Lade-/Entnahmevertiefungen, die in der Mitte des Gels lokalisiert waren. Die Vertiefungen waren 1 mm dick und 5 mm breit. Das Gel, das sich um die Vertiefungen aufgrund der Kapillarwirkung zwischen dem Vertiefungs-ausbildenden Kamm und der flüssigen Agarose hervortrat, wurde unter Verwendung einer Rasierklinge entfernt, um ein Gel mit einer einheitlich flachen Oberfläche zu erzeugen. Sowohl der Gel- als auch der Kammerpuffer waren 0,2 X TAE.
  • Die Elektrophorese wurde in einer 27,2 cm langen und 12 cm breiten H5-Gel-Elektrophorese-Kammer durchgeführt (Gibco BRL, Life Technologies). Das elektrische Feld über das Gel und die Temperatur des Gel-Kammerpuffers wurden mittels eines Multimeters des Modells 2706 gemessen (BK Precision, Chicago, IL). 870 ml Puffer wurden zu der Elektrophorese-Kammer zugegeben. Diese Puffermenge reichte aus, um das Gel mit einer 5 mm dicken Pufferschicht zu überlagern.
  • Elektrophorese-Protokoll
  • Neun Nukleinsäureproben (22 μl lysiertes und verdautes Blut, das jeweils ungefähr 80 ng humane genomische DNA enthielt) wurden in benachbarte Vertiefungen geladen. Es wurde ein DC-Vorwärts-Elektrophorese (bei 10,5 V/cm) für 18 Minuten durchgeführt. Ein DC-Rückwärtsfeld von 10,5 V/cm wurde dann für 30 Sekunden angelegt. Zwei 22 μl-Proben wurden dann von zwei der drei Vertiefungen gesammelt (Proben #1 und #2). Als nächstes wurde zur Verbesserung der Ausbeute von DNA aus dem Gel, LITAC-Pulse von 15 Sekunden bei –10,5 V/cm und 30 Sekunden bei 5,0 V/cm für 12 Minuten gegeben. Sieben 22 μl-Proben wurden dann von den anderen sieben Vertiefungen gesammelt (Proben #3 bis #9).
  • Die Proben #1, 2, 3 und 9 wurden einer analytischen Elektrophorese ausgesetzt, um die Menge und Größe der gereinigten Nukleinsäure zu bestimmen. Dieses analytische Gel zeigte, dass die zwei Proben, die bei den LITAC-Zeiten von 0 Minuten entnommen wurden (Proben #1 und #2), lediglich ungefähr die Hälfte der DNA enthielten, die in den Proben enthalten war, die nach 12 Minuten LITAC-Pulse (Proben #3 und #9) gesammelt wurden. Eine visuelle Untersuchung der EtBr-DNA-Banden, die den Proben #3 und #9 entsprachen (relativ zu bekannten Mengen λ-Phagen-DNA) zeigte, das ungefähr 50 ng DNA in diesen zwei Proben gewonnen wurden. Dies stellt eine Ausbeute von ungefähr 55 % der anfangs geladenen humanen genomischen DNA dar. Alle gereinigten DNA-Moleküle waren größer als 48,5 kb.
  • Um die Qualität der gereinigten Nukleinsäure zu bestimmen, wurden PCR-Amplifikationen unter Verwendung der gereinigten Nukleinsäure als Template durchgeführt. Es wurden Standard-PCR-Bedingungen verwendet, um die PCRs durchzuführen. Es wurden starke PCR-Amplifikationsprodukte (ein DNA-Fragment von ungefähr 400 bp) festgestellt, unabhängig davon, ob wir unverdünnte gereinigte Nukleinsäure verwendeten oder ob wir die gereinigte Nukleinsäure 1-, 2-, 3-, 4- oder 5-fach verdünnten. Dies zeigt, dass die DNA, die mit Hilfe unseres Verfahrens gereinigt wurde, so gut wie keine Kontaminanten enthielt (da eine Verdünnung nicht notwendig war, damit die PCR-Amplifikation funktionierte) und dass die gereinigte Nukleinsäure relativ konzentriert war (da ein starkes Signal selbst dann erhalten wurde, wenn die gereinigte Nukleinsäure verdünnt war).
  • Die relativ hohe Ausbeute, die hier erreicht wurde (nahe 50 %), kann durch die Tatsache erklärt werden, dass dieses Verfahren ein Einzelvertiefungsverfahren ist, das die Gewinnung von großen DNA-Molekülen, die niemals in das Gel eintreten, ermöglicht.
  • BEISPIEL 6
  • Aufreinigung von genomischer DNA aus Blut durch eine präparative Trapping-Elektrophorese unter Verwendung eines horizontalen Trocken-Gel-Formats
  • Nukleinsäureprobe
  • Die Nukleinsäureprobe wurde im Wesentlichen so, wie in Beispiel 3 oben beschrieben, präpariert, außer dass der Lyse-Puffer 125 mM anstelle von 250 mM NaCl enthielt.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die Elektrophorese-Matrix bestand aus einem 2,0 % Agarose-Gel und wurde mit SeaKem Gold-Agarose, das von FMC Corporation verkauft wird, hergestellt. Das Gel war 2,0 × 2,0 cm und 0,6 cm dick. Das Gel umfasste eine einzelne Gruppe von drei Vertiefungen, die in der Mitte des Gels lokalisiert waren. Die drei Vertiefungen von diesem Gel waren 1 mm lang, 3,8 mm breit und 5 mm tief. Wie zuvor beschrieben, wurde Gel, das über die Vertiefungen herausragte, unter Verwendung einer Rasierklinge entfernt, um ein Gel mit einer einheitlich flachen Oberfläche zu erzeugen.
  • Anstatt die Elektrophorese-Kammer mit Puffer zu füllen, wurden zwei rechtwinklige Puffer-getränkte Schwämme verwendet, um einen elektrischen Kontakt zwischen den Elektroden und dem Gel zu bewirken. Diese Schwämme wurden auf beiden Seiten des Gels platziert und in direkten Kontakt sowohl mit dem Gel als auch mit den Elektroden gebracht. Die Schwämme waren 5 cm lang, 2 cm breit (d.h. dieselbe Breite wie die Gel-Breite) und 1 cm dick (d.h. 4 mm höher als das Gel). Sie wurden hergestellt, indem kosmetische Schwämme, die von CAROLINE Cosmetics (Montreal, Kanada) verkauft wurden, zerschnitten wurden. Sowohl der Gel- als auch der Schwammpuffer waren 0,2 X TAE (nicht-eingestellter pH von 7,8).
  • Die Elektrophorese wurde in den mittleren Teil einer 27,2 × 12 cm H5-Gel-Elektrophorese-Kammer (Gibco BRL, Life Technologies) durchgeführt. Um die Elektroden relativ zu den Schwämmen und dem Gel sauber zu platzieren, wurden die Elektroden von den Wänden der Elektrophorese-Kammer abgeschraubt und in Kontakt mit den Schwämmen mittels Klemmen gebracht. Das elektrische Feld über das Gel wurde unter Verwendung eines Multimeters von dem Modell 2706 gemessen (BK, Precision, Chicago, IL).
  • Elektrophorese-Protokoll
  • Es wurden drei DNA-Proben (20 μl lysiertes und verdautes Blut, das jeweils 80 ng humane genomische DNA enthielt) in benachbarte Vertiefungen geladen. Es wurde eine DC-Elektrophorese in der Vorwärtsrichtung für 25 Minuten durchgeführt, gefolgt von einer DC-Elektrophorese in den Rückwärtsrichtungen für 40 Sekunden.
  • Es wurde eine Spannung von 95 Volt sowohl in der Vorwärts- als auch Rückwärts-Elektrophorese angelegt. Während der Elektrophorese variierte die tatsächliche Spannung über das Gel, ausgenommen die Spannungsspitzen über den Schwämmen, zwischen 7 und 8 V/cm. 20 μl gereinigte Nukleinsäureproben wurden dann von jeder der drei Vertiefungen gesammelt (Proben #1, #2 und #3).
  • Probe #1 wurde einer analytischen Elektrophorese unterzogen, um die Menge und Größe der gereinigten gewonnenen Nukleinsäure zu bestimmen. Eine visuelle Untersuchung der EtBr-DNA-Bande, die der Probe #1 entsprach (relativ zu den bekannten Mengen λ-Phagen-DNA), deutet darauf hin, dass ungefähr 30 ng DNA in dieser Probe gewonnen wurde. Dies stellt eine Gesamtausbeute von ungefähr 38 % der anfangs geladenen humanen genomischen DNA dar. Diese gereinigten DNA-Moleküle waren größer als 48,5 kb.
  • Es wurden PCR-Tests durchgeführt, um die Qualität der DNA zu bestimmen, die unter Verwendung des oben beschriebenen elektrophoretischen Aufreinigungsverfahrens gereinigt wurde. Es wurden Standard-PCR-Protokolle verwendet, um die PCRs durchzuführen. Es wurden starke Amplifikationsprodukte (ein DNA-Fragment von ungefähr 400 bp) beobachtet, unabhängig davon, ob wir unverdünnte gereinigte DNA von der Probe #2 verwendeten oder ob wir die Probe 1-fach verdünnten.
  • BEISPIEL 7
  • Aufreinigung von genomischer DNA aus Blut durch eine präparative Trapping-Elektrophorese unter Verwendung eines vertikalen Trocken-Gel-Formats Nukleinsäureprobe
  • Die Nukleinsäure wurde wie oben in Beispiel 3 beschrieben präpariert, außer dass die NaCl-Konzentration von 250 mM auf 125 mM erniedrigt wurde, um die Ionenmenge, die in den lysierten Blutproben vorliegt, zu erniedrigen. Es wurde festgestellt, dass eine solche Verringerung der NaCl-Menge die Menge von gewonnener DNA nicht signifikant erniedrigt, aber dazu tendiert, zu konsistenteren Aufreinigungsergebnissen zu führen.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die verwendete Elektrophorese-Matrix bestand aus einem 2% Agarose-Gel und wurde mit SeaKem Gold-Agarose, die von FMC Corporation verkauft wurde, hergestellt. Das zylindrische Gel hatte einen Durchmesser von 3,8 cm und eine Höhe von 8 cm.
  • Das Gel wurde in einem 8 cm hohen transparenten PlexiglasTM-Gefäß mit einem inneren Durchmesser von 3,8 cm und einem externen Durchmesser von 4,5 cm geformt. Das PlexiglasTM-Gefäß wirkte als ein Gel-Schlitten und wurde während der Elektrophorese nicht entfernt. Der "Kamm", der verwendet wurde, um die Lade/Entnahmevertiefungen zu erzeugen, bestand aus zwölf 2,5 cm langen Polypropylenstäben, die an ein flaches Stück Plexiglas geklebt waren, wobei jeder Stab ungefähr einen Durchmesser von 5 mm besaß. Diese zwölf Stäbe wurden mit einem Abstand von 9 mm zwischen dem Zentrum von jedem Stab mit dem folgenden Muster angeordnet:
    Figure 00340001
  • Die Vertiefungen, die mit diesem Kamm gemacht wurden, besaßen einen Durchmesser von 5 mm und eine Tiefe von 1,5 cm und waren voneinander durch ein Gel mit 4 mm getrennt. Der Gel-Puffer war 0,2 X TAE.
  • Die Elektrodenkonfiguration bestand aus zwei Platindrahtgittern an jedem Ende des zylindrischen Gels. Diese Gitter wurden hergestellt, indem Löcher mit einem Durchmesser von 5 mm in Plastikplatten gebohrt wurden (an der selben Stelle wie bei den Vertiefungen in dem Gel) und indem Platindrähte zwischen diesen Löchern durchgezogen wurden. Das elektrische Feld über das Gel wurde unter Verwendung eines Multimeters des Modells 2706 gemessen (BK Precision, Chicago, IL).
  • Elektrophorese-Protokoll
  • 100 μl DNA-Proben wurden in jede der vier zentralen Vertiefungen gegeben. Die Elektrophorese wurde unter Berücksichtigung der drei grundlegenden Vorgaben durchgeführt: 1) eine erste pulsierte Feldeinstellung mit einem Pulsprogramm, das aus 30 Sekunden bei 46 V eines elektrischen Vorwärtsfeldes besteht, gefolgt von 10 Sekunden bei 46 V eines elektrischen Rückwärtsfeldes, das für insgesamt 10 Minuten angewendet wurde; 2) eine zweite pulsierte Feldeinstellung mit einem Pulsprogramm, das aus 30 Sekunden bei 28 V eines elektrischen Vorwärtsfeldes bestand, gefolgt von 10 Sekunden bei 46 V eines elektrischen Rückwärtsfeldes, das für insgesamt 160 Minuten angewendet wurde und 3) eine reverse DC-Einstellung, die ein Umkehrfeld von 46 V umfasst, das für 2 Minuten angewendet wurde. Am Schluss der Elektrophorese wurde das elektrische Feld abgeschalten und es wurde eine 70 μl-Probe von jeder der vier zentralen Vertiefungen entnommen.
  • 10 μl der entnommenen gereinigten Nukleinsäure wurde einer analytischen Elektrophorese ausgesetzt, um deren Menge und Größe zu bestimmen. Die Kontrollen, die in dem elektrischen Gel geladen waren, waren Proben, die 5, 12,5, 25 und 50 ng ungeschnittene λ-Phagen-DNA enthielten (48,5 kb lang). Eine visuelle Untersuchung des analytischen Gels zeigte, dass die gereinigte Nukleinsäure größer als 48,5 kb war und dass unsere Probe ungefähr 0,5 ng/μl humane genomische DNA enthielt.
  • Die relative Reinheit der DNA, die in dieser Probe enthalten war, wurde geschätzt, indem die Intensität der PCR-Banden, die durch Serienverdünnungen von reiner humaner DNA, humaner DNA, die in lysierten und Protein-K-verdauten (aber nicht aufgereinigten) Blutproben vorhanden war, mit unserer gereinigten humanen DNA-Probe visuell verglichen wurde. Diese PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung der D7S-550-Primer (Perkin Ehmer), dem Stockmarks-Puffer (Perkin Elmer) und AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) durchgeführt. Dieses Experiment zeigte, dass die Konzentration von Kontaminanten, die in ungereinigten (aber lysierten und Proteinase K-verdauten humanem Blut-) Proben vorhanden waren, um einen Faktor von mindestens 50 in der gereinigten Nukleinsäure vermindert waren.
  • BEISPIEL 8
  • Präparation und Verwendung einer aus Agarose/Polypropylen bestehenden Elektrophorese-Matrix
  • Nukleinsäureprobe
  • Die Nukleinsäure wurde im Wesentlichen wie oben in Beispiel 3 beschrieben hergestellt, außer dass 60 μl Lyse-Puffer verwendet wurden.
  • Herstellung der Zusammensetzungsmatrix
  • Ein Polypropylenblatt, das 0,0625 Inch dick war und eine Porengröße von 120 Mikrometer aufwies, wurde in einen 11 cm breiten und 2 cm langen Streifen geschnitten. Es wurde eine Reihe von 6 Vertiefungen in der Mitte des Streifens erzeugt. Jede Vertiefung war 5 mm breit, 1,5 mm lang und 5 mm tief. Es gab darum ungefähr 1,5 mm Kunststoffmaterial am Boden der Vertiefungen. Der Abstand von dem Zentrum von einer Vertiefung zu der nächsten betrug 16 mm.
  • Der Plastikstreifen wurde für 5 Minuten in 70% Ethanol getaucht, bevor er verwendet wurde. 100 ml 3% SeaKem Gold-Agarose, die 0,2 X TAE pH 7,9 enthielt, wurde für eine Minute gekocht und für 5 Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt. Sie wurde dann gut vermischt und wiederum für 5 Minuten gekocht. Diese Prozedur wurde dann ein drittes Mal wiederholt und es wurde destilliertes Wasser zugegeben, um das verdampfte Wasser zu ersetzen. Dies stellte sicher, dass die Agarose-Lösung homogen war und gut gelöst war. Der Plastikstreifen, der mit 70% Ethanol getränkt war, wurde in heiße Agarose-Flüssigkeit gegeben, gut geschüttelt und dann in einer Mikrowelle für 3 Minuten gekocht.
  • Die heiße Flüssig-Agarose und der Plastikstreifen wurden dann in einen versiegelten Gel-Schlitten gegeben (14 cm lang, 11,2 cm breit und 2 cm tief) und die Agarose wurde für ungefähr eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, um sich zu verfestigen. Der Plastikstreifen wurde in der Mitte des Gel-Schlittens gegeben, so dass sich jeweils 2,5 cm Agarose auf jeder Seite befanden. Als sich die Agarose verfestigt hatte, wurde das Gel, das den Plastikstreifen enthielt, von dem Schlitten entfernt und dieses Gel wurde in ein Gel-Stück mit 11,2 cm Breite und 7 cm Länge geschnitten (d.h. 2,5 cm Agarose-Gel, 2 cm Plastikstreifen und weitere 2 cm Agarose-Gel). Die Agarose, die in den Vertiefungen vorlag, wurde mit Hilfe einer Nadel entfernt. Es ist auch anzumerken, dass die oberen und unteren Oberflächen des Plastikstreifens mit Hilfe einer 1 mm Agarose-Schicht bedeckt war.
  • Elektrophorese-Apparat und -Bedingungen
  • Die Elektrophorese wurde in einer 27,2 cm langen und 12 cm breiten H5-Gel-Elektrophorese-Kammer durchgeführt (Gibco BRL, Life Technologies). 870 ml 0,2 X TAE-Puffer, pH 7,9, wurden in diese Kammer gegeben. Diese Puffermenge reichte aus, um einen 5 mm dicken Bereich von Puffer zu ergeben, der das Gel, das den Plastikstreifen enthielt, bedeckt.
  • Das elektrische Feld über das gesamte Gel und der Plastikstreifen wurden unter Verwendung eines Multimeters des Modells 2706 gemessen (BK Precision, Chicago, IL). Wenn ein elektrisches Feld von 117 V angelegt wurde, wurde festgestellt, dass das elektrische Feld über das gesamte Gel 6,6 V/cm betrug und dass das elektrische Feld über dem Plastikstreifen 9 V/cm betrug. Dies deutet darauf hin, dass der Widerstand in dem Plastikstreifen (der Agarose enthält) höher war als in den Bereichen mit reiner Agarose auf einer der beiden Seiten davon.
  • Elektrophorese-Protokoll
  • 25 μl 250 mM NaCl-enthaltendes lysiertes Blut wurde in jede der 6 Vertiefungen geladen. Ein DC-Vorwärtsfeld von 9 V/cm über den Plastikstreifen wurde für 60 Minuten angelegt. 28 μl gereinigter DNA-Probe wurde von jeder der ersten drei Vertiefungen gesammelt (Proben 1, 2 und 3). Ein DC-Rückwärtsfeld von –9 V/cm wurde dann für eine Minute angelegt und es wurden drei weitere 28 μl-Proben von den verbleibenden drei Vertiefungen gesammelt (Proben 4, 5 und 6). Das gesamte Gel wurde in EtBr-Lösung gefärbt. Es wurde festgestellt, dass der Fluoreszenzhintergrund des Plastikstreifens höher war als der des Agarose-Gels und dass der Fluoreszenzhintergrund im Inneren der Vertiefungen (die im Inneren des Plastikstreifens waren) höher war als im Korpus des Plastikstreifens.
  • 20 μ der Proben 1 und 4 wurden auf ein 0,4 % SeaKem Gold-Agarose-Gel geladen. Eine visuelle Untersuchung der EtBr-DNA-Banden, die den zwei Proben entsprachen (relativ zu bekannten Mengen λ-DNA) deutete darauf hin, dass ungefähr 25 ng DNA-Banden in jeweils 20 μl der gesammelten Proben gewonnen wurden. Dies stellt eine Ausbeute von ungefähr 35 % der am Anfang geladenen humanen genomischen DNA dar (35 % = ((25 ng/20 μl) X 28 μl)/(25 μl X 4 ng/μl)).
  • Obwohl nur ein paar wenige Ausführungsformen oben im Detail beschrieben wurden, wird der Fachmann auf dem Gebiet der Biochemie erkennen, dass viele Modifikationen bei den bevorzugten Ausführungsformen möglich sind, ohne deren Lehren zu verlassen. Sämtliche Modifikationen sollen in die anhängenden Patentansprüche eingeschlossen sein.

Claims (17)

  1. Verfahren zur Aufreinigung einer Nukleinsäureprobe, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe, die eine gewünschte Nukleinsäure und ein oder mehrere Kontaminanten umfasst; Bereitstellen einer Elektrophorese-Matrix mit einer Ladevertiefung und einer darin ausgebildeten Entnahmevertiefung; Platzieren der Nukleinsäureprobe in die Ladevertiefung; Durchführen einer ersten Elektrophorese, die die Elektrophorese der Nukleinsäureprobe für eine erste Zeitdauer umfasst, die wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure aus der Ladevertiefung und in die Elektrophorese-Matrix zu transportieren; und Durchführen einer zweiten Elektrophorese, die die Elektrophorese der Nukleinsäureprobe für eine zweite Zeitdauer umfasst, die wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure aus der Elektrophorese-Matrix und in die Entnahmevertiefung zu transportieren; wobei die erste und zweite Elektrophorese wirksam sind, um die Konzentration der Kontaminanten relativ zu der Konzentration der gewünschten Nukleinsäure zu verringern, um dadurch eine gereinigte Nukleinsäure hervorzubringen; und Entfernen der gereinigten Probe aus der Entnahmevertiefung; mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäuren nicht durch Modifizieren des Druckes aufgereinigt werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ladevertiefung und die Entnahmevertiefung räumlich überlappende Vertiefungen sind.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ladevertiefung und die Entnahmevertiefung räumlich getrennte Vertiefungen sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Matrix einen Hauptmassenteil und einen Vertiefung-Matrix-Zwischenteil umfasst, wobei die Matrix wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure in dem Vertiefung-Matrix-Zwischenteil während der ersten Elektrophorese derart einzufangen, dass die gewünschte Nukleinsäure wesentlich daran gehindert wird, in den Hauptmassenteil der Matrix einzudringen.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die erste Zeitdauer geringer ist als die zweite Zeitdauer.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die erste Zeitdauer zwischen 15 und 30 Minuten und die zweite Zeitdauer geringer oder gleich 30 Sekunden beträgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei in der zweiten Elektrophorese ein elektrisches LITAC (liquid-trapping-alternating-current)-Feld eingesetzt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste Elektrophorese ausreicht, um einen Teil der Kontaminanten aus der Ladevertiefung über die Elektrophorese-Matrix und in ein Kontaminantenverdünnungsreservoir zu transportieren, wobei das Reservoir ein Puffervolumen enthält, das ausreicht, um die Kontaminanten, die in das Reservoir eindringen, wesentlich zu verdünnen.
  9. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die erste Elektrophorese die Elektrophorese der gewünschten Nukleinsäure in eine erste Richtung und die zweite Elektrophorese die Elektrophorese der gewünschten Nukleinsäure in eine zweite Richtung, die sich von der ersten Richtung unterscheidet, umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 2, 3 oder 9, wobei die erste Elektrophorese ein elektrisches DC-Feld einsetzt und die zweite Elektrophorese ein elektrisches LITAC-Feld einsetzt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das elektrische LITAC-Feld ein elektrisches Vorwärtsfeld mit einer Stärke EF und ein elektrisches Rückwärtsfeld mit einer Stärke ER umfasst, wobei das Verhältnis von EF/ER zwischen 2 und 3 beträgt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das elektrische LITAC-Feld ein elektrisches Vorwärtsfeld mit einer Stärke EF und ein elektrisches Rückwärtsfeld mit einer Stärke ER umfasst, wobei das Verhältnis von EF/ER ungefähr 2,4 beträgt.
  13. Verfahren zur Aufreinigung einer Nukleinsäureprobe, umfassend die Schritte: Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe, die eine gewünschte Nukleinsäure und eine oder mehrere Kontaminanten umfasst; Bereitstellen einer Elektrophorese-Matrix mit einer darin ausgebildeten Lade-/Entnahmevertiefung; wobei die Elektrophorese-Matrix einen Hauptmassenteil und einen Vertiefung-Matrix-Zwischenteil umfasst, wobei die Matrix wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure in dem Vertiefung-Matrix-Zwischenteil derart einzufangen, dass die gewünschte Nukleinsäure daran gehindert ist, in den Hauptmassenteil der Matrix einzudringen; Platzieren der Nukleinsäureprobe in die Lade-/Entnahmevertiefung; Durchführen einer ersten Elektrophorese, die die Elektrophorese der Nukleinsäureprobe für eine erste Zeitdauer umfasst, die wirksam ist, um die gewünschte Nukleinsäure aus der Lade-/Entnahmevertiefung und in den Vertiefung-Matrix-Zwischenteil der Elektrophorese-Matrix zu transportieren; wobei die erste Elektrophorese wirksam ist, um die Konzentration der Kontaminanten relativ zu der Konzentration der gewünschten Nukleinsäure wesentlich zu verringern, um dadurch eine gereinigte Nukleinsäure hervorzubringen; und Entfernen der gereinigten Nukleinsäure aus der Lade-/Entnahmevertiefung, mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäuren nicht durch Modifizieren des Druckes aufgereinigt werden.
  14. Verfahren zur Aufreinigung einer Nukleinsäureprobe nach den Ansprüchen 1 oder 13, weiter umfassend das Aussetzen der Nukleinsäureprobe gegenüber einem elektrischen LITAC-Feld, das ein elektrisches Vorwärtsfeld EF und ein elektrisches Rückwärtsfeld ER umfasst.
  15. Verfahren zur Aufreinigung einer Nukleinsäureprobe nach den Ansprüchen 1 oder 13, weiter umfassend das Aussetzen der Nukleinsäureprobe gegenüber einem elektrischen ZIVE (zero-integrated-velocity-electrophoresis)-Feld, das ein elektrisches Vorwärtsfeld EF und ein elektrisches Rückwärtsfeld ER umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Verhältnis von EF/ER im Bereich von 2 bis 3 liegt.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei EF/ER ungefähr 2,4 ist.
DE69928230T 1998-01-30 1999-01-19 Elektrophoretisches nukleinsäure-aufreinigungsverfahren Expired - Lifetime DE69928230T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16531 1987-02-19
US09/016,531 US6146511A (en) 1998-01-30 1998-01-30 Electrophoretic nucleic acid purification method
PCT/US1999/001137 WO1999038874A2 (en) 1998-01-30 1999-01-19 Electrophoretic nucleic acid purification method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69928230D1 DE69928230D1 (de) 2005-12-15
DE69928230T2 true DE69928230T2 (de) 2006-07-20

Family

ID=21777601

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69928230T Expired - Lifetime DE69928230T2 (de) 1998-01-30 1999-01-19 Elektrophoretisches nukleinsäure-aufreinigungsverfahren

Country Status (8)

Country Link
US (2) US6146511A (de)
EP (1) EP1056758B1 (de)
JP (1) JP2002502020A (de)
AT (1) ATE309260T1 (de)
AU (1) AU734170B2 (de)
CA (1) CA2318973A1 (de)
DE (1) DE69928230T2 (de)
WO (1) WO1999038874A2 (de)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6146511A (en) 1998-01-30 2000-11-14 The Perkin-Elmer Corporation Electrophoretic nucleic acid purification method
CA2330819A1 (en) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten Forschung E.V. Electrical integrated nucleic acid isolation, purification and detection
US20020003089A1 (en) * 2000-05-23 2002-01-10 Devault James D. Electrophoretic stacking of DNA and other samples prior to electrophoresis
WO2002071024A2 (en) * 2001-03-08 2002-09-12 Ethrog Biotechnology Ltd. Apparatus and method for electrophoresis
US7503904B2 (en) * 2002-04-25 2009-03-17 Cardiac Pacemakers, Inc. Dual balloon telescoping guiding catheter
WO2004025252A2 (en) * 2002-09-11 2004-03-25 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Automated system for high-throughput electrophoretic separations
CN1332972C (zh) * 2002-11-28 2007-08-22 爱科来株式会社 浓缩和纯化核酸的方法和装置
US20060134620A1 (en) * 2002-11-28 2006-06-22 Mitsuharu Hirai Method and apparatus for concentration and purification of nucleic acid
US7601491B2 (en) 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
JP2005110503A (ja) * 2003-10-02 2005-04-28 Arkray Inc 核酸の精製方法及びデバイス
EP1918018A3 (de) 2003-11-10 2009-03-11 Arkray, Inc. Vorrichtung zur Konzentration und Reinigung von Nukleinsäure
US8518228B2 (en) 2011-05-20 2013-08-27 The University Of British Columbia Systems and methods for enhanced SCODA
US10337054B2 (en) 2004-02-02 2019-07-02 Quantum-Si Incorporated Enrichment of nucleic acid targets
JP2007526823A (ja) 2004-02-02 2007-09-20 ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア 粒子を運動および濃縮させるためのスコダ泳動ならびに方法および装置
US8529744B2 (en) 2004-02-02 2013-09-10 Boreal Genomics Corp. Enrichment of nucleic acid targets
US9186685B2 (en) 2012-01-13 2015-11-17 The University Of British Columbia Multiple arm apparatus and methods for separation of particles
CA2496294A1 (en) 2005-02-07 2006-08-07 The University Of British Columbia Apparatus and methods for concentrating and separating particles such as molecules
US8263022B2 (en) * 2005-10-04 2012-09-11 Headway Technologies, Inc. Microfluidic detection of analytes
JP4195039B2 (ja) * 2006-02-16 2008-12-10 善之 辻本 検体の前処理方法および試薬
KR100661482B1 (ko) * 2006-04-03 2006-12-27 전남대학교산학협력단 Dna 정제를 위한 수집홈을 갖는 전기영동장치
US20080047835A1 (en) * 2006-08-22 2008-02-28 Macconnell William P Genomic DNA Purifier
EP2062036A4 (de) * 2006-08-31 2016-09-21 Life Technologies Israel Ltd Verfahren, kassetten, gele und vorrichtungen zur isolation und sammlung von biomolekülen aus elektrophorese-gelen
US8475641B2 (en) * 2008-02-01 2013-07-02 The University Of British Columbia Methods and apparatus for particle introduction and recovery
EP2257796A2 (de) * 2008-03-03 2010-12-08 Oregon Health and Science University Verfahren zur reinigung biologischer makromoleküle
US8877028B2 (en) 2009-04-21 2014-11-04 The University Of British Columbia System and methods for detection of particles
CN102656449B (zh) * 2009-09-01 2015-07-08 俄勒冈健康科学大学 用于分离生物大分子的可逆电流凝胶电泳装置
JP5246128B2 (ja) * 2009-10-09 2013-07-24 凸版印刷株式会社 電気泳動用ゲルカセット製造方法及び電気泳動用ゲルの充填方法
CN107144622A (zh) * 2011-06-16 2017-09-08 不列颠哥伦比亚癌症分社 核酸的自动化尺寸选择
EP2844773B1 (de) 2012-05-04 2017-08-16 Boreal Genomics Corp. Biomarkeranalyse mittels scodaphorese
US9340835B2 (en) 2013-03-15 2016-05-17 Boreal Genomics Corp. Method for separating homoduplexed and heteroduplexed nucleic acids
WO2016185284A1 (en) 2015-05-20 2016-11-24 Boreal Genomics, Inc. Method for isolating target nucleic acid using heteroduplex binding proteins
US11207679B2 (en) 2018-04-13 2021-12-28 Regents Of The University Of Minnesota DNA extraction device
JP6905961B2 (ja) * 2018-07-12 2021-07-21 株式会社日立ハイテク 電気泳動方法、電気泳動システム及び電気泳動ゲル
JP7471436B2 (ja) 2020-09-24 2024-04-19 株式会社日立ハイテク 電気泳動回収装置、及び核酸前処理装置
CN114277027A (zh) * 2021-12-23 2022-04-05 深圳大学 一种用于电泳分离物回收的用具及其使用方法
CN115228262B (zh) * 2022-08-22 2023-12-01 湖南国测生物科技有限公司 实验室密闭空间内核酸污染的立体净化方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6113148A (ja) * 1984-06-29 1986-01-21 Hitachi Ltd 連続型核酸断片電気泳動装置
DE3428385A1 (de) * 1984-08-01 1986-02-20 Detlev Prof.Dr. 4000 Düsseldorf Riesner Elektrophoretisches verfahren zur trennung von biopolymeren
CA2012379C (en) * 1989-04-24 2000-01-25 Gary W. Slater Processes for the preparation and separation of macromolecules
US5284940A (en) * 1990-11-14 1994-02-08 Hri Research, Inc. Preparation for nucleic acid samples
US5217593A (en) * 1991-03-13 1993-06-08 Macconnell William P Nucleic acid purification system and method
US5139637A (en) * 1991-03-13 1992-08-18 Macconnell William P Plasmid purification system and method
US5209831A (en) * 1991-06-14 1993-05-11 Macconnell William P Bufferless electrophoresis system and method
US5178737A (en) * 1991-12-04 1993-01-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Electrophoretic resolution of single strand DNA by asymmetric field inversion
ES2194843T3 (es) * 1992-09-11 2003-12-01 Hoffmann La Roche Deteccion de acidos nucleicos en sangre.
US5482836A (en) * 1993-01-14 1996-01-09 The Regents Of The University Of California DNA purification by triplex-affinity capture and affinity capture electrophoresis
DE69427690T2 (de) * 1993-04-07 2002-05-02 Gradipore Ltd Verbesserungen im auftrennen von proteinen
US5384022A (en) * 1993-09-08 1995-01-24 Cornell Research Foundation, Inc. Method and apparatus for electrophoretic DNA band isolation
US5453162A (en) * 1993-09-09 1995-09-26 University Of North Carolina At Chapel Hill Method and apparatus for gel electrophoresis using two electric fields
WO1995014921A1 (en) * 1993-11-23 1995-06-01 Perkin-Elmer Corporation Entrapment of nucleic acid sequencing template in sample mixtures by entangled polymer networks
US5891313A (en) * 1993-11-23 1999-04-06 The Perkin-Elmer Corp. Entrapment of nucleic acid sequencing template in sample mixtures by entangled polymer networks
US5538614A (en) * 1994-08-17 1996-07-23 Han; Dawn D. Macromolecule recovery cassette
US5587062A (en) * 1996-01-24 1996-12-24 Shimadzu Corporation Sample collecting apparatus by gel electrophoresis
US6120985A (en) * 1997-10-31 2000-09-19 Bbi Bioseq, Inc. Pressure-enhanced extraction and purification
US6146511A (en) 1998-01-30 2000-11-14 The Perkin-Elmer Corporation Electrophoretic nucleic acid purification method

Also Published As

Publication number Publication date
AU2237499A (en) 1999-08-16
DE69928230D1 (de) 2005-12-15
US6827830B1 (en) 2004-12-07
EP1056758B1 (de) 2005-11-09
WO1999038874A2 (en) 1999-08-05
WO1999038874A3 (en) 1999-09-23
EP1056758A2 (de) 2000-12-06
AU734170B2 (en) 2001-06-07
ATE309260T1 (de) 2005-11-15
US6146511A (en) 2000-11-14
CA2318973A1 (en) 1999-08-05
JP2002502020A (ja) 2002-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69928230T2 (de) Elektrophoretisches nukleinsäure-aufreinigungsverfahren
DE60221240T2 (de) Konzentration und reinigung von analyten mit elektrischen feldern
DE60010058T2 (de) Biochemische reinigungsgeräte mit immobilisierten fangsonden und ihre anwendungen
EP1121460B1 (de) Verfahren und mittel zur isolierung und reinigung von nukleinsäuren an oberflächen
DE69828517T2 (de) Methode zur dns-isolierung.
DE4034036C2 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellsuspensionen
DE69836587T2 (de) Nukleinsäuresammlung
EP0738733B1 (de) Vorrichtung zur Isolierung von Nukleinsäuren
EP2084280B1 (de) Integriertes mikrofluidisches bauteil zum aufreinigen von analytmolekülen sowie verfahren zum aufreinigen
EP1075546A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur isolierung von nukleinsäuren
DE2142628A1 (de) Elektrophorese Gerat
DE2929478A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur durchfuehrung einer ein- und zweidimensionalen mikro-gelelektrophorese
DE2554386A1 (de) Elutions-einrichtung
DE102008020428B3 (de) Vorrichtung und Verfahren und Gelsystem zur analytischen und präparativen Elektrophorese
EP0486580B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur trennung und detektion von komponenten eines stoffgemisches durch temperaturgradienten-gelelektrophorese
DE69817818T2 (de) Einstufige vorrichtung und verfahren zur konzentration und säuberung biologischer moleküle
DE69733755T2 (de) Elektrode-einfang von nukleinsäuren
DE3726403A1 (de) Vorrichtung zur elektrophorese
EP1034428A1 (de) Verfahren und vorrichtung zum aufschluss biologischer zellen zur extraktion und analyse der zellinhalte
WO2000049173A2 (de) Verfahren und probenträgersystem zur trennung und anreicherung von stoffen in situ
DE2529606A1 (de) Isoelektrische fokusierung
DE69534386T2 (de) Freigabe von intrazellulärem material
DE3913814A1 (de) Verfahren zur elektrischen elution von auf trenngelen gebundenen, elektrisch geladenen substanzen und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens
DE19960398B4 (de) Verfahren und elektrochemischer Sensor mit geheizten Elektroden für die biochemische Analytik, insbesondere zur Untersuchung von Hybridisierungsvorgängen der Nucleinsäuren
DE3927467C2 (de) Vorrichtung und Verwendung einer Vorrichtung zur Trennung und und Detektion von Komponenten eines Stoffgemisches durch Temperaturgradienten-Gelelektrophorese

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: APPLIED BIOSYSTEMS, LLC (N. D. GES. D. STAATES, US

Owner name: UNIVERSITY OF OTTAWA, OTTAWA, ONTARIO, CA