DE3913814A1 - Verfahren zur elektrischen elution von auf trenngelen gebundenen, elektrisch geladenen substanzen und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents
Verfahren zur elektrischen elution von auf trenngelen gebundenen, elektrisch geladenen substanzen und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrensInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrischen
Elution von auf Trenngelen gebundenen elektrisch gela
denen Substanzen sowie eine Anordnung zur Durchführung
dieses Verfahrens.
Die Auftrennung von Substanzen, insbesondere von biolo
gischen Substanzen auf Trenngelen stellt eine weit
verbreitete Methode dar, um unterschiedliche Moleküle
zu trennen. Solche Trennverfahren werden sowohl zu
analytischen als auch zu präparativen Zwecken durchge
führt. Bei der präparativen Anwendung ist jedoch die
Rückgewinnung der aufgetrennten und auf dem Trenngel
gebundenen Substanz äußerst problematisch, da insbeson
dere bei biologischen Substanzen die empfindlichen
Moleküle beschädigt werden, was zu einem Verlust der
Bioaktivität führt. Zur Lösung dieses Problems wurden
bereits eine Reihe von Verfahren zur Rückgewinnung von
auf Trenngel, insbesondere von auf Elektrophorese-Gelen
gebundenen Substanzen beschrieben.
So ist es z. B. aus der Anwendungsvorschrift AN 120 von
J. T. Baker (Groß Gerau) oder aus J.G. Guenther, Bio
Techniques (Nov./Dec. 1984), 320-325 bekannt, Nuklein
säuren mittels Polyacrylamidgelen auf N,N′-Bis-acryl
cystaminbasis (BAC) elektrophoretisch aufzutrennen und
diejenigen Banden, welche die zu isolierenden Nuklein
säuren enthalten, aus dem Gel herauszuschneiden. Die
herausgeschnittenen Gelstücke werden dann mittels
β-Mercaptoethanol verflüssigt, wodurch die darin ent
haltenen Nukleinsäuren aus der Gelmatrix freigesetzt
werden und anschließend mit einer NATRIX-SPE-Säule
(J. T. Baker, Groß-Gerau) isoliert werden können. Dieses
Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß die dabei
zu verwendenden Trenngelsysteme nicht frei wählbar sind
und es somit nicht bei allen biologischen Materialien
anwendbar ist. Durch den Einsatz von Mercaptoethanol
ist es besonders auf eine große Anzahl von Proteinen
bzw. von Peptiden nicht anwendbar, da Mercaptoethanol
Cysteinbrücken zerstört.
Es ist auch bekannt, Nukleinsäuren auf einer nieder
schmelzenden Agarose aufzutrennen und diese nach erfolg
ter Auftrennung bei 70°C zu verflüssigen. Dabei wird
die in der Agarosematrix festgehaltene Nukleinsäure
freigesetzt und kann mittels einer Flüssigkeit extra
hiert werden. In einem nachfolgenden Schritt werden
dann die freigesetzten Nukleinsäuren aus der Flüssig
keit mittels einem Sorbens (Glass Milk, NATRIX) iso
liert. Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf,
daß die Agarose bei einer für biologisches Material
relativ hohen Temperatur, nämlich bei 70°C zur Frei
setzung der Nukleinsäuren aufgeschmolzen werden muß,
welches regelmäßig zu einem beachtlichen Aktivitäts
verlust führt. Außerdem kann eine doppelsträngige DNA
schon bei Temperaturen ab 65°C in ihre Einzelstränge
aufschmelzen. Desweiteren läßt sich auch bei diesem
Verfahren das Trenngel-System nicht frei wählen und
kann somit nicht an die aufzutrennende Substanz ange
paßt werden. Desweiteren bleiben bei der Auftrennung
häufig Agarosereste zurück, welche die nachfolgende
Aufarbeitung stören (Ostermann L.A. (1984) "Methods of
Protein and Nucleic Acid Research" Part 1, 86-89 und
136-149 (Springer, Berlin)).
In einem weiteren bekannten Verfahren wird das abge
trennte Agarosegelstück tiefgefroren und die darin ent
haltene Nukleinsäure durch Pressen aus der tiefgefrore
nen Gelmatrix herausgedrückt. Dieses Verfahren weist
neben den zuvor beschriebenen Problemen noch den Nach
teil auf, daß es nicht in größerem Maßstab anwendbar
ist, eine geringe Ausbeute ergibt und eine hohe Konta
minationsgefahr mit sich bringt.
Nach einem in Ostermann L.A. (1984) "Methods of Protein
and Nucleic Acid Research" Part 1, 86-89 und 136-149
(Springer, Berlin) beschriebenen Verfahren wird bei der
Auftrennung von Substanzgemischen in einer Elektropho
rese-Apparatur die Stromzufuhr während der Elektropho
rese unterbrochen und es wird unmittelbar vor der zu
isolierenden Molekülbande eine Vertiefung in Form eines
Troges in das Trenngel geschnitten und diese mit Puffer
aufgefüllt. Anschließend wird erneut der Strom angestellt
und durch die Elektrophoresespannung wandert die Molekül
bande in die Vertiefung bzw. in den darin enthaltenen
Puffer. Durch Entnehmen des Puffers können die sich
darin befindlichen Moleküle isoliert werden. Es ist
auch möglich, anstatt einer trogartigen Vertiefung
einen Schlitz in das Gel zu schneiden und in diesen
Schlitz einen Filter oder DEAE-Papierstreifen einzulegen.
Dabei fängt das Papier die Nukleinsäuren während der
weiteren Elektrophorese ab und diese können später mit
einem geeigneten Puffer vom Papier abgelöst werden.
Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß es
nur bei horizontalen Gelen anwendbar und umständlich zu
handhaben ist. Darüberhinaus muß bei diesem Verfahren
die Elutionszeit äußerst genau beachtet werden, da die
Moleküle bei der Elektrophorese hinter der trogartigen
Vertiefung wieder in das fortführende Elektrophoresegel
einwandern. Vor allem hat dieses Verfahren jedoch den
Nachteil, daß die zu isolierenden Moleküle während der
Elektrophorese sichtbar gemacht werden müssen, um die
zu isolierende Bande abzufangen. Dies geschieht übli
cherweise entweder durch Anfärben, welches die zu
isolierende Substanz chemisch modifiziert oder durch
UV-Licht, welches eine Gefährdung des Experimentators
und insbesondere bei Nukleinsäuren eine UV-Modifizie
rung der zu isolierenden Substanz hervorruft.
In Ostermann L.A. (1984) "Methods of Protein and Nucleic
Acid Research" Part 1, 86-89 und 136-149 (Springer,
Berlin) wurde auch schon versucht, die Gelstücke mit
den entsprechende Banden zu zerkleinern und diese in
einem Elutionspuffer zu suspendieren, der gegebenenfalls
mehrmals erneuert wird. Bei diesem Verfahren werden
jedoch nur sehr verdünnte Lösungen der zu isolierenden
Substanz erhalten, die sich insbesondere bei RNA und
Proteinen nur mittels aufwendigen Verfahrensschritten
wieder aufkonzentrieren lassen. Zudem treten beim
Zerkleinern Scherkräfte auf, die hochempfindliche
Biopolymere zerstören.
In J. Biochem. Biophys. Meth. 14, 245-260 (1987) Göbel
et. al. ist ein Verfahren beschrieben, wonach die zu
isolierenden Moleküle in einem elektrischen Feld aus
den Gelbruchstücken durch eine großporige Membran in
eine einen Puffer enthaltende Kammer transportiert
werden und von dort durch eine kleinporige Membran an
dem Weiterwandern gehindert werden. Dieses System weist
jedoch den Nachteil auf, daß es nur mit ganz bestimmten
Membranen durchführbar ist und diese Membranen je nach
Art des zu isolierenden Moleküls eine Verringerung der
Ausbeute durch eine Membranadsorption hervorrufen. Nach
diesem Verfahren ist es auch nicht möglich, kleinere
Oligonukleotide oder kleinere Peptide zu isolieren, da
diese ohne weiteres die hierbei verwendbaren Membranen
durchdringen können.
Es ist schließlich auch versucht worden, Moleküle in
einer Zone hoher Salzkonzentration abzufangen (Neuhoff
V. Ed. (1984) "Electrophoresis ′84", 154-155 (Verlag
Chemie, Weinheim)). Dabei wird so vorgegangen, daß man
die Moleküle durch Anlegen eines elektrischen Feldes
aus dem abgetrennten Gelstück herauswandern und danach
in eine Zone von hoher Salzkonzentration wandern läßt.
In dieser Zone wird die Wanderungsgeschwindigkeit der
zu isolierenden Moleküle sehr stark verlangsamt, da die
kleinen Ionen eine Salzfalle ausbilden und annähernd
den gesamten Ladungstransport übernehmen. Dieses Ver
fahren ist jedoch wegen der hohen Salzkonzentration für
Proteine nicht gut geeignet. Darüberhinaus ist es bei
der parallelen Isolierung verschiedener Gelbanden
notwendig, daß die zu isolierenden Substanzen annähernd
gleiche Molekulargewichte aufweisen. Auch ist es nicht
möglich, diese Vorgehensweise auf größere Präparationen
anzuwenden.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die zuvor
beschriebenen Nachteile zu überwinden und ein Verfahren
zur elektrischen Elution von auf einem Trenngel aufge
trennten elektrisch geladenen Substanzen bereitzustel
len, welches auf einfache Weise und mit hoher Ausbeute
mit verschiedenen, insbesondere biologischen Substan
zen, vorzugsweise mit Nukleinsäuren und Proteinen bzw.
Peptiden anwendbar ist. Dabei sollen vorzugsweise
Einmalartikel verwendbar sein, um eine Kreuzkontamina
tion zu vermeiden und um das Arbeiten mit stark radio
aktiven Proben zu erleichtern. Darüberhinaus soll ein
Verfahren bereitgestellt werden, mit dem die aufzutren
nenden Moleküle auch in einem größeren präparativen
Maßstab isoliert werden können, wobei unabhängig von
der späteren Elution das für die Auftrennung jeweils am
besten geeignete Trenngel eingesetzt werden kann. Unter
Trenngel ist dabei jegliches Material zu verstehen,
das sich zur Auftrennung von Substanzgemischen eignet.
Üblicherweise wird jedoch zum Auftrennen von elektrisch
geladenen Teilchen Elektrophoresegel verwendet.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur elek
trischen Elution von elektrisch geladenen Substanzen
von einem Trenngel. Das erfindungsgemäße Verfahren
zeichnet sich nun dadurch aus, daß man zwischen den
beiden Elektroden ein einen Elektro-Elutions-Puffer
enthaltendes Aufnahmebehältnis und daran anschließend
ein Sammelbehältnis anbringt, welches ein Sorbens für
die zu eluierende Substanz enthält, wobei Aufnahme- und
Sanmelbehältnis so angeordnet werden, daß sie die
einzige elektrisch leitende Verbindung zwischen den
Elektroden darstellen. Bei der Durchführung des erfin
dungsgemäßen Verfahren wird nun derart vorgegangen, daß
man das herausgetrennte Trenngel, welches vorzugsweise
ein Elektrophoresegel ist, mit der zu eluierenden
Substanz in das Aufnahmebehältnis bringt und durch
Anlegen eines elektrischen Stromes ein elektrisches
Feld erzeugt, in welchem die Substanz vom Trenngel in
den Elektro-Elutionspuffer und anschließend in das
Sammelbehältnis wandert. Durch das im Sammelbehältnis
enthaltene Sorbens wird die Substanz gebunden und kann
somit nicht mehr im angelegten elektrischen Feld weiter
wandern. Nach Beendigung der Elektro-Elution wird nun
die an das Sorbens gebundene Substanz mit einem Elutions
puffer wieder davon heruntereluiert. Zur Abkürzung des
erfindungsgemäßen Verfahrens und zur Erhöhung der Aus
beute ist es zweckmäßig, nach dem Unterbrechen des
elektrischen Stromes den Elektro-Elutions-Puffer durch
das Sammelbehältnis laufen zu lassen, um auf diese
Weise noch im Puffer enthaltene restliche Substanz an
das Sorbens zu binden. Ebenfalls als zweckmäßig hat es
sich erwiesen, das Sorbens vor dem Heruntereluieren der
zu isolierenden Substanz von nicht gebundenem Material
mit einer Waschlösung freizuwaschen.
Die Erfindung betrifft jedoch auch eine Anordnung zur
Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die
erfindungsgemäße Anordnung enthält Elektrodenräume für
Kathode und Anode, wobei die Elektrodenräume nur über
ein Behältnis zur Aufnahme des zu eluierenden Trenngels
und über ein sich daran anschließendes Sammelbehältnis
miteinander elektrisch leitend verbunden sind und wobei
das Sammelbehältnis ein Sorbens enthält, in das die zu
eluierende Substanz bindet. Erfindungsgemäß ist dabei
das Sammelbehältnis auf derjenigen Seite des Aufnahmebe
hältnisses angebracht, zu der die zu isolierende elek
trisch geladene Substanz im elektrischen Feld während
der Elektro-Elution wandert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Sammelbe
hältnis gegenüber dem Aufnahmegefäß und/oder gegenüber
dem Elektrodenraum mit einem lösungsmitteldurchlässigen
Filter oder einer Fritte verschlossen. Zweckmäßigerweise
bestehen die Fritten aus Glas, Porzellan oder einem
gegenüber dem verwendeten Lösungsmittel und den darin
gelösten Substanzen inerten Kunststoff, vorzugsweise
aus Polyethylen.
Im erfindungsgemäßen Verfahren und für die dazugehörige
Anordnung hat es sich als zweckmäßig erwiesen, als
Sorbens Ionenaustauscher zu verwenden. Dabei richtet
sich die Auswahl des verwendeten Ionenaustauschers nach
der zu isolierenden Substanz sowie den pH-Werten der
Elektro-Elutions- und der Elutions-Puffer. Als beson
ders geeignet haben sich Ionenaustauscher erwiesen, die
quaternäres Methylamin auf porösem Glas gebunden ent
halten, wie sie z.B. von der Firma J.T. Baker (Groß-
Gerau, Bundesrepublik Deutschland) oder von der ICT
Handelsgesellschaft mbH (Frankfurt) vertrieben werden.
Auch Polyethylenimin oder DEAE-Gruppen enthaltende
Trägermaterialien haben sich im erfindungsgemäßen Ver
fahren als gute Sorbenzien erwiesen. Als Trägermaterial
wird dabei üblicherweise Silikagel oder Dextran
verwendet. Die Porengröße des die Ionenaustauschergrup
pen enthaltenden Trägermaterials richtet sich ebenfalls
nach der Art der zu isolierenden Substanz sowie nach
dem Puffer und den pH-Werten. Üblicherweise beträgt die
Porengröße des Trägermaterials 30 bis 1000 Å, vorzugs
weise 50 bis 500 Å. Erfindungsgemäß finden jedoch auch
Sorbenzien Verwendung, welche mit Reversed-Phase-Eigen
schaften versehen sind. Hierbei sind solche Reversed-
Phase-Materialien bevorzugt, deren Umkehrphase Kohlen
wasserstoffketten von C 2 bis C 22, insbesondere von C 6
bis C 18 enthält. Schließlich ist es auch möglich, im
erfindungsgemäßen Verfahren Sorbenzien zu verwenden,
die Affinitätsgruppen für die zu isolierende Substanz
enthalten. Als Affinitäts- Liganden oder Effektoren
finden insbesondere Antikörper, Enzyme, welche vorzugs
weise inaktiviert sind sowie Hormone Verwendung. Die
Herstellung solcher Affinitäts-Sorbenzien ist dem
Fachmann bekannt und zusammenfassend in Chemie in uns.
Zeit. 8 (1974), Seiten 17 bis 25 oder in Adv. Enzymol.
46 (1977) beschrieben.
Erfindungsgemäß können auch Sorbenzien aus Membranen
als Trägermaterial verwendet werden, die mit den
zuvorgenannten Ionenaustauscher-, Reversed-Phase-,
Affinitätsgruppen versehen sind.
Erfindungsgemäß hat es sich als äußerst zweckmäßig er
wiesen, mittels Druck den Elektro-Elutions-Puffer durch
das Sorbens im Sammelbehältnis zu leiten. Üblicherweise
wird dafür der Gasdruck verwendet, der dadurch entsteht,
daß beim Anlegen eines Elutionsstromes eine Elektrolyse
des Puffers stattfindet und sich dabei Gase entwickeln.
Es hat sich nun gezeigt, daß es zweckmäßig ist, die
Elektrolyse durch den dabei entstehenden Gasdruck zu
regeln. Dieser entstehende Gasdruck bewirkt nämlich ein
Absenken des Pufferspiegels im Elektrodenraum, der bei
andauernder Elektrolyse sogar so weit sinken kann, daß
die Elektrode den Kontakt mit dem Puffer verliert,
wodurch der Stromfluß unterbrochen und die elektrische
Elution gestoppt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich im Besonde
ren zur Auftrennung von biologischen Substanzen wie den
Nukleinsäuren DNA und RNA und von Proteinen. Es ist je
doch auch ohne weiteres möglich, auf diese Weise ganze
Zell- oder Viruspartikel zu isolieren. Im erfindungsge
mäßen Verfahren ist zwischen dem Elektro-Elutions-Puf
fer und dem Elutions-Puffer zu unterscheiden. Dabei
wird unter Elektro-Elutions-Puffer derjenige Puffer
verstanden, der im Aufnahmebehältnis bzw. in einem
daran angeschlossenen Vorratsbehältnis enthalten ist
und der als Ladungsträger bei der Elektro-Elution, d. h.
bei der elektrisch bewirkten Elution der Substanz von
dem Trenngel, verwendet wird. Demgegenüber wird unter
der Bezeichnung Elutions-Puffer derjenige Puffer ver
standen, der zum Ablösen und Auswaschen der gebundenen
Substanzmoleküle aus dem Absorbens verwendet wird. Als
Puffersubstanz wird im erfindungsgemäßen Verfahren
vorzugsweise 3-Morpholino-propansulfonsäure (MOPS),
Tris(Hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), Tris-Borat (TB)
oder auch Phosphatpuffer verwendet. Vorzugsweise wird
dem Puffer ein Mittel wie Tetrabutylammoniumbromid
(TBABr) zugesetzt, das die Bindung von Nukleinsäuren an
Reversed-Phase-Oberflächen verbessert. Der günstigste
pH der Pufferlösungen richtet sich nach der jeweils zu
isolierenden Substanz und kann vom Fachmann durch
einfache Versuche bestimmt werden. Üblicherweise beträgt
er 5 bis 9 und vorzugsweise 5 bis 8,5. Besonders bevor
zugt ist ein pH-Bereich zwischen 6 und 8. Wird als
Sorbensmaterial ein Ionenaustauscher oder ein Affinitäts-
Sorbens verwendet, so enthält der Elutionspuffer vorzugs
weise zusätzlich Harnstoff und ein Salz. Als Salz wird
dabei zweckmäßigerweise Natriumchlorid und zwar vorzugs
weise in einer Konzentration von 1,5 M oder größer
verwendet. Wird als Sorbens ein Reversed-Phase-Material
eingesetzt, so finden üblicherweise Elutionspuffer
Verwendung, welche ein polares organisches Lösungsmittel
in wäßriger Lösung enthalten. Als polare organische
Lösungsmittel werden vorzugsweise niedere Alkohole,
insbesondere C1-C4-Alkohole oder auch Acetonitril
verwendet. Von den Alkoholen sind wiederum Ethanol,
Isopropanol und Isobutanol bevorzugt.
Die im Elutionspuffer enthaltene isolierte Substanz
kann nun in Reinform durch Gefriertrocknen, gegebenen
falls nach vorheriger Dialyse, oder durch Ausfällen
mittels einem Alkohol oder Ammoniumsulfat in konzen
trierter Form gewonnen werden.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren bei der elektrischen
Elution verwendeten Stromstärken und Spannungen betra
gen üblicherweise 60 bis 200 Volt, vorzugsweise 80 bis
180 und insbesondere 120 bis 150 Volt. Die angewendete
Stromstärke richtet sich im erfindungsgemäßen Verfah
ren nach dem kleinsten Durchmesser der Anordnung, den
überlicherweise die Auslauffläche des Sammelbehält
nisses aufweist. Dabei ist die spezifische Stromstärke,
bezogen auf den kleinsten Durchmesser der Anordnung,
zweckmäßigerweise kleiner als 60 mA/cm2 und liegt
vorzugsweise unter 20 mA/cm2. Besonders bevorzugt sind
Stromstärken von etwa 10 mA/cm2.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist das Sorbens
üblicherweise den größten spezifischen elektrischen
Widerstand auf. Dies führt dazu, daß sich gerade dieser
Teil der Apparatur stärker erwärmt als andere Bereiche.
Daher ist es zweckmäßig, eine maximale Stromstärke zu
verwenden, bei welcher sich das Sorbens nicht zu sehr
erwärmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird daher der
Elektro-Elutions-Puffer langsam durch das Sorbens ge
leitet, wodurch es diesem die entstandene Wärme wieder
entzieht. Dabei werden das Sorbens und die sich darin
befindenden Substanzen abgekühlt. Bei besonders empfind
lichen Substanzen oder zur Schonung des Sorbens hat es
sich als zweckmäßig erwiesen, den Elektro-Elutions-Puffer
zusätzlich zu kühlen. In diesem Fall ist es auch möglich,
das erfindungsgemäße Verfahren mit größeren Stromstärken
durchzuführen. Vorzugsweise wird der Elektro-Elutions-Puf
fer mit solch einer Geschwindigkeit durch das Sorbens
geleitet, daß die darin befindliche Puffermenge alle 5
Minuten, insbesondere alle 2 Minuten einmal ausgetauscht
wird. Die Erfindung wird anhand der in den Fig. 1 bis 6
dargestellten bevorzugten Ausführungsformen näher
erläutert.
Fig. 1 zeigt eine einfache Vorrichtung zur elektri
schen Elution, die aus üblichen Laborartikeln
zusammengesetzt ist.
Fig. 2 zeigt eine Vorrichtung zur Elektroelution im
Parallelbetrieb und für verschiedene Säulen
größen.
Fig. 3 zeigt einen Adapter zum Anpassen verschiedener
Säulengrößen beim Parallelbetrieb.
Fig. 4 zeigt eine einzelne Säule, bestehend aus Sam
melbehältnis und Aufnahmebehältnis und
Fig. 5 zeigt einen Elektrodenraum zum Aufstecken
auf die Trennsäule von Fig. 4, wobei der
Elektrodenraum zusätzlich als Vorratsgefäß
für den Elektro-Elutions-Puffer dient.
Fig. 6 zeigt eine bevorzugte erfindungsgemäße Vor
richtung, bei welcher das entstehende Gas
volumen verwendet wird, um den Elektro-Elu
tions-Puffer durch das Sorbens zu drücken.
In der Fig. 1 ist eine Ausführungsform der erfindungs
gemäßen Vorrichtung gezeigt, die sich aus einfachen
Labormaterialien zusammensetzen läßt. In dieser Ausfüh
rungsform befinden sich die Elektroden 2 a, 2 b in den
Elektrodenräumen 4 a, 4 b, die gleichzeitig als Vorrats
gefäß für den Elektroelutionspuffer dienen. Die Elek
troden 2 a, 2 b sind über das Aufnahmebehältnis 6 und
das Sammelbehältnis 8 elektrisch leitend miteinander
verbunden. Dabei bestehen die Elektrodenräume 4 a, 4 b
aus Trichtern 14, welche mit Silikonschläuchen 10, 12
mit dem Aufnahmebehältnis 6 und dem Sammelbehältnis 8
verbunden sind. Aufnahmebehältnis 6 und Sammelbehältnis
8 werden dabei von einer Säule 16 gebildet, wobei das
Sammelbehältnis 8 durch Polyethylenfritten 18, 20
begrenzt ist und ein Sorbens 38 enthält. Die Poly
ethylenfritten 18, 20 weisen Poren von 20 µm Durchmes
ser auf. Das die zu isolierende Substanz enthaltende
Trenngel 22 ist im Vorratsbehältnis 6 enthalten.
Eine für den Parallelbetrieb geeignete Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in den Fig. 2 bis
5 dargestellt. Diese Ausführungsform besteht aus einem
L-förmigen Elektrodenkasten 24 der den einen Elektroden
raum 4 b darstellt und der einen am unteren Ende des
Kastens angebrachten, rechtwinklig abstehenden Vorsatz
26 aufweist und der Bohrungen 28 zur Aufnahme der
Adapter 30 aufweist. In dem Adapter 30 sitzen die
Säulen 16 mit dem aufgesteckten Trichter 32, der den
anderen Elektrodenraum 4 a darstellt. Der in Fig. 3
dargestellte Adapter 30 ist derart ausgebildet, daß er
mit seinem äußeren Durchmesser exakt in die Bohrungen
28, die ggf. ein Gewinde aufweisen, des Vorsatzes 26
des Elektrodenkastens 24 von Fig. 2 paßt. Der Adapter
30 hat eine innere Aufbohrung 34, in welche sich die
Säule 16 lösungsmitteldicht aufstecken oder auch
aufschrauben läßt. Zur besseren Abdichtung weist der
Adapter 30 außen und innen lösungsmittelfeste O-Ringe
36 auf.
Bei der in Fig. 4 dargestellten Säule 16 ist das Sammel
behältnis 8 vom Aufnahmebehältnis 6 durch zwei Poly
ethylenfritten 18, 20 abgetrennt. Es enthält ein Sor
bens 38.
Fig. 5 zeigt einen Trichter 32, der lösungsmitteldicht
auf die Säule 16 aufgesteckt wird und der die Elektrode
2 a enthält. Zum Schutz des Aufnahmebehältnisses weist
der Trichter 32 einen Filter oder ein Sieb 40 auf. Die
Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher
erläutert.
Schließlich zeigt Fig. 6 eine erfindungsgemäße Vorrich
tung, bei der die elektrolytische Gasbildung dazu be
nutzt wird, den Elektro-Elutions-Puffer durch das Sor
bens zu pressen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist
einen gasdicht auf dem Elektrodenraum 4 a aufsitzenden
Deckel auf, wodurch das bei der Elektrolyse gebildete
Gas 46 nicht mehr in die umgebende Atmosphäre entweichen
kann und somit ein Überdruck im Elektrodenraum 4 a ent
steht, der bewirkt, daß der Elektro-Elutions-Puffer
langsam durch das Sammelbehältnis 8 mit dem Sorbens 38
gedrückt wird. Auf diese Weise wird der Level oder
Spiegel der Pufferoberfläche 48 langsam abgesenkt. Ent
steht so viel Gas 46, daß der Pufferspiegel 48 unter
die Elektrode 2 a absinkt, so wird der Stromfluß und da
mit auch die elektrische Elution gestoppt. Auf diese
Weise ist es möglich, durch ein mehr oder weniger
tiefes Eintauchen der Elektrode 2 a in den Elektro-Elu
tions-Puffer bei gleichzeitiger Wahl einer bestimmten
Stromstärke die Elutionsdauer vorher festzulegen. Das
Durchleiten des Elektro-Elutions-Puffers durch das Sam
melbehältnis 8 mit dem Sorbens 38 während der Elektro
lyse, wie dies mit der in Fig. 6 dargestellten Vorrich
tung möglich ist, hat den Vorteil, daß lokal auftre
tende pH-Änderungen im Sorbens, wie sie bei der Bindung
geladener Moleküle an Ionenaustauscher auftreten, redu
ziert werden, was wiederum je nach Art des Ionenaus
tauschers zu einer Erhöhung der Bindungskapazität füh
ren kann. Darüberhinaus führt das Durchleiten des Puf
fers zu einer Kühlung des Sorbens, welches sich, da es
den größten spezifischen elektrischen Widerstand hat,
in der erfindungsgemäßen Vorrichtung üblicherweise am
stärksten erwärmt. Die hierbei auftretende Kühlung er
möglicht die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah
rens auch mit größeren Stromstärken. Schließlich ermög
licht der Verschluß eines Elektrodenraumes auch Anord
nungen, bei denen die Pufferstände der beiden Elektro
denräume innerhalb weiter Grenzen variiert werden
können. Zudem gelangen auch die geladenen Moleküle nach
dem Austritt aus dem zu eluierenden Gel durch den Fluß
des Puffers schneller in das Sorbens 38.
Mittels der in Fig. 2 dargestellten erfindungsgemäßen
Vorrichtung wurden Versuche zur Elektro-Elution von RNA
durchgeführt. Dabei wurden Gemische aus doppelsträngi
ger und einzelsträngiger RNA mit 220 bis 80 Basen bzw.
Basenpaaren auf einem Elektrophoresegel aufgetrennt,
die jeweiligen Banden aus dem Elektrophoresegel heraus
geschnitten und mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
elektrisch eluiert. Dabei wurde pro Säule jeweils
100 mg Absorbens verwendet. Das Volumen der Säule be
trug 1,5 ml und der Durchmesser des Auslaufes 5 mm. Die
Stromstärke während der Elektro-Elution betrug 2 mA pro
Säule, welches einem spezifischen Stromfluß von 10 mA/cm2
pro Auslauffläche entspricht. Vor der Elution wurden
alle Säulen mit 5 ml Elektroelutionspuffer equilibriert.
Die verwendete RNA wurde mit 3H-GMP markiert und die
Konzentrationen mit einem Szintillationszähler (Packard
TriCarb CA1900) bestimmt. Als Sorbens wurden im ein
zelnen die folgenden Materialien verwendet:
QMA: SEP-PAK, quaternäres Methylamin auf porösem Glas
mit einer Porengröße von 500 Å (SEP-PAK Accell
QMA, Waters Millipore GmbH, Eschborn).
SAX: quaternäres Methylamin, bebunden auf einem porösen Glas mit einer Porengröße von 60 Å (BOND ELUT SAX, ICT Handelsgesellschaft mbH, Frankfurt).
N+: quaternäres Methylamin ebenfalls auf porösem Glas (Baker SPE Trennsäule N+, J. T. Baker, Groß-Gerau).
PEI: Polyethylenimin auf einem weitporigen Silikagel mit einer Porengröße von 275 Å aufgebracht (Baker SPE Trennsäule WP PEI, J. T. Baker, Groß-Gerau).
Quiagen: ein Anionenaustauscher auf Silikagel, wie er von der Firme Diagen, Düsseldorf, vertrieben wird.
NATRIX: eine Silikamatrix mit Reversed-Phase-Eigen schaften (J. T. Baker, Groß-Gerau).
C2: eine mit einer C2-Kohlenstoffkette beladene Reversed-Phase-Matrix (BOND ELUT C2, ICT Handelsge sellschaft mbH, Frankfurt).
C18: ein mit einer C18-Kohlenwasserstoffkette beladenes Reversed-Phase-Material (SEP-PAK C18, Waters Millipore GmbH, Eschborn).
SAX: quaternäres Methylamin, bebunden auf einem porösen Glas mit einer Porengröße von 60 Å (BOND ELUT SAX, ICT Handelsgesellschaft mbH, Frankfurt).
N+: quaternäres Methylamin ebenfalls auf porösem Glas (Baker SPE Trennsäule N+, J. T. Baker, Groß-Gerau).
PEI: Polyethylenimin auf einem weitporigen Silikagel mit einer Porengröße von 275 Å aufgebracht (Baker SPE Trennsäule WP PEI, J. T. Baker, Groß-Gerau).
Quiagen: ein Anionenaustauscher auf Silikagel, wie er von der Firme Diagen, Düsseldorf, vertrieben wird.
NATRIX: eine Silikamatrix mit Reversed-Phase-Eigen schaften (J. T. Baker, Groß-Gerau).
C2: eine mit einer C2-Kohlenstoffkette beladene Reversed-Phase-Matrix (BOND ELUT C2, ICT Handelsge sellschaft mbH, Frankfurt).
C18: ein mit einer C18-Kohlenwasserstoffkette beladenes Reversed-Phase-Material (SEP-PAK C18, Waters Millipore GmbH, Eschborn).
Zur Bestimmung der Ausbeute wurde die Radioaktivität
der eingesetzten RNA-Menge vor und nach der Elektro-
Elution gemessen. Die in einem Elektrophoresegel aufge
trennte RNA wurde in der erfindungsgemäßen Vorrichtung
mit einem Elektro-Elutions-Puffer, bestehend aus 50 mM
MOPS-Na mit einem pH von 7,0 vom Elektrophoresegel über
einen Zeitraum von 15 bis 60 min eluiert. Anschließend
läßt man den sich noch im Aufnahmebehältnis befindenden
Elektro-Elutions-Puffer durch das Sorbens laufen und
spült mit 3×1 ml destilliertem Wasser nach. Anschlie
ßend wird die auf dem Sorbens festgehaltene RNA mit
einem Elutionspuffer, bestehend aus 50 mM MOPS · Na,
pH 7,5, 2 M Harnstoff, 1 M NaCl und 15% (V/V) Ethanol
in Wasser abgewaschen. Die Ausbeute betrug dabei je
nach verwendetem Sorbens bei QUIAGEN 98%, bei QMA
67%, bei N+ 84% und bei SAX 78%.
Beispiel 1 wurde unter Verwendung eines Reversed-Phase-
Sorbens wiederholt. Dabei wurde als Elektro-Elutions-
Puffer eine wäßrige Lösung mit 50 mM MOPS · Na, pH 7,0
und 2,5 mM TBABr und als Elutionspuffer Acetonitril/Was
ser 1 : 1 (V/V) verwendet. Dabei wurden folgende Ausbeu
ten erhalten: C2=36%; C 18=16% und NATRIX=98%.
Es wurde Beispiel 1 unter Verwendung von Polyethylen
imin als Sorbens wiederholt. Als Elektro-Elutions-
Puffer wurde dabei 50 mM Tris-Borat (TB) mit einem pH
von 8,3 und als Elutionspuffer 50 mM TB, pH 8,3 mit 2 M
Harnstoff und 1 M NaCl in 15% (V/V) Ethanol verwendet.
Die Ausbeute betrug dabei 100%.
Beispiel 1 wurde mit 50 mM TB, pH 8,3 und 2,5 mM TBABr
als Elektro-Elutions-Puffer und mit 50 mM TB, pH 8,3,
2 M Harnstoff, 1 M NaCl in 15%iger Ethanol (V/V)
wiederholt. Dabei betrug die Ausbeute je nach verwende
tem Sorbens bei QUIAGEN 98%, bei QMA 62%, bei SAX 77%
und bei PEI 52%.
Beispiel 1 wurde mit einem Elektro-Elutions-Puffer
wiederholt, der 50 mM TB, pH 8,3, 2,5 mM TBABr enthielt
und mit einem Elutionspuffer aus Acetonitril/Wasser 1 : 1
(V/V) wiederholt. Bei der Verwendung von C18 als Sor
bens betrug die Ausbeute 51% und bei NATRIX 98%.
Wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde das erfindungsge
mäße Verfahren mit einer doppelsträngig linearisierten
(mit ApaI) 2964 Basenpaaren enthaltenden Plasmid-DNA
(Plasmid BlueKS+, Stratagene) durchgeführt. Mit 50 mM
TB, pH 8,3 und 2,5 mM TBABr als Elutionspuffer und mit
1,5 M NaCl, 50 mM MOPS, pH 7,5 in 50% (V/V) Ethanol
wurde mit QUIAGEN als Sorbens eine Ausbeute von 72%
und mit PEI eine Ausbeute von 18% erhalten.
Die Wiederholung von Beispiel 6 mit einem Reverse-
Phase-Sorbens und einem Elektro-Elutions-Puffer, der
50 mM TB, pH 8,3 und 2,5 mM TBABr enthält und Aceto
nitril/Wasser 1 : 1 (V/V) als Elutionspuffer ergibt mit
NATRIX eine Ausbeute von 48% und mit C18 von 42%.
Das 5793 Basenpaare große doppelsträngige Plasmid p Q β 1
wird mit BamHI und DraI enzymatisch geschnitten. Auf
diese Weise wird ein Gemisch von DNA-Restriktionsfrag
menten mit 1869, 1171, 1030, 692, 527, 532, 53 und 19
Basenpaaren erhalten. Dieses Gemisch wird elektrophore
tisch aufgetrennt und die einzelnen Banden, wie im
Beispiel 1 beschrieben, elektrisch euliert.
- a) Unter Verwendung der Pufferlösung von Beispiel 6 wird dabei mit QUIAGEN als Sorbens eine Ausbeute von 100% und mit PEI von 29% erhalten.
- b) Unter Verwendung der Elutionspuffer von Beispiel 7 wird mit NATRIX als Sorbens eine Ausbeute von 53% und mit C18 von 36% erhalten.
Handelsübliches Rinderserumalbumin wird in Wasser ge
löst und die Konzentration durch die Absorption bei
280 nm in einem Perkin-Elmer lambda 17 Spektrometer be
stimmt. Das Rinderserumalbumin wird auf ein Elektro
phoresegel aufgetragen und nach erfolgter Elektropho
rese die Bande vom Gel ausgeschnitten und elektrisch
eluiert.
- a) Bei der Verwendung von 50 mM Tris · C1, pH 7,5 als Elektroelutionspuffer und von 50 mM Tris×C1, pH 7,5 und 1 mM NaCl als Elutionspuffer wird dabei mit QMA als Sorbens eine Ausbeute von 75% und mit PEI von 44% erhalten.
- b) Wird als Sorbens ein Reversed-Phase-Material und 50 mM Tris · C1, pH 7,5 als Elektro-Elutions-Puffer und Acetonitril/Wasser 1 : 1 (V/V) als Elutionspuf fer verwendet, so beträgt die Ausbeute bei C18 als Sorbens 100%.
Claims (24)
1. Anordnung zur elektrischen Elution von auf Trenn
gelen (22) gebundenen, elektrisch geladenen Sub
stanzen, umfassend mindestens jeweils einen Elek
trodenraum (4 a, 4 b) für Kathode und Anode,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Elektrodenräume (4 a, 4 b) als einzige
elektrisch leitende Verbindung über ein Aufnahme-
Behältnis (6) für das zu eluierende Trenngel (22)
und über ein sich daran anschließendes Sammelbehäl
tnis (8) miteinander verbunden sind und wobei das
Sammelbehältnis (8) ein Sorbens (38) enthält, an
das die zu eluierende Substanz bindet.
2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß sie als
Sorbens (38) einen Ionenaustauscher enthält.
3. Anordnung nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Sorbens (38) DEAE-Gruppen enthält.
4. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß es als
Sorbens (38) ein Reversed Phase-Material enthält.
5. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Sammelbehältnis (8) vom Aufnahmebehältnis
(6) und/oder vom Elektrodenraum durch Filter
und/oder Fritten (18, 20) abgetrennt ist.
6. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß der an das Aufnahmebehältnis 6 angrenzende
Elektrodenraum (4 a) gasdicht verschlossen ist und
der andere Elektrodenraum (4 b) Gausaustrittsöffnun
gen aufweist.
7. Anordnung nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Elektrodenräume (4 a, 4 b) über mehrere
parallel geschaltete Aufnahme- (6) und Sammelbe
hältnisse (8) elektrisch leitend miteinander
verbunden sind.
8. Verfahren zur elektrischen Elution von elektrisch
geladenen Substanzen von einem Trenngel (22),
dadurch gekennzeichnet,
daß man
- - das die Substanz enthaltende Trenngel (22) in ein zwischen zwei Elektroden (2 a, 2 b) ange brachtes, einen Elektro-Elutions-Puffer enthal tendes Aufnahmebehältnis (6) bringt, und
- - durch Anlegen eines elektrischen Feldes die Sub stanz von dem Trenngel (22) heraus in den Elektro- Elutions-Puffer und von dort
- - in ein Sammelbehältnis (8) wandern läßt, welches ein Sorbens (38) enthält,
- - die Substanz an das Sorbens (38) bindet und anschließend
- - die vom Sorbens (38) gebundene Substanz mit einem Elutionspuffer wieder eluiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß man vor
der Elution der gebundenen Substanz mit dem
Elutionspuffer das Sorbens (38) mit einem Wasch
puffer von nicht gebundenem Material freiwäscht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß man den Elektro-Elutions-Puffer zumindest
teilweise mittels Druck durch das Sorbens leitet.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß man den bei der elektrischen Elution durch
Elektrolyse entstehenden Gasdruck verwendet, um
den Elektro-Elutions-Puffer zumindest teilweise
durch das Sorbens (38) zu leiten.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß die
elektrische Elution durch Erzeugung einer be
stimmten Gasmenge im Elektrodenraum (4 a) den Puf
ferspiegel so weit senkt, daß dieser den Kontakt
mit der Elektrode (2 a) verliert und auf diese
Weise die elektrische Elution gestoppt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß man vor der Elution der Substanz vom Sorbens
(38) den gesamten Elektro-Elutions-Puffer durch
das Sorbens (38) leitet.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das Sorbens (38) mittels Durchleiten des
Elektro-Elutions-Puffers durch das Sammelbehältnis
(8) kühlt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als elektrisch geladene Substanz biologische
Moleküle verwendet.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als elektrisch geladene Substanzen DNA,
RNA, Proteine oder Peptide verwendet.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Elektro-Elutions-Puffer mit einem pH
von 5 bis 9 verwendet.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 17,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Elektro-Elutions-Puffer mit einem pH
von 6 bis 8,0 verwendet.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 18,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Elutionspuffer MOPS und/oder Tris-Bo
rat verwendet.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 19,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Elutionspuffer verwendet, der Harn
stoff enthält.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 20,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen Elutionspuffer verwendet, der NaCl
enthält.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 21,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das Verfahren mit einer Stromstärke von
höchstens 50 mA/cm2, bezogen auf die Auslauffläche
(42) des Sammelbehältnisses (8), durchführt.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 22,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Stromstärke höchstens 10 mA/cm2, bezogen
auf die Auslauffläche (42) des Sammelbehältnisses
(8) beträgt.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Trenngel ein Elektrophoresegel verwendet
wird.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19893913814 DE3913814A1 (de) | 1989-01-13 | 1989-04-26 | Verfahren zur elektrischen elution von auf trenngelen gebundenen, elektrisch geladenen substanzen und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3900920 | 1989-01-13 | ||
DE19893913814 DE3913814A1 (de) | 1989-01-13 | 1989-04-26 | Verfahren zur elektrischen elution von auf trenngelen gebundenen, elektrisch geladenen substanzen und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3913814A1 true DE3913814A1 (de) | 1990-07-19 |
Family
ID=25876765
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE19893913814 Withdrawn DE3913814A1 (de) | 1989-01-13 | 1989-04-26 | Verfahren zur elektrischen elution von auf trenngelen gebundenen, elektrisch geladenen substanzen und eine anordnung zur durchfuehrung des verfahrens |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE3913814A1 (de) |
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-
1989
- 1989-04-26 DE DE19893913814 patent/DE3913814A1/de not_active Withdrawn
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