JPS62501033A - 分離用電気泳動法及び装置の改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は分離用（分取用）電気泳動（５１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅｐｒ５ｐａ ｒａｔｉｖｅ　）の方法及び装置の改良に係わる。。 周知のようにゲル電気泳動は、電界の作用下におかれた所定化合物の移動度の差 に基つく高性能分離技術を構成する。この技術は化合物、特にタンパク質及び核 酸の如き葛分子の精製に広く使用されている。 しかしながら分離段階（島ｈｅ１１．ｅ　ｐｒｅｐａｒａｔ、１ｖｅ）での使用 は、特に高分子の場合にはゲル中に捕捉された化合物のび離という問題があるた め難しい。 分離した化合物乞回収する方法はこれまでも多数提案されてきた。 その中には例えは、ゲルを薄切りにしてこれらの断片を緩衝液中で膨張（膨潤） させ、高分子ケゲル外の緩衝液中へ拡散させる方法がある。しかしながらこの方 法は、特に拡散の遅さ、試料の希釈及び収率の低さに関連した多くの欠点？有す る。 別の方法では不安定な試薬（例えばビス−アクリリルシスタミン）ゲ用いてゲル 乞重合体化する。電気泳動後ゲル乞切断し、第２の試薬（この例では２−ノルカ プトエタノール）により可溶化して生成物（物’Ｅｌ）’ｉ遊＠させる。しかし ながら可溶化処理生成物は透析にかけ１よければならないことが多く、その結果 しばしば透析膜に吸着されることになる。加えて、可溶化試薬は特定の分離生成 物に対して必ずしも中性ではないため、これら生成物を変質させる可能性がある 。 ゲル又はゲル切片ンヒドロキシアバタイト上で横断形電気溶離操作にかけ、次い で緩衝数ケ交換して分離生成物を溶離する方法も提案された。 しカシしながらこれらの方法では試料が希釈され、且つ通常は分解能の低下がみ られる。 別の方法として、生成物がゲルの端に現われるプで７↓ｆ気泳動を続けることも 提案された。この移動終了ゾーンに対応するゲルの表面は膜又は多孔質体と共に 溶離チャンパン規定し、緩衝液がこのチャンバを横切ってかしれて、…■記出現 生成物を画分コレクタ方向へ移送する。 この棟の溶離チャンパンこは重大な欠点、即ち溶離した生成物が希釈されるとい う欠点がある。実際、溶離緩衝液の流−支が少ないと前記生成物は溶離チャンバ の列で１と極方向へ移動し消滅する。この損失を回避すべ（緩衝液の流ｆｉｔな 十分多くすると試料が希釈されろ。そのため試料の０縮が必要となるが、このよ うにすると濃縮膜への吸Ｈに、より損失が生じろ。 試料の希釈を制限すべく別の装置では溶離チャンバを規定するための半浸透性痕 な使用する。この場合には生成物は電極刃め下記のサイクルを制御し得る自動装 （ｌが必要となる。 １１１１　所定時間（実験者によって選択される）経過後プログラムにより電気 泳動が停止する。 （ｂｌ　第２所定時間（やはり実験者によって選択される）の間に、膜に付着し た生成物が剥離されるようにプログラムにより電気泳動の優性が反転する。 （ｃｌ　プログラムによって再び電気泳動が停止し、ポンプが始動して、溶離チ ャンバから画分コレクタ方向への吸出１．を行なう。 ＋＋１１　プログラムによつ℃ポンプが停止し、電気弁が開いて溶離チャンバへ の充填かが行なわれ、前記−１）イクルが再開される。 この種の装置は電子部分ケよむためコストが、Ｉ−６いという欠点な■する。 本賢明の目的は当該技術の要件に関してより良い結果をもｆ−ら丁電２泳動法及 びそのだめの装置を提供することにある。 本発明は特定的には、目的の生成物を少なくとも先行技術の場合と同程度の高収 率で溶離し且つ回収せしめる性能の冒い方法乞提供する。 本発明は一！た、１穎単な構造を有し且つ原価も現在知られているものより低い 装置乞提供する。 本発明によれば、第１緩衝系を用いて、ゲル電気泳動により所与の試料から目的 の生成物を梢製し、ρ）つこの生成物を溶離する方法は、 一分廃すべき生成物の移動終了ゾーンに相当するゲル表面と平行に、この面力） らＯであってもよいような極めて小さい距離をおいて気密的に保持された半浸透 性部材を横切って、前記生成物の移動方向と逆の方向に第２緩衝液乞流しく但し 、前記半浸透性部材の孔は溶離された生成物の粒子とほぼ同程度の大きさぞ五す る）、 一電気泳動にかけられた生成物を前記緩衝液によって排出し、−これら生成物乞 回収する ことを特徴とする。 このようにすれば、電気泳動中に生じる電気（円方）浸透現象を有利に使用する ことができる。 有利なことに、前記半浸透性部材ン横切って緩衝液ン流すとこの部材が継続的に 洗浄され、回収されるぺぎ生成物の該半浸透性部材への吸着による損失が少なく とも大幅に回避される。 溶離チャンバの容枦はｌ朋より小さく、有利には−もしく衝液流滑が少なくて丁 み、且つａ′製生成物を僅かな溶離量で回収できるという利点が得られる。 しかるに、現在公知の装置では溶離チャンバの容積はｌａｗより大きい。 更に、浸透圧流を使用丁れば、装置の分離能力損失の要因たるポンプを使用する 必要がなくなる。 最も一般的に使用される方法では精製すべき試料をゲルカラムの最上部に配置し 、こりカラムの上方部分ケミ極を具備した容器内に入った緩衝液、即ち上方電極 緩衝液中に浸漬し、且つ半浸透性部材で規定された溶離チャンバ′？１′有する カラム下方部分を別の電極を具備した容器内に入った緩衝液、即ち下方電極緩衝 液と接触させる。 本発明の方法では下方電極緩衝液を生成物の移動方向と逆の方向から半浸透性部 材を通して流す。 下方及び上方電離緩衝液は互に同じか又は異なっていてよい。 同様にしてゲルは、これら電極緩衝液と同一の緩衝液又は異なる緩衝液中に存在 し得る。 従来の技術ではゲルはゲル中に種々のゾーンを規定する複数種の緩衝液を含入得 、このようにすると生成物の分離が容易になる。 より特定的には半浸透性部材（特にその種類及び多孔率）、選択は精製すべき生 成物と晶縫体を回収するだめの所望の流量ツク材料〒≠リ　−　の層を必要であ ればサポート、特にカートンの上に配置したもので構成し得る。これはまた二動 物の皮膚の膜又はミリボア（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と称する膜でも構成し得る。 孔の大きさは広範囲に亘って変化し得るが、これらの孔は勿論移動した生成物と ほぼ同じ大きさを有していなければならず、且つ前述の如く緩衝液と共に電気浸 透現象を生起させるようなものでなければならない。例えば「透析用ミリボア」 と称する膜の場合は２００〜３ｏｏＸのオーダーの平均医径な有する。 別の半浸透性膜又は層では前記直径は１０〜２０Ｘのオーダー又はそれより小さ いオーダーであり得る。 グルは荷電ポリマーで形成し得る。電気泳動で使用されるポリマーとしては、ポ リアクリルアミド、アガロース、アミトン、寒天又はゲロースが挙げられる。 ポリマーの電荷乞増加すると浸透現象が強くなる。 ゲルの構造は多様である。円柱形状が最も簡単なものであると思われるが、例え ばドラム又はプレート形状も使用し得る。 緩衝液も、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液又はトリスタイプ、即 ちトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液を含めた広範囲の適切な系 の中から選択し得る。 本発明は分離用電気泳動法を実施するための装置にも踊る。 この装置は、 一電気泳動中に生じる電気浸透現象を利用するのに必要な半浸透性部材と、 一前記半浸透性部材を生成物の移動方向と逆の方向に回かって通過する緩衝液に より、ゲルから出現する生成物を外部へ排出せしめる排出手段 とを備えることン特徴とする。 前記半浸透性部材は有利には前述の如く構成される。 １つ以上の排出管は、ゲルから出現する所定タイプの住成物ｒｙ）分子（、Ｒで を同１１５ｉ’１４ｉつｒｎ　＜Ｕ＞　ｉｉａσ−）時間−”Ｊ−’Ｆ　Ｉｆｊ 　５　ｌｖようｉｃ　Ｋｔ　ｆｆｆｉ：@Ｉ。 、−［け才１げなｒｌない２゜ コｏ）％ｌ１体排出Ｊ、（・段は、５１茹定的Ｋ　ケｔ　Ｊ）；！［ｉ　＠　− ’ｉ’　段””’ニー　＆Ｊ　ＪｚＺ　（”＝：１１、ＨＪ：ｒにゲットの寸１ ．靴ｆイ＼育丁かただ！、　；１区）　ｉｌｌ’　ｆｉｌｌ　＋　’７ン（１１ 午径（１）小さいゲルの場合にはゲ７ｌ−１７）傍に配ｂ）シ得、り１′法ｔｌ ”Ｊ大Ｂ　Ｌ・り５刀・の場＠にはゲル表面の中央（′こ配亡′シ２府り。こσ ）ように配６′すオｔは、同−ｍの生成物の分子が総て同時に排出されなし・時 に生起する生成物再混合が回避され、装置σ）分離能力カー増大する。 別の構成では、本発明の′電気泳動装置は冷却回路ビ有する。 例えば、前述のｉｏ＜下方電極緩衝液ケ収容’ｆる容器χ備える装置のｊ重合に は、この容器が上方電極緩衝液容器の低まで持上本体に含まれる蛇管により下方 駿衝液ｔ−＃て電気泳動カラムを冷却する冷却液が導入される。例えば棒磁石７ ：ｌ）らなる攪拌手段を使用すれば熱交換を同上させることができる。 以下添付図面に基づき本発明ｔより詳細に説明する。これら中 図面第１図及び第２図は夫々本発明の電気泳動条件の具体例乞示している。 第１図にはゲ／ｌ／２と、その上に配］庁された回収丁べき生成物を含む試料３ とを収容するガラス製円筒管１かもなる容器乞■−Ｊ−７，）　７ｆｊ、　気泳 ぶ１１１１ノ；　１７　・、ど：”ｉｌｌ　ノ゛：　。 ”ｆ？直の、１丁”ノ、ン８］只、）、ンルＩ）。・十１；モの（イ＋ｌ　４　 ｉ、Ｑ　’ｌ・７１τ’　Ｎ（りｌ汐シ］・企芹、、そ＼１P．ごの槽 Ｕ）　４．＋　１ＬＣＩＩｌｖ容キλ′７、

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Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．第１緩衝系を使用して生成物の溶離を行ないながらゲル電気泳動により所与 の試料から生成物を精製する方法であつて、−分離すべき生成物の移動終了ゾー ンに対応するゲル表面と平行に、この表面から０であつてもよいような極めて小 さい距離をおいて気密的に保持された半浸透性部材を通して、前記生成物の移動 方向と逆の方向に第２緩衝液を流し（ただし、前記半浸透性部材の孔は溶離され た生成物の粒子とほぼ同じ大きさを有する）、 −電気泳動にかけられた生成物を前記緩衝液によつて排出し、且つ −これら生成物を回収する ことからなることを特徴とする方法。
2. ２．溶離チヤンバの容積が１ｍｍより小さく、有利には２／１０もしくは３／１ ０ｍｍ、又は０でさえあることを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．精製処理すべき試料をゲルカラムの最上部に配置し、このカラムの上方部分 は電極を備えた容器に入つている緩衝液、則ち上方電極緩衝液に浸漬し、前記カ ラムの半浸透性部材で規定された溶離チヤンバを有する下方部分は別の電極を備 えた容器に入つている緩衝液、即ち下方電極緩衝液に接触させ、前記半浸透性部 材を通して下方電極緩衝液を生成物の移動方向と逆の方向に流すことを特徴とす る請求の範囲１又は２に記載の方法。
4. ４．ゲルが円筒、ドラム又はプレートの形状を有することを特徴とする請求の範 囲１から３のいずれかに記載の方法。
5. ５．分離用電気泳動法を実施するための装置であつて、−電気泳動中に生起する 電気浸透現象の利用を可能にする半浸透性部材と、 −前記半浸透性部材を生成物の移動方向と逆の方向に通過する緩衝液により、ゲ ルから出現する生成物を外部へ排出せしめる排出手段 とを有することを特徴とする装置。
6. ６．１つ以上の排出管がゲルから出現する所定タイプの分子を総て同時に且つ最 小限の時間で排出するように配置されることを特徴とする請求の範囲５に記載の 装置。
7. ７．更に冷却回路をも備えることを特徴とする請求の範囲５又は６に記載の装置 。
8. ８．分離用電気泳動法を実施するための装置であつて、−ゲル２と、その上に配 置された回収すべき生成物を含む試料３とを収容するガラス製円筒管１からなる 容器、−槽４に収容された上方電極緩衝液５に浸漬される管１の上方部分、 −ネジ付ツバ７により管１の下端のゲルの周囲で気密的に保持され、極めて小さ い容量の溶離チヤンバ８を規定する半浸透膜６、 −管１の下方部分を浸漬するための下方電極緩衝液９を収溶する下方槽１０、 −槽４及び槽１０の内側壁面に夫々固定されたカソード１１及びアノード１２、 −端が半浸透膜６に当接し他端が画分コレクタ１６方向へ外側に突出するように ネジ付ツバ７によつて管１に対して保持される管１５ な備えることを特徴とする装置。
9. ９．請求の範囲５から８のいずれかに記載の装置、並びに請求の範囲１から４の いずれかに記載の方法の、化学的又は生物学的組成物、特にタンパク質とりわけ 酵素及び核酸の精製への使用。