DE69534386T2

DE69534386T2 - Freigabe von intrazellulärem material

Info

Publication number: DE69534386T2
Application number: DE69534386T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Sophie MARTIN; Karin Bergmann; Vera Denise POLLARD-KNIGHT
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1995-08-25
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2015-08-26
Also published as: US6811981B2; US20020151694A1; US6335161B1; DE69534386D1; US20050003436A1; JPH11511322A; ATE302264T1; JP3751979B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Bewirken der Freigabe von intrazellulärem Material aus Zellen.
Gängige Verfahren zum Aufschluss von Zellen und Isolieren von intrazellulärem Material sind arbeitsintensiv sowie zeitaufwendig und machen eine Reihe von Schritten erforderlich. So zum Beispiel benötigt das Präparieren von DNS aus Bakterien eine Laborabfolge von nicht weniger als 10 Schritten. Um einen effizienten Zellaufschluss bei gramnegativen Bakterien zu erreichen, ist eine Behandlung mit Reagenzien, wie zum Beispiel EDTA, und das Digerieren mit Enzymen, wie zum Beispiel Lysozym und RNAse erforderlich. Diesem folgt ein Kälteschock, ein osmotischer Schock oder Aufkochen zur Freigabe des intrazellulären Materials. Im Anschluss daran sind vielfache Schritte zum Aufsammeln der Nukleinsäuren aus dem aufgeschlossenen Präparat notwendig.
Im Falle einer Isolierung von DNS aus einem Genom im Gefolge eines Aufschlusses von Zellen zur Freigabe der DNS sind dies:
Digerieren der RNS und Proteine mit Enzymen,
Entfernen von Verunreinigungen, für gewöhnlich mit Lösungsmittelextraktion, und schließlich,
Dialyse oder ethanolische Fällungsschritte zum Erhalt eines reinen Präparats.
Die Extraktion von Plasmiden umfasst einen Zellaufschluss und eine selektive Fällung der DNS aus dem Genom, wonach sich die Reinigung der DNS aus dem Plasmid über eine Gradientenzentrifugation oder Chromatographie mittels Ionenaustausch anschließt. Die aktuell in Gebrauch befindlichen Techniken zur Extraktion von DNS schließen eine Extraktion mittels Phenol – Chloroform und Aussalzungsverfahren für die DNS aus Genomen, darüber hinaus im Hinblick auf Plasmid-DNS noch den Dichtegradienten über Cäsiumchlorid/Ethidiumbromid sowie Ionenaustauschersäulen mit ein. Weiterhin sind Laborsätze für die Reinigung von DNS und Fragmenten der DNS, die auf der Fällung der DNS unter chaotropen Bedingungen beruhen, weit verbreitet im Einsatz. Alle diese Techniken weisen ihre Begrenzungen auf. Zum Beispiel sind Dichtegradienten und die Extraktion mittels Phenol/Chloroform beim Einsatz zeitaufwendige Verfahren, welche zur Durchführung bis zu 24 Stunden benötigen. Ferner ist der verschwenderische Umgang mit Phenol für diese Zwecke auf Grund seiner giftigen und ätzenden Natur höchst unerwünscht. Verfahren zum Isolieren großer Fragmente von DNS kann zum Abscheren von DNS führen.
Es ist bekannt, dass eine Elektroporation unter Anlegen von Spannungen im Kilovoltbereich die Freigabe von intrazellulärem Material durch die permeabilisierte Membran hindurch bewirken kann, wobei dieses vorübergehend während des Elektroporationsvorganges gewonnen wird, siehe beispielsweise P. E. Brodelius, C. Funk, R. D. Shillito in Plant Cell Reports, 7, S. 186 (1988) und D. M. Heery, R. Powell, F. Gannon und L. K. Dunican in Nuc. Acids Res., 17, S. 10131, (1989).
Die Elektroporation umfasst die Anwendung hoher Spannungen, welche in typischer Weise 1 KV übersteigen, und zwar in Form von Pulsstößen kurzer Dauer in der Größenordnung von Millisekunden. Im allgemeinen wird der Feldgradient zwischen den Elektroden, an denen die Spannung im Hinblick auf die Suspension angelegt wird, welche die zu elektroporierenden Zellen enthält, 1 KV pro cm übersteigen. Dies macht eine ausgeklügelte und teure Apparatur erforderlich.
Es hat sich nun herausgestellt, dass die Möglichkeit besteht, die Freigabe von intrazellulärem Material aus Zellen durch das Anlegen von Spannungen einer niedrigeren Größenordnung zu bewirken, welche früher in einer derartigen Art und Weise nicht für möglich gehalten wurde im Hinblick auf den Angriff auf die Struktur der Zellmembran.
Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bewirken der Freigabe von intrazellulärem Material aus Zellen geschaffen, welches das Anlegen einer Spannung von nicht mehr als 50 Volt an eine Suspension mit einem Gehalt an den genannten Zellen mit umfasst.
Vorzugsweise liegt die Spannung im Bereich von 0,5 bis 50 Volt mit einer starken Bevorzugung von Spannungen im unteren Teil dieses Bereiches, beispielsweise von 0,5 bis 15 Volt, am meisten bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 Volt.
Die Spannung kann eine Gleichstrom- oder Wechselstromspannung sein.
Im Unterschied zur Praxis bei der Elektroporation kann die Spannung kontinuierlich angelegt werden, und zwar um übermäßige Erhitzungseffekte zu vermeiden, welche dann ein Problem werden können, wenn die Spannung 15 Volt übersteigt. In bevorzugter Weise wird die Spannung für die Zeitdauer von mindestens 30 Sekunden, in höchst bevorzugter Weise 2 Minuten, zum Beispiel 2 bis 20 Minuten, angelegt. Vorzugsweise wird die Spannung kontinuierlich für die oben stehend spezifizierte Zeitdauer angelegt, wobei diese Prozedur jedoch wiederholt werden kann, zum Beispiel durch das Anlegen der Spannung für wiederholte Perioden mehrerer Sekunden bis zu mehreren Minuten, zum Beispiel 5 Sekunden bis zu 10 Minuten.
Die Elektroden, an denen die Spannung angelegt wird, können einen Abstand von 10 mm oder weniger, zum Beispiel 5 bis 7 mm, aufweisen. Es können aber vorzugsweise die Bedingungen zum Bewirken der Denaturierung der doppelsträngigen DNS, die aus den Zellen frei gegeben wird, optimiert werden, wobei in diesem Falle ein schmälerer Elektrodenabstand wünschenswert sein dürfte. Um die Denaturierung der frei gesetzten DNS zu vervollständigen, wird in bevorzugterer Weise die Spannung an die Suspension zwischen den ganz eng nebeneinander befindlichen Elektroden angelegt, die vorzugsweise einen Abstand von nicht mehr als 1,5 mm und in der am meisten bevorzugten Weise nicht mehr als 0,5 mm aufweisen.
Eine der Elektroden kann aus einem Behälter aus leitfähigem Material bestehen, der die zu behandelnde Probe enthält.
Das Verfahren lässt sich zum Bewirken des Zellaufschlusses und der Freigabe von intrazellulären Materialien einschließlich Proteinen und Nukleinsäuren, doppelsträngiger DNS, sowie andere Biomoleküle mit inbegriffen, durchführen. In der Anmeldung PCT/GB95/00 542 ist ein Verfahren zum Bewirken der Denaturierung doppelsträngiger Nukleinsäure unter Einsatz einer Apparatur beschrieben, die sich für den Gebrauch bei der vorliegende Erfindung eignet. Dieses Verfahren selbst stellt eine Verbesserung von Verfahren zur elektrochemischen Denaturierung doppelsträngiger Nukleinsäure dar, wie sie in der WO92/04 470 und der WO93/15 224 beschrieben sind. Gemäß der Offenbarung in jenen Spezifikationen kann die Nukleinsäure reversibel durch die Beaufschlagung einer elektrischen Spannung denaturiert werden, wobei eine derartige Denaturierung als Schritt bei einer Anzahl von komplexeren Aufgaben einschließlich von Studien zur Hybridisierung und Prozeduren zur Nukleinsäurevermehrung, wie zum Beispiel der PCR, eingesetzt werden kann.
Nukleinsäuren, die aus Zellen anhand von Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung freigesetzt wurden, lassen sich ferner entsprechend den Lehren dieser Spezifikationen weiter verarbeiten.
Demgemäß schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von einzelsträngiger Nukleinsäure mit ein, das die Freigabe von doppelsträngiger Nukleinsäure aus Zellen durch das Anlegen einer Spannung von nicht mehr als 50 Volt an eine Suspension mit den genannten Zellen mit einer Elektrode zum Freisetzen der Nukleinsäure aus den genannten Zellen und Denaturieren der doppelsträngigen Nukleinsäure durch das Beaufschlagen der bezeichneten Suspension mit der gleichen oder einer davon verschiedenen Spannung an den genannten Elektroden mit umfasst, wobei die besagte doppelsträngige Nukleinsäure in die einzelsträngige Nukleinsäure umgesetzt wird.
Der Spannungsbereich, innerhalb dessen das Bewirken der Denaturierung auf diese Weise erzielbar ist, soll nicht so breit sein wie der Spannungsbereich, der für das Bewirken des Zellaufschlusses passend ist; demzufolge wird im Stadium der Denaturierung eine Spannung im Bereich von 0,5 bis 3 Volt, in bevorzugterer Weise von 1,5 bis 2,5 Volt in Form der gemessenen Spannungsdifferenz zwischen den Elektroden angelegt.
Gemäß der Beschreibung in der WO92/04 470 lässt sich eine Promotorenverbindung, wie zum Beispiel Methylviologen zum schnelleren Bewirken der Denaturierung einsetzen.
In allgemeinerer Weise kann der Promotor in Form eines beliebigen anorganischen oder organischen Moleküls vorliegen, das die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Denaturierung der Doppelhelix steigert. Es sollte in dem gewählten Reaktionsmilieu löslich sein. Vorzugsweise beeinträchtigt oder stört es nicht die DNS oder andere Materialien, wie zum Beispiel Enzyme oder Oligonukleotidsonden, die in der Lösung vorhanden sein können. Alternativ lässt sich der Promotor an der Elektrode immobilisieren oder in ein Material einschließen, aus welchem die Elektrode aufgebaut ist. Dies kann eine wasserlösliche Verbindung aus der Reihe Bipyridyle sein, speziell ein Viologen, wie zum Beispiel ein Methylviologen oder eines seiner Salze. Während der Mechanismus der Funktion eines derartigen Promotors derzeit nicht mit Sicherheit bekannt ist, wird davon ausgegangen, dass die positiv geladenen Viologenmoleküle mit den negativ geladenen Nukleinsäuren, wie zum Beispiel DNS, und der negativ geladenen Kathode zum Vermindern des dazwischen entstehenden elektrostatischen Rückstoßes in Wechselwirkung treten; somit wird die Annäherung der DNS an die Elektrodenoberfläche dort begünstigt, wo das elektrische Feld am stärksten ist. Dementsprechend werden (von uns) bevorzugt solche Promotorverbindungen eingesetzt, die mit einem Abstand voneinander positiv geladene Zentren aufweisen, zum Beispiel bipolar positiv geladene Verbindungen. In bevorzugter Weise ist der Abstand zwischen den positiv geladenen Zentren ähnlich dem Abstand, wie er in positiv geladenen Zentren im Viologen ist. Andere geeignete Viologenverbindungen schließen das Ethylviologen, Isopropylviologen und das Benzylviologen mit ein.
Weitere Promotoren sind in der WO93/15 224 beschrieben, zum Beispiel mehrwertige Kationen, wie zum Beispiel Magnesium. Andere mehrwertige Kationen, die effizient und einsetzbar sind, schließen das Lanthan (La³⁺) mit ein. Promotoren in Form von Kationen können anorganische Kationen, die mit anorganischen oder organischen Liganden komplexiert sind, zum Beispiel Pt(NH₃)₆ ⁴⁺ und Cr(NH₃)₆ ²⁺, mit einschließen. Das Verfahren der Freigabe von intrazellulärem Material gemäß der vorliegenden Erfindung lässt sich in An- oder Abwesenheit eines derartigen Promotors in die Praxis umsetzen, oder auch in An- oder Abwesenheit einer die Freigabe fördernden Menge eines beliebigen Promotors.
Zumindest im Stadium der Denaturierung wird dort, wo die Elektroden die dichteste Annäherung aneinander aufweisen, eine oder beide Elektroden angespitzt werden. Eine derartige Elektrode lässt sich mit einer einzelnen Spitze oder einer Vielzahl von Spitzen versehen. Es dürfte dabei ein gewisser innerer Zusammenhang zwischen der angelegten Idealspannung und der Elektrodenform bestehen, wobei möglicherweise ein bevorzugter oder idealer Feldgradient an der Elektrodenspitze besteht, welcher durch die Einjustierung der Spannung in Angleichung an die Schärfe des Elektrodenteils, an dem die Denaturierung stattfindet, erzielbar ist. Je nach Wunsch lässt sich die Denaturierung unter Benutzung einer Konstantstromquelle durchführen, und zwar besser als durch eine geregelte Spannung; dies kann zum Kompensieren von Schwankungen beim geometrischen Aufbau der Elektroden zwischen den verschiedenen Denaturierungsvorgängen dienen.
Dort, wo ein Konstantstromprogramm angewendet wird, dürfte es im allgemeinen bevorzugt sein, einen Strom im Bereich von 80 bis 160 μA, zum Beispiel etwa 100 bis 125 μA, fließen zu lassen.
Das Verfahren lässt sich auch je nach Wunsch unter Einsatz eines Drei-Elektrodensystems in der Art durchführen, wie sie in der WO92/04 470 beschrieben ist; im allgemeinen aber ist in bevorzugter Weise das Volumen der verwendeten Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung klein, zum Beispiel 1 ml oder weniger, vorzugsweise sehr klein, zum Beispiel 100 μl oder weniger, zum Beispiel etwa 25 μl bis zu 40 μl. In dem Falle, dass äußerst kleine Reaktionsvolumina dieser Art zum Einsatz gelangen, dürfte es im allgemeinen nicht praktisch sein, ein Drei-Elektrodensystem zu benutzen.
Die Verfahren, zum Beispiel zum Zellaufschluss und zur Denaturierung lassen sich jeweils bei Umgebungstemperaturen oder gewünschtenfalls bei Temperaturen nahe an der Vorschmelztemperatur der Nukleinsäure durchführen. Jedes Verfahren lässt sich bei einem pH-Wert im Bereich zwischen 3 und 10, günstigerweise bei etwa 7 ausführen. Im allgemeinen wird bei einem niedrigeren pH-Wert eine schnellere Denaturierung erreicht. Deshalb kann für einige Zwecke ein pH-Wert von etwas unterhalb von neutral, zum Beispiel etwa pH 5,5 bevorzugt sein. Die Zellen können in einer wässrigen Lösung mit einem Gehalt an einem Puffer suspendiert werden, dessen Natur und Ionenstärke so beschaffen sind, dass bei dem Verfahren der Separierung des Stranges keine gegenseitige Störung eintritt.
Vorzugsweise enthält die Lösung einen Puffer in einer Konzentration von mindestens 10 mM, zum Beispiel etwa 25 mM. Je nach Wunsch kann die Lösung ferner noch Salze, wie zum Beispiel Magnesiumchlorid und Natriumchlorid enthalten. In bevorzugter Weise wird das Verfahren in einem Puffer der Art durchgeführt, wie sie bei den PCR- und LCR-Prozeduren angewendet wird.
Vorzugsweise beträgt daher die Ionenstärke der Lösung mehr als 20 mM, zum Beispiel 25 bis 50 mM.
Die Freigabe von Nukleinsäure und das Verfahren zur Denaturierung gemäß der Erfindung können als Schritte bei einer Anzahl komplexerer Verfahren eingebaut werden, zum Beispiel Verfahren unter Einbeziehung der Analyse und/oder Vermehrung von Nukleinsäure. Einige Beispiele für derartige Verfahren sind unten stehend beschrieben.
Es wurde (von uns) festgestellt, dass es auf Grund des überlegenen elektrochemischen Zellkonzepts gemäß der Beschreibung in der PCT/GB)95/00 542 die Möglichkeit besteht, eine Denaturierung innerhalb von weniger als 3 Minuten, zum Beispiel ab 1 bis 2 Minuten oder weniger selbst in Anwesenheit von Materiellen, z.B. in Form von PCR-Puffersubstanzen, zu erreichen.
Dies ermöglicht es, ein Verfahren zur wiederholten Denaturierung doppelsträngiger Nukleinsäure zu praktizieren, bei welchem die Nukleinsäure durch das oben stehend beschriebene Verfahren denaturiert wird, wobei die Spannung als Aufeinanderfolge von wiederholten Pulsationen mit einer Dauer von bis zu 2 Minuten, vorzugsweise bis lediglich zu 1 Minute, beaufschlagt wird. Zwischen den Pulsationen kann die Spannung weggenommen oder umgekehrt werden, und zwar für eine Zeitdauer, welche in bevorzugter Weise die Länge der Periode hat, während der die Spannung angelegt ist. Es besteht die Möglichkeit, Pulsationen einer beträchtlich höheren Frequenz einzusetzen als oben stehend beschrieben ist, zum Beispiel von 1 bis 100 Hz. Je nach dem Zweck, für welchen die Denaturierung durchgeführt wird, ist es ggf. nicht notwendig, jede beliebige Menge an Umsetzung von doppelsträngiger Nukleinsäure in die einzelsträngige Nukleinsäure bei jedem Denaturierungszyklus zu erzielen. Es mag ausreichend sein, die Denaturierung lediglich elektrochemisch zu initiieren. Beispielsweise kann während einer Vermehrungsprozedur in dem Falle, dass eine ausreichende Denaturierung abläuft, um einen Primer zu binden, auf die Verlängerung des Primers durch Nuklease Verlass sein, wobei der nicht vom Primer erfasste Strang der ursprünglichen Nukleinsäure von seinem Bindungspartner über die Restlänge der Nukleinsäure deplatziert wird.
Gemäß der Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Vermehrung der Zielsequenz von Nukleinsäure unter Einschluss der Hybridisierung, Vermehrung und Denaturierung von Nukleinsäure geschaffen, bei dem die Nukleinsäure aus der Zelle, wie oben stehend beschrieben, freigegeben wird; dabei wird die bezeichnete Denaturierung in der Weise durchgeführt, dass eine Lösung mit einem Gehalt an der genannten Nukleinsäure mit einer Spannung zwischen Elektroden für eine Zeitdauer von bis zu 2 Minuten beaufschlagt wird, und zwar unter solchen Bedingungen, dass mindestens eine Teilmenge der Nukleinsäure in die vollständig oder partiell einzelsträngige Form in Lösung umgesetzt wird. Vorzugsweise ist die in einem derartigen Verfahren verwendete Elektrodenkonfiguration wie oben stehend beschrieben. Vorzugsweise wird die Spannung in Form wiederholter Pulsationen für eine Dauer von bis zu 1 Minute beaufschlagt, jedoch vorzugsweise kürzer, zum Beispiel bis zu 0,1 Minuten oder sogar noch kürzer, zum Beispiel bei 1 bis 100 Hz.
Vorzugsweise ist die Vermehrungsprozedur eine PCR (Polymerase-Kettenreaktion) oder LCR (Ligase-Kettenreaktion).
Somit schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Replizieren einer Nukleinsäure mit ein, welches folgende Maßnahmen umfasst: Freigabe doppelsträngiger Nukleinsäure aus Zellen mittels ei nes oben stehend beschriebenen Verfahrens; Abtrennen der Stränge aus einer Probe mit doppelsträngiger Nukleinsäure in Lösung unter der Einwirkung einer elektrischen Spannung, die an die Lösung vonseiten einer Elektrode angelegt wird; Hybridisieren der abgetrennten Stränge der Nukleinsäure mit mindestens 1 Oligonukleotid-Primer(-Starter), welcher mit mindestens einem der Stränge der denaturierten Nukleinsäure hybridisiert; Synthese eines Verlängerungsproduktes des Primers oder jeden Primers, welcher in hinreichender Weise zu dem jeweiligen Strang der Nukleinsäure komplementär ist, um damit eine Hybridisierung zu erzielen; sowie das Abtrennen des Verlängerungsproduktes oder jedes Verlängerungsproduktes aus dem Nukleinsäurestrang, mit dem zur Gewinnung des Verlängerungsproduktes die Hybridisierung erfolgt.
Das Replikationsverfahren kann ein Schritt in einem 3 SR- oder NASBA-Vermehrungsverfahren oder einem Labortest zur Strangversetzung sein.
In einem derartigen, durch eine Polymerase vermittelten Verfahren, zum Beispiel einer Kettenreaktionsprozedur auf Basis von Polymerase, braucht die Denaturierung nicht in allen Fällen bis zu dem Punkt durchgeführt werden, dass vollständig einzelsträngige Moleküle der Nukleinsäure produziert werden. Es kann ausreichen, eine hinreichende lokale und/oder vorübergehende Schwächung oder Abtrennung der Doppelhelix an der Primer-Hybridisierungsstelle zu bewirken, so dass dem Primer die Möglichkeit gegeben wird, an seinem Ziel anzubinden. Sobald der Primer auf einem der ersten der Zielstränge in Position ist, wird die Rehybridisierung der Zielstränge in der Primer-Region unterbunden, wobei der andere Zielstrang fortschreitend durch die Verlängerung des Primers oder durch eine weitere vorübergehende Schwächung oder Abtrennungsprozeduren versetzt wird.
Vorzugsweise umfasst das genannte Replikationsverfahren ferner noch die Wiederholung der oben stehend definierten Prozedur in zyklischer Abfolge, zum Beispiel für mehr als 10 Zyklen, beispielsweise bis zu 20 oder 30 Zyklen. Bei dem Verfahren wird der Hybridisierungsschritt vorzugsweise unter Einsatz von 2 Primern durchgeführt, die zu den verschiedenen Nukleinsäuresträngen komplementär sind.
Die Denaturierung zur Gewinnung der Verlängerungsprodukte ebenso wie das ursprüngliche Denaturieren der Zielnukleinsäure werden vorzugsweise durch das Anlegen der Spannung an die Lösung vonseiten der Elektroden durchgeführt.
Das Verfahren kann ein Standard- oder klassisches PCR-Verfahren zur Vermehrung sein, wobei mindestens 1 spezielle Nukleinsäuresequenz in einer Nukleinsäure oder einem Gemisch aus Nukleinsäuren vorhanden ist, worin jede Nukleinsäure aus 2 separaten, komplementären Strängen gleicher oder ungleicher Länge besteht und wobei das Verfahren die folgenden Maßnahmen umfasst:

(a) Behandeln der Stränge mit 2 Oligonukleotidprimern zum Vermehren jeder unterschiedlichen, speziellen Sequenz unter solchen Bedingungen, dass für jede zu vermehrende unterschiedliche Sequenz ein Verlängerungsprodukt für jeden Primer synthetisiert wird, das zu jedem Nukleinsäurestrang komplementär ist, wobei die genannten Primer so ausgewählt werden, dass sie im Wesentlichen zu den unterschiedlichen Strängen jeder speziellen Sequenz komplementär sind, so dass das aus 1 Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt im Falle der Abtrennung vom Komplement (der Komplementärverbindung) als "Schablone" ("Matrize") für die Synthese des Verlängerungsproduktes des anderen Primers dienen kann;
(b) Abtrennen der Verlängerungsprodukte des Primers von den Schablonen, auf denen sie zur Gewinnung der einzelsträngigen Moleküle durch das Anlegen der Spannung an das Reaktionsgemisch vonseiten der Elektroden synthetisiert wurden; sowie
(c) Behandeln der einzelsträngigen Moleküle, die aus dem Schritt (b) mit den Primern gemäß dem Schritt (a) unter solchen Bedingungen stammen, dass ein Primerverlängerungsprodukt derart synthetisiert wird, dass jeder der gemäß dem Schritt (b) hergestellten Einzelstränge als Schablone eingesetzt wird.

In alternativer Weise kann das Verfahren eine beliebige Variante des klassischen oder Standard-PCR-Verfahrens sein, zum Beispiel das "umgekehrte" oder "Umkehr"-PCR-Verfahren oder auch das "Verankerungs"-PCR-Verfahren.
Gemäß der Erfindung ist deshalb der Einsatz eines Vermehrungsverfahrens, wie oben beschrieben, mit eingeschlossen, bei dem ein Primer zu einer ringförmigen Nukleinsäure hybridisiert wird, welche gemäß der Beschreibung aus einer Zelle freigesetzt wurde und zur Bildung eines Doppels verlängert wird, das durch die Beaufschlagung der denaturierenden Spannung denaturiert wird, wobei je nach Wunsch das Vermehrungsverfahren über 1 Zyklus oder mehrere zusätzliche Zyklen hinweg wiederholt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung lässt sich bei der Kettenreaktion mittels Ligase einsetzen. Demgemäß schließt die Erfindung ein Verfahren zur Vermehrung einer Zielnukleinsäure mit ein, das die Schritte der Freisetzung der Zielnukleinsäure aus der Zelle, wie beschrieben umfasst, woran sich die folgenden Maßnahmen anschließen:

(a) Vorlegen von Nukleinsäure aus einer Probe in Form von einzelsträngiger Nukleinsäure;
(b) Vorlegen von mindestens 4 Nukleinsäuresonden in der Probe, bei denen
(i) die erste und zweite der bezeichneten Sonden primäre Sonden, und die dritte und vierte der genannten Sonden sekundäre Nukleinsäuresonden darstellen;
(ii) die erste Sonde einen Einzelstrang darstellt, der dazu befähigt ist, mit einem ersten Segment eines Primärstranges der Zielnukleinsäure zu hybridisieren;
(iii) die zweite Sonde einen Einzelstrang darstellt, der dazu befähigt ist, mit einem zweiten Segment des bezeichneten Primärstranges der Zielnukleinsäure zu hybridisieren;
(iv) das 5'-Ende des ersten Segments des genannten Primärstranges des Ziels in Bezug auf das 3'-Ende des zweiten Segments des genannten Primärstranges des Ziels positioniert wird, um das Verknüpfen des 3'-Endes der ersten Sonde mit dem 5'-Ende der zweiten Sonde zu ermöglichen, und zwar in dem Falle, dass die bezeichneten Sonden mit dem genannten Primärstrang der bezeichneten Zielnukleinsäure hybridisiert werden;
(v) die dritte Sonde dazu befähigt ist, mit der ersten Sonde zu hybridisieren; sowie
(vi) die vierte Sonde dazu befähigt ist, mit der zweiten Sonde zu hybridisieren; und
(c) (i) Hybridisieren die genannten Sonden mit der Nukleinsäure in der bezeichneten Probe;
(ii) Ligieren der hybridisierten Sonden zur Bildung der reorganisierten fusionierten Sondensequenzen; sowie
(iii) Denaturieren von DNS in der bezeichneten Probe durch das Anlegen einer Spannung an das Reaktionsgemisch.

Die Freigabe von DNS auf elektrochemischem Wege und die Technik der Vermehrung lässt sich analytisch zum Aufspüren und Analysieren einer äußerst winzigen Probe mit DNS, zum Beispiel einer Einzelkopie eines Gens in einer tierischen oder bakteriellen Zelle einsetzen.
Die Temperatur, bei welcher das Verfahren ausgeführt wird, kann in passender Weise je nach beliebigem eingesetzten Enzym gewählt werden. Somit wird dort, wo Taq als Polymerase (aus Thermophilus aquaticus) benutzt wird, eine Temperatur von 55 bis 68°C bevorzugt. Im Falle des Einsatzes von Klenow-Polymerase sollte die Umgebungstemperatur passen. Es kann wünschenswert sein, bekannte Techniken zur Stabilisierung von Proteinen anzuwenden, um eine strombedingte Beschädigung an der Polymerase zu vermeiden, insbesondere dann, wenn eine Mesophyll-Polymerase verwendet wird.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Aufspüren der An- oder Abwesenheit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz in einer Zelle mit eingeschlossen, welches folgende Maßnahmen umfasst: Freigabe von Nukleinsäure aus der Zelle gemäß der Beschreibung, Denaturieren der freigesetzten doppelsträngigen Nukleinsäure mittels einer an die Nukleinsäure angelegten Spannung; Hybridisieren der denaturierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotidsonde für die Sequenz; sowie die Bestimmung des Umstandes, ob die genannte Hybridisierung eingetreten ist.
Somit findet das erfundene Verfahren seine Anwendung bei der Hybridisierung von DNS und RNS, und zwar dort, wo eine spezielle Gensequenz zu identifizieren ist, zum Beispiel eine solche, die für einen besonderen Organismus oder für eine besondere Erbkrankheit spezifisch ist, wofür die Sichelzellenkrankheit ein Beispiel darstellt. Zum Aufspüren einer speziellen Sequenz ist es zunächst notwendig, eine Probe der DNS zu präparieren, und zwar durch die Freisetzung der DNS aus einer Zelle gemäß der Beschreibung, welche in der nativen doppelsträngigen Form vorliegt. Sodann ist es notwendig, die doppelsträngige DNS in die einzelsträngige Form umzuwandeln, bevor ein Hybridisierungsschritt mit einer markierten Nukleotidsonde, welche eine komplementäre Sequenz zu der DNS-Probe aufweist, ablaufen kann. Das Verfahren gemäß der Erfindung lässt sich für diesen Zweck in einer bevorzugten Weise durch das Ausführen der folgenden Schritte einsetzen:

– Freisetzung der DNS aus einer Zelle vermittels des Verfahrens gemäß obiger Beschreibung;
– Denaturierung der DNS durch das Anlegen einer Spannung an die DNS-Probe mittels einer Elektrodenanordnung gemäß Beschreibung, wobei je nach Wunsch ein Promotor in der Lösung oder an die Elektrodenstruktur gebunden ist oder einen Teil von ihr darstellt;
– Hybridisieren der denaturierten DNS mit einer direkt oder indirekt markierten Nukleotidsonde, die zu der Sequenz, die von Interesse ist, komplementär ist; sowie
– Bestimmung des Umstandes, ob die Hybridisierung eingetreten ist, wobei diese Bestimmung die Erkennung der Anwesenheit der Sonde sein kann, wobei diese Sonde direkt radio-, fluoreszenz-, chemiluminiszenz- oder enzymmarkiert ist oder eine indirekt markierte Sonde darstellt, die Biotin trägt, an die beispielsweise später ein markiertes Avidin oder ein Molekül vom Avidintyp gebunden werden kann.

Bei einem typischen DNS-Sondenlabortest wird traditionellerweise die Proben-DNS an einer Oberfläche einer Membran immobilisiert, welche aus neutralem oder geladenem Nylon oder Nitrocellulose besteht. Die Immobilisierung lässt sich durch Wechselwirkungen der Ladungen oder durch "Backen" der Membran mit einem Gehalt an DNS in einem Ofen erzielen. Die Proben-DNS kann auf eine hohe Temperatur erhitzt werden, um die Umsetzung in die einzelsträngige Form vor der Bindung an die Membran sicher zu stellen, oder sie kann, sobald sie auf der Membran ist, mit Alkali behandelt werden, um die Umsetzung in die einzelsträngige Form zu gewährleisten. Die Nachteile derartiger Verfahren sind folgende:

– Erhitzen auf eine hohe Temperatur zur Darstellung der einzelsträngigen DNS kann eine Beschädigung der Proben-DNS selbst verursachen;
– die Verwendung von Alkali macht einen zusätzlichen Schritt der Neutralisation erforderlich, bevor die Hybridisierung mit der markierten Sonde ablaufen kann.

Ein verbessertes Verfahren zur Durchführung von Hybridisierungstests mit DNS-Sonden besteht in der so genannten "Sandwich"-Technik, wonach ein spezielles Oligonukleotid auf einer Oberfläche immobilisiert wird. Die Oberfläche mit dem speziellen Oligonukleotid darauf wird sodann mit einer Lösung mit einem Gehalt an der Ziel-DNS in einzelsträngiger Form hybridisiert, worauf dann ein zweites markiertes Oligonukleotid hinzugefügt wird, welches ebenfalls mit der Ziel-DNS hybridisiert. Die Oberfläche wird danach zur Entfernung des ungebundenen markierten Oligonukleotids gewaschen, wonach jede beliebige Markierung, die an die Ziel-DNS gebunden wurde, später aufgespürt werden kann.
Diese Prozedur lässt sich durch den Einsatz des Zellaufschlusses und Denaturierungsverfahren gemäß der Erfindung vereinfachen, um die Ziel-DNS von der doppelsträngigen in Richtung der benötigten einzelsträngigen DNS zu denaturieren, welche zu dem immobilisierten Oligonukleotid hybridisieren kann. Die Arbeitselektrode, Gegenelelektrode und ggf. eine Referenzelektrode und/oder der Promotor lassen sich auf eine Testfläche auf- oder in ein Näpfchen einbringen, worauf bzw. worin der Labortest auf der Basis der DNS-Sonde durchgeführt werden soll. Die Zellprobe und die Oligonukleotidsonden können sodann hinzugefügt werden, wonach die Spannung zur Freigabe und Denaturierung der DNS angelegt wird. Die daraus resultierende einzelsträngige DNS wird mit dem speziellen Oligonukleotid hybridisiert, das auf der Oberfläche immobilisiert wurde, wonach die verbleibenden Stadien eines Sandwich-Labortests durchgeführt werden. Sämtliche oben stehenden Schritte finden ohne die Notwendigkeit für hohe Temperaturen oder eine Zugabe von alkalischen Reagenzien wie in dem herkömmlichen Verfahren statt.
Die Freigabe der Nukleinsäuren aus der oder den Zellen sowie die Denaturierung der Nukleinsäuren können unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt werden, wobei in diesem Falle möglicherweise keine klare Trennung zwischen den Schritten der Zellfreigabe und Denaturierung besteht. Die Nukleinsäure kann so denaturiert werden, wie sie aus den Zellen freigesetzt wird.
Es kann selbstverständlich auch ein jeweils anderer Zellinhalt als Nukleinsäure gemäß den Verfahren der Erfindung frei gegeben werden, wobei die Freigabe derartiger anderer Materialien auf verschiedenerlei Weise genutzt werden kann; zum Beispiel kann die Freigabe spezieller Proteine als ein Schritt bei einer Labortestprozedur eingesetzt werden, bei der solche Proteine aufgespürt werden. Freigesetzte RNS kann mit Hybridisierungstests erkannt oder vermehrt werden, zum Beispiel durch die Techniken auf Basis von 3SR oder NASBA. Im allgemeinen können mittels der Verfahren gemäß der Erfindung freigesetzte, intrazelluläre Materialien für all die Zwecke benutzt werden, für die auch solche Materialien verwendet werden, die mittels herkömmlicher Prozeduren für den Zellaufschluss freigesetzt werden.
Die Erfindung soll ferner in Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben und erläutert werden, worin:
1 eine Querschnittsansicht durch eine Elektrozelle für den Gebrauch in Einklang mit der Erfindung darstellt;
2 ein Gel gemäß Herstellung nach Beispiel 1 darstellt; es wird darin die Freigabe von Protein aus Zellen gezeigt;
3 ein Gel gemäß Herstellung nach Beispiel 2 darstellt; es wird darin die Freigabe von Protein aus Zellen gezeigt;
4 ein Gel gemäß Herstellung nach Beispiel 3 darstellt; es wird darin die Vermehrung von DNS auf PCR-Basis gezeigt, das aus Zellen freigesetzt wurde; und
5 eine Querschnittsansicht durch eine alternative Elektrozelle für den Gebrauch gemäß der Erfindung darstellt.
Die in der 1 dargestellte Zelle umfasst einen Glasbehälter 10 mit 2 Elektroden 14, die in die darin befindliche Zellsuspension 12 eintauchen. Die Elektroden 14 sind parallele, zugespitzte Kohlenstoffstifte mit einem Abstand von 5 bis 8 mm und einem Durchmesser oberhalb der genannten konisch zulaufenden Spitzen von ca. 1 mm. Die Elektrode ist mit einer Länge von 5 bis 15 mm in die Suspension eingetaucht.
In der 5 ist eine alternative Apparatur dargestellt, bei der die erläuterte Zelle einen Graphitblock 10 umfasst, der ein Näpfchen 12 mit einem Durchmesser von 4 mm auf ihrer oberen Fläche aufweist, welches die erste Elektrode bildet. In das Näpfchen ist eine zweite, aus einem Graphitstift mit einem Durchmesser von 2 mm geformte Elektrode 14 eingepresst, die ein konisch zulaufendes Endstück 16 aufweist, wobei sie durch einen kragenförmigen Isoliermantel aus Kunststoffmaterial 18 hindurch geführt ist. Der Stift wird stromabwärts in dem Näpfchen so lange einjustiert, bis er einen Kurzschluss bildet, wonach er so wenig wie möglich wieder angehoben wird, um den Stromschluss wieder zu öffnen. Das Fassungsvermögen für die Flüssigkeit in der Zelle beträgt annähernd 25 μl. An die Apparatur wird ein Gleichstrom angelegt, wobei das Näpfchen in Bezug auf den Stift positiv gemacht wird, und zwar vorzugsweise durch 1,6 bis 2,5 Volt.
Obwohl die in der 1 gezeigte Stiftelektrode ungeschärfte Enden aufweist, wird eine scharte Kante zwischen ihrem flachen Ende und ihrer konisch zulaufenden, kegelstumpfförmigen Oberfläche geboten. Eine wahlweise alternative Anordnung stellt eine Spitze am Stift dar, die geschärft werden sollte. Dies lässt sich dadurch erreichen, dass ein herkömmlicher Bleistiftspitzer verwendet wird. Die so erhaltene Elektrode kann ferner noch unter Verwendung einer Klinge oder von Schmirgel geglättet werden. Beim Einsatz einer derartig zugespitzten Elektrode wird das Fassungsvermögen für die Flüssigkeit im Näpfchen auf 40 μl erhöht.
In der Apparatur, die eine Vielzahl von Näpfchen zur Aufnahme von Proben aufweist, lassen sich eine vielfältige Verfahren gemäß der Erfindung durchführen, wobei jedes Näpfchen mit einem jeweili gen Elektrodenpaar ausgestattet ist und 1 Elektrode in jedem Falle ggf. das Näpfchen selbst darstellt. Gemäß einer bevorzugten Form für eine derartige Apparatur weist ein Block mit den Näpfchen darin einen abhebbaren Deckel mit Elektroden auf, die von da aus in die Näpfchen hinunterragen. Jedes Näpfchen kann dabei ein Elektrodenpaar auf dem Deckel in verschiedenen möglichen Konformationen aufweisen, wie zum Beispiel Parallelstifte, Parallelplatten, ggf. aus Maschendraht oder koaxialen Hohlzylindern, wiederum ggf. aus Maschendraht. In alternativer Weise können die Einzelelektroden auf dem Deckel jeweils für jedes Näpfchen vorgesehen sein, wobei der die Näpfchen aufweisende Block leitfähig sein kann und als eine gewöhnliche zweite Elektrode dienen kann. Der Block mit den Näpfchen kann auch entsprechende Elektroden für jedes Näpfchen aufweisen.
Der Deckel kann einen flachen Plattenabschnitt aufweisen, der eine oder mehrere Elektroden für jedes Näpfchen und ein separates Verstärkungsglied trägt, das wiederum selbst elektrische Anschlüsse und den Stromkreis trägt, der die Elektroden zusammenschließt, sobald die beiden Teile zusammengefügt werden. Durch den genannten Stromkreis kann eine einzelne Stromversorgung verzweigt und in einer kontrollierten Art und Weise den Elektroden zugeführt werden, so dass jede Elektrode gesteuert, zum Beispiel mit Konstantspannung oder Konstantstrom, versorgt wird. Der Plattenabschnitt, der die Elektrodenanordnung trägt, kann dadurch austauschbar sein, ohne dass der gesteuerte Stromkreis ausgetauscht werden müsste; er kann deshalb als Einweg(austausch)teil vorliegen. Der Plattenabschnitt und das Verstärkungsglied können auf dem montierten Gerät miteinander in Linie gebracht werden, und zwar durch Anordnen von Nadelstiften und Öffnungen, wobei sie in ähnlicher Weise mit dem die Näpfchen aufweisenden Block miteinander in Linie gebracht werden können, welche ebenfalls als Einwegteile vorliegen können.
Das folgende Beispiele erläutert Verfahren gemäß der Erfindung.
Beispiel 1
Über Nacht wurden in einem Medium auf Basis von Luria Bertani gramnegative Bakterien (E. Coli Stamm DH5αF (Gibco, BRL) kultiviert. Die durchschnittlich erzielte Zelldichte betrug 1/10⁹ Zellen ml^–1. Die abgeernteten Zellen wurden in 1 M Trispuffer bei einem pH-Wert von 8,0 gewaschen und in 1/5 des Volumens der ursprünglichen Kultur resuspendiert. In die Probe wurden 2 Kohlenstoffelektroden platziert, wie in der 1 dargestellt ist, wobei Gleichstromspannungen von 2 bis 8 Volt für die Dauer von 2 bis 5 Minuten angelegt wurden. Positive Kontrollproben wurden 5 Minuten lang gekocht. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugieren bei 5000 UpM für die Dauer von 5 Minuten pelletisiert, wonach 20 μl des Überstandes mittels Elektrophorese über ein Polyacrylamidgel, das mit Coomassie-Blau eingefärbt war, analysiert. Die Werte zeigen auf, dass das Beaufschlagen mit einer Potentialdifferenz von 8 Volt und 4 Volt für die Dauer von 5 Minuten (Gleichstrom) zu einer Freigabe von Protein aus der Zelle führte. Ähnliche Ergebnisse werden unter Einsatz einer Wechselspannung von 2 bis 8 Volt erhalten.
Beispiel 2
Die gleichen experimentellen Bedingungen wurden eingesetzt wie im Beispiel 1, jedoch unter reduzierten Elektroschockzeiten bei 8 Volt. Dies führte zu der Freigabe von Protein aus der Zelle sogar in nur 1 Minute.
Beispiel 3
Zur Demonstration der Freigabe von DNS und Erhöhung der Empfindlichkeit der Erkennung wurde der Zellaufschluss an Hand der Vermehrung von DNS unter Einsatz der Polymerase-Ketten-Reaktion bewertet.
Bakterien vom Stamm Escherichia Coli DH5αF (Gibco, BRL) wurden mit pBR322 (Sigma) wurden transformiert und über Nacht in einem Medium auf Basis von Luria Bertani mit einem Gehalt an 100 μg ml^–1 Ampicillin kultiviert. Die durchschnittlich erzielte Zelldichte betrug 1/10⁸ Zellen ml^–1. Die Zellen wurden durch Abzentrifugieren bei 10 000 UpM für die Dauer von 5 Minuten eingesammelt und in PCR-Puffer (10 mM Tris, 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl₂, pH 8,3) gewaschen. Die Zellen wurden im PCR-Puffer in einer Konzentration resuspendiert, die fünfmal höher war als ursprünglich. Die positiven Kontrollproben wurden 5 Minuten lang durch Kochen behandelt.
In die Probe wurden 2 Kohlenstoffsondenelektroden verbracht und mit 4 bis 8 Volt (Gleichstrom) 0,5 bis 2 Minuten lang beaufschlagt (Stromversorgung: Thurlby 30 V, 2A). Die Zelltrümmer wurden pelletisiert und der jeweilige Überstand mittels PCR analysiert. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: 0,1 μl/ml Probe in PCR-Puffer (wie oben), 1 μM (jeweils) an den Primern ATGCGTCCGGCCGTAGAGGAT und GTATCACGAGGCCCTT, 200 μM jeweils von dATP, dCPT, dGTP, dTTP, 5 U/ml AmpliTaq – DNS-Polymerase (Perkin Elmer). Alle Reagenzkonzentrationen sind in Form der Endkonzentration in einem Reaktionsvolumen, das mit PCR-Puffer (wie oben stehend) ausgeglichen wird, wiedergegeben. Die vermehrte DNS wurde jeweils über Agarosegel, das mit Ethidiumbromid eingefärbt war, analysiert. In den Proben wurde ein vermehrtes DNS-Fragment mit dem erwarteten Molekulargewicht (417 bp) beobachtet, welche der kürzesten Testzeit von 30 Sekunden unterworfen waren (siehe 3). Die Bandendichte zeigte an, dass der Zellaufschluss, der durch die beaufschlagte Spannung induziert war, die DNS im Überschuss gegenüber dem Hintergrundausmaß (zum Vergleich der nicht aufgeschlossenen Zellen) freisetzte.

Claims

Verfahren zum Bewirken der Freigabe von intrazellulärem Material aus 1 oder mehreren Zellen, welches das Anlegen einer Spannung von nicht mehr als 50 Volt an eine Suspension mit einem Gehalt an der genannten Zelle oder diesen Zellen mit umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannte Spannung im Bereich von 0,5 bis 50 Volt liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannte Spannung im Bereich von 0,5 bis 15 Volt liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die genannte Spannung im Bereich von 1 bis 10 Volt liegt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die genannte Spannung zwischen Elektroden angelegt wird, welche einen Abstand von nicht mehr als 10 mm in der bezeichneten Suspension aufweisen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die genannte Spannung zwischen Elektroden angelegt wird, welche einen Abstand von nicht mehr als 5 mm in der bezeichneten Suspension aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem der genannte Elektrodenabstand nicht mehr als 1,5 mm beträgt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem der genannte Elektrodenabstand nicht mehr als 0,5 mm beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die genannten Zellen als Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, tierische, Insekten- oder menschliche Zellen vorliegen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die genannte Spannung für eine Zeitdauer von mindestens 30 Sekunden angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die genannte Spannung für eine Zeitdauer von mindestens 2 Minuten angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die genannte Spannung für die genannte Zeitdauer kontinuierlich angelegt wird.
Verfahren zur Gewinnung einzelsträngiger Nukleinsäure, das die folgenden Maßnahmen umfasst: Freigabe von doppelsträngiger Nukleinsäure aus Zellen unter Anlegen einer Spannung von nicht mehr als 50 Volt an eine Suspension der genannten Zellen mit einer Elektrode zur Freigabe der Nukleinsäure aus den genannten Zellen, sowie Denaturierung der doppelsträngigen Nukleinsäure durch das Anlegen der gleichen oder einer unterschiedlichen Spannung an die genannte Suspension mit der genannten Elektrode, um die bezeichnete doppelsträngige Nukleinsäure in eine einzelsträngige Nukleinsäure umzuwandeln.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem zum Bewirken der genannten Denaturierung eine Spannung im Bereich von 0,5 bis 3 Volt angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, bei dem zum Bewirken der genannten Denaturierung eine Spannung im Bereich von 1,5 bis 2,5 Volt angelegt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, bei welchem die Denaturierung in Anwesenheit eines Promotors durchgeführt wird, der die Denaturierung unterstützt.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem der genannte Promotor das Methylviologen oder ein Salz davon ist oder in Form eines mehrwertigen anorganischen Kations vorliegt.
Verfahren zum Vervielfältigen einer Zielsequenz von Nukleinsäure, das die Denaturierung, Hybridisierung und Replikation der Nukleinsäure umfasst, wobei die Freigabe der Nukleinsäure aus einer Zelle mittels eines in einem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchten Verfahrens sowie die Durchführung der Denaturierung in der Weise mit umfasst ist, dass eine Lösung mit einem Gehalt an der genannten Nukleinsäure einer Spannung unterworfen wird, die zwischen Elektroden für eine Zeitdauer von bis zu 2 Minuten unter solchen Bedingungen angelegt wird, dass mindestens eine Teilmenge der Nukleinsäure in der Lösung in die vollständig oder teilweise einzelsträngige Form umgewandelt wird.
Vervielfältigungsprozess nach Anspruch 18, bei welchem sich die Vermehrungsprozedur als PCR (Polymerase-Kettenreaktion) oder LCR (Ligase-Kettenreaktion) darstellt.
Verfahren zum Replizieren einer Nukleinsäure, das folgende Maßnahmen umfasst: Freigabe doppelsträngiger Nukleinsäure aus Zellen mittels eines in einem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchten Verfahrens; Abtrennen der Stränge aus einer Probe mit doppelsträngiger Nukleinsäure in Lösung unter der Einwirkung einer elektrischen Spannung, die an die Lösung vonseiten einer Elektrode angelegt wird; Hybridisieren der abgetrennten Stränge der Nukleinsäure mit mindestens 1 Oligonukleotid-Primer(-Starter), welcher mit mindestens einem der Stränge der denaturierten Nukleinsäure hybridisiert; Synthese eines Verlängerungsproduktes des Primers oder jeden Primers, welcher in hinreichender Weise zu dem jeweiligen Strang der Nukleinsäure komplementär ist, um da mit eine Hybridisierung zu erzielen; sowie das Abtrennen des Verlängerungsproduktes oder jedes Verlängerungsproduktes aus dem Nukleinsäurestrang, mit dem zur Gewinnung des Verlängerungsproduktes die Hybridisierung erfolgt.
Verfahren zum Erkennen der An- oder Abwesenheit einer vorherbestimmten Nukleinsäuresequenz in einer Zelle, das folgende Maßnahmen umfasst: Freigabe von Nukleinsäure aus der Zelle mittels eines in einem der Ansprüche 1 bis 12 beanspruchten Verfahrens, Denaturieren der freigesetzten doppelsträngigen Nukleinsäure mittels einer an die Nukleinsäure angelegten Spannung; Hybridisieren der denaturierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotid-Sonde für die Sequenz; sowie eine Bestimmung mit der Fragestellung, ob die genannte Hybridisierung eingetreten ist.