DE69827375T2

DE69827375T2 - Dissoziation von interagierenden molekülen

Info

Publication number: DE69827375T2
Application number: DE69827375T
Authority: DE
Inventors: Nicholas David MILLER-JONES; Karin West Wratting BERGMANN; Louise Susan WATSON
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1998-04-02
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2018-04-03
Also published as: DE69827375D1; KR20010005904A; ATE281517T1; CA2286302A1; EP0973885A1; KR100510606B1; WO1998044100A1; HK1025129A1; US6333157B1; GB9706654D0; EP0973885B1; JP4004548B2; JP2001519658A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren für die Behandlung von miteinander in Wechselwirkung stehenden Molekülen, um deren vollständige oder teilweise Dissoziierung zu bewirken.
Doppelsträngige DNS (Desoxyribonukleinsäure) und Komplexe aus DNS/RNS (Ribonukleinsäure) und RNS/RNS in der geläufigen Doppelhelixkonfiguration werden durch die stabile Wechselwirkung von einzelsträngigen Molekülen erzeugt. Solche Komplexe benötigen in vitro aggressive Bedingungen, um die komplementären Stränge der Nukleinsäuren zu trennen. Bekannte Verfahren, die gewöhnlich für die Strangtrennung genutzt werden, erfordern die Verwendung hoher Temperaturen von wenigstens 60° C und oftmals 100° C oder die Verwendung eines alkalischen pH-Wertes von 11 oder mehr oder eines niedrigen pH-Werts. Andere Verfahren schließen die Verwendung von Helicaseenzymen wie das Rep-Protein von E. coli ein, welche das Entwinden der DNS auf einen unbekannten Wege katalysieren können, oder die Verwendung von Bindungsproteinen wie das 32-Protein des E. coli-Phagen T4, welche dahingehend wirken, dass sie die einzelsträngige Form der DNS stabilisieren. Die durch die bekannten Vorgänge der Hitze- oder Alkalibehandlung erzeugte denaturierte einzelsträngige DNS wird gewöhnlich für Hybridisierungsuntersuchungen verwendet oder wird Amplifikationszyklen ausgesetzt.
Solch eine Trennung ist eine Voraussetzung einer Anzahl an Protokollen, die die in-vitro-Manipulation von Nukleinsäuren einschließen, wovon ein Beispiel eine Reaktion ist, welche vielfache Kopien von DNS-Zielsequenzen erzeugt und welche ein hitzestabiles Polymeraseenzym nutzt (US-Patent 4,683,202, K.B. Mullis et al). Diese Entwicklung, bekannt als die Polymerasekettenreaktion (PCR), ist von bedeutender kommerzieller Wichtigkeit und die Strangtrennung wird normalerweise durch Erhitzen der Probe auf annähernd 95° C bewirkt. Die Entfernung des Bedürfnisses, die Probe zu erhitzen, würde eine Reihe von Vorteilen bereitstellen. Zum Beispiel ermöglicht es die Gestaltung einer kompakten und leicht kontrollierbaren Apparatur und die Verwendung von mesophilen Enzymen mit einer größeren Genauigkeit.
Die WO 92/04470 offenbart einen Prozess, bei dem Nukleinsäurestränge durch das Anlegen eines elektrischen Feldes aufgetrennt werden. Die Vorteile des elektrischen Verfahrens werden detaillierter diskutiert, gemeinsam mit der Anwendung des Verfahrens bei Amplifikationsreaktionen wie PCR und Ligasekettenreaktion. Es werden Formen elektrochemischer Zellen zur Durchführung der Reaktion beschrieben und ebenfalls die Verwendung von „Promotor"-Verbindungen, die die Effizienz der Denaturierung erhöhen.
Vor der WO 92/04470 hatten eine Reihe von anderen Arbeitern die Denaturierung von DNS in elektrochemischen Zellen beschrieben. In keinem dieser Fälle bleib jedoch das einzelsträngige Produkt in nützlichen Mengen frei in Lösung. Eher scheint die DNS irreversibel an die Oberfläche der Elektrode gebunden worden zu sein, in welchem Zustand sie nicht für die weitere Beteiligung in Vorgängen wie PCR zugänglich ist. Bei dem Verfahren der in der WO 92/04470 beschriebenen elektrischen Denaturierung akkumulieren Einzelstränge in Lösung und ihr Nutzen und ihre Integrität wird durch die nachfolgende Durchführung von PCR bestätigt.
In WO 92/04470 wurde die elektrische Denaturierung von DNS unter Verwendung einer Elektrode, die einen zentralen Stab aus glasartigen Kohlenstoff, der in einer Teflonscheide mit Ausnahme seiner Enden eingeschlossen ist, umfasst, durchgeführt. Die Arbeitselektrode war aus Platingitter, das gegen die Teflonscheide lag. Es wurde eine Kalomel-Referenzelektrode verwendet, die in einer Nebenkammer, welche mit der Hauptzelle durch eine Kapillarröhre verbunden war, platziert worden war (siehe Stanley C.J. et al., J. Immunol. Meth. (1988), 112, 153-161). Unter Verwendung dieses Apparates mit der Arbeitselektrode mit einem Potential von -1V bezüglich der Referenz wurde die schnellste Denaturierung in 15 Minuten erzielt. Die Anwesenheit von NaCl in der Reaktion verzögerte die Denaturierung.
In WO 92/04470 wird eine PCR-Reaktion durchgeführt, in welcher wiederholte Denaturierungsoperationen unter Verwendung der mit Zwischenamplifikationszuständen beschriebenen elektrochemischen Zelle durchgeführt werden. Die Denaturierungszustände werden jeweils für einen Zeitraum von fünf Minuten oder länger durchgeführt und die Gesamtzeit für die PCR-Reaktion ist deswegen sehr verlängert. Weiterhin unterscheiden sich die Bedingungen, unter denen die PCR-Reaktion durchgeführt worden war, von jenen des gewöhnlichen PCR-Vorgangs, dahingehend, dass es als nicht möglich gefunden wurde, ein konventionelles PCR-Puffersystem zu verwenden. Um die Denaturierung zu erreichen, war es notwendig, den Vorgang bei einer sehr viel niedrigeren Ionenstärke durchzuführen, als es mit solch einem Puffersystem zu vereinbaren wäre. Unter Ausschluss des Promotors Methylviologen wurde der Vorgang hauptsächlich in destilliertem Wasser durchgeführt.
In WO 95/25177 zeigten wir, dass es möglich ist, eine Denaturierung elektrochemisch merklich schneller durchzuführen als es in der WO 92/04470 offenbart ist, und ein Amplifikationsverfahren durchzuführen, das viel schneller ist, als es dort offenbart ist. Obwohl der Abstand zwischen den beiden Arbeitselektroden in WO 92/04470 nicht ausdrücklich festgestellt ist, waren es in der Tat etliche Millimeter.
Ein verbessertes Verfahren ist beschrieben in WO 95/25177, bei welchem eine Lösung, die besagte Nukleinsäure enthält, einer Spannung ausgesetzt wird, die zwischen Elektroden angelegt wird, die einander in dieser Lösung innerhalb von 1,5 mm annähern. Dies resultiert in einer wesentlichen Zunahme in der Denaturierungsrate, so dass die WO 95/25177 Beispiele enthält, bei denen die vollständige Denaturierung von DNS innerhalb von 1 bis 2 Minuten erreicht wird, im Vergleich mit Denaturierungszeiten von wenigstens 25 Minuten unter Verwendung der nach der WO 92/04470 aufgestellten Elektroden.
Es ist in der WO 95/25177 gezeigt, dass, wenn PCR unter Verwendung des dort beschriebenen Apparates durchgeführt wird, man eher als einfach das elektrische Feld anund abzuschalten wahlweise das Feld umkehren kann. In WO 95/25177 wird diese Umkehrung des Feldes lediglich als ein Äquivalent zur Abschaltung des Feldes gesehen. Es werden Zeiträume mit gar keiner Spannung in Kombination mit solchen Feldumkehrungen verwendet, um den Vorgang weiter zu verbessern.
Obwohl der Vorgang der Anmeldung WO 92/04470 in einer Lösung stattfinden kann, die nur die Elektrode und die in Wasser, das einen geeigneten Puffer enthält, gelöste Nukleinsäure enthält, kann der Vorgang durch die Anwesenheit einer Promotor-Verbindung in der Lösung, die die Nukleinsäure enthält, erleichtert werden.
Methylviologen oder ein Salz davon wurde als die bevorzugte Promotor-Verbindung offenbart.
Es wird angenommen, dass die positiv geladenen Viologenmoleküle zwischen der negativ geladenen DNS und der negativ geladenen Kathode wirken, um deren elektrostatische Abstoßung zu reduzieren und folglich das Annähern der DNS an die Elektrodenoberfläche, wo das elektrische Feld am stärksten ist, zu fördern. Demgemäß bekundeten wir eine Vorliebe in der WO 92/04470, als Promotoren Verbindungen mit beabstandeten positiv geladenen Zentren, z. B. positiv geladenen Bipolarverbindungen, zu nutzen. Vorzugsweise sollte der Abstand zwischen den positiv geladenen Zentren ähnlich zu dem in Viologenen sein.
Die WO 93/15224 wurde wiederum auf der Entdeckung basiert, dass mehrwertige anorganische Kationen, vorzugsweise Mg²⁺, ebenfalls als Promotoren in solch einem System mit annähernd derselben Effizienz wie Methlviologen wirken können.
Es wird gedacht, dass große Kationen wie Mg²⁺in der Lage sind, als eine Brücke zwischen einer negativen Elektrode und negativ geladenen Bereichen der doppelsträngigen Nukleinsäure wirken können.
Es wurde auch herausgefunden, dass Lithiumionen ebenfalls die Denaturierung fördern können.
Die Konzentration dieses Promotorkations beträgt vorzugsweise von 1 mM bis 50 mM, bevorzugter von 5 mM bis 20 mM, z. B. ungefähr 10 mM.
Die Rate und das Ausmaß der in solchen elektrochemischen Systemen erreichbaren Denaturierung hängen von einer Anzahl von Faktoren ab, einschließlich des Mediums, in welchem die Nukleinsäure vorhanden ist. In der Molekularbiologie verwendete Prozesse wie Nukleinsäurehybridisierungstests oder Amplifikationsvorgänge wie PCR werden in Medien durchgeführt, die ein Puffermittel enthalten, um einen optimalen pH-Wert für die involvierten Reaktionen aufrecht zu erhalten. Die Anwesenheit solch eines Puffermittels ist jedoch allgemein für die elektrochemische Dehybridisierung von Nukleinsäuren nachteilig.
Dies wird zu einem gewissen Grad durch eine geeignete Wahl des Promotors überwunden, wie oben beschrieben, es würde jedoch höchst wünschenswert sein, Systeme zu entwickeln, bei welchen die Anwesenheit des Puffers im Wesentlichen weniger nachteilig für seinen Einfluss auf den Dehybridisierungsvorgang war.
Folglich, während normalerweise gefunden wird, dass das Erhöhen der Ionenstärke dazu neigt, die Wechselwirkung zwischen Molekülen zu stabilisieren, so dass die Disassoziation leichter in der Abwesenheit von Puffern geschieht, welche eine Quelle für Ionen sind, die zu der Ionenstärke des Mediums beitragen, haben wir nun herausgefunden, dass gewisse Puffer, hierin bezeichnet als die „Disassoziation zulassende Puffer", der Disassoziation ermöglichen, ohne die Zugabe von disassoziationsfördernden Mitteln wie Magnesium- oder Lithiumionen oder die Zugabe von Viologenen fortzuschreiten.
Tris-HCl ist ein Beispiel eines Puffers der Art, welcher verwendet werden kann, wenn geeignete Promotoren anwesend sind. Wie unten gezeigt sind die nun vorgeschlagenen Puffer im Vergleich mit Tris-HCl überragend in ihrer Fähigkeit, der Disassoziation ermöglichen, fortzuschreiten.
Weiterhin können die Puffer verwendet werden, die Disassoziation von anderen, miteinander in Wechselwirkung stehenden Molekülen, insbesondere Biomoleküle, unter dem Einfluss einer elektrischen Spannung zu erlauben. Die Art der Wechselwirkung zwischen den Molekülen kann insbesondere eine Wasserstoffbrückenbindung sein.
Der Mechanismus, durch welchen die gemäß dieser Erfindung verwendeten Puffer die Disassoziation erlauben oder begünstigen, ist gegenwärtig noch nicht vollständig verstanden. Es kann sein, dass die Disassoziation durch eine lokale Änderung im pH-Wert in der Lösung verursacht wird, in welche die Elektroden eingetaucht sind, wobei solch eine Änderung in einer sich benachbart zu der Elektrodenoberfläche befindenden Mikroschicht geschieht und saure Bedingungen an der positiven Anode und alkalische Zustände an der negativen Kathode erzeugt. Dies würde in Übereinstimmung stehen mit der Tatsache, dass DNS dazu gebracht werden kann, zu denaturieren, sowohl durch einen sauren als auch durch einen alkalischen pH-Wert. Puffer, die die zeitweilige und lokale Erzeugung eines relativ niedrigen pH-Werts erlauben, d. h. jene, die selber einen pK_a Wert haben, welcher vergleichsweise hoch ist, können der notwendigen pH-Veränderung ermöglichen, zu geschehen, wenn andere Puffer mit niedrigerem pK_a-Wert es verhindern würden.
Puffer zeigen eine maximale Pufferkapazität wenn der pH-Wert der Lösung derselbe ist wie der pK_a- Wert des Puffers: indem sich der pH-Wert von dem pK_a- Wert entfernt, wird die Pufferkapazität reduziert. Deswegen hat eine Lösung aus CHES (pK_a- Wert 9,4) bei einem pH-Wert von 7,5 – 8,0 eine schwache Pufferkapazität und ihr pH-Wert wird prompt nach unten abgelenkt. Wir schlagen vor, dass an der Anode einer elektrochemischen Zelle erzeugte Wasserstoffionen ausreichend sind, den Puffereffekt zu überwinden, wodurch eine lokale Erniedrigung des pH-Werts des Mediums bewirkt wird, welche wiederum die Denaturierung doppelsträngiger Nukleinsäuren verursacht.
Wenn das elektrische Feld abgeschaltet wird, stabilisiert sich das Medium auf seinen früheren pH-Wert wegen der Wirkung des Puffermittels.
Diese Fähigkeit des Puffers, den pH-Wert reversibel „umzudrehen" in Antwort auf ein elektrisches Feld, kann in Beziehung gesetzt werden mit seinem pK_a- Wert.
Alternativ kann es sein, dass es die Interkalation des Puffers in die Nukleinsäure-Doppelhelix ist, die verantwortlich ist für das Fördern oder Erlauben der Denaturierung doppelsträngiger Nukleinsäuren, und dass wegen entweder dem Abstand zwischen den Ladungen oder der Anwesenheit des Cyclohexylrings die hierin beschriebenen, bevorzugten Puffer besonders geeignet sind für die Verwendung in solchen Systemen. Eine Kombination dieser Mechanismen kann gleichzeitig wirken.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen Prozess für die Denaturierung von hybridisierten Nukleinsäuremolekülen bereit, umfassend das Aussetzen einer diese Nukleinsäuremoleküle enthaltenden Flüssigkeit an eine zwischen Elektroden angelegte elektrische Spannung unter Bedingungen, wenigstens einen Teil dieser Nukleinsäuremoleküle in der Anwesenheit eines Puffers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus N-Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES), N-Cyclohexyl-3-aminopropansulfonsäure (CAPS) und N-Cyclohexyl-3-amino-2-hydroxypropansulfonsäure (CAPSO), vollständig oder teilweise zu denaturieren.
Der Prozess wird vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 9 durchgeführt. Der gewählte Puffer wird zu einem gewissen Ausmaß den pH-Wert vorgeben, bei welchem die Disassoziationsreaktion durchgeführt werden kann. Wo die Disassoziation die Dehybridisierung von Nukleinsäuresträngen ist, die mit einer Lösung in Kontakt stehen, welche ein Enzym wie eine Polymerase enthält, kann der pH-Wert ausgewählt werden, um die Aktivität des Enzyms zu optimieren. Folglich werden die Wahl des Puffers und des Enzyms miteinander in Verbindung stehen. Als Beispiel, wird der Puffer CHES besonders bevorzugt für die Verwendung mit „Vent"-Polymerase, aber Puffer mit höheren pK_a- Werten wie CAPS oder CAPSO können eine geeignetere Wahl für Enzyme mit hohen pH-Wert-Optima wie Bst-DNS-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus (pH 8 – 9), „Deep Vent" (New England Biolabs) aus Pyrococcus sp. (pH 8,8), Dynazym-II-DNS-Polymerase (Finnzymes Oy) aus Thermus brockianus (pH 8,5), Taq-DNS-Polymerase und Derivate von Thermus aquaticus (pH 8,8) oder T4-DNS-Polymerase des Bakteriophagen T4 (pH 8,8) sein.
Der Puffer ist CHES, CAPS oder CAPSO. Die pK_a- Werte dieser Puffer werden in der Literatur entweder als Arbeitswerte oder als zurückkorrigierte thermodynamische Werte, die ein wenig höher sind, angegeben. In Bezug auf die bevorzugten Bereiche an oben genannten pK_a- Werten, sollte auf die thermodynamischen Werte Acht gegeben werden, welche sind: CHES 9,41, CAPS 10,51 und CAPSO 9,71.
Die Formeln von CHES, CAPS und CAPSO sind unten gezeigt:
Vorzugsweise umfasst der Puffer ein Molekül mit einer negativen Ladung, die von einer positiven Ladung durch einen Abstand, der 0,75 bis 1,5 Mal dem Abstand zwischen solchen Ladungen in CHES-, CAPS- oder CAPSO-Molekülen entspricht, getrennt ist. Vorzugsweise hat der Puffer auch eine Einheit, die in der Lage ist, in doppelsträngige Nukleinsäuren zu interkalieren, z. B. einen Cyclohexylsubstituenten.
Der Prozess wird vorzugsweise mit einer Konzentration von 5 bis 10 mM dieses Puffers durchgeführt.
Es wird verstanden werden, dass die Nukleinsäuren nicht in der Lösung, die den Puffer enthält, gelöst werden müssen, jedoch auf einer festen Phase immobilisiert werden können, die in die Lösung eingetaucht ist. Folglich ist das erzeugte einzelsträngige Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung vorzugsweise frei von der Elektrode, z. B. in der Lösung gelöst. Eine Nukleinsäure kann jedoch auf der Elektrode oder auf einer anderen Oberfläche in der Zelle immobilisiert werden oder kann ein Überzug auf der Elektrode in doppel- oder einzelsträngiger Form vor der Anlegung des elektrischen Potentials sein, z. B. angeheftet durch das Ende oder durch einen kleinen dazwischen liegenden Teil der Enden der Nukleinsäurekette oder durch ein Linkermolekül, so dass wesentliche Abschnitte der Nukleinsäuremoleküle von der Elektrodenoberfläche vor und nach der Denaturierung frei hängend belassen werden. Der Teil der Nukleinsäure, durch welchen sie angeheftet wird, ist bevorzugt einer, der für den Zweck durch den Nutzer ausgewählt wird.
Zusätzlich zu dieser Elektrode und einer Gegenelektrode kann eine Referenzelektrode in Kontakt mit dieser Lösung gebracht werden und eine Spannung kann zwischen dieser Elektrode und dieser Gegenelektrode angelegt werden, um eine gewünschte kontrollierte Spannung zwischen dieser Elektrode und dieser Referenzelektrode zu erreichen. Die Elektroden können durch einen Potentiostatenschaltkreis verbunden werden, wie es in dem Stand der Technik der Elektrochemie bekannt ist.
Bevorzugt wird ein Potential von -0,5 bis -1,5 V an dieser Arbeitselektrode bezüglich dieser Referenzelektrode angelegt, bevorzugter von -0,8 bis -1,5 V, z. B. ungefähr -1,0 V.
Arbeitselektrodenspannungen relativ zu Referenzelektroden werden durchweg so angegeben, als ob sie relativ zu einer Kalomelreferenzelektrode (BDH Nr. 309.1030.02) gemessen würden oder wie tatsächlich relativ zu ihr gemessen.
Folglich kann der Prozess wahlweise unter Verwendung eines Drei-Elektrodensystems der An, wie es in WO 92/04470 beschrieben ist, durchgeführt werden, allgemein ist jedoch bevorzugt, dass das gemäß dieser Erfindung genutzte Lösungsvolumen klein ist, z. B. 1 ml oder weniger, vorzugsweise sehr klein, z. B. 100 μl oder weniger, z. B. ungefähr 25 μl bis 40 μl. Wenn sehr kleine Reaktionsvolumina dieser Art verwendet werden, wird es allgemein nicht praktisch sein, ein Drei-Elektrodensystem zu verwenden. Folglich wird typischerweise eine Spannung zwischen zwei Elektroden angelegt werden und direkt gemessen werden. Hierin angegebene Spannungen für Zwei-Elektrodensysteme werden auf diesem Wege angegeben und nicht mit Bezug auf eine Kalomelelektrode.
Eine weitere alternative bevorzugte Zellenform umfasst ein Paar an Platinelektroden, die durch ein Elastomerblatt, welches einen Ausschnitt enthält, der den Zellraum definiert, abgetrennt werden. Geeigneterweise kann das Elastomer eine Dicke von 100 μm bis 1 mm haben, bevorzugter von 200 μm bis 800 μm, am bevorzugtesten von 300 μm bis 500 μm.
Es ist bevorzugt, eine Spannungsdifferenz von 0,5 bis 3 Volt zwischen den Elektroden anzulegen. Spannungsdifferenzen über 3 Volt scheinen die Denaturierung zu inhibieren oder den Abbau zu fördern, obwohl der darin involvierte Mechanismus gegenwärtig unbekannt ist.
Vorzugsweise wird der Prozess bei einer Spannung von 1,5 bis 2,5 Volt durchgeführt, gemessen als eine Spannungsdifferenz zwischen den Elektroden.
Falls es einen Überzug auf der Elektrode gibt, wird die angelegte Spannung allgemein erhöht werden brauchen, um den Spannungsabfall über den Überzug hinweg zu kompensieren.
Wahlweise kann man die Denaturierung der Disassoziation eher unter Verwendung einer konstanten Stromzufuhr als einer regulierten Spannung durchführen und dies kann dazu dienen, Variationen in der geometrischen Anordnung der Elektroden zwischen unterschiedlichen Denaturierungs- oder Disassoziierungsoperationen zu kompensieren.
Wo ein Regime mit konstantem Strom verwendet wird, wird es allgemein bevorzugt sein, einen Strom von 80 bis 160 μA, z. B. ungefähr 100 bis 125 μA zu verwenden.
Zusätzlich zu dem Lithiumpromotor, der GB9614544.6 kann man eine Promotorverbindung wie Methylviologen nutzen, wie beschrieben in WO 92/04470, um eine schnellere Disassoziierung oder Denaturierung zu erzeugen. Andere Promotoren werden in WO 93/15224 beschrieben, d. h. mehrwertige Kationen wie Magnesium. Andere mehrwertige Kationen, die wirksam sind und die verwendet werden können, schließen Lanthan (La³⁺) ein. Die als die Promotoren verwendeten Kationen können anorganische Kationen einschließen, die mit anorganischen oder organischen Liganden komplexiert sind, z. B. Pt (NH3)6⁴⁺ und Cr (NH3)6²⁺.
Solch ein Promotor kann irgendein anorganisches oder organisches Molekül sein, welches die Rate oder das Ausmaß der Denaturierung der Doppelhelix erhöht. Er sollte in dem gewählten Reaktionsmedium löslich sein. Er beeinträchtigt oder stört DNS oder andere Materialien wie Enzyme oder Oligonukleotidsonden, die in der Lösung anwesend sein können, vorzugsweise nicht. Alternativ kann der Promotor auf dem Material, aus welchem die Elektrode konstruiert ist, immobilisiert sein oder darin eingeschlossen sein.
Der zusätzliche Promotor kann eine wasserlösliche Verbindung der Bipyridyl-Reihen sein, insbesondere ein Viologen wie Methylviologen oder ein Salz davon. Während der Wirkmechanismus solcher Promotoren gegenwärtig nicht mit Sicherheit bekannt ist, wird angenommen, dass die positiv geladenen Viologenmoleküle zwischen den negativ geladenen Nukleinsäuren wie DNS und der negativ geladenen Kathode wirken, um die elektrostatische Abstoßung zwischen diesen zu reduzieren und folglich das Annähern der DNS an die Elektrodenoberfläche, wo das elektrische Feld am stärksten ist, zu fördern. Demgemäß ist eine bevorzugte Option, als Promotoren Verbindungen zu nutzen, die beabstandete, positiv geladene Zentren haben, z. B. positiv geladene Bipolarverbindungen. Vorzugsweise ist der Abstand zwischen den positiv geladenen Zentren ähnlich zu jenem in Viologenen. Andere geeignete Viologene schließen Ethylviologen, Isopropylviologen und Benzylviologen ein.
Die Ionenstärke dieser Lösung ist vorzugsweise nicht höher als 250 mM, bevorzugt nicht höher als 100 mM. Da herausgefunden wurde, dass die Denaturierungsrate mit der Reduktion der Ionenstärke ansteigt, beträgt diese Ionenstärke immer noch bevorzugter nicht mehr als 50 mM, z. B. nicht mehr als 25 mM oder sogar nicht mehr als 5 mM. Allgemein gilt, dass je niedriger die Ionenstärke ist, desto schneller ist die Denaturierung. Bei der Berechnung der Ionenstärke für diese Zwecke kann es jedoch angebracht sein, die Ionenstärke irgendeines Bestandteils, der als ein Promotor wie oben beschrieben wird, zu ignorieren.
Die Elektrode kann eine so genannte „modifizierte Elektrode" sein, bei welcher die Denaturierung durch eine Verbindung gefördert wird, mit der die Elektrode beschichtet ist, oder die adsorbiert ist auf der Elektrode oder die eingebaut ist in die Struktur der Elektrode, die ansonsten aus einem inerten, aber leitfähigem Material besteht.
Eine erste bevorzugte Form einer elektrochemischen Zelle für die Verwendung in dieser Erfindung ist unten beschrieben, welche eine Kohlenstoffstabelektrode verwendet, die in einen Kohlenstoffblock, der eine Vertiefung enthält, eintaucht. Bei einer alternativen Konfiguration einer elektrochemischen Zelle können Arbeits-, Gegen- und wahlweise Referenzelektrode auf einer einzelnen Oberfläche, z. B. einer flachen Oberfläche, durch irgendein Druckverfahren wie Dickschichtsiebdruck, Tintenstrahldruck oder durch Verwendung eines Photoresist, gefolgt von Ätzen, gebildet werden. Es ist auch möglich, dass die Gegen- und Referenzelektroden auf der flachen Oberfläche kombiniert werden können, was zu einer Zwei-Elektrodenkonfiguration führt. Alternativ können die Elektroden auf der inneren Oberfläche einer Vertiefung gebildet werden, welche so angepasst ist, dass sie eine Flüssigkeit aufnimmt, wobei solch eine Vertiefung die wohlbekannte 96-Well- oder Mikrotiter-Platte sein könnte, sie kann auch ein Reagenzglas oder ein anderes Gefäß sein. Elektrodenanordnungen in Mikrotiter-Platten oder anderen gegossenen oder warmgeformten Plastikmaterialien können für multiple Nukleinsäuredenaturierungsexperimente oder andere Disassoziierungsreaktionen bereitgestellt werden. Die Reaktion kann auf einem feuchten porösen Teil, z. B. Filterpapier, durchgeführt werden.
Nukleinsäure-Strangtrennung kann in einem wässrigen Medium oder in einer Mischung aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel wie Dimethylformamid durchgeführt werden. Die Verwendung von anderen polaren Lösungsmitteln als Wasser oder unpolaren Lösungsmitteln wird auch gelten gelassen jedoch nicht bevorzugt. Der Prozess kann bei Umgebungstemperaturen oder, falls gewünscht, bei Temperaturen bis in die Nähe der Vorschmelztemperatur der Nukleinsäure durchgeführt werden.
Der an Nukleinsäuren durchgeführte Denaturierungsprozess gemäß der Erfindung kann als ein Schritt in eine Reihe komplexerer Prozesse, z. B. Vorgänge, die bei der Analyse und/oder der Amplifikation von Nukleinsäuren involviert sind, eingebaut werden. Einige Beispiele solcher Anwendungen werden unten beschrieben.
Die Erfindung schließt einen Prozess für das Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz in einer Probe ein, welcher umfasst: Denaturieren einer Probe doppelsträngiger Nukleinsäure mittels einer Elektrode; Hybridisieren der denaturierten Nukleinsäure mit einer Oligonukleotidsonde für die Sequenz; und Bestimmen, ob diese Hybridisierung geschah, wobei die Lösung diesen Puffer während der Denaturierung enthält.
Folglich findet der erfundene Prozess Anwendung bei DNS- und RNS-Hybridisierung, wo eine spezifische Gensequenz identifiziert werden soll, z. B. spezifisch für einen bestimmten Organismus oder spezifisch für eine bestimmte Erbkrankheit, für die Sichelzellanämie ein Beispiel ist. Um eine spezifische Sequenz nachzuweisen, ist es zuerst notwendig, eine DNS-Probe, vorzugsweise aus gereinigter DNS, welche in natürlicher doppelsträngiger Form vorliegt, zuzubereiten, wofür Mittel bekannt sind. Es ist dann notwendig, die doppelsträngige DNS in eine einzelsträngige Form umzuwandeln, bevor ein Hybridisierungsschritt mit einer markierten Nukleotidsonde, die eine zu der DNS-Probe komplementäre Sequenz hat, stattfinden kann. Der Denaturierungsprozess der Erfindung kann für diesen Zweck in einer bevorzugten Weise durch Durchführen der folgenden Schritte verwendet werden:

– Denaturieren einer DNS-Probe durch Anlegen einer Spannung mittels einer Elektrode an die Proben-DNS in Kontakt mit diesem Puffer in Lösung;
– Hybridisieren der denaturierten DNS mit einer direkt markierten oder indirekt markierten Nukleotidsonde, die zu der Sequenz von Interesse komplementär ist; und
– Bestimmen, ob die Hybridisierung geschah, wobei die Bestimmung durch Detektieren der Anwesenheit der Sonde geschehen kann, wobei die Sonde direkt radiomarkiert, fluoreszierend markiert, chemilumineszierend markiert oder enzymmarkiert sein kann oder eine indirekt markierte Sonde sein kann, welche, zum Beispiel Biotin trägt, an welches ein markiertes Avidin- oder avidinartiges Molekül später gebunden werden kann.

Bei einem typischen DNS-Sondentest ist es üblich, die Proben-DNS auf einer Membranoberfläche, die aus neutralem oder geladenem Nylon oder Nitrozellulose bestehen kann, zu immobilisieren. Die Immobilisierung wird durch Ladungswechselwirkungen oder durch Verbacken der DNS enthaltenden Membran, in einem Ofen erreicht. Die Proben-DNS kann auf eine hohe Temperatur erhitzt werden, um die Umwandlung zur einzelsträngigen Form vor der Bindung an die Membran sicher zu stellen, oder sie kann mit Alkali behandelt werden, wenn sie erst einmal auf der Membran ist, um die Umwandlung zu der einzelsträngigen Form sicher zu stellen. Die Nachteile der vorstehenden Verfahren sind:

– Das Erhitzen auf hohe Temperaturen, um einzelsträngige DNS zu schaffen, kann Schäden an der Proben-DNS selber verursachen;
– die Verwendung von Alkali erfordert einen zusätzlichen Neutralisierungsschritt bevor die Hybridisierung mit der markierten Sonde stattfinden kann.

Ein verbessertes Verfahren zur Durchführung von DNS-Sonden-Hybridisierungstests ist die sogenannte „Sandwich"-Technik, wo ein spezifisches Oligonukleotid auf einer Oberfläche immobilisiert wird. Die Oberfläche mit dem darauf befindlichen spezifischen Oligonukleotid wird dann mit einer Lösung hybridisiert, die die Ziel-DNS in einer einzelsträngigen Form enthält, wonach dann ein zweites markiertes Oligonukleotid hinzugefügt wird, welches ebenfalls mit der Ziel-DNS hybridisiert. Die Oberfläche wird dann gewaschen, um ungebundenes markiertes Oligonukleotid zu entfernen, wonach irgendeine Markierung, welche an der Ziel-DNS auf der Oberfläche gebunden worden ist, später detektiert werden kann.
Dieses Vorgehen kann durch Verwendung des Disassoziierungsprozesses der Erfindung vereinfacht werden, um die doppelsträngige DNS zu der benötigten einzelsträngigen DNS zu denaturieren. Die Arbeitselektrode, Gegenelektrode und wahlweise eine Referenzelektrode und/oder der Promotor können in ein Teströhrchen oder eine Vertiefung, in welcher der DNS-Sondentest durchgeführt werden soll, eingeschlossen werden. Die DNS-Probe, der Promotor, falls nicht bereits vorhanden, und Oligonukleotidsonden können dann zugefügt werden und die Spannung kann angelegt werden, um die DNS zu denaturieren. Die resultierende einzelsträngige DNS wird mit dem auf der Oberfläche immobilisierten spezifischen Oligonukleotid hybridisiert, wonach die verbleibenden Schritte eines Sandwichtests durchgeführt werden. Sämtliche der obigen Schritte können ohne, wie in den üblichen Prozessen, den Bedarf nach hohen Temperaturen oder der Zugabe von alkalischen Reagenzien stattfinden.
Die elektrochemische Denaturierung von DNS kann bei der Amplifikation von Nukleinsäuren verwendet werden, zum Beispiel in einer Polymerasekettenreaktion, einem Ligasekettenreaktions-Amplifikationsvorgehen oder einer Strangverdrängungs-Amplifikationstechnik. Folglich stellt die vorliegende Erfindung einen Prozess für die Replikation einer Nukleinsäure bereit, welcher folgendes umfasst: Trennen der Stränge einer Probe doppelsträngiger Nukleinsäure, die in Kontakt ist mit oder gelöst ist in einer diesen Puffer enthaltenden Lösung, unter dem Einfluss einer an die Lösung angelegten elektrischen Spannung von einer Elektrode; Hybridisieren der getrennten Stränge der Nukleinsäure mit wenigstens einem Oligonukleotidprimer, der mit wenigstens einem der Stränge der denaturierten Nukleinsäure hybridisiert; Synthetisieren eines Verlängerungsproduktes von einem oder jedem Primer, der ausreichend komplementär ist mit den jeweiligen Strängen der Nukleinsäure, um damit zu hybridisieren; und Trennen des einen oder jedes Verlängerungsproduktes von dem Nukleinsäurestrang, mit welchem er hybridisiert ist, um das Verlängerungsprodukt zu erhalten.
Bei solch einem durch Polymerase vermittelten Replikationsvorgehen, z. B. einem Polymerasekettenreaktionsvorgehen, mag es nicht in allen Fällen notwendig sein, Denaturierung bis zu dem Punkt- durchzuführen, an dem vollständig einzelsträngige Moleküle der Nukleinsäure produziert worden sind. Es kann ausreichend sein, eine ausreichende lokale und/oder vorübergehende Schwächung oder Trennung der Doppelhelix an der Primerhybridisierungsstelle zu erzeugen, um dem Primer zu ermöglichen, an sein Ziel zu binden. Wenn der Primer erst in Position auf einem ersten der Zielstränge ist, wird die Rehybridisierung der Zielstränge in dem Primerbereich verhindert werden und die anderen Zielstränge können durch Verlängerung des Primers oder durch weitere zeitweilige Schwächungs- oder Trennungsprozesse fortschreitend verdrängt werden.
Vorzugsweise umfasst dieser Amplifikationsprozess weiter das zyklische Wiederholen des oben definierten Vorgehens, z. B. für mehr als 10 Zyklen, z. B. bis zu 20 oder 30 Zyklen. Bei dem Amplifikationsprozess wird der Hybridisierungsschritt vorzugsweise unter Verwendung von zwei Primern durchgeführt, die komplementär zu unterschiedlichen Strängen der Nukleinsäure sind.
Die Denaturierung, um die Verlängerungsprodukte zu erhalten, ebenso wie die Ausgangsdenaturierung der Zielnukleinsäure wird vorzugsweise durch Anlegen einer Spannung zwischen Elektroden an die Lösung der Nukleinsäure durchgeführt, wobei die Lösung einen wie hierin beschriebenen Puffer enthält.
Der Prozess kann ein Standard- oder klassischer PCR-Prozess für die Amplifizierung von wenigstens einer spezifischen Nukleinsäuresequenz sein, die in einer Nukleinsäure oder einer Mischung aus Nukleinsäuren enthalten ist, worin jede Nukleinsäure aus zwei gesonderten komplementären Strängen von gleicher oder ungleicher Länge besteht, wobei der Prozess die folgenden Schritte umfasst:

a. Behandeln der Stränge mit zwei Oligonukleotidprimern für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die angewendet wird, unter Bedingungen, so dass für jede unterschiedliche Sequenz, die amplifiziert wird, ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert wird, welches zu jedem Nukleinsäurestrang komplementär ist, worin diese Primer ausgewählt werden, um im Wesentlichen mit verschiedenen Strängen jeder spezifischen Sequenz komplementär zu sein, so dass das aus einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt, wenn es von seinem Komplement getrennt wird, als eine Matrize für die Synthese des Verlängerungsproduktes des anderen Primers dienen kann;
b. Trennen der Primerverlängerungsprodukte von den Matrizen, auf welchen sie synthetisiert worden sind, um einzelsträngige Moleküle zu erzeugen, in der Anwesenheit dieses Promotors durch Anlegen einer Spannung von einer Elektrode an die Reaktionsmischung;
c. Behandeln der in Schritt b. erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern von Schritt a. unter Bedingungen, so dass ein Primerverlängerungsprodukt unter Verwendung jeder der in Schritt b. erzeugten Einzelstränge als eine Matrize synthetisiert wird.

Alternativ kann der Prozess irgendeine Variante des klassischen oder Standard-PCR-Prozesses sein, z. B. der so genannte „umgekehrte" oder „Umkehr"-PCR-Prozess oder der „verankerte" PCR-Prozess.
Die Erfindung schließt deswegen einen Amplifikationsprozess wie er oben beschrieben ist ein, in welchem ein Primer mit einer zirkulären Nukleinsäure hybridisiert wird und verlängert wird, um eine Duplex zu bilden, die durch den Denaturierungsprozess der Erfindung denaturiert wird, wobei der Amplifikationsprozess wahlweise durch einen oder mehrere zusätzliche Zyklen wiederholt wird.
Allgemeiner schließt die Erfindung einen Prozess für das Replizieren einer Zielsequenz aus Nukleinsäure ein, umfassend Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung der Nukleinsäure, (z. B. Zyklen aus Hybridisierung und Denaturierung), worin diese Denaturierung durch das Einwirken auf eine diese Nukleinsäure enthaltende Lösung mit einer Elektrode in der Anwesenheit dieses Puffers erzeugt wird.
Der Prozess der Erfindung ist anwendbar auf die Ligasekettenreaktion. Demgemäß schließt die Erfindung einen Prozess für die Amplifikation einer Zielnukleinsäure ein, umfassend die folgenden Schritte:

a. Bereitstellen von Nukleinsäure einer Probe als einzelsträngige Nukleinsäure;
b. Bereitstellen von wenigstens vier Nukleinsäurensonden in der Probe, worin:
i. die erste und zweite dieser Sonden primäre Sonden sind und die dritte und vierte dieser Sonden sekundäre Nukleinsäuresonden sind;
ii. die erste Sonde ein Einzelstrang ist, der in der Lage ist, mit einem ersten Segment eines primären Stranges der Zielnukleinsäure zu hybridisieren;
iii. die zweite Sonde ein Einzelstrang ist, der in der Lage ist, mit einem zweiten Segment dieses primären Stranges der Zielnukleinsäure zu hybridisieren;
iv. das 5'-Ende des ersten Segmentes dieses primären Stranges des Ziels relativ zu dem 3'-Ende des zweiten Segmentes dieses primären Stranges des Ziels positioniert wird, um das Verbinden des 3'-Endes der ersten Sonde mit dem 5'-Ende der zweiten Sonde zu ermöglichen, wenn diese Sonden mit diesem primären Strang dieser Zielnukleinsäure hybridisiert werden;
v. die dritte Sonde in der Lage ist, mit der ersten Sonde zu hybridisieren; und
vi. die vierte Sonde in der Lage ist, mit der zweiten Sonde zu hybridisieren; und
c. wiederholt oder fortwährend:
i. Hybridisieren dieser Sonden mit Nukleinsäure in dieser Probe;
ii. Ligieren hybridisierter Sonden, um reorganisierte fusionierte Sondensequenzen zu bilden; und
iii. Denaturieren von DNS in dieser Probe durch Anlegen einer Spannung aus einer Elektrode an die Reaktionsmischung in der Anwesenheit dieses Puffers.

Bei all den oben beschriebenen Amplifikationsvorgängen kann die Denaturierung der DNS, um die anschließende Hybridisierung mit den Primern zu ermöglichen, durch das Anlegen eines geeigneten Potentials an die Elektrode durchgeführt werden. Der Prozess kann schrittweise durchgeführt werden, was aufeinander folgende Zyklen der Denaturierung oder Renaturierung wie bei den bestehenden thermischen Verfahren von PCR und LCR einschließt, es ist jedoch auch möglich für ihn, kontinuierlich durchgeführt zu werden, da der Prozess der Kettenverlängerung oder Ligation durch das Enzym und die nachfolgende Strangtrennung durch den elektrochemischen Prozess in derselben Reaktion fortschreiten kann, da Nukleinsäuremoleküle in der einzelsträngigen Form frei sein werden, sobald sie den denaturierenden Einfluss der Elektrode verlassen, mit Primern zu hybridisieren.
Folglich, vorausgesetzt, dass der Primer mit der DNS hybridisieren wird, wird ein Verlängerungs- oder Ligationsprodukt synthetisiert werden. Die elektrochemische DNS-Amplifikationstechnik kann analytisch verwendet werden, um eine sehr kleine DNS-Probe, z. B. eine einzelne Kopie eines Gens in einer Tierzelle oder eine einzelne Zelle eines Bakteriums, nachzuweisen und zu analysieren.
Die Zeit, die benötigt wird, um die Denaturierung geschehen zu lassen, kann äußerst kurz sein, z. B. weniger als 0,5 Sekunden bis zu 1,0 Sekunden. Es kann ein Prozess der wiederholten Denaturierung doppelsträngiger Nukleinsäure durchgeführt werden, bei welchem diese Spannung als ein wiederholender Puls mit einer Dauer von bis zu 2 Minuten, z. B. bis zu einer Minute oder viel weniger angelegt wird.
Zwischen diesen Pulsen können die Spannungen für einen Zeitraum abgeschaltet und/oder umgekehrt werden, der ähnlich oder gleich ist mit dem Zeitraum, für den die Spannung angelegt wird, z. B. kann die Spannung als Pulse mit einer Frequenz von 0,01 bis 10 Hz angelegt werden. Eine einzelne Denaturierung kann unter Verwendung eines Einzelpulszyklus durchgeführt werden.
Die Spannung kann so angelegt werden, dass es in irgendeiner anderen Reihenfolge Zeiträume der Spannungsanlegung mit einer ersten Polarität, Zeiträume der Spannungsanlegung mit der zu dieser ersten Polarität entgegengesetzten Polarität und Zeiträume von wesentlich reduziert angelegter Spannung gibt. Die Zyklen können von 0,01 Sekunden bis 5 Minuten oder mehr lang sein, z. B. von 1 Sekunde bis 5 Minuten lang.
Vorzugsweise sind die Zeiträume, während denen diese Spannung mit einer ersten Polarität angelegt wird, und diese Zeiträume, während denen diese Spannung mit einer zweiten Polarität angelegt wird, jeweils unabhängig von 0,5 Sekunden bis 1 Minute.
Vorzugsweise sind die Zeiträume, während denen diese Spannung wesentlich reduziert ist, jeweils unabhängig von 0,5 Sekunden bis 3 Minuten.
Die Erfindung schließt einen Kit zur Verwendung in einem Prozess der Disassoziierung miteinander in Wechselwirkung stehender Moleküle ein, wobei der Kit eine Elektrode, eine Gegenelektrode und wahlweise eine Referenzelektrode und diesen Puffer umfasst.
Der Kit kann weiterhin irgendeine oder alle von einer oder mehreren Oligonukleotidsonden, ein Enzym wie Polymerase, einen oder mehrere Primer oder einen Disassoziierungspromotor, z. B. eine Lithiumionen-Quelle einschließen. Die Sonde, falls sie vorhanden ist, kann auf irgendeinem der oben diskutierten Wege markiert sein.
Die Reassoziation von Molekülen, insbesondere die Rehybridisierung von Nukleinsäuresträngen, kann durch die Anwendung einer Umkehrspannung unter Verwendung eines ähnlichen Puffers und anderen als hierin mit Bezug auf die Disassoziation beschriebenen Bedingungen erzeugt oder gefördert werden.
Die Erfindung wird nun mit Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen und Beispiele beschrieben werden.
1 ist eine Explosionsdarstellung einer elektrochemischen Zelle, die für die Denaturierung von DNS verwendet wird.
2 zeigt ein Zeit-/Spannungs-Profil, geeignet für die Verwendung bei der Betätigung der Zelle der 1.
3 zeigt in Beispiel 1 erhaltene Gele; und
4 zeigt ein in Beispiel 2 erhaltenes Gel.
Die in 1 gezeigte Zelle umfasst einen Sandwich, gebildet zwischen einem Paar gegenüberliegender Glasplatten 10, 11, außerhalb eines Paars gegenüberliegender Platinfolienelektroden 12, 13, welche auf jeder Seite eines Abstandsblattes aus einem Silikonelastomer (Silastic^TM) liegen. Ein Paar Kammern 15, 16 ist in dem Silastic^TM-Blatt ausgebildet. Jede Kammer besteht aus einem runden Ausschnitt mit einem Durchmesser von annähernd 10 mm und einem Einlasskanal, der sich bis zu der Kante des Blattes erstreckt. Das Silastic^TM-Blatt ist annähernd 400 μm dick. Jede Elektrode wird mit einer Verbindungsklemme 17, 18 bereitgestellt, durch welche die elektrische Verbindung mit ihr hergestellt wird.
Die Bereitstellung von zwei Hohlräumen in dem Silastic^TM-Blatt ermöglicht gleichzeitig das Durchführen von zwei Reaktionen gemäß der Erfindung oder von einer solchen Reaktion mit einer Kontrolle.
Folglich kann gesehen werden, dass die dargestellte elektrochemische Zelle zwei gegenüberliegende, flächige Platinelektroden umfasst. Die Elektroden werden durch ein Blatt eines verformbaren isolierenden Materials getrennt (in diesem Fall ein Silikonelastomer), welches eine Versiegelung gegen Flüssigkeitsverlust bildet und welches zugeschnitten ist, um die Elektrodenkammer zu bilden. Die Elektroden werden durch flache Platten abgestützt und das Ganze ist zwischen Aluminiumblöcken (nicht gezeigt) zusammengeklemmt, umfassend das Elastomerblatt mit einer Dicke im freien Zustand von ungefähr 500 μm. Der Potentialunterschied zwischen den Elektroden und das Polaritätsumkehrmuster über die Zeit werden auf einem PC eingestellt, der eine Spannungszufuhr kontrolliert. Die Elektrodenanordnungen werden bei der Arbeitstemperatur (geeigneterweise 55° C) gehalten, indem sie auf einen Heizblock mit geeigneter Temperatur gestellt werden.
Die in 1 gezeigte Zelle wird in den folgenden Beispielen verwendet.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wird elektrische Denaturierung in der elektrochemischen Zelle durch Anlegen eines Potentials zwischen den Elektroden durchgeführt. Es werden 45 μl linearisiertes Plasmid pUC 18 (2868 Basenpaare) in einer Konzentration von 0,5 μg/ml in Wasser oder Puffer in die Zelle gegeben. Es wird ein Potentialunterschied über die Elektroden für eine festgelegte Zeitdauer angelegt, mit oder ohne einer Anzahl von Polaritätsänderungen. Ein typisches „Profil" ist in 2 dargestellt, wo x = 1,2 V, t₁= 3 s und t₂ = 1 s ist. Die Probe wird dann aus der Zelle entfernt und der Agarosegelelektrophorese ausgesetzt. Die Denaturierung wird als geschehen beurteilt, wenn eine Abwärtsverschiebung in der Lage der Bande beobachtet wird.
3 zeigt drei Gele, die pUC-DNS in einigen der untersuchten Puffer nach Aussetzen an die elektrischen Profile der 2 enthalten. Erfolgreiche Denaturierung geschah in CHES, CAPS, CAPSO und in den durch Hitze denaturierten Kontrollproben. Tris-HCl resultierte in diffusen Banden und die anderen Puffer waren unwirksam. Alle Puffer wurden in einer Konzentration von 5 mM und bei pH 7,5 verwendet, mit Ausnahme von CAPS mit pH 8,0.
Beispiel 2
Dies ist ein in einer elektrochemischen Zelle durchgeführtes PCR-Verfahren, bei dem ein angelegtes Potential Hitze als das Denaturierungsmittel ersetzt. 45 μl der Reaktionsmischung enthielten Matrizen-DNS (0,5 ng linearisiertes pUC), 200 μM von jedem dNTP, 0,2 μM von jedem Primer (um ein Amplikon von 375 Basenpaaren zu ergeben), 0,5 U „Vent"-Polymerase (New England Biolabs Inc.), 0,1 % Triton X-100, 3 mM MgSO₄, in 10 mM CHES-Puffer, pH 7,5. Es wurden 20 Zyklen mit dem in 2 gezeigten elektrischen Profil verwendet, wo x = 0,5 V, jedoch mit einem 60-s-Zeitraum von 0 V nach jedem Zyklus, um das Annealing der Primer und die Verlängerung der Stränge zu ermöglichen.
Amplifikation wurde erreicht und ist in 4 dargestellt, welche vier Wiederholungen und eine Kontrolle zeigt. Die Identität der bei der elektrischen Amplifikation erzeugten Banden wurde bestätigt durch:

– optische Beurteilung auf mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen;
– Extraktion der Probe mit Phenol-Chloroform-ISA und Fällung aus der wässrigen Phase mit Ethanol und erneutes Erscheinen der Bande, wenn sie auf einem Gel laufen gelassen wurde;
– Detektion des biotinylierten Amplikons in einem Test, bei dem das Amplikon auf einer Streptavidinplatte gefangen wurde, zur Einzelsträngigkeit geschmolzen wurde, mit spezifischen DIG-markierten Sonden hybridisiert wurde, die durch die Zugabe von Anti-DIG-Antikörpern, welche mit einem Farbe bewirkenden Enzym konjugiert waren, sichtbar gemacht werden;
– das Nichterscheinen der Bande (in Agarosegelen) nach der Behandlung des elektrisch erzeugten Amplikons mit DNAse.

Claims

Verfahren zur Denaturierung hybridisierter Nucleinsäuremoleküle, bei dem eine die Nucleinsäuremoleküle enthaltende Flüssigkeit einer elektrischen Spannung unterworfen wird, die unter solchen Bedingungen zwischen Elektroden angelegt wird, dass zumindest ein Anteil der Nucleinsäuremoleküle in Gegenwart eines Puffers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus N-Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES), N-Cyclohexyl-3-aminopropansulfonsäure (CAPS) und N-Cyclohexyl-3-amino-2-hydroxypropansulfonsäure (CAPSO), ganz oder teilweise denaturiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, das in einer Konzentration des Puffers von 5 bis 10 mM durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem sich die Elektroden bis auf 0,5 mm nahe kommen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem eine Spannung von 0,5 bis 3 Volt zwischen den Elektroden angelegt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem eine Spannung von 1,5 bis 2,5 Volt zwischen den Elektroden angelegt wird.
Verfahren der wiederholten Dissoziation der Moleküle, bei dem die Moleküle nach einem in einem der vorstehenden Ansprüche beanspruchten Verfahren dissoziiert werden, bei dem die Spannung als wiederholter Puls mit einer Dauer von bis zu 2 Minuten angelegt wird.
Verfahren der wiederholten Dissoziation nach Anspruch 6, bei dem die Spannung als wiederholter Puls mit einer Dauer von bis zu einer Minute angelegt wird.
Verfahren der wiederholten Dissoziation nach Anspruch 6 oder 7, bei dem die Spannung zwischen den Pulsen für einen Zeitraum abgeschaltet und/oder umgekehrt wird, der dem Zeitraum, über den die Spannung angelegt wird, gleich ist.
Verfahren der wiederholten Dissoziation nach Anspruch 8, bei dem die Spannung als Impulse mit einer Frequenz von 0,01 bis 10 Hz angelegt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Spannung so angelegt wird, dass es in beliebiger Reihenfolge Zeiträume des Anlegens von Spannung mit einer ersten Polarität, Zeiträume des Anlegens von Spannung mit der der ersten Polarität entgegengesetzten Polarität und Zeiträume mit wesentlich verringerter angelegter Spannung gibt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Zyklen 1 Sekunde bis 5 Minuten lang sind.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem die Zeiträume, während derer Spannung mit einer ersten Polarität angelegt wird, und die Zeiträume, während derer die Spannung mit einer zweiten Polarität angelegt wird, unabhängig voneinander jeweils 0,5 Sekunden bis 1 Minute betragen.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, bei dem die Zeiträume, während derer die Spannung wesentlich verringert wird, einzeln jeweils 0,5 Sekunden bis 3 Minuten betragen.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielsequenz von Nucleinsäure, umfassend die Hybridisierung, Verlängerung und Denaturierung von Nucleinsäure, wobei die Denaturierung dadurch durchgeführt wird, dass die Nucleinsäure einer Spannung unterworfen wird, die in Gegenwart eines die Dissoziation gestattenden Puffers, bei dem es sich um CHES, CAPS oder CAPSO handelt, zwischen Elektroden angelegt wird.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielsequenz von Nucleinsäure nach Anspruch 14, bei dem die Denaturierung durch ein Dehybridisierungsverfahren der in einem der Ansprüche 1 bis 13 beanspruchten Art durchgeführt wird.
Verfahren zur Amplifikation einer Zielsequenz nach Anspruch 14 oder 15, bei dem es sich um eine PCR- oder LCR-Amplifikation handelt.
Kit zur Verwendung in einem Verfahren zur Denaturierung hybridisierter Nucleinsäuremoleküle, das eine Elektrode, eine Gegenelektrode, ggfs. eine Referenzelektrode und einen Puffer umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus N-Cyclohexyl-2- aminoethansulfonsäure (CHES), N-Cyclohexyl-3-aminopropansulfonsäure (CAPS) und N-Cyclohexyl-3-amino-2-hydroxypropansulfonsäure (CAPSO).