-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur gleichzeitigen Detektion verschiedener Target-Nukleinsäuren in
einer Probe mittels eines elektrochemischen Sensors.
-
Nukleinsäuren gehören zur Stoffklasse der langkettigen
Polynukleotide, die die Träger
der genetischen Information darstellen. Als Bausteine des Lebens
spielen Nukleinsäuren
oder deren Äquivalente eine
zentrale Rolle im gesamten Gebiet der Life-Sciences (Lebenswissenschaften)
und Chemie.
-
Die wiederkehrenden Einheiten von
Base, Pentose und Phosphorsäure,
aus denen Nukleinsäuren
bestehen, werden als Nukleotide bezeichnet. Die Abfolge bzw. die
Strukturen dieser wiederkehrenden Einheiten bestimmen die Funktion
der Nukleinsäuren und
sind für
jeden Organismus charakteristisch. Das heißt, mit der Detektion einer
bestimmten Nukleotidabfolge der in einer Probe vorkommenden Nukleinsäure, beispielsweise
in einer Trinkwasser- oder Lebensmittelprobe, ist es u.a. möglich, zu
bestimmen, durch welche Organismen, insbesondere Mikroorganismen,
die Probe kontaminiert ist. Bei der Lebensmittelprüfung ist
es selbstverständlich
auch möglich, nicht
nur die Anwesenheit von kontaminierenden Mikroorganismen oder Parasiten
nachzuweisen, sondern auch die Reinheit der Lebensmittel zu bestimmen.
So kann z. B. bestimmt werden, ob Rind- oder Schweinefleisch, das
aus religiösen
oder gesundheitlichen Gründen
in definierten Lebensmitteln nicht vorhanden sein sollte, in der
Lebensmittelprobe vorkommt.
-
Gemäß der Schlüsselrolle der Nukleinsäuren im
gesamten Bereich der Life-Sciences sind im Stand der Technik eine
Vielzahl von Methoden und Vorrichtungen offenbart, mit denen Nukleinsäuren bzw.
Oligonukleotide detektiert werden können.
-
In einer ersten Näherung ist es möglich, Nukleinsäuren durch
Zonenzentrifugation bzw. Gleichgewichtszentrifugation zu bestimmen.
Bei bestimmten Nukleinsäuremolekülen kann
auch die Analyse mit Hilfe der Elektronenmikroskopie hilfreich sein,
um beispielsweise eine virale Nukleinsäure in einer Probe zu detektieren.
Derartige Methoden lassen jedoch keine detaillierte Bestimmung der
anwesenden Nukleinsäuren
zu.
-
Eine weitere Nachweismethode ist
die Agarose-Gel-Elektrophorese,
die in Kombination mit Endo- und Exonukleasen die Untersuchung von
Nukleinsäuremolekülen ermöglicht.
Zahlreiche weitere Detektionsmöglichkeiten
machen sich die Fähigkeit
der Denaturierung und Renaturierung von Nukleinsäuren zunutze. Bei diesen Verfahren
bildet die Fähigkeit
der Nukleinsäuren
zur Hybridisierung die Grundlage des Nachweises. Hybridisierung
ist die sequenzabhängige
Paarung von einzelsträngigen
RNA- oder DNA-Molekülen
zu einem Doppelstrang – dem
Hybrid. Wenn z. B. überprüft werden
soll, ob ein Stück DNA
aus einem Organismus mit dem eines anderen Organismus verwandt ist,
werden die zu vergleichenden DNA- Abschnitte
denaturiert, folgend zur Reassoziation in einem Reaktionsgefäß vereinigt
und untersucht, ob sich ein Strang des ersten Organismus mit einem
Strang einer DNA des zweiten Organismus zu einem Doppelstrang zusammenfinden
kann. Auch komplementäre
RNA kann mit DNA ein doppelsträngiges
RNA-DNA-Hybrid bilden
und dadurch zum Nachweis und zur Analyse von Nukleinsäuren genutzt
werden.
-
Die WO 00/42217 betrifft ein Nachweisverfahren
von Nukleinsäuresequenzen
mittels der Detektion eines Hybridisierungsereignisses. Dabei dienen
einzelsträngige
Oligomere mit redoxaktiven Einheiten, die an einer leitfähigen Fläche gebunden
sind, als Hybridisierungssonde, wobei sich das Stromsignal an der
Elektrode nach der Hybridisierungsreaktion ändert.
-
In der WO 01/16361 A2 ist ein Verfahren
zum Nachweis und zur Quantifizierung von in einer Flüssigkeit
befindlichen Biomolekülen
offenbart, wobei Polymere, die eine spezifische Affinität zu den
Biomolekülen
aufweisen, an der Oberfläche
von Elektroden gebunden sind und durch Anlegen einer veränderlichen
Spannung die Anlagerung der Biomoleküle durch Messung der unmittelbaren
Spannungsänderung
bestimmt werden kann.
-
Weiterhin sind im Stand der Technik
Verfahren beschrieben, bei denen so genannte Fänger-Sequenzen, die an einer
Elektrode gebunden sind, komplementär zu einem Teil des Targets
sind, und Nachweissequenzen komplementär zu einem anderen Teil des
Targets sind, wobei die Nachweissequenzen mit einer signalverstärkenden
Einheit verbunden sind, wie z. B. einem Enzym (WO 00/32813, WO 99/67628,
WO 99/57319).
-
Die genannten Verfahren weisen jedoch mehrere
Nachteile auf. Die Verfahren, die sich die unterschiedlichen Sedimentationskonstanten
oder bestimmte optische Eigenschaften zunutze machen, sind relativ
ungenau und lassen eine genaue Detektion der Nukleinsäuren nicht
zu. Die elektrophoretischen Verfahren, einschließlich der Blottingmethoden,
sind sehr teuer und zeitaufwendig. Mit den bekannten elektrochemischen
Verfahren ist es nicht möglich,
mit einer universellen Nachweisreaktion unterschiedliche Analyten
unter Verwendung einer Messreaktion zu erfassen. Das heißt, dass
unterschiedliche Analyten jeweils unterschiedlich analysiert oder
nachgewiesen werden müssen,
so dass das Verfahren zur parallelen Bestimmung verschiedener Nukleinsäuren relativ
aufwendig ist.
-
Aufgabe der Erfindung ist es daher,
ein Verfahren bereitzustellen, bei dem mit einer universellen Nachweisreaktion
unterschiedliche Analyten gleichzeitig sicher, effektiv und kostengünstig erfasst
werden können.
-
Die Erfindung löst dieses technische Problem
durch Bereitstellung eines Verfahrens zur simultanen Detektion verschiedener
bzw. unterschiedlicher Target-Nukleinsäuren in einer Probe, wobei das
Verfahren folgende Schritte umfasst:
- – kovalentes
Koppeln einer im Wesentlichen einheitlichen Nachweissequenz an die
unterschiedlichen Target-Nukleinsäuren, wodurch
Target-Nachweis-Oligonukleotide entstehen, wobei diese zumindest
in einem Teilbereich identisch sind,
- – in
Kontakt bringen der Target-Nachweis-Oligonukleotide mit mindestens
einer Elektrode oder einem Elektrodenarray umfassend targetspezifische,
komplementäre
Fänger-Oligonukleotide, die
auf den Elektroden oder dem Elektrodenarray fixiert sind, wobei
die Target-Nachweis-Oligonukleotide
in einer ersten Hybridisierungsreaktion an die komplementären Fänger-Oligonukleotide
binden,
- – Zugabe
eines im Wesentlichen einheitlichen Marker-Oligonukleotids umfassend eine zur Nachweissequenz
komplementäre
Sequenz und ein Markermolekül,
wobei in einer zweiten Hybridisierungsreaktion das Marker-Oligonukleotid an alle
in der ersten Reaktion gebundenen Nachweissequenzen bindet,
- – Detektion
des Markers.
-
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
können
daher mehrere verschiedene Target-Nukleinsäuren parallel bzw. simultan
unter Nutzung einer einheitlichen Nachweisreaktion detektiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren
kann selbstverständlich
mit anderen Verfahren zur Probenvor- oder -nachbereitung kombiniert
werden. Insbesondere kann die nachzuweisende Nukleinsäure – beispielsweise
eine DNA – zunächst denaturiert
und folgend eine spezifische Region dieser Nukleinsäure mittels PCR
vervielfältigt
werden. Diese spezifische Region ist ein charakteristischer Sequenzbestandteil
der zu detektierenden Nukleinsäure.
Erfindungsgemäß ist es
in einem ersten Verfahrensschritt möglich, mittels entsprechender
Primerpaare diese spezifischen Regionen der zu detektierenden Nukleinsäuren in
einer PCR zu amplifizieren. Einer der Primer ist dabei z. B. an
seinem 5'-Ende mit
einer nichtprimenden Nachweissequenz modifiziert. So ist gewährleistet,
dass alle amplifizierten Nukleinsäurefragmente mit einer einheitlichen
Nachweissequenz verlängert
sind, intern jedoch die targetspezifischen Regionen der ursprünglich zu
detektierenden Nukleinsäuren
enthalten. Sofern die zu untersuchende Probe für das erfindungsgemäße Verfahren
auf diese Weise vorbereitet wurde, werden beide Stränge der
aus der PCR hervorgegangenen dsDNA getrennt. Der +Strang, der erfindungsgemäß auch als
einzelsträngiges
Target-Nachweis-Oligonukleotid bezeichnet werden kann, wird dann
in einem weiteren Verfahrensschritt mit der Elektrode oder einem
Elektroden-Array in Kontakt gebracht. Jede Elektrode ist so aufgebaut, dass
sie eine für
einen bestimmten Abschnitt der Target-Nukleinsäuren spezifische und komplementäre Sequenz
trägt.
Demgemäß sind diese
Target-Nukleinsäure spezifischen
Sequenzen, die wegen ihrer Funktion auch als Fänger-Oligonukleotide bezeichnet
werden können,
an den Elektroden immobilisiert. Dabei ist es vorteilhafterweise
nicht erforderlich, dass die Fänger-Oligonukleotide
in ihrer Länge
der vollständigen
nachzuweisenden Target-Nukleinsäure
im Target-Nachweis-Oligonukleotid entsprechen. Die Fänger-Oligonukleotide hybridisieren
jeweils mit den komplementären
Bereichen der Target-Nukleinsäure im
Target-Nachweis-Oligonukleotid
in einer ersten Hybridisierungsreaktion, so dass eine Bindung untereinander
und somit an der Elektrode erfolgt. Im Ergebnis dieser ersten Hybridisierungsreaktion
hat sich demgemäß auf der
Elektrode ein Hybrid aus Target-Nachweis-Oligonukleotid
und dem Fänger-Oligonukleotid
ausgebildet, welches außerdem
die durch den vorgeschalteten Verfahrensschritt eingefügte Nachweissequenz
umfasst.
-
Nach dieser ersten Hybridisierungsreaktion an
den Elektroden ist eine Sortierung der Target-Nachweis-Oligonukleotide
und somit eine Zuordnung zu einzelnen Elektroden im Array erfolgt.
-
In einem weiteren Verfahrensschritt
werden einheitliche Marker-Oligonukleotide zugegeben. Diese können mit
den komplementären
Nachweissequenzen in den Target-Nachweis-Oligonukleotiden in einer zweiten Reaktion
hybridisieren, sofern sich auf den Elektroden die Hybride aus Fänger-Oligonukleotid und
Target-Nachweis-Oligonukleotid gebildet haben. Das heißt, die
Marker-Oligonukleotide und somit die an diesen befindlichen Markermoleküle werden genau
auf den Elektroden angekoppelt, auf denen in der ersten Hybridisierungsreaktion
die Target-Nachweis-Oligonukleotide an komplementäre Fänger-Oligonukleotide
binden konnten. Im Anschluss an diese zweite Hybridisierungreaktion
kann nun in Abhängigkeit
vom verwendeten Markermolekül
mit einer einheitlichen elektrochemischen bzw. biochemischen Nachweisreaktion
der Marker detektiert werden.
-
Der Marker kann beispielsweise ein
redoxaktives Molekül
oder ein Enzym sein, wobei durch eine Reduktion bzw. Oxidation des
Markers selbst oder durch die Reduktion oder Oxidation von Substraten bzw.
Produkten in einer Enzymreaktion der Marker direkt oder indirekt
detektierbar ist. Dem Fachmann sind weitere Marker bekannt, die
durch Enzymreaktionen direkt oder indirekt bestimmt werden können. Es
ist selbstverständlich
auch möglich,
dass redoxaktive Markermoleküle
verwendet werden, die bewirken, dass die Bindungsreaktion der Marker-Oligonukleotide an
die Nachweissequenzen in den Target-Nachweis-Oligonukleotiden, also die
zweite Hybridisierungsreaktion, zu einer Spannungs- oder Stromänderung
führt,
und daher z. B. durch Impedanzmessung, durch Square Wave-Voltammetrie und/oder
Differenzial-Puls-Voltammetrie
das zweite Hybridisierungsereignis bestimmt werden kann. Durch das
Anlegen einer Spannung und/oder eines Stroms an den Elektroden und
die Mesung der zweiten Hybridisierungsreaktion, die eine unmittelbare Änderung
der Spannung und/oder des Stroms an den betreffenden Elektroden
bedingt, können
die in der Probe befindlichen Target-Nachweis-Oligonukleotide detektiert werden. Dem
Fachmann sind verschiedene Formen der Ausgestaltung solcher Verfahren
bekannt. Es ist beispielsweise möglich,
dass die Messung der zweiten Hybridisierungsreaktion über eine
aufgeprägte Änderung
eines Gleichspannungssignals mit bestimmter Geschwindigkeit innerhalb
eines bestimmten Potentialbereichs und Messung des daraus resultierenden
Gleichstromsignals erfasst wird, beispielsweise als zyklovoltammetrische Messung.
Selbstverständlich
ist es auch möglich, dass
die zweite Hybridisierungsreaktion über ein Wechselstromsignal
phasensensitiv bestimmt wird, insbesondere so, dass das Wechselstromsignal
einem zyklischen Gleichstromsignal aufgeprägt ist.
-
Die erfolgreiche Hybridisierungsreaktion
wird also u.a. durch elektrochemische Effekte erkennbar, die in
vielen Fällen
auch zu einer quantitativen Analyse nutzbar sind.
-
Unter Immobilisierung im Sinne der
Erfindung sind alle Methoden zur Einschränkung der Beweglichkeit und
Löslichkeit
von Nukleinsäuren,
insbesondere von den Fänger-Oligonukleotiden,
auf chemischen und/oder physikalischen Wegen zu verstehen. Die Immobilisierung
kann durch unterschiedliche Methoden erfolgen, wie der Bindung der
Oligonukleotide an Elektrodenflächen, durch
Festhalten im Netzwerk einer polymeren Matrix oder Umschließen durch
Membranen. Weiterhin ist es selbstverständlich möglich, die Oberfläche der
Elektroden mit Poly-L-Lysinen, Aminosilanen, Aldehydsilanen, Epoxy-Gruppen,
Gold, Streptavidin, reaktiven Gruppen, Polyacrylamid-Pads, immobilisierter
Nitrocellulose, aktivierten Aldehyden, Agarose-Aldehyd-Gruppen und/oder
Tresyl-Gruppen zu beschichten. Durch derartige Substratoberflächenbehandlungen
ist es vorteilhafterweise möglich,
die Haltbarkeit und die Bindungskapazität der Oberfläche der
Elektroden so zu verbessern, dass die Fänger-Oligonukleotide sehr gut
und stabil über
einen längeren
Zeitraum immobilisiert werden können.
Durch die Immobilisierung der Oligonukleotide (Fänger-Oligonukleotide) kann die Elektrodenoberfläche nach
dem Prozess der Interaktion mit der biologischen Probe leicht wieder
regeneriert und somit wiederverwendbar werden, indem die über Hybridisierung
gebundenen Nukleinsäuren
wieder abgelöst
werden, die Immobilisierung der Fänger-Oligonukleotide aber erhalten bleibt.
Die Bindung bzw. die Immobilisierung der Oligonukleotide an den Elektroden
kann durch direkte Trägerbindung
und durch Quervernetzung erfolgen. Die Trägerbindung bzw. Quervernetzung
erfolgt gemäß der Erfindung insbesondere
ionisch/adsorptiv oder durch kovalente Bindung. Die Quervernetzung
im Sinne der Erfindung ist eine Vernetzung der Detektionsmoleküle, das heißt der Fänger-Oligonukleotide,
untereinander oder mit anderen Polymeren. Bei der Immobilisierung durch
Einschluss werden die Oligonukleotide in Gelstrukturen bzw. in Membranen
so eingeschlossen, dass eine Interaktion mit den nachzuweisenden
Target-Nukleinsäuren
nach wie vor möglich
ist.
-
Im Weiteren können Temperaturerhöhungen benutzt
werden, um durch Hybridisierung entstandene doppelsträngige Nukleinsäure-Bereiche wieder aufzutrennen.
Im Falle von Nukleinsäure-Molekülen, die
an Elektrodenoberflächen
immobilisiert sind, wie den Fänger-Oligonukleotiden,
kann z. B. eine vorübergehende
Temperaturerhöhung
bis kurz unterhalb der Siedetemperatur des Wassers dazu dienen,
alle hybridisierten Target-Nachweis-Oligonukleotide und Marker-Oligonukleotide
von der Elektrodenoberfläche
zu entfernen und diese dadurch für
den nächsten Erkennungsvorgang
zu regenerieren. Diese Vorgehensweise zur Regeneration der Elektrodenoberfläche macht
häufig
wiederholte Temperaturänderungen
zwischen einer oberen Temperatur, bei der die komplementären. Partner
getrennt werden, und einer unteren Temperatur (meist nahe der Zimmertemperatur),
bei der eine Hybridisierung möglich
ist, notwendig. Beide Grenztemperaturen müssen vom Fachmann durch Routineversuche
eingestellt werden. Chemische Regenerierungsschritte, die ebenfalls
benutzt werden können,
beruhen auf der Lösung der
Wasserstoffbrückenbindungen,
z. B. durch Harnstoff, NaOH oder Formamid.
-
Das Ablegen der Fänger-Oligonukleotide auf den
Elektroden für
deren Immobilisierung kann zum Beispiel mit physikalischen oder
chemischen Methoden erfolgen. Unabhängig von der Art der zu immobilisierenden
Oligonukleotide (spezifische Nukleotidabfolge) können verschiedene Wege verfolgt
werden, wie z. B.:
- 1. Ablegen und Immobilisieren
von zuvor synthetisierten Fänger-Oligonukleotiden
an definierten Positionen eines funktionalisierten Elektrodenmaterials.
Hierfür
können
sowohl Spotting- als auch Druckverfahren eingesetzt wer den. Unter
Spotting versteht man Verfahren, bei denen Flüssigkeitstropfen abgelegt werden,
wobei durch Oberflächenwechselwirkung
und Trocknen im Wesentlichen runde Spots entstehen. Andere Druckverfahren
ermöglichen
das Aufbringen des Immobilisats in definierten Flächen auf
der Oberfläche. Bevorzugt
werden die Fänger-Oligonukleotide – durch
Contact Tip Printing, Ring and Pin Printing, Nanopipetting, Buble
Jet Printing, TopSpot Printing, Micro Contact Printing, Micro Fluidic
Networks-Methoden,
Photolithographic Activation-Verfahren, Photoresist Lithography,
Electrochemical Focusing und/oder Micro Wet Printing immobilisiert.
- 2. In situ-Synthese der Fänger-Oligonukleotide
an definierten Positionen der Elektroden durch sukzessive Kopplung
monomerer Synthesebausteine.
-
Eine Probe im Sinne der Erfindung
ist die Bezeichnung für
ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches oder chemisches
Gut oder eines Teiles bzw. einer kleinen Menge eines solchen, dessen
Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden
soll. Die Probenentnahme erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge
einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch Untersuchung
der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch
die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf
die Gesamtmenge, z. B. Trinkwasser, Lebensmittel, Blut, transplantierte
Organe u. a., zulässt.
Für die
Untersuchung können
die Proben durch Mischen, Zerteilen, Zerkleinern, Zugabe von Enzymen
oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind
verschiedene Möglichkeiten
der Vorbehandlung der Proben bekannt.
-
Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein,
dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der
gesamten Menge entspricht. Eine Probe können alle biologischen und nichtbiologischen
Materialien sein, wie biologische Gewebe und Flüssigkeiten, z. B. Blut, Lymphe,
Urin, Gehirnflüssigkeit
und andere, sowie Trink- und Badewässer, Umweltabwässer, Bioreaktorenflüssigkeiten, Lebensmittelinhaltsstoffe,
Gefahrenstoffe u.v.a. mehr.
-
In einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung erfolgt in einem ersten Verfahrensschritt das kovalente
Binden der einheitlichen Nachweissequenz an die in einer Probe befindlichen,
potentiellen Target-Nukleinsäuren
in einer PCR mit entsprechenden Primern, wobei einer der Primer
an seinem 5'-Ende
mit einer nichtprimenden Nachweissequenz modifiziert ist. Die Auswahl
der Primer richtet sich nach der Art der nachzuweisenden Target-Nukleinsäuren. Beispielsweise
können
mit Hilfe so genannter Universalprimer Regionen der 16S rDNA aus
Mikroorganismen amplifiziert werden. Diese Universalprimer sind
komplementär
zu den hoch konservierten Bereichen der 16S rDNA, um eine Vielzahl
unterschiedlicher Mikroorganismen zu erfassen. Gleichzeitig flankieren
sie einen Bereich der 16S rDNA, der für die jeweils verschiedenen
Mikroorganismen spezifisch ist. Die auf den Elektroden immobilisierten Fänger-Oligonukleotide werden
aus diesen spezifischen Bereichen gewählt und können somit ganz bestimmte Mikroorganismen
detektieren. Neben den Universalprimern können auch spezifische Primer
in der PCR eingesetzt werden, um beispielsweise Bereiche aus Genen
zu amplifizieren, die charakteristisch für bestimmte Mikroorganismen
oder Mikroorganismengruppen sind. Unabhängig jedoch von der Art der gewählten Primerpaare
wird in jedem Fall durch die Modifizierung eines Primers an seinem 5'-Ende mit der nichtprimenden
Nachweissequenz eine dsDNA amplifiziert, welche nun sowohl die targetspezifischen
Sequenzen enthält,
als auch die einheitliche Nachweissequenz. Für den eigentlichen Detektionsschritt
an der Elektrode wird aus dem doppelsträngigen PCR-Produkt das einzelsträngige Target-Nachweis-Oligonukleotid
gewonnen. Dem Fachmann sind verschiedene Verfahrensweisen diesbezüglich bekannt.
-
Das Target-Nachweis-Oligonukleotid
wird anschließend
mit der modifizierten Elektrodenoberfläche in Kontakt gebracht. In
einer ersten Reaktion können
die targetspezifischen Sequenzen des Target-Nachweis-Oligonukleotids
mit den komplementären
Sequenzen des auf der Elektrode immobilisierten Fänger-Oligonukleotids hybridisieren.
In einer nachfolgenden zweiten Hybridisierungsreaktion kann nun das
einheitliche Marker-Oligonukleotid
an die komplementäre
Nachweissequenz im zuvor entstandenen Hybrid binden. Das Marker-Oligonukleotid
enthält
seinerseits ein Markermolekül,
mit Hilfe dessen der gebildete Oligonukleotid-Komplex auf der Elektrode
elektrochemisch nachgewiesen werden kann.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung kann als Marker ein redoxaktives Molekül oder ein
Enzym eingesetzt werden. Im Sinne der Erfindung kann der Marker
demgemäß ein redoxaktives
Molekül
sein, wie beispielsweise ein Farbstoff aus den Stoffgruppen der
Phenazine, Phenothiazine, Phenoxazine, Indigosulfonate, Viologene
oder Triarylmethan-Farbstoffe,
der an der entsprechend polarisierten Elektrode ein Stromsignal
bewirkt. Es ist selbstverständlich
auch möglich,
dass der Marker ein Enzym ist, das bei einer Reaktion ein Substrat
zu einem Produkt umsetzt, wobei die verbrauchten Substrate/Cosubstrate
und/oder die gebildeten Produkte so aufgebaut sind, dass sie in
einer elektrochemischen Reaktion an der Elektrode gemessen werden können. Derartige
Verfahren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Mit
Vorteil ist es selbstverständlich
weiterhin möglich,
an diese erste Enzymreaktion eine zweite Enzymreaktion zu koppeln,
die vorteilhafterweise zu einer Signalverstärkung führen kann. Bevorzugt ist hierfür als Markerenzym
eine saure und/oder alkalische Phosphatase oder Beta-Galaktosidase,
die bei der Hydrolyse eines geeigneten Substrats (z. B. Phenylphosphat)
Phenol generiert. Auf einer mediatormodifizierten Elektrodenoberfläche kann
gemäß der Lehre
Kotte et al. „Analytical
Chemistry 67" (1995)
Tyrosinase immobilisiert werden. Tyrosinase katalysiert die Oxidation von
Phenol zu Catechol und in einem zweiten Reaktionsschritt zu o-Chinon.
Der aufgrund der verwendeten Polarisationsspannung der Elektrode
in reduzierter Form vorliegende Redoxmediator reduziert o-Chinon
wieder zu Catechol, so dass es vorteilhafterweise für einen
weiteren Reaktionsschritt wieder zur Verfügung steht. Diese zyklische
Reaktion führt
zur Signalverstärkung
und ermöglicht
dadurch die Erfassung sehr kleiner Messsignale. Der Marker kann
erfindungsgemäß jedoch
auch so aufgebaut sein, dass er einen markierten Antikörper umfasst,
der beispielsweise durch Radioimmuntests detektiert werden kann.
-
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die Elektroden als Arbeitselektroden auf einem
Array oder Träger
angeordnet. Die Arbeitselektroden können beispielsweise bevorzugt
aus Gold, Platin, Silber, Karbon oder anderen dem Fachmann bekannten
Materialien oder Mischungen, z. B. auch Dickschichtpasten, bestehen. Bevorzugt
werden auf die Oberflächen
der Arbeitselektroden die Fänger-Oligonukleotide
für die
nachzuweisenden Sequenzen fixiert. Bevorzugt kann dies durch Adsorption,
Bindung über
reaktive Gruppen oder durch die Fixierung an eine Polymermatrix
erfolgen. Selbstverständlich
ist es auch möglich,
Leiterbahnen, beispielsweise aus einem Silberplatingemisch, einem
Karbonplatingemisch oder aus Kohlenstoffgemischen zu verwenden,
wobei die Isolierung der Elektroden insbesondere mit einem Epoxidharz oder
durch andere Lacke erfolgt. Es ist bevorzugt, neben den Arbeitselektroden
auch Referenz-Elektroden zu verwenden, die insbesondere aus Platin,
Silber, Silber/Silberchlorid oder anderen dem Fachmann bekannten
Materialien bestehen können.
-
Bei der Herstellung von Ultra-Mikroelektroden
und Ultra-Mikroelektroden-Arrays
(UMA) sind Arbeitselektroden mit einem Durchmesser von wenigen Mikrometern
oder kleiner bevorzugt, da solche Mikro- bzw. Ultra-Mikroarbeitselektroden
aus analytischer Sicht vorteilhafte Eigenschaften aufweisen. Vorteilhafterweise
bestehen qualitative Unterschiede zwischen Elektroden und Mikroelektroden,
die durch die Verringerung der Elektrodenfläche bedingt sind. Diese sind
beispielsweise die Verringerung des Einflusses von konvektiven Flüssigkeitsströmungen auf
das Elektrodensignal. Die an Mikroelektroden auftretenden Kapazitäten sind
vorteilhafterweise sehr klein und demgemäß sind die korrespondierenden
Ladeströme
zumeist so unbedeutend, dass elektrochemische Prozesse, wie sie
durch die zwei Hybridisierungsreaktionen verursacht werden bzw.
die elektrochemisch aktiven Marker bzw. Substrate/Produkte der Reaktion
des Markers, gut detektiert werden können. Die Massentransportrate
nimmt mit dem abnehmenden Elektrodenradius zu, wodurch der Strom
einen stationären
Zustand erreicht. Da die kapazitiven Ströme an Mikroelektroden vorteilhafterweise
zugleich verringert sind, wird so eine deutliche Verbesserung des
Signal-Rausch-Verhältnisses
erzielt, so dass die elektrochemische Reaktion zum Nachweis redoxaktiver
Marker bzw. Substrate/Produkte des Markers mit einem guten Signal
detektiert werden kann. Vorteilhaft sind die hohen Stromdichten
an Mikroelektroden. Die Mikroelektroden haben den Vorteil, mit geringem
Probenvolumen zu arbeiten.
-
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung, werden die Arbeitselektroden mit einer Gegenelektrode
und/oder Referenzelektrode verwendet. Durch den Einsatz von Arbeitselektroden, insbesondere
von mindestens zwei Arbeitselektroden, mit der Gegenelektrode und/oder
der Referenzelektrode ist es möglich,
Störungen
der Messung weitestgehend zu vermeiden. Bei einer elektrochemischen
Detektion der Marker kann beispielsweise auch vorgesehen sein, dass
nur ein Teil der Elektroden die Fänger-Oligonukleotide umfasst
und ein anderer Teil nicht. Die verschiedenen Elektroden können dann
mit der Probenflüssigkeit,
welche die nachzuweisenden Target-Nachweis-Oligonukleotide enthält, in Kontakt
gebracht werden. Auf diese Weise können Interferenzen, die aus
der Wechselwirkung störender
Substanzen in der Probe mit der unbedeckten Elektrode resultieren,
erfasst werden.
-
Durch das Zusammenwirken von Arbeitselektrode-Referenzelektrode
und/oder Gegenelektrode können
beispielsweise wichtige Größen, wie
insbesondere das Konstanthalten der angelegten Spannung, vorteilhafterweise
optimiert werden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn bei
enzymatischen Prozessen pH-Wert-Änderungen
und andere Modifikationen im System zu Störungen innerhalb der Zwei-
oder Drei-Elektroden-Systeme – je
nachdem, ob mit einer Gegen- oder Referenzelektrode oder mit beiden
im Zusammenhang mit einer Arbeitselektrode gearbeitet wird – führen können. Als
Gegenelektrode können
hierbei beispielsweise dem Fachmann bekannte Edelstahlelektroden
oder Platin, Kohlenstoff, Metall-Gemische oder Dickschichtpasten
verwendet werden. Als Arbeitselektrode können neben den oben genannten
bevorzugt Gold-, Kupfer-, Nickel-, Titan-, Blei-, Bleigraphit-Elektroden
bzw. Mischungen der genannten Metalle oder Mischungen in Dickschichtpasten
verwendet werden. Selbstverständlich
können
die Metalle auch aufgedampft werden.
-
Mit Vorteil können Arbeitselektroden verwendet
werden, bei denen im polarisierten Zustand in einem bestimmten Potentialbereich
kein Ladungstransfer zwischen der Metalloberfläche und der angrenzenden Probenlösung stattffindet.
-
Demgemäß können nichtpolarisierbare Elektroden,
die ihr Potential bei unterschiedlichen Strömen nicht verändern, insbesondere
als Referenzelektroden eingesetzt werden. Um vor allem einen hohen
Widerstand und somit einen Spannungsabfall im Zusammenhang mit einer
Zerstörung
der Referenzelektrode bei hohen Messströmungen vorzubeugen, ist eine
Anordnung vorteilhaft, in der der Strom über die Arbeitselektrode und
eine zusätzliche
Gegenelektrode geführt
wird, während
die als Bezugselektrode fungierende Referenzelektrode aufgrund ihrer
hohen Impedanz nahezu stromlos bleibt.
-
Besonderes vorteilhaft ist es, wenn
alle Arbeitselektroden auf die gleiche Spannung polarisiert werden
können,
weil die elektrochemische Nachweisreaktion an allen Elektroden gleich
ist. Dadurch können
Störungen
vermieden werden, die bei der Verwendung mehrerer unterschiedlicher
Polarisationsspannungen für
mehrere Arbeitselektroden mit einer gemeinsamen Gegenelektrode sowie
einer gemeinsamen Referenzelektrode auf treten würden.
-
Die Erfindung betrifft auch einen
Kit umfassend mindestens (a) eine Elektrode und/oder einen Elektrodenarray,
(b) ein Fänger-Oligonukleotid, (c) eine
Target-Nukleinsäure,
(d) eine Nachweissequenz für
die Target-Nukleinsäure
und/oder (e) ein Marker-Oligonukleotid. In dem Kit können die
Komponenten (a), (b), (c), (d) und/oder (e) getrennt oder in Kombination
vorliegen. Der Kit kann z.B. aus mehreren Sets bestehen, wobei in
jedem Set jeweils mindestens eine Komponente gemäß (a) bis (e) enthalten ist,
wobei nicht alle Komponenten, wie z.B. die Target-Nukleinsäure, Bestandteil
des Kits sein müssen.
Dem Fachmann ist durch die Offenbarung des erfindungsgemäßen Verfahrens
bekannt, wie er die einzelnen Komponenten gemäß (a) bis (e) in Kontakt bringen
muss, um eine Target-Nukleinsäure
nachzuweisen.
-
Selbstverständlich kann auch vorgesehen sein,
dass mehrere Komponenten in dem Kit bereits in Kontakt gebracht
sind, z.B. kann das Fänger-Oligonukleotid
an die Elektrode und/oder den Elektrodenarray gebunden sein; es
ist auch möglich,
dass weitere Komponenten nach (a) bis (e) kombiniert oder in einer
Teilkombination in dem Kit vorliegen. Es ist daher auch möglich, dass
eine bestimmte Komponente kein Bestandteil des Kits ist. Dies ist
beispielsweise der Fall, wenn nur die Komponenten gemäß (b), (d) und
(e) Bestandteil des Kits sind und die Elektrode durch den Anwender
bereitgestellt wird. Selbstverständlich
ist es möglich,
dass der Kit insbesondere die Elektrode und das Fänger-Oligonukleotid
oder die Elektrode, das Fänger-Oligonukleotid
und das Marker-Oligonukleotid
getrennt oder in Kombination bzw. Teilkombination – bereits
in Kontakt gebracht – umfasst.
Dem Fachmann ist bekannt, dass der Kit weitere Komponenten wie Primer,
beispielsweise Universalprimer oder Binde-Moleküle für die Immobilisierung umfassen
kann.
-
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des
Kits zum Nachweis einer Target-Nukleinsäure in einer Probe. Diese Probe
ist insbesondere eine biologische/chemische Probe wie z.B. ein Lebensmittel, eine
Abwasser- oder Trinkwasserprobe, Blut oder Serum, eine Gewebeprobe
oder anderes; es wird auf die obigen Ausführungen zu der Zusammensetzung der
möglichen
Proben verwiesen.
-
Im Folgenden soll die Erfindung anhand
eines Ausführungsbeispieles
näher erläutert werden, ohne
auf dieses Beispiel beschränkt
zu sein.
-
Beispiel
-
Das Verfahren wurde für die Kontrolle
von Wässern
auf die Anwesenheit von Pathogenen genutzt. Es gibt verschiedene
Leit-Keime, deren Anwesenheit in Wässern auf eine Verunreinigung
mit Mikroorganismen hinweisen, wie Coliforme, Fäkalstreptokokken, Clostridier,
Salmonellen, deren Anwesenheit untersucht wurde. Der Nachweis dieser
Keime erfolgt bisher mittels Methoden, die meist einen Schritt der
Kultivierung der Keime einschließen. Dadurch wird einerseits für die Methoden
ein hoher Arbeits- und Zeitaufwand erforderlich, andererseits können nur
kultivierbare Keime nachgewiesen werden, weshalb sich die bisherigen
Nachweismethoden bisher auf die kultivierbaren Leitkeime beschränken. Die
Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens (siehe 1) mit einem DNA-Sensor
bzw. DNA-Array-Sensor (2)
ist von Vorteil, weil damit parallel verschiedene Mikroorganismen
nachgewiesen werden können,
die zudem nicht kultivierbar sein müssen, denn ein Kultivierungsschritt
ist in dieser Methode nicht erforderlich. Dadurch werden zusätzliche
Mikroorganismen überhaupt
erst nachweisbar und es entsteht auch ein Vorteil bezüglich des
erforderlichen Zeitaufwands.