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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung eines
Nukleinsäure-Tests,
bei welchem eine Probe auf mehrere Zielsequenzen getestet werden
soll. Darüber
hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung
einer solchen Vorrichtung.
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Es
besteht heutzutage allgemein das Bestreben, biologische und chemische
Reaktionsabläufe zum
Nachweis einer Substanz zu standardisieren und möglichst in einen Teststreifen
zu integrieren, so dass die Nachweistests auch von nicht spezialisiertem
Personal durchgeführt
werden können.
Im Fall von Immunoassays ist dies bereits gelungen: Immunoassays
werden bereits erfolgreich als Schnelltest auf günstigen Teststreifen angeboten.
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Auch
für andere
Nachweisreaktionen und Assays ist es bereits gelungen, sämtliche
Prozessschritte von der Probenaufbereitung bis hin zur Detektion
auf einer Plastikkarte (Cartridge) umzusetzen. Die Vorgänge auf
einer derartigen Cartridge werden von einem Auslesegerät gesteuert,
in dem sich die Cartridge befindet. Die Zielmoleküle werden
am Ende des Prozesses mit Hilfe von Biochips (Mikroarrays), die
mit spezifischen Fängermolekülen ausgestattet
sind, detektiert, und die biologische Information wird optisch,
elektrisch oder magnetisch ausgelesen.
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Die
Integration verschiedener Aufbereitungsschritte auf einer Plastikkarte
erfordert jedoch eine komplexe Mikrofluidik auf der Cartridge, die
von dem Auslesegerät
gesteuert werden muss. Die Herstellung solcher Cartridges ist daher
wesentlich aufwändiger
und teurer als die der o. g. Immonoassay-Teststreifen. Zusätzlich erfordert
die Steuerung der Prozesse und die Signalauslesung komplexe Geräte, die ebenfalls
teuer in der Herstellung sind.
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Für Nukleinsäure-Tests,
bei denen eine Probe auf das Vorhandensein verschiedener DNA- oder RNA-Sequenzen
getestet werden soll, sind derartige Teststreifen oder Cartriges
derzeit nicht kommerziell erhältlich.
Dies hat seine Ursache darin, dass Nukleinsäuretests eine komplexe Probenaufbereitung, eine
Amplifikation der Zielsequenzen und eine Detektion mit spezifischen
Gensonden erfordern. Diese Schritte werden zurzeit noch fast ausschließlich manuell
im Labor durchgeführt.
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Die
heutigen schnellsten und einfachsten Nukleinsäure-Tests bedienen sich homogener
Assays mit Hilfe von Peltierblock-PCR oder einer Lightcycler-PCR.
Ein solcher Assay soll im Folgenden kurz beschrieben werden:
Zunächst müssen die
Nukleinsäuren
aus der Probe isoliert und aufgereinigt werden. Hierzu kann z. B. das
DNA-Isolationskit der Firma Qiagen verwendet werden.
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Anschließend wird
eine Amplifikation der Ziel-DNA-Stränge, bspw. durch eine PCR (Polymerase
Kettenreaktion, Engl. ”Polymerase
Chain Reaction”)
durchgeführt,
um die in der Probe enthaltene DNA zu vervielfältigen. PCR wird eingesetzt,
um einen kurzen, genau definierten Teil eines DNA-Stranges zu vervielfältigen.
Die hierfür
benötigten
Reagenzien sind: Ein DNA-Strang, der den zu vervielfältigenden
Abschnitt enthält,
zwei Primer, um Anfang und Ende des zu vervielfältigenden Abschnitts festzulegen,
eine thermostabile DNA-Polymerase, um den festgelegten Abschnitt
zu replizieren, Nukleotide, die Bausteine für den von der Polymerase synthetisierten
DNA-Strang, sowie
eine Pufferlösung
zur Schaffung einer geeigneten chemischen Umgebung.
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Der
PCR-Ablauf umfasst mehrere Thermozyklen mit jeweils drei Schritten:
Zunächst
wird die in der Probe enthaltene doppelsträngige DNA erhitzt, um die Stränge zu trennen.
Darauf hin wird die Temperatur gesenkt, so dass die Primer sich an
die DNA-Einzelstränge
anlagern können.
Im letzten Schritt wird der DNA-Abschnitt zwischen den Primern durch
die Polymerase mit den jeweils komplementären Nukleotiden aufgefüllt. Dieser
Zyklus wird ca. 10–50
mal wiederholt.
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Um
das Vorhandensein einer derart vervielfältigten DNA-Sequenz nachzuweisen, wird in homogenen
Assays eine z. B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Gensonde
zugesetzt, die während oder
nach der Thermozyklisierung mit einem bestimmten DNA-Abschnitt hybridisiert
und dadurch eine indirekte Detektion der gesuchten Zielsequenz ermöglicht.
Je nach Konzentration der zu detektierenden Zielsequenzen in der
Lösung ändert sich
die Fluoreszenz. Die Lichtquanten werden mit Hilfe von Detektoren
nachgewiesen, die sich entweder direkt im Thermozykler (Lightcycler)
oder extern in einem zusätzlichen
Auslesegerät
befinden.
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Ein
derartiger homogener Assay hat jedoch den Nachteil, dass nur begrenzt
viele verschiedene Zielsequenzen detektiert werden können. Die
Limitation ergibt sich aus der Anzahl der Primer und Gensonden,
die gleichzeitig in einer Reaktion verwendet werden. Auch die Kapazität des Thermozyklers
ist begrenzt, da nur eine gewisse Anzahl von Proben parallel behandelt
werden können.
Die Beschränkung in
der Anzahl der Gensonden resultiert generell aus der Anzahl der
verfügbaren
Fluoreszenzfarbstoffe, deren Fluoreszenzspektrum noch getrennt von
den vorhandenen Detektoren und Filtern erfasst werden können.
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Zur
Durchführung
eines Nukleinsäure-Tests ist
daher noch kein Schnelltest verfügbar,
der von ungeübtem
Personal oder sogar dem Patienten selbst am Point-of-Care durchgeführt werden
könnte.
Im allgemeinen sind eine Laborinfrastruktur mit fachkundigem Personal
und den nötigen
Geräten
und Materialien notwendig.
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GUSCHIN,
D. u. a., Manual manufacturing of oligonucleotide, DNA, and Protein
microchips. Anal. Biochem. (1997) 250 (2) 203–11 offenbart eine gattungsgemäße Vorrichtung
zur Durchführung
eines Nukleinsäure-Tests.
Bei dieser Vorrichtung kann eine Probe auf mehrere Zielsequenzen
getestet werden, und sie hat ein Substrat und ein oder mehrere auf dem
Substrat angeordnete Gelpads, die dazu eingerichtet sind, dass in
ihnen zumindest eine der für
den Test erforderlichen biologischen oder chemischen Reaktionen
stattfindet.
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Weitere
Vorrichtungen sind in YERSHOV, G. u. a., DNA analysis and diagnostics
an oligonucleotide microchips. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996)
93 (10) 4913–8
sowie in MIKHAILOVICH, V. u. a., Identification of rifampin-resistant
Mycobacterium tuberculosos strains by hybridization, PCR, and ligase
detection reaction an oligonucleotide microchips. J. Clin. Microbiol.
(2001) 39 (7) 2531–40
offenbart.
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur
Durchführung
eines Nukleinsäure-Tests,
ein Verfahren zur Herstellung der Vorrichtung und ein Verfahren
zur Durchführung
eines Nukleinsäure-Tests
vorzusehen, die eine kostengünstigere
Durchführung
des Nukleinsäure-Tests
mit verbessertem Workflow ermöglichen.
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Diese
Aufgabe wird jeweils durch die Vorrichtung mit den Merkmalen des
neuen Anspruchs 1 und durch die Verfahren mit den Merkmalen der
neuen Ansprüche
10, 11 und 14 gelöst.
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Vorteilhafte
Ausgestaltungen der Vorrichtung und der Verfahren sind in den jeweiligen
Unteransprüchen
angegeben. Die in den Verfahrensansprüchen angegebenen Merkmale können soweit
anwendbar auch bei der beanspruchten Vorrichtung zum Einsatz kommen
und umgekehrt.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung
umfasst ein Substrat und ein oder mehrere auf dem Substrat angeordnete
Gelpads, die dazu eingerichtet sind, dass in ihnen zumindest eine
der für
den Test erforderlichen biologischen oder chemischen Reaktionen stattfindet.
In vorteilhafter Weise ist das Substrat ein Streifen aus Kunststoff,
Pappe oder Verbundstoffen daraus.
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Dadurch
wird der Workflow gegenüber
herkömmlichen
Nukleinsäure-Tests
maßgeblich
vereinfacht. Da keine aufwändige
Mikrofluidik von Nöten
ist, ist der Test auch weniger störungsanfällig. Darüber hinaus ist eine sog. „Lab-on-a-Strip” Lösung gegenüber den
herkömmlichen
Labormethoden, aber auch gegenüber
neueren Cartridges bzw. ”Lab-on-a-Chip” Systemen
sehr kostengünstig.
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Auf
dem Substrat können,
je nach der Größe bzw.
der Anzahl der Gelpads, viele Reaktionen gleichzeitig realisiert
werden. Dadurch existieren kaum Limitationen hinsichtlich der Anzahl
der parallel durchführbaren
Reaktionen.
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Vorzugsweise
findet in den Gelpads zumindest die für die Detektion der gesuchten
Zielsequenzen erforderliche Nachweisreaktion statt. Insbesondere
werden in den einzelnen Gelpads, oder in verschiedenen Regionen
eines einzigen Gelpads, verschiedene Gensonden verwendet, die jeweils
mit einem bestimmten Abschnitt der DNA hybridisieren.
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Der
Nachweis von Zielmolekülen
kann auf verschiedene Art und Weisen erfolgen: Einerseits können analog
zur homogenen PCR in flüssigem
Medium fluoreszenzmarkierte Gensonden verwendet werden, die mit
einem Quencher ausgestattet sind. Wenn das Molekül der Gensonde an eine komplementäre Zielsequenz
hybridisiert und der Quencher durch die Exonukleaseaktivität der Polymerase
entfernt wird, kann Fluoreszenz mittels eines Fluoreszenzmikroskops
oder einer CCD-Kamera detektiert werden. Der genaue Mechanismus
der Nachweisreaktion und der Erzeugung der Fluoreszenzstrahlung etc.
ist dem Fachmann bekannt und braucht nicht näher erläutert zu werden. Alternativ
können
im Gelpad Fällungsreaktionen,
Farbreaktionen oder die Bildung von Molekülkonglomeraten optisch durch
turbidimetrische, nephelometrische oder kolorimetrische Verfahren
erfasst wer den. Die Verwendung von radioaktiven Markern ist ebenfalls
denkbar.
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Ferner
findet in den Gelpads vorzugsweise auch eine Amplifikation der Zielsequenzen
statt, insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die hierfür erforderlichen
Reagenzien, beispielsweise Primer, Polymerase, Pufferlösung etc.,
sind vorzugsweise in den Gelpads bereits vorhanden. Alternativ kann
die Vorrichtung jedoch auch erst durch den Benutzer mit den benötigten Reagenzien
beladen werden.
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Die
Gelpads werden bevorzugt aus einer wässrigen Phase und einer Gelmatrix
aus einem hydrophilen vernetzten Polymer gebildet. Die Gelmatrix sollte
so beschaffen sein, dass DNA-Moleküle aus der
Probe in das Gelbett eindringen können und durch Diffusion innerhalb
des Gelbettes Bewegungsfreiheit gegeben ist, so dass eine Ablesung
durch die Polymerase gewährleistet
ist. Zur Durchführung
einer PCR sollte die Gelmatrix darüber hinaus hitzestabil sein
und bei Temperaturen bis 100°C
nicht zerfließen.
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Für den Aufbau
einer derartigen Gelmatrix eignen sich insbesondere quer vernetzte
Polymere auf Basis von Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polyhydroxyethylmethacrylat,
Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Vorteilhafterweise werden
in die Gelmatrix zusätzlich
linkergruppenhaltige Comonomere wie z. B. Glycidylmethacrylat oder
Maleinsäureimid einpolymerisiert.
Diese zusätzlichen
Monomere können
sowohl zur Verbesserung der Haftung der Gelmatrix auf dem Substrat
als auch zur kovalenten Einkopplung von Sondenmolekülen in die
Gelpads dienen.
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Das
Substrat wird vorzugsweise durch einen Kunststoffstreifen gebildet,
es kann jedoch auch aus beschichtetem Karton, Pappe oder einem Verbundstoff
aus Kunststoff und Pappe gebildet sein. Werden auf das Substrat
mehrere Gelpads aufgebracht, sind diese bevorzugt durch Zwischenwände oder
eine Töpfchen
oder Kammerstruktur im Substrat voneinander abgegrenzt. Die Substratoberfläche ist
vorzugsweise so beschaffen, dass die Gelpads gut darauf haften.
Vorzugsweise ist das Substrat rechteckig und ist mit einem Array
aus 1 × 2
bis 100 × 100,
besonders bevorzugt 10 × 10
bis 20 × 20
Gelpads versehen.
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Um
eine Austrocknung zu verhindern, können die Gelpads mit einer
Folie abdeckbar sein oder sich in einer Druckkammer befinden, die
ein Entweichen von Wasserdampf und das Austrocknen unterbindet.
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Die
Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen
Vorrichtung gerichtet, welches die folgenden Schritte aufweist:
Bereitstellen eines Substrates in Gestalt eines Streifens aus Kunststoff,
Pappe oder Verbundstoffen daraus zur Aufnahme von einem oder mehreren
Gelpads, Herstellen einer Mischung aus den für die gewünschte biologische oder chemische
Reaktion erforderlichen Reagenzien und einer Monomerzubereitung
für die Herstellung
einer vernetzten Gelmatrix, Auftragen der Mischung auf das Substrat,
und Induzieren einer Polyreaktion der Monomerzubereitung zur Bildung von
einem oder mehreren Gelpads auf dem Substrat. Die Monomerzubereitung
enthält
dabei vorzugsweise – neben
Wasser oder einer wässrigen
Lösung – wenigstens
einen Monomertyp zur Erzeugung einer hydrophilen Polymerkette und
mindestens einen Monomertyp zur Vernetzung dieser Ketten. Die Polyreaktion
zur Gelierung geschieht z. B. durch Polymerisation, Polykondensation
oder Polyaddition. Die Gelierung wird z. B. durch chemische Katalysatoren
(z. B. Radikalbildner) oder eine Lichtreaktion (z. B. UV-Bestrahlung)
induziert.
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In
einer anderen Ausführungsform
des Herstellungsverfahrens werden die Gelpads zuerst aus einer Monomerzubereitung
hergestellt und erst in einem zweiten Schritt mit den anderen Reagenzien
(z. B. Primer, Gensonden, Polymerase, Puffer) beladen. In diesem
Fall können
die unbeladenen Gelpads auch durch fotolithografische Verfahren
unter Verwendung einer Maske erzeugt werden. Das Beladen kann spezifisch
durch sog. Bespotten geschehen.
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Bevorzugt
enthalten verschiedene Gelpads unterschiedliche Primer, so dass
die einzelnen Gelpads zur Amplifikation verschiedener Nukleinsäure-Sequenzen
ausgelegt sind. Entsprechend enthalten verschiedene Gelpads vorzugsweise
auch unterschiedliche Gensonden zum Nachweis unterschiedlicher Zielsequenzen.
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Schließlich ist
die Erfindung auch auf ein Verfahren zur Durchführung eines Nukleinsäure-Tests gerichtet,
welches die folgenden Schritte umfasst: Aufbereitung der Probe durch
Aufschluss der Zellen, Isolieren der DNA aus den Zellen und/oder
Zerstückeln
der DNA in kleinere Segmente; Auftragen der aufbereiteten Probe
auf die Gelpads einer oben beschriebenen Vorrichtung; und Nachweis
der Zielsequenzen durch Detektion von markierten Gensonden in den
einzelnen Gelpads. Das Auftragen der Probe auf die Gelpads geschieht
vorzugsweise mittels eines geeigneten Abstrichbestecks, z. B. eines
Abstrichstäbchens
mit einem Wattebausch.
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Bei
dem Verfahren ist zu beachten, dass vor einer Zyklisierung im Rahmen
einer PCR die nachzuweisende Nukleinsäure aus der Probe präpariert werden
muss. Dabei muss gewährleistet
werden, dass Nukleinsäure-Fragmente
in das Gelpad eindringen, um als Template einer PCR zu fungieren.
Hierzu sind zwei Varianten denkbar:
Die DNA-Präparation
aus einer beliebigen Probe erfolgt separat mit Hilfe konventioneller
Isolationsmethoden (z. B. Qiagen-DNA-Isolationskit). Anschließend wird
die DNA mechanisch, chemisch oder enzymatisch fragmentiert, bevor
sie auf das Gelbett mittels eines geeigneten Abstrichbestecks (z.
B. Abstrichstäbchen
mit Wattebausch) aufgetragen wird.
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Alternativ
ist denkbar, dass die DNA nicht vorher aus der Probe isoliert werden
muss. Vor dem Auftragen auf das Gelpad wird die Probe mit einer geeigneten
Lyselösung
behandelt und nach Neutralisation mit dem Abstrichbesteck gleichmäßig auf
die Gelpads aufgetragen. In der Lyselösung können sich bei spielsweise DNAsen
oder Restriktions-Endonukleasen in definierter Konzentration befinden,
die bewirken, dass die genomische DNA in kleinere Fragmente zerstückelt wird,
um eine anschließende
Diffusion in das Gelbett zu erleichtern.
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In
einer alternativen Ausführungsform
wird die DNA aktiv in das Gelpad hineintransportiert, z. B. durch
Elektrophorese. In dieser Ausführungsform sind
daher zur Erzeugung eines elektrischen Feldes zwei Elektroden über und
unter bzw. auf zwei Seiten des Gelpads angeordnet. Die Elektroden,
zumindest die untere Elektrode, können in das Substrat integriert
sein.
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Die
Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen mit Bezug
auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:
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1 einen
Querschnitt durch einen Teststreifen gemäß einer ersten Ausführungsform
der Erfindung;
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2 einen
Querschnitt durch einen Teststreifen gemäß einer zweiten Ausführungsform
der Erfindung;
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3 einen
Querschnitt durch einen Teststreifen gemäß einer dritten Ausführungsform
der Erfindung;
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4 eine
Draufsicht auf einen Teststreifen mit einem Abstrichbesteck;
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5 einen
Querschnitt durch einen Teststreifen in einer Druckkammer;
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6 einen
Querschnitt durch einen Teststreifen mit Auswertevorrichtung gemäß einer
ersten Ausführungsform;
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7 einen
Querschnitt durch einen Teststreifen mit Auswertevorrichtung gemäß einer
zweiten Ausführungsform;
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8 einen
Querschnitt durch einen Teststreifen gemäß einer noch weiteren Ausführungsform der
Erfindung.
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1 zeigt
eine Vorrichtung zur Durchführung
eines Nukleinsäure-Tests 1,
im folgenden auch Teststreifen genannt, im Querschnitt. Der Teststreifen weist
im wesentlichen ein Substrat 4 und darauf angeordnete Gelpads 2 auf.
Das Substrat bzw. der Streifen 4 besteht z. B. aus Plastik
oder Pappe mit einer geeigneten Oberfläche zur ausreichenden Haftbarkeit
der Pads. Diese werden vorzugsweise in ungeliertem Zustand aufgespottet.
Alternativ können die
Gelpads auch auf einer anderen Fläche hergestellt und im gelierten
Zustand auf den Teststreifen 4 übertragen werden. Anstelle
eines Gels kann prinzipiell jedes geeignete Trägermedium mit geeigneter, möglichst
hoher Viskosität
verwendet werden.
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In
den 2 und 3 ist das Substrat 4 mit einzelnen
Töpfchen 3 ausgestattet,
damit die in den einzelnen Gelpads vorhandenen Reagenzien sich nicht
vermischen. Die Abgrenzung erleichtert auch die spätere Auslesung
des Ergebnisses. Alternativ können
auch auf einem einzigen Gelpad mehrere verschiedene Reaktionen ablaufen,
insbesondere wenn diese zumindest teilweise die gleichen Reagenzien
verwenden.
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Der
Teststreifen der 3 ist zusätzlich mit einer Plastikfolie 6 abgedeckt,
die vorzugsweise zum Auftragen der Probe kurzzeitig entfernt werden
kann. Anstelle der Folie 6 kann auch ein beliebiger Deckel zum
Einsatz kommen, der jedoch vorzugsweise für die Fluoreszenzstrahlung
der verwendeten Marker durchlässig
ist.
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In 4 ist
ein Teststreifen 1 in Draufsicht gezeigt. Das Substrat 4 weist
einen freigelassenen Bereich 5 zum Anfassen des Streifens
und einen Array-Bereich 8 auf, der eine matrixartige Anordnung mehrerer
Gelpads 2 enthält.
Die Probe wird vorzugsweise mit dem Abstrichbesteck 11 aufgetragen,
welches einen an die Breite des Teststreifens 4 angepassten
Watte bausch 10 und einen Griff 12 aufweist. Alternativ
kann die Probe auch durch Pipettieren aufgetragen werden.
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Der
Teststreifen 1 wird zur Durchführung der für die PCR benötigte Thermozyklisierung
vorzugsweise auf ein entsprechendes Heizelement aufgelegt. Dieses
ist in den 5–7 jeweils
mit 14 gekennzeichnet. Hierbei kann es sich z. B. um ein
Peltier-Element oder Heißluft-Kammer
handeln. Es können
Standardgeräte
verwendet werden, es kann jedoch auch ein an die Größe und Dicke
des Teststreifens angepasstes Thermoelement verwendet werden. Aufgrund
der geringen Größe des Teststreifens sind
die benötigten
Thermozykler kostengünstiger als
bei herkömmlichen
Assays.
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In
den in 5–7 gezeigten
Beispielen sind der Teststreifen 1 und das Thermoelement 14 jeweils
in einer Druckkammer 16 angeordnet, die ein Entweichen
von Wasserdampf und das Austrocknen verhindert.
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Gemäß 6 und 7 ist
bevorzugt auch ein Auslesegerät 20 vorgesehen,
welches die in den einzelnen Gelpads stattfindende Nachweisreaktion detektiert.
Hierbei kann es sich um ein Fluoreszenzmikroskop, eine CCD-Kamera
oder eine Gamma-Kamera
handeln. Die Auswerteeinheit 20 kann gemäß 6 außerhalb
der Druckkammer angeordnet sein. Im Falle einer optischen Auswerteeinheit
wird dann ein transparenter Deckel 18 der Druckkammer verwendet.
Alternativ kann, wie in 7 gezeigt, die Auswerteeinheit 20 in
die Druckkammer 16 integriert sein.
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In 8 ist
eine Ausführungsform
eines Teststreifens gezeigt, welcher einen aktiven Transport der
DNA in die Gelpads hinein durch Elektrophorese erlaubt. Hierzu sind
zwei Optionen zur Anordnung entsprechender Elektronen 7a bis 7d zur
Erzeugung eines elektrischen Feldes gezeigt: Gemäß der linken Ausführungsform
kann die untere Elektrode 7b in das Substrat 4 eingebettet
sein oder auf diesem aufliegen. Auf der Elektrode 7b sind
die Gelpads 2 angeordnet, auf denen die zweite Elektrode 7a zu liegen
kommt. Durch diese Anordnung kann ein starkes, in Vertikalrichtung
verlaufendes elektrisches Feld erzeugt werden, durch das die DNA
Moleküle
in das Gelpad hinein wandern. Die rechte Seite des Teststreifens
zeigt die bevorzugte Ausführungsform, bei
welcher die Elektroden 7c und 7d jeweils links und
rechts eines Gelpads 2 angeordnet sind. Bei einem Gelpad-Array
sind unter Umständen
auch mehrere Elektroden vorgesehen.
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Die
Erfindung erlaubt die Durchführung
homogener Reaktionen in einem parallelen Multiplex-Verfahren, welches
auf einem Substratstreifen mit Gelpads äußerst kostengünstig realisierbar
ist.