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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einbringen von
Reagenzien in Mikrokanäle einer
Analyseeinheit.
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Die
Bio- und Gentechnologie hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung
gewonnen. Eine Grundaufgabe in der Bio- und Gentechnologie ist der
Nachweis von biologischen Molekülen
wie DNA (Desoxyribonukleinsäure)
oder RNA (Ribonukleinsäure),
Proteinen, Polypeptiden, etc. Insbesondere Moleküle, in denen Erbgutinformation
kodiert ist, sind für
viele medizinische Anwendungen von großem Interesse. Durch ihren
Nachweis, beispielsweise in einer Blutprobe eines Patienten, können Krankheitserreger
nachgewiesen werden, was eine Diagnose für einen Arzt erleichtert. Die
DNA ist eine Doppelhelix, die aus zwei vernetzten wendelförmigen Einzelketten,
so genannten Halbsträngen,
aufgebaut ist. Jeder dieser Halbstränge weist eine Rasensequenz
auf, wobei durch die Reihenfolge der Basen (Adenin, Guanin, Thymin,
Cytosin) die Erbinformation festgelegt ist. DNA-Halbstränge weisen
die charakteristische Eigenschaft auf, sehr spezifisch nur mit ganz
bestimmten anderen Molekülen
eine Bindung einzugehen. Daher ist es für das Andocken eines DNA-Halbstrangs
an einen anderen DNA-Halbstrang Voraussetzung, dass die jeweiligen
Moleküle
zueinander komplementär
angeordnet sind.
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Dieses
von der Natur vorgegebene Prinzip kann zum selektiven Nachweis von
Molekülen
in einer zu untersuchenden Probe verwendet werden. Die Grundidee
eines auf diesem Prinzip basierenden Biochip-Sensors besteht darin,
dass auf einem Substrat aus einem geeigneten Material zunächst so
genannte Fängermoleküle (Oligonukleotide),
beispielsweise mittels Mikrodispensierung aufgebracht und immobilisiert
werden, d. h. an der Oberfläche
des Biochip-Sensors dauerhaft fixiert werden. In diesem Zusammenhang
ist es bekannt, Bio-Moleküle
mit Thiol-Gruppen
(SH-Gruppen) an Gold-Oberflächen
zu immobilisieren.
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Ein
entsprechender Biochip-Sensor mit einem Substrat und daran gebundenen
Fängermolekülen, die
beispielsweise auf einen bestimmten, nachzuweisenden DNA-Halbstrang
sensitiv sind, wird üblicherweise
zum Untersuchen einer Probe, meist in Form einer Flüssigkeit,
auf das Vorhandensein des DNA-Halbstrangs verwendet werden. Hierzu
ist die auf das Vorhandensein eines bestimmten DNA-Halbstrangs zu
untersuchende Probe mit den immobilisierten Fängermolekülen in Wirkkontakt zu bringen. Sind
ein Fängermolekül und ein
zu untersuchender DNA-Halbstrang zueinander komplementär, so hybridisiert
der DNA-Halbstrang an dem Fängermolekül, d. h.
er wird daran gebunden. Wenn infolge dieser Bindung sich der Wert
einer messtechnisch erfassbaren physikalischen Größe in charakteristischer
Weise ändert,
so kann dieser Wert gemessen werden und auf diese Weise das Vorhandensein
oder Nichtvorhandensein eines DNA-Halbstrangs in der untersuchten Probe
festgestellt werden.
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Das
beschriebene Prinzip ist nicht auf den Nachweis von DNA-Halbsträngen beschränkt. Vielmehr
sind weitere Kombinationen von auf dem Substrat aufgebrachten Fängermolekülen und
zu erfassenden Molekülen
in einer zu untersuchenden Probe bekannt. So können beispielsweise Nukleinsäuren als
Fängermoleküle für Peptide
oder Proteine, die nukleinsäurespezifisch
binden, verwendet werden. Weiterhin bekannt ist, Peptide oder Proteine
als Fängermoleküle für andere,
das Fängerpeptid
bzw. das Fängerprotein
bindende Proteine oder Peptide zu verwenden.
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Zum
Nachweis der erfolgten Bindung zwischen dem auf dem Substrat aufgebrachten
Fängermolekül und dem
in der zu untersuchenden Probe vorhandenen, zu erfassenden Molekül werden
häufig optische
oder elektronische Nachweisverfahren verwendet. Solche Nachweisverfahren
erlangen zunehmende Bedeutung bei der industriellen Identifikation und
Bewertung von neuen Medikamenten organischer oder gentechnologischer
Herkunft. Diese Nachweisverfahren eröffnen vielfältige Anwendungen bei spielsweise
in der medizinischen Diagnostik, in der Pharmaindustrie, in der
chemischen Industrie, in der Lebensmittelanalytik, sowie in der
Umwelt- und Lebensmitteltechnik.
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Zur
Durchführung
einer Analyse der oben beschriebenen Art, beispielsweise zum Nachweis
einer bestimmten DNA, sind im Allgemeinen mehrere Aufbereitungsschritte
erforderlich, mittels derer in der Probe enthaltene DNA extrahiert
wird. Im Folgenden wird beispielhaft auf den Fall der Analyse einer
Blutprobe eines Patienten eingegangen, die Ausführungen sind aber auch auf
andere Analyseverfahren übertragbar.
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Die
zur Analyse durchzuführenden
Aufbereitungsschritte umfassen eine Vielzahl biochemischer Vorgänge. So
müssen
zunächst
aus der Blutprobe die zu analysierenden Bestandteile, beispielsweise Bakterien
oder Viren, extrahiert und die restliche Blutprobe entsorgt werden.
Durch eine so genannte Lyse wird mittels einer Pufferlösung die
umgebende Hülle der
Viren oder Bakterien zerstört
und so die später
zu analysierende DNA freigesetzt. Da im Allgemeinen für einen
Nachweis der DNA zu wenige Exemplare der DNA in der Blutprobe vorliegen,
findet mittels einer bekannten Reaktion, der so genannten Polymerase-Kettenreaktion
(PCR), eine Vervielfältigung
der DNA statt. Im weiteren Verlauf der Analyse sind verschiedene
Möglichkeiten
bekannt, die DNA und damit den Krankheitserreger nachzuweisen.
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Die
verwendeten Biochips basieren in ihrer einfachsten Form auf einem
Glassubstrat, auf dem die Fängermoleküle immobilisiert
sind. Diese oftmals synthetisch hergestellten kurzen Nukleinsäurefragmente
sind von ihrer Sequenz her wenigstens teilweise komplementär zur Sequenz
der nachzuweisenden Nukleinsäure,
so dass die Bindung hochspezifisch ist. Eine Bindung anderer Nukleinsäuren als
der nachzuweisenden muss in jedem Fall vermieden werden, damit das
Messergebnis nicht falsch positiv ist. Der eigentliche Nachweis
der Nukleinsäure
erfolgt in vielen Verfahren über
Fluoreszenz-Verfahren, bei denen ein Fluoreszenzfarbstoff an die
nachzuweisende Nuklein säure
angelagert wird, beispielsweise über
eine Biotin-Streptavidin-Bindung.
Nach spezifischer Hybridisierung der Nukleinsäure mit den Fängermolekülen wird
der Biochip gespült,
so dass nicht gebundenes Material entfernt wird. In der Lösung befinden
sich folglich keine fluoreszierenden Farbstoffe mehr. Mittels Anregung
der Farbstoffe lässt
sich mit einer CCD-Kamera die Fluoreszenz beobachten, wodurch ein
Nachweis ermöglicht
wird.
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Ein
Vorteil der Biochips ist die Multiplexfähigkeit des Nachweises. So
lassen sich auf verschiedenen Positionen des Biochips verschiedene
Sorten von Fängermolekülen immobilisieren,
die gegen verschiedene nachzuweisende Nukleinsäuren gerichtet sind. Der Nachweis
lässt sich
dann über
die ortsaufgelöste
Messung der Fluoreszenz durchführen.
Somit lassen sich auch mehrere Nachweise von Nukleinsäuren in
einem Verfahren durchführen.
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Da
die Anzahl der vorhandenen Kopien der Nukleinsäuren im Allgemeinen nicht ausreicht,
um einen Nachweis direkt zu ermöglichen,
werden die Nukleinsäuren
vor dem Nachweis vervielfältigt
(amplifiziert). Dies kann beispielsweise mittels einer Poymerase-Kettenreaktion
(PCR, Polymerase Chain Reaction) erfolgen. Die PCR basiert auf der
Replikation von Nukleinsäuren
mit Hilfe von thermostabile DNA-Polymerasen. Hierbei wird ein Paar
von Oligonukleotid-Primern (einzelsträngige Oligonukleotide) mit
der zu amplifizierenden Nukleinsäure
in Kontakt gebracht. Die Primer werden so gewählt, dass sie an den beiden
Enden eines zu amplifizierenden Fragments auf den komplementären Strängen binden. Bei
der Elongation wird dann die Primer in der 3'-Richtung entlang des jeweiligen Zielnukleinsäurestrangs
elongiert (Vorwärts-
und Rückwärts-Primer). Vorwärts- und
Rückwärts-Primer
werden alternativ auch als Sense- oder
Antisense-Primer bezeichnet. Auf diese Weise kann das zwischen den
zu den Primern komplementären
Stellen auf der Zielnukleinsäure
liegende Stück
amplifiziert werden. Für
nachfolgende Nachweisreaktionen werden die PCR Produkte vor teilhafterweise
von Primern, Nukleotiden und anderen störenden Komponenten des PCR-Ansatzes
abgetrennt.
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Der
PCR-Ablauf umfasst mehrere Thermozyklen mit jeweils drei Schritten:
Zunächst
wird die Probe erhitzt (z. B. auf 94°C), um die Stränge der
in der Probe enthaltenen doppelsträngigen Ziel-DNA zu trennen
(Denaturierung). Daraufhin wird die Temperatur gesenkt (z. B. auf
45–60°C), so dass
die Primer sich an die komplementären Bereiche der nunmehr einzelsträngigen DNA
anlagern können
(Annealing). Im letzten Schritt werden die an den Einzelstrang gebundene
Primer durch die DNA-Polymerase
entsprechend der Information des DNA-Templatestranges in 3'-Richtung verlängert, wobei
die entsprechenden Nucleotidtriphosphate in der Lösung als
Bausteine verwendet werden (Elongation, z. B. bei 72°C). Dieser
Zyklus wird während
einer PCR typischerweise ca. 15–50
mal durchlaufen. Die angegebenen Temperaturen dienen lediglich als
Beispielwerte und sind auf die jeweilig spezifisch auszuführende PCR
abzustimmen.
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Somit
lässt sich
von wenigen vorliegenden Exemplaren einer DNA (oder im Allgemeinen
einer Nukleinsäure)
binnen kürzester
Zeit eine Vielzahl von Kopien herstellen, deren Konzentration zum
anschließenden
qualitativen Nachweis der DNA bzw. Nukleinsäure in der Probe ausreicht.
Beispielsweise wird nach 20-fachem Durchlaufen der PCR (typischer
Zeitbedarf 20 bis 40 Minuten) die theoretisch 220-fache,
also die etwa 106-fache Mange der ursprünglich eingesetzten
Nukleinsäure
erhalten. Die PCR bietet gleichzeitig die Möglichkeit, in das resultierende
PCR-Produkt eine Markierung (Label) einzubauen, das den Nachweis
ermöglicht.
So lassen sich beispielsweise mit Biotin markierte PCR-Primer oder
Nukleotidtriphosphate verwenden, was dazu führt dass die synthetisierten
PCR-Produkte biotinyliert sind. Das Biotin ist nach der Anlagerung
des PCR-Produkts
an die immobilisierten Fängermoleküle folglich
ebenfall auf dem Biochip an der entsprechenden Position immobilisiert.
An das Biotin lassen sich dann in einem weiteren Schritt mit Streptavidin verbundene
Fluoreszenz-Farbstoffe binden, die dann letztlich den Nachweis der
Nukleinsäure
bzw. ihres PCR-Produkts erlauben. Alternativ zum Fluoreszenz-Farbstoff lassen
sich andere Nachweissysteme nutzen, die beispielsweise auf elektrochemischer
Detektion beruhen.
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Als
Fängermoleküle können grundsätzlich sämtliche
in der Affinitätschromatographie
verwendeten Liganden gekoppelt werden. Beispiele hierfür sind:
Protein A, Protein G, Protein L, Streptavidin, Biotin, Heparin,
Antikörper,
Serum Albumin, Gelatine, Lysin, Concanavalin A, Oligosaccharide,
Oligonukleotide, Polynukleotide, proteinbindende Metallionen, Lektine,
Aptamere oder Enzyme.
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Weit
verbreitet sind z. B. in der medizinischen Diagnostik und im Forschungslabor
ELISA-Tests (Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay). Auch für Anwendungen
auf dem Gebiet des DNA-Chips werden Verfahren mit Enzymmarkern bei einer
bekannten Methode des Redoxcyclings eingesetzt.
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Bei
der letztgenannten Methode wird der zu untersuchenden DNA beispielsweise
ein Biotin-Molekül
angehängt.
Nach erfolgter Hybridisierung mit den Oligonukleotiden des Biochips
wird ein Streptavidin verbundenes Label hinzugefügt. Streptavidin und die Routinen
in den eine Bindung ein, so dass das Label mit dem hybridisierten
Komplex aus Oligonukleotid und nachzuweisende DNA verbunden ist.
Nach einem Waschvorgang, in dem nicht gebundenes Label von der Biochip-Oberfläche entfernt
wird, ist nur im Falle eines Bindungsereignisses zwischen nachzuweisender
DNA und Oligonukleotid ein Label oberhalb des Biochips vorhanden.
Durch den Nachweis des Labels kann also auf das vorliegenden der
nachzuweisenden DNA in der ursprünglichen
Probe geschlossen werden.
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Zum
Nachweis des Labels wird ein Substrat hinzugefügt, durch das das Label vom
Streptavidin gelöst
wird. Es liegt hiernach in Lösung
vor.
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In
bestimmten Fällen
ist das Redoxverhalten diffusionsbestimmt. Ein Redoxpaar ist p-Aminophenol/Chinonimin.
Am entsprechenden Redoxprozess sind 2 Elektronen und 2 H+-Ionen beteiligt. Dieses System kommt z.
B. bei Enzym-gekoppelten Nachweisreaktionen zum Einsatz. Dabei wird
das Enzym "Alkalische
Phosphatase" als
Label- bzw. Verstärkungs-Substanz
eingesetzt. Alkalische Phosphatase ist in der Lage, p-Aminophenyl-Phosphat in p-Aminophenol
und Phosphat zu spalten. Das entstehende p-Aminophenol wird am Elektroden-System
oxidiert bzw. das Redoxpaar p-Aminophenol/Chinonimin zyklisiert.
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Die
Höhe des
letztlich zur Verfügung
stehenden Signals hängt
insbesondere von der Anzahl der gebildeten Fängermolekül-Zielmolekül-Komplexe ab. Daher ist es
insbesondere wichtig, die Zahl der immobilisierten Fängermoleküle zu maximieren.
Durch eine PCR lassen sich ausreichend Zielmoleküle für einen Nachweis bereitstellen,
sofern ausreichend Fängermoleküle auf dem
Biochip immobilisiert sind. Die Qualität des generierten sie Signals
hängt maßgeblich
von der Homogenität
und Reproduzierbarkeit der Immobilisierung der Fängermoleküle während des Herstellungsprozesses
des Biochips ab. Daher spielt Qualitätskontrolle eine wichtige Rolle
bei der Herstellung um auch in sensitiver Biochips.
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Zur
Durchführung
von biochemischen Analysen unter Einsatz von Biochips werden insbesondere bei
Point-of-Care-Anwendungen bevorzugt integrierte Systeme eingesetzt.
Diese bestehen beispielsweise aus einer einmal verwendbaren Karte
(Cartridge) und einem Steuergerät.
Es ist wünschenswert,
die Integration derart zu gestalten, dass sämtliche Aufbereitungs- und
Nachweisschritte innerhalb der Cartridge voll automatisch ablaufen.
So kann beispielsweise ein einem Patienten entnommener Blutstropfen
in die Cartridge eingefügt
werden, woraufhin nach Einschub in das Steuergerät aus dem Vollblut das nachzuweisende
Molekül
(DNA, Protein, ...) extrahiert und nachgewiesen wird. Dazu sind
in der Cartridge im Allgemeinen zahlreiche Kanäle vorgesehen, in denen die
einzelnen Prozessschritte ablaufen. Zur Durchführung der Prozessschritte sind
in der Cartridge Reagenzien zu lagern. Dies erfolgt vorzugsweise
in Form getrockneter Reagenzien, da diese eine längere Haltbarkeit als Flüssig-Reagenzien
aufweisen. Es ist ebenfalls möglich,
Reagenzien im Steuergerät
vorzuhalten, und diese bei Bedarf in die Cartridge zu leiten. Hierdurch
wird jedoch das Steuergerät
komplexer und die Flexibilität
des Geräts
geringer. Bei Einsatz von Cartridges mit Trockenreagenzien ist im
Steuergerät
lediglich Wasser vorzuhalten, das zum Lösen der getrockneten Reagenzien
und zur Steuerung der Mikrofluidik in der Cartridge verwendet werden
kann.
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Das
Einbringen von Reagenzien in Mikrokanäle einer Cartridge (Spotten)
ist mit Geräten
möglich,
die beispielsweise ähnlich
zu einem Nadel- oder Tintenstrahldrucker arbeiten. Dabei werden über eine Kanüle Reagenzien
im flüssigen
Zustand in die Mikrokanäle
der Cartridge getropft. Anschließend werden die Reagenzien
getrocknet, so dass eine verlängerte
Lagerungszeit möglich
wird. Dieser Prozess ist bei Cartridges mit einer Vielzahl von Mikrokanälen zeitaufwändig und
erfordert eine hohe Anzahl von Prozessschritten. Dies wiederum erhöht die Kosten der
Cartridge und damit der medizinischen Untersuchung, die mittels
der Cartridge durchgeführt
werden soll. Insbesondere im Fall getrockneter Reagenzien erhöht sich
die Bearbeitungszeit, da nach jedem Spott-Vorgang die aufgebrachten
Reagenzien trocknen müssen,
bevor weitere Reagenzien aufgebracht werden können.
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Es
ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben,
dass eine zeiteffiziente Einbringung von Reagenzien in Mikrokanäle einer
Analyseeinheit ermöglicht.
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Diese
Aufgabe wird durch Verfahren gemäß Anspruch
1 gelöst.
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Es
wird ein Verfahren zum Einbringen von Reagenzien in Mikrokanäle einer
Analyseeinheit angegeben, aufweisend folgende Verfahrensschritte:
- – Bereitstellen
einer Dispensionseinheit mit wenigstens einer Untereinheit, durch
die Reagenzien dispensierbar sind,
- – Bereitstellen
einer Analyseeinheit, die wenigstens einen Mikrokanal aufweist,
- – Bewegen
der Dispensionseinheit entlang des wenigstens einen Mikrokanals
und dabei
- – Dispensieren
der Reagenzien in den Mikrokanal.
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Der
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
liegt darin, die einzubringenden Reagenzien kontinuierlich in den
Mikrokanal zu dispensieren. Ein schrittweises Dispensieren der Reagenzien
ist nicht erforderlich.
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Bei
einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens
umfasst die Dispensionseinheit mehrere Untereinheiten zum Dispensieren
der Reagenzien, die derart angeordnet sind, dass mehrere parallel
verlaufende Mikrokanäle
der Analyseeinheit parallel mit Reagenzien bestückbar sind, und bei dem das
Dispensieren der Reagenzien in die parallel angeordneten Mikrokanäle gleichzeitig
erfolgt. Dieses Verfahren mit der entsprechend ausgebildeten Dispensionseinheit
bietet insbesondere den Vorteil, dass parallel laufende Kanäle der Analyseeinheit
gleichzeitig innerhalb eines Prozessschritts mit verschiedenen Reagenzien
versehen werden können.
Dies reduziert die Herstellungszeit für die Analyseeinheit beträchtlich.
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Vorteilhaft
ist eine Ausgestaltung der Erfindung derart, dass die Untereinheiten
der Dispensionseinheit wenigstens teilweise so hintereinander angeordnet
sind, dass mehrere Untereinheiten gleichzeitig verschiedene Abschnitte
eines Mikrokanals mit Reagenzien versehen können. Hierdurch wird die Parallelisierung
des Dispensierens weiter erhöht,
da nun jede Untereinheit nur einen Teil des ihr zugeordneten Mikrokanals
mit Reagenzien versehen muss.
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Weitere
Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den
nachfolgend beschriebenen Ausführungsbeispielen
in Zusammenhang mit den beigefügten
Zeichnungen: Es zeigen:
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1 eine
Cartridge und einem Spotter und
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2 den
Spotter bei der Aufbringung von Reagenzien in die Cartridge.
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In 1 sind
schematisch eine Cartridge 101 und ein Spotter 103 dargestellt.
Die Cartridge 101 umfasst eine Chipkarten-förmige Plastikkarte 105 in
der mehrere Mikrokanäle 107 ausgebildet sind.
Die Mikrokanäle 107 sind
der besseren Übersicht
halber lediglich grade dargestellt. Im Allgemeinen werden diese
jedoch eine Vielzahl von Kurven und Windungen aufweisen. Der Spotter 103 umfasst eine
Halterung 109 und eine Vielzahl von Kanülen 111. Die Kanülen 111 sind
in einer regelmäßigen Matrixstruktur
angeordnet. Hier nicht dargestellt ist eine Verbindung der Kanülen 111 zu
mehreren Reagenzien-Reservoiren,
durch die Reagenzien in die Kanülen
leitbar sind, so dass sie am Ende der Kanülen 111 austreten
können.
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In 2 ist
der Spotter 103 oberhalb der Cartridge 101 angeordnet,
so dass ein Auftrag von Reagenzien in die Mikrokanäle 107 erfolgen
kann. Dazu wird der Spotter 103 mit den Kanülen 111 entlang
der Mikrokanäle 107 bewegt.
Dabei werden Reagenzien 113 an vorbestimmte Positionen
in den jeweiligen Mikrokanal 107 eingebracht. Durch die
regelmäßige Anordnung
der Vielzahl von Kanülen 111 kann
die Einbringung der Reagenzien 113 in die Mikrokanäle 107 in
einem Durchgang erfolgen. Die Trocknung der Reagenzien kann in einem
nachgelagerten Schritt erfolgen, so dass ein kontinuierliches einbringen
der Reagenzien in die Mikrokanäle 107 möglich ist.