WO2003035259A2 - Arrays mit hairpin-strukturen - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft Arrays von auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäuren, die zumindest teilweise in Form von Sekundärstrukturen, wie etwa Hairpin-Strukturen, vorliegen. Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung solcher Arrays und Anwendungen davon offenbart.

Description

Arrays mit Hairpin-Strukturen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Arrays von auf einem Träger immobilisierten Nukleinsäuren, die zumindest teilweise in Form von Sekundärstrukturen, wie etwa Hairpin-Strukturen, vorliegen. Weiterhin werden Verfahren zur Herstellung solcher Arrays und Anwendungen davon offenbart.
In den letzten Jahren wurde mit der Technologie von auf einem Träger immobilisierten Rezeptorarrays, z.B. DNA-Chips, ein wertvolles Mittel geschaffen, das es erlaubt, komplexe Analytbestimmungsverfahren schnell und hochparallel durchzuführen. Das den Rezeptorarrays zugrunde liegende biophysikalische Prinzip ist das der Wechselwirkung eines spezifischen immobilisierten Rezeptors mit einem in einer Flüssigphase vorhandenen Analyten, beispielsweise durch Nukleinsäurehybridisierung, wobei auf dem Träger eine Vielzahl von Rezeptoren, z.B. Hybridisierungssonden, angebracht sind, die mit in der Probe vorhandenen Analyten, z.B. komplementären Nukleinsäureanalyten, spezifisch binden.
Ein Bindungsereignis zwischen immobilisiertem Rezeptor und Analyt wird üblicherweise durch Detektion einer Markierungsgruppe nachgewiesen, die an den Analyten gebunden ist. Ein Träger und ein Verfahren zur Analytbestimmung, die eine integrierte Synthese von Rezeptoren und Analyse erlauben, sind z.B. in WO 00/1 301 8 beschrieben.
Um mit Rezeptorarrays, z.B. DNA-Chips, komplexe biologische Fragestellungen (Genexpressions-Studien, Target-Validierung, Sequencing By Hybridisation, Re-Sequenzierung) bearbeiten zu können, ist es von grundlegender Bedeutung, dass die Hybridisierung zwischen Rezeptor und Target möglichst fehlerfrei durchgeführt werden kann. Das Nachweissystem muss daher in der Lage sein, zwischen einem sogenannten „füll match", d.h. wenn Sonde und Target vollkommen komplementär sind, und einem „mismatch", wenn eine oder mehrere fehlerhafte Basenpaarungen vorliegen, zu unterscheiden. Besonders schwer ist natürlicherweise die Unterscheidung zwischen einem „Single mismatch", wenn lediglich 1 Basenpaarung fehlerhaft ist , und dem „füll match". Desweiteren sind aus thermodynamischen Gründen besonders endständige (terminale) Basen-Fehlpaarungen schwer bzw. nur unzureichend zu detektieren. Fehlpaarungen in der Mitte einer Sequenz sind dagegen aus denselben Gründen einfacher zu detektieren.
Auf bekannten DNA-Chips liegen Nukleinsäure-Rezeptoren möglichst in einzelsträngiger Form vor. Bei der Auswahl der Sequenzen für die Rezeptoren wird daher darauf geachtet, dass eine etwaige Ausbildung von Sekundärstrukturen vermieden wird. Die Detektion von Basen- Fehlpaarungen erfolgt nun dadurch, dass auf dem DNA-Chip nicht nur die eigentliche abzufragende Sequenz, sondern auch als Vergleich die entsprechende Sequenz mit einer Fehlpaarung in der Mitte der Basenabfolge als Negativ-Kontrolle aufgebracht ist. Ob es sich um einen „füll match" oder „mismatch" handelt, wird durch die jeweils unterschiedlichen Signalintensitäten, die sich durch Hybridisierung der Probe (Target) auf die Sonde bzw. ihrer Negativ-Kontrollsequenz (Mismatch-Sequenz) ergeben, detektierbar. Da aber auch hier nicht immer eine eindeutige Entscheidung getroffen werden kann, müssen zur Detektion einer bestimmten DNA-Sequenz innerhalb des Targets nicht nur eine einzige Sequenz, sondern mehrere (z.B. 20 Sequenzen pro Gen) Sequenzen (R. Lipschutz et.al., Nature Genetics, 1 999, 21 , 20ff), die sich jeweils als Bruchstücke der nachzuweisenden Probe ergeben, mit den jeweils zugehörigen Kontroll-Sequenzen (Mismatch-Sequenzen) verwendet werden. Dadurch wird zum Nachweis einer einzigen Probensequenz nicht nur eine einzige Nukleinsäuresequenz auf dem DNA-Chip benötigt, sondern es sind üblicherweise 20 Sequenzen zuzüglich der jeweiligen 20 Negativ- Kontrollsequenzen (Mismatch-Sequenzen) erforderlich. Dies resultiert in einem erheblichen Mehraufwand bei der Herstellung von DNA-Chips und verringert deren Informationsdichte signifikant.
Gegenwärtig gibt es noch keine Möglichkeiten, terminale Basen- Fehlpaarungen auf DNA-Chips zu detektieren.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein System bereitzustellen, dass es erlaubt, Basen-Fehlpaarungen sehr genau detektieren zu können. Weiterhin soll das erfindungsgemässe System nicht nur Basen- Fehlpaarungen in der Mitte einer Sequenz, sondern auch am Ende (terminal) auf einem Array hochparallel zu erkennen.
Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung von Rezeptorarrays gelöst, die Nukleinsäure-Rezeptoren enthalten, die mindestens teilweise in Form von Hairpins vorliegen.
Hairpins sind eine spezielle Form von Sekundärstrukturen bei Nukleinsäuren, die sich aus zwei komplementären Sequenz-Abschnitten im sogenannten Stem und einem weiteren Sequenzabschnitt im sogenannten Loop zusammensetzen (Figur 1 a). Hierbei besteht ein Gleichgewicht zwischen der geschlossenen Form und der geöffneten Form (Figur 1 b). Hairpin-Strukturen wurden bereits in Lösung zur markierungsfreien Detektion von Hybridisierungs-Ereignissen eingesetzt (Tyagi et.al, Nature Biotechnology 1 995, 14, 303-308). Diese Hairpin-Strukturen (Figur 2 Typ A) zeichnen sich dadurch aus, dass sich die Erkennungssequenz im Loop des Hairpins befindet (Marras et.al, Genetic Analysis; Biomolecular Engineering, 1 999, 14, 1 51 -1 56). In einer besonderen Ausführungsform befinden sich ein Quencher- und ein Fluorophor-Molekül im geschlossenen Zustand in unmittelbar räumlicher Nähe, so dass die Fluoreszenz gelöscht wird. Tritt nun ein Hybridisierungs-Ereignis mit der sich im Loop befindlichen Erkennungssequenz ein, öffnet sich der Hairpin, wobei Fluorophor und Quencher räumlich voneinander getrennt werden. Als Folge davon ist ein Fluoreszenzsignal zu beobachten. Als Quencher können neben bekannten Farbstoffen auch poly-Deoxyguanosinsequenzen fungieren (M. Sauer, BioTec, 2000, 1 , 30ff). Dies hat den Vorteil, dass die Hairpin-Struktur nur mit einem Fluorophor markiert werden muss (M. Sauer et.al., Anal.Chem. 1999, 71 (14), 2850ff), dass der Einbau eines Quencher- Moleküls entfällt.
Studien über das Verhalten von Hairpinstrukturen auf einer festen Phase - d.h. Arrays mit Hairpin-Strukturen - sind zwar bekannt (US 5770772), nutzen jedoch lediglich das Vorhandensein der doppelsträngigen Struktur eines Hairpin als Erkennungsstelle für z.B. Proteine aus. Der Nachweis einer Analytbindung durch Auflösung der Hairpinstruktur wird nicht offenbart. Im Besonderen sind keine Hairpin-Strukturen bekannt, die die Sequenzinformation im Stem des Hairpins als Erkennungssequenz für eine Hybridisierung nutzen. Desweiteren sind bislang noch keine Hairpinstrukturen bekannt, deren Anbindung an die feste Phase nicht über ein terminales Ende erfolgt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in
Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen,
(b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und (c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor den Nachweis der Auflösung der in Abwesenheit des Analyten vorliegenden Sekundärstruktur umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten, umfassend
(i) eine Lichtquellenmatrix,
(ii) einen Träger mit mehreren vorbestimmten Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren auf dem Träger immobilisiert sind, (iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und (iv) eine Detektionsmatrix mit umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Positionen auf dem Träger zugeordnet sind.
D i e erfi n d ung sg em ässe n H ai rp i n- Stru ktu re n l assen si c h überraschenderweise für eine sehr genaue Diskriminierung von Basenfehlpaarungen auf einer Festphase, insbesondere auf einem Array, verwenden. Die erfindungsgemässen Hairpin-Strukturen lassen sich hochparallel sowohl in situ auf der festen Phase erzeugen, können aber auch, wenn vorgefertigt, auf dieser immobilisiert werden.
Die Rezeptoren werden ausgewählt aus Nukleinsäure-Biopolymeren, z.B. Nukleinsäuren wie DNA und RNA oder Nukleinsäureanaloga wie Peptidnukleinsäuren (PNA) und Locked-Nukleinsäuren (LNA) sowie Kombinationen davon. Besonders bevorzugt werden als Analyten Nukleinsäuren bestimmt, wobei die Bindung der Analyten eine Hybridisierung umfasst. Das Verfahren ermöglicht jedoch auch den Nachweis anderer Rezeptor-Analyt-Wechselwirkungen, z.B. den Nachweis von Nukleinsäure-Protein-Wechsel Wirkungen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst vorzugsweise eine parallele Bestimmung von mehreren Analyten, d.h. es wird ein Träger bereitgestellt, der mehrere unterschiedliche Rezeptoren, die mit jeweils unterschiedlichen Analyten in einer einzigen Probe reagieren können, enthält. Vorzugsweise werden durch das erfindungsgemäße Verfahren mindestens 50, vorzugsweise mindestens 100 und besonders bevorzugt mindestens 200 Analyten parallel bestimmt.
Die Immobilisierung der Rezeptoren an den Träger kann durch kovalente Bindung, nicht-kovalente Selbstassemblierung, Ladungswechselwirkung oder Kombinationen davon erfolgen. Die kovalente Bindung umfasst vorzugsweise die Bereitstellung einer Trägeroberfläche mit einer chemisch reaktiven Grupppe, an die die Startbausteine zur Rezeptorsynthese, vorzugsweise über einen Spacer bzw. Linker gebunden werden können. Die nicht-kovalente Selbstassemblierung kann beispielsweise auf einer Edelmetalloberfläche, z.B. einer Goldoberfläche, mittels Thiolgruppen, vorzugsweise über einen Spacer bzw. Linker, erfolgen.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich vorzugsweise dadurch aus, dass das Detektionssystem zur Analytbestimmung, eine Lichtquellenmatrix, einen mikrofluidischen Träger und eine Detektionsmatrix in einem zumindest teilweise integrierten Aufbau kombiniert. Dieses Detektionssystem kann zur integrierten Synthese und Analyse eingesetzt werden, insbesondere zum Aufbau komplexer Träger, z.B. Biochips, und zur Analyse komplexer Proben, z.B. zur Genom-, Genexpressions- oder Proteomanalyse.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Synthese der Rezeptoren in situ auf dem Träger, beispielsweise indem Fluid mit Rezeptorsynthesebausteinen über den Träger geleitet wird, die Bausteine an jeweils vorbestimmten Bereichen auf dem Träger orts- oder/und zeitspezifisch immobilisiert werden und diese Schritte wiederholt werden, bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Bereichen auf dem Träger synthetisiert worden sind. Diese Rezeptorsynthese umfasst vorzugsweise mindestens einen fluidchemischen Schritt, einen fotochemischen Schritt, einen elektrochemischen Schritt oder eine Kombination solcher Schritte sowie eine online-Prozessüberwachung, beispielsweise unter Verwendung der Detektionsmatrix.
Die Lichtquellenmatrix ist vorzugsweise eine programmierbare Lichtquellenmatrix, z.B. ausgewählt aus einer Lichtventilmatrix, einem Spiegelarray, einem UV-Laserarray und einem UV-LED (Dioden)-Array.
Der Träger ist vorzugsweise eine Flusszelle bzw. eine Mikroflusszelle, d.h. ein mikrofluidischer Träger mit Kanälen, vorzugsweise mit geschlossenen Kanälen, in denen sich die vorbestimmten Positionen mit den jeweils unterschiedlich immobilisierten Rezeptoren befinden. Die Kanäle haben vorzugsweise Durchmesser im Bereich von 10 bis 10000 μm, besonders bevorzugt von 50 bis 250 μm und können grundsätzlich in beliebiger Form ausgestaltet sein, z.B. mit rundem, ovalem, quadratischem oder rechteckigem Querschnitt.
Wie bereits ausgeführt, umfassen die Sekundärstrukturen der Rezeptoren vorzugsweise eine Hairpin-Struktur, die aus einem Stem und einem Loop zusammengesetzt ist. In einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann sich die mit dem Analyten bindefähige Sequenz des Rezeptors im Bereich des Loops eines Hairpins befinden. Durch Bindung des Loops an den Rezeptor wird die Hairpin-Struktur geöffnet. Diese Hairpin-Öffnung kann wiederum durch geeignete Maßnahmen (z.B. siehe oben) nachgewiesen werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform befindet sich jedoch die mit dem Analyten spezifisch bindefähige Sequenz des Rezeptors im Stem der Hairpin- Struktur. Auch in dieser Ausführungsform bewirkt die Bindung des Analyten an den Rezeptor eine nachweisbare Auflösung der Hairpin- Struktur. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen mit einer Erkennungssequenz im Stem (Figur 2B, 3A und 3B) komplementäre Sequenzen A und A* im Stem und eine Linker-Einheit L im Loop. Dabei befinden sich im Loop des Hairpins Bausteine, die keine Basenpaarungen eingehen können (z.B. Polyethylenglykol-, Alkyl-, Polyethylenglykolphosphat- oder Alkylphosphat- Einheiten) oder Bausteine, die nur schwache Basenpaarungen eingehen können (z.B. ein Tn-Loop mit n = 2-8). Als Erkennungssequenzen können beide Sequenzabschnitte A (Figur 3B) oder A* (Figur 3A) im Stem dienen. Wird ein Hybridisierungsexperiment durchgeführt, konkurriert z.B. eine in der zu untersuchenden Probe befindliche Sequenz A mit der Referenzsequenz A im Stem des Hairpins um die Sequenz A* (Figur 3A). Diese Konkurrenzsituation wird dazu verwendet, die Spezifität der Hybridisierung zu erhöhen. Ist z.B. die in der Probe befindliche Sequenz A nicht vollständig komplementär zu A* (d.h. es treten Fehlpaarungen auf), ist die Paarung zwischen den beiden Sequenzen A und A* im Hairpin stabiler, was zur Folge hat, dass das Hybridisierungsgleichgewicht auf die linke Seite zur geschlossenen Form des Hairpin verlagert ist (Figur 3A). Wird zur Hybridisierung also eine markierte Probe A verwendet, bedeutet dies, dass kein oder nur ein geringes Signal detektierbar ist, da das Gleichgewicht auf der Seite des geschlossenen Hairpins liegt. Signale werden nur detektierbar, wenn die Hairpinstruktur im geöffneten Zustand vorliegt, d.h. eine stabile Paarung zwischen A in der zu untersuchenden Probe und A* im Hairpin möglich ist, und das Gleichgewicht rechts, d.h. bei einem offenen Hairpin, liegt.
Somit wird neben gebräuchlichen Variablen der Stringenzbedingungen, wie z.B. Salzkonzentration, Temperatur, Sonden- und Target-Konzentration, eine weitere Variable eingeführt, mit der Einfluss auf die Stringenz eines Hybridisierungsexperimentes genommen werden kann. Desweiteren kann das Hybridisierungsgleichgewicht (und damit die Stringenz) der Referenz- Sonde bzw. der Erkennungssequenz u.a. dadurch variiert werden, dass diese Sequenzen Bausteine von Nukleinsäure-Analoga enthalten, die sich dadurch auszeichnen, dass diese stärker mit DNA binden, als DNA mit DNA. Hierfür kommen u.a. PNA oder LNA-Bausteine oder andere dem Fachmann bekannte Bausteine mit den beschriebenen Charakteristika in Frage.
Durch das beschriebene Vorgehen wird erreicht, dass im Gegensatz zum üblichen Vorgehen (Verwendung von 1 Perfect-Match + 1 Single-Base- Mismatch Sonde) für die Diskriminierung zwischen Perfect-Match und Single-Base-Mismatch nur eine einzige Sonde verwendet werden muss, und somit Stellplätze auf dem Array eingespart werden können bzw. mehr Informationen mit einer vorgegebenen Menge an Stellplätzen abgefragt werden kann. Desweiteren können hierdurch auch terminale Mismatche abgefragt werden, da durch Anwesenheit der Referenzsequenz im gleichen Molekül höhere Stringenzbedingungen eingestellt werden können, als wenn für die Diskriminierung von Perfect-Match und Single-Base-Mismatch 2 separate Sonden verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Hairpin- Strukturen zwei komplementäre Sequenzen (A, A*) und zwei nicht komplementäre Einheiten (Z, X) im Stem und eine Linker-Einheit (L) im Loop
(Figur 4). Als Erkennungssequenzen können sowohl die der Festphase nahe
Sequenzabfolge A-Z (Figur 4A) als auch die der Festphase ferne
Sequenzabfolge A*-Z (Figur 4B) dienen. Von entscheidender Bedeutung ist die Tatsache, dass X und Z nicht miteinander paaren. Hierzu wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, dass es sich bei X um einen oder mehrere paarungsfähige Nukleinsäure-Bausteine und bei Z um eine oder mehrere nicht-paarungsfähige Bausteine handelt. Z kann beispielsweise eine „Abasic site" (DNA- oder RNA-Baustein ohne Heterobase) oder ein dem Fachmann bekannter Baustein sein, der zwar keine Basenpaarung eingeht, aber die
DNA-Struktur nicht stört. Unter L ist ein Linker zu verstehen, der vorzugsweise aus nicht paarungsfähigen Nukleinsäure-Bausteinen, so z.B. Polyethylenglykolphosphat-Einheiten (R. Micura, Angew. Chemie, 2000, 39(5), 922ff) oder Bausteinen, die nur schwache Basenpaarungen eingehen können (z.B. ein Tn-Loop mit n = 2-8), besteht. Hierdurch wird erreicht, dass besonders terminale Mismatche besser detektierbar werden. Dies erfolgt dadurch, dass in dieser Ausführungsform (Figur 4A) dem Target A- X* weitere Basen zur Paarung zur Verfügung stehen, jedoch der Referenz A-Z nicht. Das bewirkt, dass das Gleichgewicht zwischen geschlossener Form des Hairpins (links) vorteilhaft auf die rechte Seite (offener Hairpin) verschoben wird, wenn eine zusätzliche Basenpaarung vom Target A-X* mit dem Sequenzbereich X im Hairpin erfolgen kann. Treten Fehlpaarungen zwischen Target A-X* und dem Sequenzbereich X im Hairpin auf, ist dies nicht der Fall und das Gleichgewicht wird nicht verstärkt auf die rechte (offene) Seite verschoben.
Durch Vorhandensein zusätzlicher paarungsfähiger Abschnitte X in der Hairpinstruktur des Rezeptors, die mit dem nachzuweisenden Analyten k o m p l e m e n t ä r s i n d , k a n n s o m i t d i e St r i n g e n z d e s Hybridisierungexperimentes weiter erhöht werden (Figuren 4A und 4B). Auch hier können Nukleinsäure-Analoga, wie zuvor beschrieben, Verwendung finden, die stärker mit DNA binden, als DNA mit DNA.
In einer weiteren Ausführungsform kann Z auch das Gemisch der 4 Basen Adenosin, Guanosin, Cytidin und Thymidin bzw. Uracil sein.
In noch einer weiteren Ausführungsform enthält die Hairpin-Struktur eine im geschlossenen Zustand zumindest teilweise gequenchte Markierungsgruppe, z.B. einen Fluorophor. Durch Auflösung der Hairpinstruktur nimmt das von der Markierungsgruppe stammende Signal zu und man weist diese Signalzunahme nach. So enthält eine erfindungsgemäße Hairpin-Struktur (Figur 5) beispielsweise einen Quencher (Q) und einen Fluorophor (F), die sich an entgegengesetzten Enden der Nukleinsäure-Sequenz des Hairpins befinden. Erfindungsgemäß ist die Fluoreszenz im geschlossenen Hairpin durch die räumliche Nähe von Q und F gelöscht. Im geöffneten Zustand ist Fluoreszenz detektierbar. Molekül- Kombinationen Q und F sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
In noch einer weiteren Ausführungform kann die Hybridisierung auch mit doppelsträngigen Targets erfolgen (Figur 6 ). Sind beide Stränge markiert, kann somit die für einen Stellplatz detektierbare Leuchtintensität verstärkt werden.
In einer weiteren Ausführungform kann die Trägeranbindung der Hairpinstrukturen sowohl vom Typ A (Erkennungssequenz im Loop) als auch vom Typ B (Erkennungssequenz im Stem) nicht nur terminal, sondern auch intern erfolgen (Figur 7). Es werden hiermit auch intern an den Träger gebundene Hairpinstrukturen vom Typ A offenbart. Auch Kombinationen von terminal und intern immobilisierten Rezeptoren auf einen Träger sind möglich.
Eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik wird insbesondere dadurch erzielt, dass die erfindungsgemäße Hairpinstruktur die Erkennungssequenz im Stem beinhaltet. Der zur Erkennungssequenz komplementäre Strang wird als Referenz-Sequenz zur Mismatch- Diskriminierung verwendet. Bei einem Hybrisdisierungsexperiment konkurriert eine in der Probenlösung vorhandene Target-Sequenz mit der Referenz-Sequenz (A*) um die Sondensequenz (A). Ist es erwünscht, kann die Stringenz durch Einbau von besonderen Nukleinsäure-Bausteinen (PNA, LNA) im Referenz-Strang weiter gesteigert werden. Das heißt, es wird nur eine Hybridisierung erfolgen - d.h. der Hairpin in die offene Form wechseln - wenn die in der Probenlösung vorhandene Targetsequenz exakt komplementär zur Sondensequenz ist. Ist dies nicht der Fall, sorgt die im Hairpin integrierte Referenzsequenz dafür, dass der Hairpin nicht in die offene Form wechselt, und somit kein Hybridisierung mit einer Targetsequenz erfolgen kann. Desweiteren erlaubt die erfindungsgemäße Hairpinstruktur die Diskriminierung von terminalen Basenfehlpaarungen. Diese werden über die Hybridisierung der Targetsequenz an die Position X möglich. Basenpaarungen komplementär zu terminalen Position X entscheiden darüber, ob der Hairpin verstärkt in die offene Form wechselt und daraus resultierend ein Hybridisierungs-Ereignis detektiert werden kann.
Dies hat zur Folge, dass im Gegensatz zu herkömmlichen DNA-Arrays für die Entscheidung, ob es sich um einen „füll match" oder „mismatch" handelt, wesentlich weniger Sequenzen aufgebracht werden müssen. Daraus resultiert, dass mit der a priori gegebenen maximalen Stellplatzdichte eines Array mehr unterschiedliche Targetsequenzen bearbeitet werden können. Dies steigert die Informationsdichte des Arrays signifikant.
Durch Inkorporation von Fluoreszenz- (F) oder/und Quencher (Q) - Bausteinen in die erfindungsgemäße Hairpinstruktur lässt sich außerdem eine markierungsfreie Detektion von DNA-Arrays erreichen (Figur 5).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein integriertes System zur Bestimmung von Analyten bereitgestellt, welches eine hochparallele in situ Herstellung komplexer Populationen von Hairpin- Rezeptoren immobilisiert in Mikrostukturen zum Nachweis von Analyten erlaubt.
Hierzu verwendet man günstigerweise eine Vorrichtung, umfassend:
(i) eine Lichtquellenmatrix,
(ii) einen mikrofluidischen Träger mit mehreren vorbestimmten
Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten
Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen, (iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und (iv) eine Detektionsmatrix, umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Bereichen auf dem Träger zugeordnet sind.
In der erfindungsgemäßen Vorrichtung legen vorzugsweise zumindest die Komponenten (ii), (iii) und (iv) in integrierter Form vor. Besonders bevorzugt ist der Träger zwischen Lichtquellenmatrix und Detektionsmatrix angeordnet. Die Detektoren der Detektionsmatrix sind vorzugsweise aus Fotodetektoren oder/und elektronischen Detektoren, z.B. Elektroden, ausgewählt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann zur gesteuerten in situ Synthese von Nukleinsäuren, z.B. DNA/RNA-Oligomeren benutzt werden, wobei als temporäre Schutzgruppen fotochemische, fluidchemische, oder/und elektronisch abspaltbare Schutzgruppen, verwendet werden können. Die orts- oder/und zeitaufgelöste Rezeptorsynthese kann durch gezielte Ansteuerung von Elektroden in der Detektionsmatrix, gezielte Fluidzufuhr in definierte Bereiche oder Bereichsgruppen auf dem Träger oder/und gezielte Belichtung über die Lichtquellenmatrix erfolgen.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen erläutert werden:
Figur 1A zeigt schematisch eine Hairpin-Struktur und Figur 1 B zeigt das Gleichgewicht zwischen geschlossener und offener Form des Hairpins.
Figur 2 zeigt zwei Typen von oberflächengebundenen Hairpin-Strukturen. Gemäß Figur 2A befindet sich die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz des Rezeptors im Loop. Gemäß Figur 2B befindet sich die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz im Stem. Dabei bestehen zwei Möglichkeiten zur Anordnung der Erkennungssequenz, d.h. oberflächennah (A) oder oberflächenfern (A*). Die in Figur 2B gezeigte Anordnung der Erkennungssequenz stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.
Figur 3 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hairpin- Struktur und deren Wirkungsweise, wobei S die Festphase und L eine Linkersequenz bedeutet. In Figur 3A ist A* die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz des Rezeptors und A eine dazu komplementäre Sequenz (Referenzsequenz) des Rezeptors. In Figur 3B ist A die mit dem Analyten bindefähige Erkennungssequenz des Rezeptors und A* eine dazu komplementäre Sequenz (Referenzsequenz) des Rezeptors.
Figur 4A und 4B zeigen eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen mit einer zusätzlichen Erkennungssequenz X und einer dazu nicht komplementären Sequenz Z innerhalb des Sterns bzw. deren Wirkungsweise.
Figur 5A und 5B zeigen eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Hairpin-Strukturen, die eine markierungsfreie Detektion, d.h. zum Nachweis von nichtmarkierten Analyten, bzw. deren Wirkungsweise. F bedeutet eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe, Q einen Quencher.
Figur 6 zeigt die Wirkungsweise erfindungsgemäßer Hairpin-Strukturen bei einer Doppelstrang-Hybridisierung, d.h. der zu bestimmende Analyt liegt in Form eines doppelsträngigen Targets vor.
Figur 7 zeigt erfindungsgemäße Hairpin-Strukturen, die nicht über die Enden, sondern im inneren der Sequenz an die Festphase gebunden sind. Gemäß Figur 7A befindet sich die Erkennungssequenz im Loop und gemäß Figur 7B befindet sich die Erkennungssequenz im Stem. Figur 8 zeigt ein Beispiel für eine Hybridisierung auf einem Array mit Hairpin-Strukturen, bei denen sich die Erkennungssequenz im Loop befindet.
Figur 9 zeigt ein Beispiel für eine Hybridisierung auf einem Array, der Hairpin-Strukturen mit einer Erkennungssequenz im Stem beinhaltet.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zur Bestimmung von Analyten, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen eines Trägers mit mehreren vorbestimmten
Bereichen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen,
(b) Inkontaktbringen des Trägers mit einer Analyten enthaltenden Probe und
(c) Bestimmen der Analyten über deren Bindung an die auf dem Träger immobilisierten Rezeptoren, wobei die Bindung eines
Analyten an einem damit spezifisch bindefähigen Rezeptor den Nachweis einer Auflösung der in Abwesenheit des Analyten vorliegenden Sekundärstruktur umfasst.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man einen mikrofluidischen Träger mit Kanälen, insbesondere mit geschlossenen Kanälen, verwendet, in denen sich die vorbestimmten Bereiche mit den dort immobilisierten Rezeptoren befinden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Rezeptoren DNA-Moleküle verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung eines Analyten an den Rezeptor eine Hybridisierung umfasst.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man mehrere Analyten parallel in der Probe bestimmt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens 50, vorzugsweise mindestens 100 Analyten parallel bestimmt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Immobilisierung der Rezeptoren an den Träger durch kovalente Bindung, nicht-kovalente Selbstassemblierung, Ladungswechselwirkung oder Kombinationen davon erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren in situ auf dem Träger erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren umfasst: das Leiten von Fluid mit Rezeptor-Synthesebausteinen über den Träger, das orts- oder/und zeitspezifische Immobilisieren der Bausteine an jeweils vorbestimmten Positionen auf dem Träger und das Wiederholen dieser Schritte bis die gewünschten Rezeptoren an den jeweils vorbestimmten Positionen synthetisiert worden sind.
0. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren mindestens einen fluidchemischen Schritt, einen fotochemischen Schritt, einen elektrochemischen Schritt oder eine Kombination von zwei oder mehr solcher Schritte umfasst.
1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese der Rezeptoren eine on-line Prozessüberwachung umfasst.
2. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Analytbestimmung in einer Vorrichtung erfolgt, umfassend:
(i) eine Lichtquellenmatrix, (ii) einen mikrofluidischen Träger,
(iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und (iv) eine Detektionsmatrix, umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Bereichen auf dem Träger zugeordnet sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine programmierbare Lichtquellenmatrix ausgewählt aus einer Lichtventilmatrix, einem Spiegelarray und einem UV-Laser-Array verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 2 oder 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Vorrichtung verwendet, in der zumindest die Komponenten (ii), (iii) und (iv) in integrierter Form vorliegen.
1 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Sekundärstrukturen der Rezeptoren eine Hairpin-Struktur, umfassend einen Stem und einen Loop, aufweisen.
1 6. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich die mit dem Analyten spezifisch bindefähige Sequenz des Rezeptors im Loop der Hairpin-Struktur befindet.
17. Verfahren nach Anspruch 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich die mit dem Analyten spezifisch bindefähige Sequenz des Rezeptors im Stem der Hairpin-Struktur befindet.
1 8. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Loop der Hairpin-Struktur keine Bausteine enthält, die mit dem Analyten starke Hybridisierungsreaktionen eingehen können.
1 9. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Stem aus miteinander komplementären Sequenzbereichen und miteinander nicht komplementären Sequenzbereichen besteht.
20. Verfahren nach Anspruch 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass die nicht komplementären Sequenzbereiche des Stem zur Basenpaarung fähige Abschnitte oder/und nicht oder nur schwach zur Basenpaarung fähige Abschnitte umfassen.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren terminal oder/und intern an den vorbestimmten Bereichen des Trägers immobilisiert werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass man eine Hairpinstruktur verwendet, die eine im geschlossenen Zustand zumindestteilweise gequenchte Markierungsgruppe enthält, und dass man eine durch Auflösung der Hairpinstruktur bewirkte Zunahme eines von der Markierungsgruppe stammenden Signals nachweist.
23. Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten, umfassend (i) eine Lichtquellenmatrix,
(ii) einen mikrofluidischen Träger mit mehreren vorbestimmten
Positionen, an denen jeweils unterschiedliche Rezeptoren ausgewählt aus Nukleinsäuren und Nukleinsäureanaloga auf dem Träger immobilisiert sind, wobei in einem oder mehreren der vorbestimmten Bereiche die Rezeptoren in Abwesenheit eines damit spezifisch bindefähigen Analyten zumindest teilweise als Sekundärstruktur vorliegen,
(iii) Mittel zur Zufuhr von Fluids zum Träger und zur Ableitung von Fluids aus dem Träger und
(iv) eine Detektionsmatrix umfassend mehrere Detektoren, die den vorbestimmten Positionen auf dem Träger zugeordnet sind.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, in der zumindest die Komponenten (ii), (iii) und (iv) in integrierter Form vorliegen.
25. Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger zwischen Lichtquellenmatrix und Detektionsmatrix angeordnet ist.
26. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 23 bis 25 in einem Verfahren zur parallelen Bestimmung einer Vielzahl von Analyten.
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