DE10318139B4

DE10318139B4 - Selbstkonfigurerbarer Biochip

Info

Publication number: DE10318139B4
Application number: DE10318139A
Authority: DE
Inventors: Friedemann Seibert; Oliver Weinberg
Original assignee: PRO DESIGN GES fur PRODUKTENT; Pro Design Gesellschaft fur Produktentwicklung Mbh
Current assignee: WEINBERG, OLIVER, DIPL.-ING.(FH), 71065 SINDELFING
Priority date: 2003-04-18
Filing date: 2003-04-18
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2023-04-19
Also published as: DE10318139A1; WO2004094059A1

Abstract

Der Biochip für die Analyse von Nukleinsäure-Proben besteht aus einem Träger mit Oberseite, Unterseite und Trägerkörper. an seiner Oberseite sind Reaktionsbereiche für die Synthese oder Fixierung von Sonden-Oligonukleotiden ausgebildet. Darüber hinaus weist der Träger Reagenzbehälter zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe von Reagenzien auf, Probenbehälter zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe von Probennukleinsäuren, ein erstes Transportleitungssystem zur Beförderung von Reagenzien und/oder Nukleinsäureproben zwischen den Behältern und den Reaktionsbereichen, ein zweites Transportleitungssystem für die Zu- und Abfuhr von Spülflüssigkeit zu bzw. von den Raktionsbereichen, wenigstens eine Steuerung zur gezielten Beförderung von Reagenzien, Nukleinsäureproben und/oder Spülflüssigkeit und eine Energieversorgung.

Description

Die Erfindung betrifft einen selbstkonfigurierbaren Biochip für die Analyse von Nukleinsäure-Proben, bestehend aus einem Träger mit Oberseite, Unterseite und Trägerkörper, an dessen Oberseite vorbestimmte Reaktionsbereiche für die Synthese oder Fixierung von bestimmten Sonden-Oligonukleotiden ausgebildet sind.

Für die medizinische Diagnostik, die Lebensmittelanalytik und viele Bereiche der Grundlagenforschung, bieten Screening-Verfahren auf Basis der Biochip- bzw. DNS-Chip-Technologie ein großes Potential – insbesondere für Routineanalysen. Einsatzgebiete der Nukleinsäureanalytik sind u. a. die Detektion transgener Lebensmittel, die Blutanalytik und die Genexpression.

Mit Hilfe der Biochips bzw. DNS-Chips ist es möglich, eine sehr hohe Anzahl von DNA-Sequenzen zu bestimmen und so beispielsweise die transkriptionelle Aktivität einer Zelle in verschiedenen physiologischen Zuständen zu analysieren und verschiedene Zustände zu vergleichen.

Das Prinzip einer Biochip- bzw. DNS-Chip-Analyse ist einfach: Auf der Oberfläche eines Trägers, beispielsweise eines Glas- oder Polymerträgers, des sogenannten Chips, werden Oligonukleotide (cDNA) bekannter Sequenz in einem geordneten Raster fixiert. Hierbei kann eine Vielzahl von Oligonukleotiden auf kleinstem Raum aufgebracht werden. Die Oligonukleotide dienen als Sensoren bzw. sogenannte "Sonden".

Zu dieser Matrize wird als sogenannte "Probe" bzw. "Target" die zu untersuchende Nukleinsäure gegeben. Diese wird zuvor mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Eine Proben-Nukleinsäure (Target-Nukleinsäure) bleibt nur dann an einem Sonden- bzw. Sensor-Oligonukleotid haften und hybridisiert mit diesem, wenn ihre Nukleotidsequenz komplementär zu der Nukleotidsequenz des betreffenden Sonden- bzw. Sensor-Oligonukleotids ist. Aufgrund der Selektivität des Hybridisierungsvorgangs sind sehr genaue Analysen möglich. Eine Hybridisierung der Proben-Nukleinsäure an die chipgebundenen Sondenmoleküle passender Sequenz wird durch ein Fluoreszenzfarbsignal an der entsprechenden Rasterposition angezeigt, wobei die Signalintensität zusätzlich eine Aussage über die Anzahl gebundener Sondenmoleküle zulässt.

Mit Hilfe eines sogenannten Biochip-Readers wird die Biochip-Analyse ausgewertet. Dazu regt eine in dem Reader integrierte Lichtquelle den bzw. die Fluoreszenzfarbstoff(e) der gebundenen Proben-Nukleinsäure zum Leuchten an und eine Kamera nimmt diese Lichtpunkte auf.

Bio-Chips bzw. DNS-Chips bzw. Mikroarrays können auf sehr unterschiedliche Art und Weise hergestellt werden, üblicherweise wird jedoch eine der drei folgenden Methoden zur Fixierung der Sonden-Molekülen auf dem Träger eingesetzt:

(1) Der Aufbau der Sonden-Oligonukleotide Base für Base direkt auf der Träger-Oberfläche.

Bei dieser Methode erfolgt die Oligonukleotid-Synthese in der Regel fotolithographisch. Das heißt durch das Einstrahlen von Licht an bestimmten Positionen der Chip-Oberfläche wird diese dort aktiviert bzw. werden Schutzgruppen an den Enden dort bereits vorliegender Oligonukleotide entfernt. In einer nachfolgenden chemischen Reaktion wird dann gezielt ein weiteres Nukleotid angehängt. Durch ein iteratives Durchlaufen des Prozesses unter Nutzung verschiedener Masken lassen sich so an verschiedenen Positionen unabhängige Oligonukleotidsequenzen als Sonden/Sensoren synthetisieren.

(2) Das Aufbringen vorsynthetisierter Sondenmoleküle auf die Chip-Oberfläche

Bei dieser Methode werden vorsynthetisierte Oligonukleotide, zum Beispiel die PCR-Produkte aller Gene eines Organismus, mit speziellen Link-Molekülen, die reaktive Gruppen aufweisen, z.B. Amine oder Silanen versetzt und auf die Chip-Oberfläche aufgebracht. Die Bindung der Sonden-Oligonukleotide an die Chip-Oberfläche erfolgt vermittels der Link-Moleküle.

(3) Befestigung von vorsynthetisierten Sonden-Oligonukleotiden mit einem Volumenelement.

Bei dieser Methode werden die Sonden-Oligonukleotid-Moleküle in einem dreidimensionalen Gelpunkt fixiert (welcher mit den Sondenmolekülen wechselwirkt), anstatt auf einer Oberfläche.

Der Bereich bzw. Ort auf der Chipoberfläche, der für die Synthese oder Fixierung eines bestimmten Sonden-Oligonukleotids vorgesehen ist, wird im folgenden als Reaktionsbereich oder kurz "Reaktor" bezeichnet. Eine Ansammlung mehrere solcher (Reaktions-)Bereiche bzw. Orte auf der der Chipoberfläche, die für die Synthese oder Fixierung aller gewünschten Sonden-Oligonukleotide vorgesehen ist, wird im folgenden als Reaktionsareal oder Reaktorareal bezeichnet.

Alle bekannten Methoden sind für die Chip-Herstellung im industriellen Maßstab geeignet und vorgesehen. Die daraus resultierenden und derzeit im Handel verfügbaren Biochips sind deshalb nur für ein begrenztes Anwendungsspektrum geeignet, nämlich für die geläufigsten und immer wiederkehrenden Fragestellungen. Für spezielle Fragestellungen, d.h. für eine spezielle Analyse eines bestimmten Probenmaterials sind diese Biochips nur eingeschränkt geeignet und liefern vielfach nur unvollständige Ergebnisse. Die Synthese eines Biochips mit einer vom Anwender frei wählbaren Sonden-Konfiguration direkt vor Ort ist derzeit nicht oder nur mit ökonomisch unvertretbar hohem Aufwand möglich.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Biochips, dessen Ausrüstung (Konfiguration) mit bestimmten, beliebig wählbaren Sonden-Oligonukleotiden an vorbestimmten Positionen vom Anwender selbst durchgeführt werden kann, ein Miniaturlabor zu entwickeln, mit dem die Synthese und Analyse von Oligonukleotiden vom Anwender selbst einfach, schnell und kostengünstig durchgeführt werden kann.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Biochip der eingangs genannten Art gelöst, der durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

– es sind Reagenzbehälter zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe von Reagenzien auf der oder integriert in die Trägeroberseite angeordnet,
– es sind Probenbehälter zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe von Proben-Nukleinsäuren auf der oder integriert in die Trägeroberseite angeordnet,
– es ist ein erstes Transportleitungssystem an der Trägeroberseite oder in dem Trägerkörper ausgebildet, welches die Reaktoren und/oder Reaktorareale mit den Reagenzbehältern und den Probenbehältern verbindet und dazu geeignet ist, Reagenzien und/oder Nukleinsäureproben zwischen den Behältern und den Reaktoren bzw. Reaktorarealen zu befördern,
– es ist ein zweites Transportleitungssystem an der Trägeroberseite oder in dem Trägerkörper ausgebildet, welches Zu- und Ableitungen umfasst und für die Zu- und Abfuhr von Spülflüssigkeit zu bzw. von den Reaktoren und/oder Reaktorarealen geeignet ist,
– es ist wenigstens eine Steuerung vorgesehen, die derart mit den Reaktoren und/oder den Reaktorarealen und/oder den Reagenzbehältern und/oder den Probenbehältern und/oder dem ersten und/oder dem zweiten Transportleitungssystem gekoppelt ist, dass eine gezielte Beförderung von Reagenzien und/oder Nukleinsäureproben und/oder Spülflüssigkeit zu den Reaktoren und/oder den Reaktorarealen hin und/oder von diesen weg durchführbar ist,
– es ist eine Energieversorgung vorgesehen, die zumindest die für die Synthese der Sonden-Oligonukleotide und die Analysereaktionen, insbesondere die Hybridisierungsreaktion, erforderliche Energie bereitstellt bzw. liefert.

Das erste Transportleitungssystem ist vorzugsweise derart mit Ventilen und/oder Pumpen ausgestattet bzw. gekoppelt, dass die Beförderung der Reagenzien und/oder Proben-Nukleinsäure zwischen den Proben- bzw. Reagenzbehältern und den Reaktoren und/oder den Reaktorarealen räumlich und zeitlich und mengenmäßig gezielt gesteuert und kontrolliert werden kann.

Die Ventile und/oder die Pumpen sind vorzugsweise an den jeweiligen Anschlussstellen (Anschlüssen) zwischen Transportleistungssystem und Reaktor, zwischen Transportleitungssystem und Probenbehälter und zwischen Transportleitungssystem und Reagenzbehälter ausgebildet.

Eine Variante der Erfindung sieht vor, dass jedem Reagenzbehälter, jedem Probenbehälter und jedem Reaktor eine separate Pumpe und/oder ein separates Ventil zugeordnet ist. Insbesondere kann jedem Reagenzbehälter und jedem Probenbehälter eine separate Pumpe und jeder Anschlussstelle ein separates Ventil zugeordnet sein. Bei einer anderen Variante ist vorgesehen, dass Gruppen von Reagenzbehältern und/oder Gruppen von Probenbehältern jeweils eine separate Pumpe zugeordnet ist. Geeignete Pumpen sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise Mikromembranpumpen, Piezopumpen, u.ä.

Das erste Transportleitungssystem kann derart konfiguriert sein, dass jeweils diejenigen Leitungen, die einen bestimmten Reagenzbehälter oder eine bestimmte Gruppe von Reagenzbehältern mit allen Reaktoren verbinden, einen Systemteilabschnitt dieses ersten Transportleitungssystems darstellen, der in einer Ebene des Trägerkörpers angeordnet ist, und dass die verschiedenen Systemteilabschnitte der verschiedenen Reagenzbehälter in verschiedenen, vorzugsweise kongruenten Ebenen des Trägerkörpers angeordnet sind.

Bei einer bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Biochips sind an dem Träger, d. h. auf seiner oder integriert in seine Ober- und/oder Unterseite oder integriert in den Trägerkörper Kühl- und/oder Heizelemente ausgebildet, die in derart räumlichen Kontakt zu den Reagenzbehältern und/oder Probenbehältern und/oder Reaktoren und/oder den Reaktorarealen und/oder dem ersten und/oder zweiten Transportleitungssystem stehen, dass sie zur Kühlung bzw. Beheizung der Reagenzbehältern und/oder Probenbehältern und/oder Reaktoren und/oder den Reaktorarealen und/oder dem ersten und/oder dem zweiten Transportleitungssystem geeignet ist.

Als Kühl- und/oder Heizelemente werden insbesondere Peltierelemente vorgeschlagen. Es können aber auch einfachere Wärmeleiter eingesetzt werden, z.B. Aluminiumstreifen, die von außen beheizt oder gekühlt werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Biochips ist das erste Transportleitungssystem wenigstens in einem Abschnitt meanderförmig oder ringförmig ausgebildet und steht derart mit den Kühl- und/oder Heizelementen in Kontakt, dass gekühlte und erwärmte Schleifen alternierend aufeinander folgen.

Das zweite Transportleitungssystem kann ebenfalls Ventile und/oder Pumpen aufweisen, insbesondere an den Anschlüssen zu (mit) den einzelnen Reaktoren.

Die Steuerung kann an dem Träger ausgebildet bzw. im Träger integriert sein, d.h. ein Bauteil des Trägers sein. Eben so gut kann sie eine separate, externe, vom Träger bzw. Biochip unabhängige Konstruktionseinheit sein. Bei dieser Ausführungsvariante ist der erfindungsgemäße Biochip bzw. Träger mit Schnittstellen für die externe Steuereinheit ausgerüstet. Diese Schnittstellen können mit den Schnittstellen für die Zuleitungen der Energiequelle zu bzw. für die Energieversorgung von Pumpen, Ventilen, Heiz- und Kühlelementen und sonstigen energiegetriebenen Bauteilen des Trägers identisch sein. In der Praxis hat sich eine solche externe Konstruktionseinheit in Gestalt eines herkömmlichen Personal Computers (PC) bewährt. Die Steuerung gewährleistet, dass die Beförderung von Reagenzien und Probenmaterial, die Synthese der Sonden-Oligonukleotide und die einzelnen Schritte des Analyseverfahrens, insbesondere auch die Probenaufbereitung mittels PCR und die Hybridisierungsreaktion planmäßig geregelt und kontrolliert ablaufen (können).

Die Steuerung ist vorzugsweise eine elektrisch getriebene Steuerung.

Die Steuerung kann derart konzipiert sein, dass sie auch zur gezielten Aktivierung des zweiten Transportleitungssystems 24, d.h. zur gezielten Zu- und Ableitung der Spülflüssigkeit(en), geeignet ist.

Zu diesem Zweck kann aber eben so gut eine separate zweite Steuerung mit dem Träger gekoppelt sein.

Die Energiequelle, die die für die Synthese der Sonden-Oligonukleotide und das Analyseverfahren notwendige Energie liefert, kann an dem Träger ausgebildet bzw. im Träger integriert sein, d.h. ein Bauteil des Trägers sein. Eben so gut kann sie eine separate, externe, vom Träger bzw. Biochip unabhängige Konstruktionseinheit sein. In der Praxis hat sich eine externe Energieversorgung durch Lichteinstrahlung (Fhotolithographie) oder durch Anlegen eines elektrischen Feldes als geeignet erwiesen.

Einige oder alle vorbestimmten Reaktionsbereiche bzw. Reaktoren können als eine oder mehrere Vertiefungen) der Trägeroberseite realisiert sein.

Die Reagenz- und/oder Probenbehälter sind vorzugsweise derart konzipiert, dass sie einmal oder wiederholbar befüllt werden können und nach dem Befüllen versiegelt werden können.

Der erfindungsgemäße Biochip und seine Funktionsweise werden nachfolgend anhand von Zeichnungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Es zeigen
1 eine perspektivische Darstellung eines erfindungsgemäßen Chips,
2 einen vergrößerten Teilbereich des Chips gemäß 1 ,
3 eine Detaildarstellung der Reaktoren des Chips gemäß 1.
Der in 1 dargestellte Biochip gemäß vorliegender Erfindung umfasst einen abgeplatteten Träger 2 mit einer Oberseite 4, einer Unterseite 6 und dem dazwischen liegenden Trägerkörper 5.
In einer Vertiefung 8 etwa in der Mitte der Oberseite 4 sind in rasterartiger Anordnung eine Mehrzahl Reaktionsbereiche 10 – sogenannte Reaktoren 10 – ausgebildet, von denen jeder einzelne für die Synthese oder Fixierung eines bestimmtes Sonden-Oligonukleotids vorbestimmt ist. Eine solche Anordnung bzw. Mehrzahl von Reaktionsbereichen bzw. Reaktoren 10 wird als Reaktionsareal bzw. Reaktorareal 12 bezeichnet. Jeder einzelne Reaktor 10 besteht aus einem Teilbereich 14 der Trägeroberseite 4, der vorzugsweise als kreisförmige muldenartige Vertiefung ausgebildet ist. Jedem dieser Teilbereiche 14 sind ein oder mehrere Ventile 16 zugeordnet (in 3 schematisch als Zylinder dargestellte), über die zumindest die Zufuhr der Reagenzien für die Sonden-Oligonukleotidsynthese und der Proben-Nukleinsäure und Reagenzien für die Analysereaktion(en) erfolgt.
In einem an das Reaktionsareal/Reaktorareal 12 angrenzenden Bereich der Trägeroberseite 4 sind mehrere Reagenzbehälter 18 angeordnet, hier im Beispiel in die Trägeroberseite 4 eingelassen, die zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe von Reagenzien für die Synthese oder Fixierung der Sonden-Oligonukleotide oder für die Hybridisierungsreaktion zwischen Sonde(n)-Oligonukleotiden und Proben-Nukleinsäure(n) dienen. Die Reagenzbehälter 18 können maschinell, im industriellen Maßstab und unter Einsatz herkömmlicher Verfahren mit den gewünschten Reagenzien befüllt werden und bei Bedarf verschlossen werden. Als Verschluss kommt insbesondere eine Siegelfolie in Betracht. Die Reagenzbehälter 18 können als Einwegbehälter oder als wieder befüllbare Behälter realisiert sein.
In einem anderen an das Reaktionsareal/Reaktorareal 12 angrenzenden Bereich der Trägeroberseite 4 ist ein Probenbehälter 20 angeordnet, hier im Beispiel in die Trägeroberseite 4 eingelassen, der zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe der Proben-Nukleinsäuren dient.
An der Trägerunterseite 6 und/oder im Trägerkörper 5 ist ein erstes Transportleitungssystem 22 ausgebildet, das die Reaktoren 10, die Reagenzbehälter 18 und den Probenbehälter 20 untereinander verbindet. Es umfasst zumindest Leitungen ("Hauptleitungen") zwischen Reaktoren 10 und Reagenzbehälter 18, Leitungen ("Hauptleitungen") zwischen Reaktoren 10 und Probenbehälter 20 und Leitungen ("Hauptleitungen") zwischen Reagenzbehältern 18 und Probenbehälter 20. Bei Bedarf können diese Leitungen über sogenannte Querleitungen untereinander verbunden sein. Das Transportleitungssystem 22 ist derart konfiguriert, dass jeder einzelne Reagenzbehälter 18 und/oder ausgewählte Gruppen von Reagenzbehältern 18 mit allen Reaktoren 10 über Transportleitungen in Verbindung steht/stehen und folglich jeden einzelnen Reaktor 10 mit dem/den betreffenden Reagenzien) befüllen kann. Damit ist gewährleistet, dass in jedem beliebigen Reaktor 10 jedes beliebige Sonden-Oligonukleotid erzeugt werden kann.
Das Transportleitungssystem 22 ist zudem derart konfiguriert, dass jeder einzelne Reagenzbehälter 18 und/oder ausgewählte Gruppen von Reagenzbehältern 18 mit dem Probenbehälter 20 über Transportleitungen in Verbindung steht/stehen und gezielt Reagenzien in den Probenbehälter 20 (zu der Nukleinsäureprobe) befördern kann können.
Das Transportleitungssystem 22 kann ferner derart konfiguriert sein, dass Reagenzien aus den Reagenzbehältern 18 über die sogenannten Querverbindungen in Leitungen ("Hauptleitungen") zwischen Reagenzbehältern 18 und Reaktoren 10, Leitungen zwischen Probenbehälter 20 und Reaktoren 10 und/oder Leitungen zwischen Reagenzbehälter 18 und Probenbehälter 20 befördert werden können.
Das Transportleitungssystem 22 ist mit (hier nicht näher dargestellten) Pumpen und Ventilen (Mikroventilen) gekoppelt, um einen gezielten und gerichteten Transport zu gewährleisten. Die Ventile und die Pumpen sind vorzugsweise an den Anschlussstellen zwischen Transportleitungssystem 22 und Reagenzbehälter 18, zwischen Transportleitungssystem 22 und Probenbehälter 20 sowie zwischen Transportleitungssystem 22 und Reaktor 10 ausgebildet.
Wie in 2 schematisch dargestellt, ist in dem Trägerkörper 5 in einer Ebene parallel zu derjenigen des ersten Transportleitungssystems 22 ein Heiz- und Kühlsystem angeordnet – hier im Beispiel in Form von zwei Peltierelementen 26, 28 –, mit denen das erste Transportleitungssystem 22, d.h. die einzelnen Transportleitungen, und damit die darin beförderten Reagenzien und das Probenmaterial gezielt temperiert werden können, was insbesondere für die Durchführung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) erwünscht ist.
Um eine alternierende Abfolge von erwärmten und gekühlten Leitungsabschnitten zu erzeugen, die z.B. für die Durchführung einer Polymerasekettenreaktion in den Leitungen erwünscht ist, sind diejenigen Leitungen des ersten Transportleitungssystems 22, die Probenbehälter 20 und Reaktor 10 miteinander verbinden, meanderförmig ausgebildet und derart räumlich mit dem Heiz- und Kühlsystem gekoppelt, dass gekühlte und erwärmte Schleifen alternierend (abwechselnd) aufeinander folgen (vgl. 2 und 3). Anstelle der Meanderform kann die Leitung selbstverständlich auch jede andere Form aufweisen, die eine alternierende Kühlung und Erwärmung der betreffenden Leitung gewährleistet.
In dem Trägerkörper 5 ist ein zweites Transportleitungssystem 24 ausgebildet, das Zu- und Ableitungen umfasst, die mit dem Reaktorareal 12 über ein (hier nicht näher dargestelltes) adaptiertes Anschlußstück in Verbindung stehen und für die Zu- und Abfuhr von Spülflüssigkeit vorgesehen ist (vgl. 1 und 2). Über dieses zweite Transportleitungssystem 24 kann eine Spülflüssigkeit dem Reaktorareal 12 zugeführt und gelöste Reaktionsrückstände von ihm abgeführt werden. Die Spülflüssigkeit ist entweder extern des Trägers bevorratet und wird von dort mit üblichen Mitteln dem Träger 5 zugeführt, oder sie ist in einem Vorratsbehälter aufbewahrt, der an bzw. in dem Träger 5 ausgebildet ist.
Spülungen sind in der Regel im Verlauf der Sonden-Oligonukleotid-Synthesereaktionen und der Analysereaktionen vorgesehen. Es ist aber auch denkbar, dass nach Beendigung eines bestimmten Analyseverfahrens ein komplexer Spülvorgang zur vollständigen Reinigung des Reaktorareals durchgeführt wird, so dass der Chip anschließend für eine erneute Sonden-Oligonukleotid-Synthese und nachfolgende Analysereaktion zur Verfügung steht.
Um eine gezielte Beförderung von Reagenzien und Probenmaterial in dem ersten Transportsystem 26 zu gewährleisten, ist eine hier nicht näher dargestellte Steuerung vorgesehen. Diese Steuerung ist beispielsweise als elektrische Steuerung realisiert, bestehend aus einer prozessorgesteuerten Recheneinheit mit wiederbeschreibbarem Speicher, die über elektrische Kontakte 30 an den Träger 2 gekoppelt ist. Die elektrischen Kontakte 30 sind hier beispielhaft an der Trägerunterseite 6 angeordnet und in dem Fachmann geläufiger (hier nicht näher dargestellter) Weise derart mit den Pumpen und Ventilen an den Reaktoren 10, den Reagenzbehältern 18, dem Probenbehälter 20 sowie dem ersten und dem zweiten Transportleitungssystem 26 und 28 gekoppelt, dass sowohl die Synthese der Sonden-Oligonukleotide als auch die einzelnen Schritte des Analyseverfahrens, insbesondere die Probenaufbereitung und Hybridisierung, planmäßig geregelt und kontrolliert durchgeführt werden können.
Die elektrischen Kontakte 30 dienen hier außerdem zur Energieversorgung der Pumpen und Ventile sowie der Peltierelemente.
Jeder Reaktor 10 ist mit einer Energiequelle koppelbar, die die für die einzelnen Synthese- und/oder Analyseschritte erforderliche Energie liefert. Im vorliegenden Beispiel erfolgt die Energieversorgung in nicht näher dargestellter Weise durch Lichteinstrahlung (Photolithographie) oder durch Anlegen eines elektrischen Feldes.
Beispiel 1: Herstellung eines Biochips mit einer speziellen gewünschten Sondenkonfiguration und Durchführung einer DNS-Analyse mit diesem Biochip
Zur Herstellung eines Biochips mit einer speziellen gewünschten Sondenkonfiguration erzeugt der Benutzer zunächst in dem/den Reaktoren) 10 die gewünschten Sonden-Oligonukleotide. Die hierfür benötigten einzelnen Nukleotide oder Oligonukleotide – beispielsweise 16 verschiedene Nukleotid-Dimere – und weiteren Reagenzien (z.B. katalytische Enzyme) sind in verschiedenen Reagenzbehältern 18 bevorratet und werden mit Hilfe der Steuerung gezielt je nach Bedarf aus diesen entnommen und über das erste Transportleitungssystem 22 dem/den Reaktoren) 10 zugeführt. Die für die einzelnen Syntheseschritte notwendige Energie wird beispielsweise fotolitographisch durch Lichteinstrahlung oder durch Anlegen eines elektrischen Feldes geliefert. Für gegebenenfalls erforderliche Waschschritte wird über das zweite Transportleitungssystem 24 Spülflüssigkeit in die Reaktoren) 10 hineinbefördert und anschließend wieder aus diesen abgeführt.
Die auf diese Weise mit Sonden-Oligonukeotiden vorkonfigurierten Reaktoren 10 werden anschließend mit einer ausreichenden Menge an aufbereitetem Probenmaterial beschickt.
Zur Aufbereitung des Probenmaterials gibt der Benutzer eine üblicherweise geringe Menge der zu untersuchenden Proben-Nukleinsäure in den Probenbehälter 20.
Diese Proben-Nukleinsäure kann erfindungsgemäß in dem Probenbehälter 20 und/oder in dem Transportleitungssystem 22 während der Beförderung zu einem Reaktor 10 im Zuge einer Polymerasekettenreaktion vervielfältigt werden. Zu diesem Zweck sind in bestimmten Reagenzbehältern 18 die für die Polymerasekettenreaktion erforderlichen Reagenzien bevorratet. Mit Hilfe der Steuerung werden diese Reagenzien gezielt hinsichtlich Zeitpunkt und Menge aus den betreffenden Reagenzbehältern 18 entnommen und über das erste Transportleitungssystem 22 in den Probenbehälter 20 befördert. Die notwendigen Primer können ebenfalls in speziellen Reagenzbehältern 18 bevorratet sein und werden dann wie die anderen Reagenzien von dort über das erste Transportleitungssystem 22 in den Probenbehälter 20 transportiert, oder sie werden vom Anwender direkt in diesen gegeben. Der Ort der Polymerasekettenreaktion (PCR) ist entweder der Probenbehälter 20 selbst oder ein Abschnitt des Transportleitungssystems 22 zwischen dem Probenbehälter 20 und den Reaktoren 10. Das Heiz- und Kühlsystem, dass dem Transportleitungssystems 22 zugeordnet ist, sorgt für eine alternierende Abfolge von erwärmten und gekühlten Leitungsabschnitten und letztendlich zusammen mit einer den Durchfluss regelnden Pumpe für die wechselnde Erwärmung und Kühlung der Polymerasekettenreaktionspartner, die den erfolgreichen Ablauf der PCR erste ermöglicht.
Das Produkt der PCR wird den vorbereiteten Reaktoren 10 zugeführt und falls nötig mit weiteren Reagenzien aus den Reagenzbehältern 12 über das Transportleitungssystem 22 angereichert. Sobald eine derart aufbereitete Proben-Nukleinsäure ihre(n) vorbestimmten Reaktoren) 10 erreicht hat, läuft die Analysereaktion ab, in deren Verlauf die Proben-Nukleinsäure entweder an das Sonden-Oligonukleotid bindet oder nicht. Um die Reaktion zu beschleunigen, können die in dem Trägern integrierten Heiz- und Kühlelemente 26, 28 aktiviert werden, so dass sie das Transportleitungssystem 22 und/oder den betreffenden Reaktor 10 erwärmen. Falls ein oder mehrere Spülvorgänge mit Reinigungsflüssigkeit (Wasser oder anderen Waschlösungen) erforderlich oder gewünscht sind, werden diese durchgeführt, in dem die gewünschte Reinigungsflüssigkeit über das zweite Transportleitungssystem 24 in den betreffenden Reaktor 10 hinein und anschließend wieder aus diesem heraus geführt wird.
Die Detektion der Analyseergebnisse, d.h. gegebenenfalls der Hybridisierungsprodukte in den betreffenden Reaktoren 10 kann mittels der üblichen Readersysteme erfolgen.

2: Träger
4: Trägeroberseite
5: Trägerkörper
6: Trägerunterseite
8: Vertiefung
10: Reaktionsbereich/Reaktor
12: Reaktionsareal/Reaktorareal
14: Teilbereich
16: Ventil
18: Reagenzbehälter
20: Probenbehälter
22: erstes Transportleitsystem
24: zweites Transportleitsystem
26: Peltierelement
28: Peltierelement
30: elektrischer Kontakt

Claims

Biochip für die Analyse von Nuleinsäure-Proben, bestehend aus einem Träger mit Oberseite, Unterseite und Trägerkörper, an dessen Oberseite vorbestimmte Reaktionsbereiche für die Synthese oder Fixierung von bestimmten Sonden-Oligonukleotiden ausgebildet sind, dadurch gekennzeichnet, – dass Reagenzbehälter zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe von Reagenzien auf der oder integriert in die Trägeroberseite angeordnet sind, – dass Probenbehälter zur Aufnahme, Bevorratung und Abgabe von Proben- bzw. Target-Nukleinsäuren auf der oder integriert in die Trägeroberseite angeordnet sind, – dass ein erstes Transportleitungssystem an der Trägeroberseite oder in dem Trägerkörper ausgebildet ist, welches die Reaktionsbereiche mit den Reagenzbehältern und den Probenbehältern verbindet und dazu geeignet ist, Reagenzien und/oder Nukleinsäureproben zwischen den Behältern und den Reaktionsbereichen zu befördern, – dass ein zweites Transportleitungssystem an der Trägeroberseite oder in dem Trägerkörper ausgebildet ist, welches Zu- und Ableitungen zu bzw. von den Reaktionsbereichen aufweist und für die Zu- und Abfuhr von Spülflüssigkeit geeignet ist, – dass wenigstens eine Steuerung vorgesehen ist, die derart mit den Reaktionsbereichen und/oder den Reagenzbehältern und/oder den Probenbehältern und/oder dem ersten und/oder dem zweiten Transportleitungssystem gekoppelt ist, dass eine gezielte Beförderung von Reagenzien und/oder Nukleinsäureproben und/oder Spülflüssigkeit zu den Reaktionsbereichen hin und/oder von diesen weg durchführbar ist – dass eine Energieversorgung vorgesehen ist, die zumindest die für die Synthese der Sonden-Oligonukleotide und die Analysereaktionen erforderliche Energie liefert.
Biochip nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Transportleitungssystem derart mit Ventilen und Pumpen ausgestattet ist, dass die Beförderung der Reagenzien und/oder Nukleinsäureproben zwischen den Behältern und den Reaktionsbereichen gezielt steuerbar und kontrollierbar ist.
Biochip nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ventile und/oder die Pumpen an den jeweiligen Anschlussstellen (Anschlüssen) zwischen Transportleistungssystem und Reaktionsbereich, Transportsystem und Probenbehälter sowie Transportsystem und Reagenzbehälter ausgebildet sind.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass jedem Reagenzbehälter, jedem Probenbehälter und jedem Reaktionsbereich eine separate Pumpe und/oder ein separates Ventil zugeordnet ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Gruppen von Reagenzbehältern und/oder Gruppen von Probenbehältern jeweils eine separate Pumpe zugeordnet ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, das die Pumpen als Mikromembranpumpen oder Piezopumpen realisiert sind.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Transportleitungssystem derart konfiguriert ist, dass jeweils diejenigen Leitungen, die einen bestimmten Reagenzbehälter oder eine bestimmte Gruppe von Reagenzbehältern mit allen Reaktionsbereichen verbinden, einen Systemteilabschnitt dieses ersten Transportleitungssystems darstellen, der in einer Ebene des Trägerkörpers angeordnet ist, und dass die verschiedenen Systemteilabschnitte der verschiedenen Reagenzbehälter in verschiedenen, vorzugsweise kongruenten Ebenen des Trägerkörpers angeordnet sind.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Kühl- und/oder Heizelemente an dem Träger ausgebildet sind, die in derart räumlichem Kontakt zu den Reagenzbehältern und/oder Probenbehältern und/oder Reaktionsbereichen und/oder erstem und/oder zweitem Transportleitungssystem stehen, dass sie zur Kühlung und/oder Beheizung der Reagenzbehälter und/oder Probenbehälter und/oder Reaktionsbereiche und/oder erstem und/oder zweitem Transportleitungssystem geeignet sind.
Biochip nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühl- und/oder Heizelemente Peltierelemente sind.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Transportleitungssystem wenigstens in einem Abschnitt meanderförmig oder ringförmig ausgebildet ist und derart mit den Kühl- und/oder Heizelementen in Kontakt steht, dass gekühlte und erwärmte Schleifen alternierend aufeinander folgen.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Transportleitungssystem derart mit Reagenzbehältern, Probenbehältern und Reaktionsbreichen verbunden ist, derart mit den Kühl- und/oder Heizelementen in Kontakt steht und derart mit der Steuerung gekoppelt ist, dass die für eine Vervielfältigung der Proben-Nukleinsäure mittels Polymerasekettenreaktion benötigten Reagenzien in dem Transportleitungssystem oder in dem Probenbehälter zusammenbringbar und mischbar sind und eine Polymerasekettenreaktion durchführbar ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Transportleitungssystem Ventile und/oder Pumpen aufweist, die insbesondere an den Anschlüssen zu den einzelnen Reaktionsbereichen angeordnet sind.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung an dem Träger ausgebildet bzw. im Träger integriert ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerung eine separate, externe, vom Träger bzw. Biochip unabhängige Konstruktionseinheit ist, und dass der Träger mit Schnittstellen für diese externe Steuereinheit ausgerüstet ist.
Biochip nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Schnittstellen für die externe Steuerung mit den Schnittstellen für die Energieversorgung der Steuerung bzw. für die Zuleitungen der Energiequelle identisch sind.
Biochip nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die externe Steuerung ein Personal Computer (PC) ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine separate zweite Steuerung zur gezielten Aktivierung des zweiten Transportleitungssystems mit dem Träger gekoppelt ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Energiequelle, die die für die Synthese der Sonden-Oligonukleotide und das Analyseverfahren notwendige Energie liefert, an dem Träger ausgebildet bzw. im Träger integriert ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Energiequelle, die die für die Synthese der Sonden-Oligonukleotide und das Analyseverfahren notwendige Energie liefert, eine separate, externe, vom Träger bzw. Biochip unabhängige Konstruktionseinheit ist.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass einige oder alle vorbestimmten Reaktionsbereiche als eine oder mehrere Vertiefungen) der Trägeroberseite realisiert sind.
Biochip nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Reagenz- und/oder Probenbehälter nach dem Befüllen versiegelt sind.