JP2004515231A - バイオチップを多重化するための装置および方法 - Google Patents

バイオチップを多重化するための装置および方法 Download PDF

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ハウ エイチ デュオン
ロバート ピエトリ
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Abstract

本発明は、同時に複数のバイオチップ分析を可能にする装置に向けられている。特に、当該装置は、核酸アレイのようなアレイを備えたバイオチップを具備してなる複数のカートリッジを保持し、サンプルの高スループット分析を可能にするように構成される。
【選択図】図1G

Description

【0001】
本願は、2000年11月3日に出願された米国特許出願第60/145,840号の優先日の利益を主張する。本願は、2001年7月11日に出願された米国特許出願第09/904,175号の継続出願であり、この親出願は、2000年1月11日に出願された米国特許出願第60/175,539号および2001年1月11日に出願されたPCT国際出願第US01/01150の優先日の利益を主張して、2001年1月11日に出願された米国特許出願第09/760,384号の継続出願である。
【0002】
[発明の分野]
本発明は、同時に複数のバイオチップ分析を可能にする装置に向けられている。特に、当該装置は、核酸アレイのようなアレイを含むバイオチップを具備した複数のカートリッジを保持するように構成され、高スループットでのサンプル分析を可能にする。
【0003】
[発明の背景]
液体および気体における特定の物質の存在および/または濃度を検出するための、多くのアッセイおよびセンサが存在する。これらの多くは、検出機構としての特定のリガンド/アンチリガンド反応に依存している。即ち、相互に結合するが他の物質に対しては殆どまたは全く結合しない、対をなす物質(結合対、またはリガンド/アンチリガンド)が知られている。このことは、これら結合対をその複合体の検出に利用する多くの技術の中心であった。一般に、これらは幾つかの方法、例えば放射性アイソトープ、蛍光分子および他の光学活性物質、酵素などを使用して複合体の一方の成分を標識し、複合体全体を検出可能にすることによって行われる。
【0004】
他のアッセイは、検出のための電気信号に依存する。特に興味があるのはバイオセンサである。少なくとも二つの種類のバイオセンサが知られている。即ち、酵素に基づくバイオセンサまたは代謝バイオセンサと、結合性またはバイオ親和性センサである。例えば、米国特許第4,713,347号、同第5,192,507号、同第4,920,047号、同第3,873,267号、およびそこに開示されている参照文献を参照されたい。これら公知のセンサの幾つかは交流電流(AC)技術を使用するが、これらの技術は、一般にバルク(または誘電性)インピーダンスの差の検出に制限される。
【0005】
現在、種々の核酸バイオセンサが知られている。これらには、蛍光検出に基づく核酸バイオチップが含まれる。例えば、アフィメトリックス社が開発したもの(米国特許第5,800,992号、同第5,445,934号、同第5,774,305号、並びに関連特許および資料)、ナノジェン社が開発したもの(米国特許第5,532,129号、同第5,605,662号、同第5,565,322号、同第5,632,957号、並びに関連特許および資料)、サザン(EP 0 373 023 B1)、およびシンテニ/インサイト社(WO 95/35505号、並びに関連特許および資料)を参照されたい。同様に、電極を使用した核酸の電気的検出が知られている;例えば、米国特許第5,591,578号、同第5,582,473号、同第5,705,348号、同第5,780,234号、同第5,770,369号、米国特許出願08/873,598号、同08/911,589号、WO 98/20162号、PCT/US98/12430号、PCT/US98/12082号、PCT/US99/10104号、PCT/US99/01705、およびPCT/US99/01703、並びに関連資料を参照されたい。
【0006】
しかし、これら方法は今まで、バイオチップの多重化を可能にする高度の並列システムに使用されたことはない。従って、本発明の目的は、バイオチップ、特に核酸バイオチップの多重分析のための装置および方法を提供することである。
【0007】
[発明の概要]
上記で概説した目的に従って、本発明は、核酸増幅チャンバのような一以上の反応チャンバを含むバイオチップカートリッジを提供する。該チャンバは、入口ポート、出口ポート、該チャンバに対する流体の流入および流出を制御する弁、およびポンプを含むように構成される。
更なる側面において、当該バイオチップカートリッジは、電極アレイを備えた検出チャンバを含む。
更なる側面において、当該バイオチップカートリッジは一以上のヒータを含んでいる。
【0008】
[図面の詳細な説明]
図1A〜1Jは、多くの異なる検出チャンバの実施例を示している。図1A〜1Fは、入口ポート100がチャンバの頂部に配置された検出チャンバーの幾何学的構成における幾つかの変形例を示している。対照的に、出口ポート101は幾つかの構成を取ることができる。例えば、図1Aでは、出口ポートがチャンバの頂部に配置されるが、外部に通気されていない。図1Bおよび図1Dでは、出口ポート101は頂部に配置され且つ外部に通気されている。図1Cでは、出口ポート101がチャンバの側部に配置されている。図1Fでは、出口ポート101は入口ポート100から外れている。図1Aから図1Eにおいて、電極アレイ103が反応チャンバ102内に配置されており、これはガスケット、その下のプリント回路基板の凹部から、またはハウジング104から形成されている。図1Aおよび図1Cにおいて、反応チャンバは傾斜した菱形の形状を有し、図1Bでは反応チャンバは菱形形状を有し、図1Dでは反応チャンバは円形形状を有し、図1Eでは反応チャンバは三角形状を有し、図1Fでは反応チャンバは矩形の形状を有している。図1Fは、参照電極106が入口チャンネルおよび/または出口チャンネルの中に配置された実施例を示している。これらの参照電極は、好ましくはAgClである。これらの参照電極は、カートリッジ内に配置する前にAgClでコーティングしてもよい。或いは、AgClのコーティングは、銀を酸化してAg+を形成するように、Ag電極に充分な強度の電圧を印加することによって、カートリッジ内にある参照電極にAgClのコーティングを適用してもよい。図1Gは、電極アレイ103を備えた反応チャンバ102と、PCRチャンバ115と、緩衝液チャンバ170と、空気ポンプチャンバまたは流体を移動させるための他の機構116と、流体の移動を制御するための一以上の弁171と、温度センサ172と、当該装置173に組込まれた加熱素子173と、混合素子174と、参照電極106と、入口100および出口101と、マイクロチャンネル110と、検出チャンバ113のための切下記を備えたシリコンガスケット104Bと、キャップ130とを具備したバイオチップ105を示している。図1Hは、電極バイオチップの頂面を示している。電極アレイ103は、各電極が配線リード109を介して、バイオチップ縁部のコンタクトパッドまたはインターコネクト108に接続されるように構成されている。これらの金属製コンタクトパッドは、標準のコンピュータエッジカードコネクタを使用して、電気的バイオチップ読取り器とバイオチップとの間のコンタクトを形成するように使用することができる。或いは、図1Iおよび図1Jに示すように、ボードを貫通して基板の反対側への電気的接続を形成することができる。該基板の反対側は、正面側に対して鏡像関係の配置に構成することができ、または別の形式の配置で構成することができる。図1Kは、ボードを貫通してポーゴピンコネクタ176と接触するコネクタを備えたバイオチップ105を示している。該コネクタは、従順なピン177のアレイ、回路基板ハウジング177、および潜在的には電気的マルチプレクサ178を有する。このピン格子コネクタは、最終的には、金属製フィンガー179を介して、エッジカードコネクタのような或る種のインターフェースを通して器具の中に差込まれる。ポーゴピンコネクタとチップとの間の良好な接続を保証するためには、ある種の留め具を使用するのが普通である。
【0009】
図2は、カートリッジを構成する種々の部品を示している。図2Aに示したカートリッジの実施例において、検出チャンバ102は、配線109を介してインターコネクト108に接続された電極アレイ103を含んでいる。このアレイは、以下で述べる何れかの数の材料で形成できる固体表面105に取り付けられる。加えて、他の部品の追加を可能にするように、見当合わせピン107をバイオチップに取り付けることができる。図2Bはゴムガスケット104を示しており、該ガスケットは検出チャンバ113のための切欠き、および当該ガスケットを図2Aに示したバイオチップに取付けるための見当合わせ孔112を備えている。図2Cはハウジング114を示しており、該ハウジングはプラスチック製で、見当合わせ孔112を介してバイオチップに取付けられる。当該カートリッジ114は、任意に、検出チャンバ103のための切欠き113A、および入口ポート100から検出チャンバ103に走る凹んだマイクロチャンネル110を含んでいる。
【0010】
図3Aおよび図3Bは、サンプルをロードする際にカートリッジを保持するために使用されるカートリッジホルダの二つの図、即ち、頂面図(図3A)および斜め正面図を示している。図3Aおよび図3Bに示すように、カートリッジホルダ129は、バイオチップ105を取付けた幾つかのカートリッジ114を保持することができる。また、「スナップインロック」によりオンおよびオフできるカートリッジキャップ130も示されている。
【0011】
図3Cおよび図3Dは、キャップを備えたカートリッジの異なる図を示している。図3Cにおいて、キャップ130は、カートリッジ114のスロット133の中にロックされるスナップインロック132を含むように構成されている。図3Cに示した実施例において、該キャップは、サンプル導入モジュール136のためのシール134を含むように構成されている。好ましくは、該シール134は、空気を通すが液体は通さないセルロース、または他の疎水性材料に囲まれたプラスチック製プラグを含んでいる。カートリッジ114は、サンプル導入モジュールおよびPCRチャンバを含むように構成されている。カートリッジ114は、反応チャンバ102、配線109を介してインターコネクト18に接続された電極アレイ103、マイクロチャンネル110、および出口ポート101を備えたバイオチップに取り付けられる。図3Dは、キャップ130、PCRチャンバ115を収容するように構成されたカートリッジ114、およびチップ105の側面を示している。
【0012】
図3Eは、幾つかのカートリッジアセンブリーの側面を、それらがカートリッジホルダの中に現れる状態で示している。キャップ130はカートリッジ114に取付けられており、該カートリッジは、サンプル導入モジュール136およびPCRチャンバ115を含むように構成されている。該カートリッジにはバイオチップ105が取付けられる。
【0013】
図4Aおよび図4Bは、多重化装置137の異なる図を示している。図4Aにおいて、多重化装置137の頂面および側面は、カートリッジ/ステーション対139および引出し138を図示している。図4Bにおいて、多重化装置137は、カートリッジを保持するためのステーション141および開いた引出し138と共に図示されている。
【0014】
図5は、カートリッジ内部の温度センサを用いてサンプル温度をモニターするように設計された、電気回路の概略図を示している。この設計バージョンは、銅トレースで構成された抵抗温度計を使用する。この回路は、カートリッジ温度を温度制御するためのフィードバックシステムにおいて使用することができる。
【0015】
図6は、温度制御論理回路を示している。このフィードバック機構は、比例積分微分(Proportional Integral Derivative:PID)アルゴリズムを用いる。
【0016】
図7は、多重化装置のレイアウトを図示している。この装置は、八つの独立したモジュールを有している。この特別の図において、各モジュールは六つのカードエッジコネクタ141、および信号処理用プリント回路基板140を有している。これらモジュールの直下には電源145が存在している。該電源に隣接して、バスバー150が存在している。図7は、カートリッジが挿入されるステーションを図示している。キャップ130を備えたカートリッジ114が、カートリッジエッジコネクタ141の中に挿入された状態で示されている。
【0017】
図8は、多重化装置を制御するために使用されるソフトウエアアプリケーションののブロック図である。
【0018】
図9A〜図9Fは、本発明において使用し得る種々の異なる弁を示している。図9Aは、マイクロチャンネル110内の鴨嘴弁144を示しており、これは一方向の液体の流れを制御するために使用できるが、他の方向の流れは制御できない。図9Bは、カンチレバー弁146を示している。この実施例においては、カンチレバー弁146を開閉するために、電極147を介して印加される電圧が用いられる。図9Cは、プランジャー型弁機構を示している。この実施例において、プランジャー弁148は形状記憶ワイヤ149の使用を介して開閉することができる。図9Dおよび図9Eは、回転弁を示している。図9Dに示した実施例では、回転弁151を回転させるために外力を加えなければならない。図9Eでは、回転弁151を回転させるために、形状記憶ワイヤ149が用いられる。図9Fは熱駆動弁を示しており、これは、ヒータ154と共に使用するための、流体または空気を充填できる可撓性膜152を備えたマイクロチャンネル110の一部を含んでいる。
【0019】
図9Gは、汎用ポンプ設計を示しており、ここでは空気および/または液体を流すことができるチャンバ156が、該チャンバー内への移動を制御するカンチレバー146のような弁を備えた入口ポート100、および該チャンバからの移動を制御する弁146Aを備えた出口ポート101に取付けられている。PZTのような外部装置181を使用して、該チャンバ156を圧縮することができる。或いは、ヒータ182を駆動させて、チャンバ156内の気体または液体の容積を膨張させることができる。
【0020】
図10Aは、バイオチップ105の側面図であり、ヒータがチップに組込まれた実施例を示している。図10Aにおいて、抵抗ヒータ157には銅の層158が重層されている。この銅の層にはプリント回路基板125が重層されており、これは半田マスク159で覆われている。
【0021】
図10Bは、バイオチップ105における温度ゾーンを形成する一つの手段を示している。図10Bに示した実施例において、数列の抵抗ヒータ157を含む連続的な温度ゾーン161,162,163には、蛇行したマイクロチャンネル164が重層されている。抵抗ヒータ161,162,163の間の最小分離距離を制御すること、並びに分離材料の熱的性質を変化させることによって、離間した温度ゾーンが維持される。図10Bに示された装置は、これら温度領域の間で流体を移動させて、PCRのような熱サイクルを必要とする生物学的反応を行うポンプ装置と共に使用することができる。
【0022】
図10Cは、図10Bに類似しているが、埋設されたヒータ166および対応するエッジコネクション108を備えたセラミック製のバイオチップを示している。これら温度ゾーン間の温度差は、周囲のセラミックよりも低い熱伝導率を有する空気ポケット切欠き部167を形成することによって維持される。
【0023】
図11は、バーコード143を読取るためのバーコード読取り器を142示している。
図12は、バーコード使用のシナリオを記載している。
図13は、本発明の装置と組合せたバーコード使用の利益を強調している。
【0024】
図14Aおよび図14Bは、カートリッジ114を取付けるための位置合わせ孔112を備えた、バイオチップ105の好ましい実施例を示している。図14Aには、バイオチップ105の頂部表面が描かれており、位置合わせ孔112、電極アレイ103およびインターコネクト108が示されている。図14Bには、図14Aに示したバイオチップ105を覆うカートリッジ114が示されている。図示の実施例において、カートリッジ114は、該カートリッジをバイオチップに取付けるための位置合わせピン107を含んでいる。好ましくは、これらの位置合わせピンはプラスチック製である。また、入口ポート100、出口ポート101、マイクロチャンネル110、PCRチャンバ115、反応チャンバ102、およびサンプル導入チャンバ136が示されている。キャップガスケット134は、サンプル導入チャンバ136内の挿入物として描かれている
【0025】
図15Aは、多重化装置137のステーション141に挿入されたカートリッジ114の中への、ピペットチップ144を用いたサンプルの注入を示している。
図15Bおよび図15Cは、カートリッジをバイオチップに取付けるための別の実施例を示している。図15Bにおいて、バイオチップ105は整列スロット118を有するように設計される。図15Cにおいて、カートリッジは、バイオチップの側面上の位置合わせ孔に嵌合される位置合わせピン107を有するように構成される。また、図15Cには、サンプル導入チャンバ136にサンプルを注入するためのピペットチップ144の使用が描かれている。
【0026】
図16は、正弦波およびその対応するベクトル表示を示している。
図17は、図16に示した正弦波のベクトル表示を用いた視覚的表現を示している。図17に示すように、二つの値はRおよびθであってもよいが、振動の1/4、即ち90°を隔てた(X,Y)対であってもよい。
図18は、四次高調波ACEボルタンメトリーについてのRおよびθの軌跡の例である。
【0027】
図19は、四次高調波ACEボルタンメトリーについてのRおよびθの軌跡の例である。
図20および図21は、バックグラウンドの大きさに対して信号が収縮するときに、R空間信号が歪むことを示している。
図22〜図25は、直交座表の使用が、ベクトルSおよびベクトルBに対するベクトルDのパラメータの依存性をどのように単純化するかを示している。この単純さは、先に示した同じ例を、図22および図23(中程度の大きさの信号)、並びに図24および図25(小さい信号)に描いたように、(X,Y)としてグラフ化するときに示される。
【0028】
図26は、バックグラウンドに対する大きな信号を有するAC電圧−4の軌跡を描いている。図26は、二次元グラフにおいて、電圧の関数としてのデータベクトルの先端をプロットするときに得られる(10 mV毎に一つの点がプロットされる)。
図27および図28は、X軸およびY軸が信号を跨ぐように参照フレームが選択されるときの結果を示している。この場合に、信号はXおよびYに強く寄与する。
【0029】
図29および図30は、信号に対して概ね平行および直交する一対の軸(図26に描いた軸に対して45°回転される)が選択されるときに観察される信号を示している。この場合、非常に少ない信号しか直交ベクトルに寄与しない。
【0030】
図31〜図35は、ベクトル加算法を示している。AC電圧4軌跡モデルに基づく信号認識について、何等かの減損の電気化学的信号を跨ぐように、新たな一つの軸を選択する必要がある。このような軸を選ぶために、信号の方向を測定する必要がある。このような一つの方法は、ベクトル加算法を使用することである。図31に示された三つの点のグループ化を考慮しよう。これらの点をベクトルとして考慮すれば、それらの座標を加算することにより、これらを加えることができる。このベクトル加算法は、(0,0)を通過するデータの全体に亘る最良の線のための合理的な角度を提供する。この角度は「最適位相」と呼ばれる。我々の例について、この加算法は図32に描かれている。図33は、三つのサンプルデータ点が当該線の回りに集中する仕方を示している。この方法の利点は、その結果が、元のデータ点のベクトル長さによって重み付けされることである。例えば、このサンプルグループに小さなデータ点を加えるとき、その結果は図34および図35に示される。
【0031】
図36〜図41は、ベクトル和を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算するときに、考慮しなければならない複雑さを図示している。例えば、電気化学的信号が、上記で述べた計算を完了するときにその位置が相互に相殺し合うように形成されるならば、データの最初の半分は180°回転されなければならない。図26に示したデータを取ることにより、我々は、図36に示すデータを使用して最適位相を計算する。得られた線は、図37において、元のデータの上に重なる。図36および図37に描いた線の角度(101°)は、このファイルについてX軸およびY軸を選択(±45°で)するために使用されたものである。しかし、この信号が、回転切片および非回転切片の間を分割する線に対して異なる向きであれば、上述の操作は適正な角度を生じない可能性がある。例えば、上記の信号を取り、それを時計方向に101°回転させれば、その最適位相は0°になるはずである。しかし、図38に示すように、計算された値は、実際には−48°以下で終わる。これを防止するために、信号に対して平行ではなく、より直交する回転境界が選択される。90°に近い信号の座標の絶対値のベクトル和を取ることにより、得られる角度は45°よりも大きくなるであろう。従って、上記の場合に、我々は45°未満の10°の角度(図39参照)を見出し、該信号はより0°に沿っていると結論する。従って、我々は90°の軸の遠い側から、信号の半分を回転させる(図40参照)。ベクトル和を計算することにより、今度は最適位相のための合理的な値:1°(予想された0°に類似)を生じる。この走査を二次元で調べると、全体の走査位相が殆ど120°に沿っていることが分かる(図41)。
【0032】
図42〜図46は、多項式を全体の走査(夫々は0および90°軸に沿う)に適合させるために必要な高速計算を実行するときに得られる結果を図示している。例えば、バックグラウンドは図42および図43に示すように近似される。このバックグラウンドに対する近似は差し引かれて、図44および図45に示すように、当該走査を遥かに純粋な信号である何かに変換する。図46は、これを二次元プロットとして描いており、これから略70°の最適位相を計算することができる。
【0033】
図47〜図52は、モデル化されない属性が如何にして検出されるかを図示している。合計の処理時間を減少させるために第一になすべきことは、走査が、それを無意味に適合するモデルからの何等かの著しい偏差を有するかどうかをチェックすることである。ACボルタンメトリーにおいて遭遇する一つのこのような特徴(四次高調波)は、金属汚染物のストリッピングにより生じた鋭いピークである。図47は、R空間に表示された一つの例を示している。XおよびY(最適位相から45°)において、この鋭いスパイクの特徴は、図48および図49に示すように明瞭に残る。この特徴の対称性によって、それは我々の正常な信号から識別される。この対称性をモニターする一つの方法は、近似バックグラウンドを分離して、ベースラインを超える点の分布を、ベースラインの下の分布と比較することである。例えば、Y軌跡から多項式を差し引けば、我々は図50および図51に示した結果を得る。今度は、近似バックグラウンドよりも上または下のデータの分布を調べると、図52に示すように、スパイクの存在は、バックグラウンドラインの上よりも該ラインの下の方に、より大きな範囲の値を生じさせる。
【0034】
図53〜図58は、反復適合法のための出発点として必要な、初期推定プロセスを図示している。信号位置および信号高さのパラメータを推定するために、既知のAC電圧−4の対称性を、特徴幅の知識と組合せて使用する。二つのより大きな中心ローブ間の平均分離が知られているから、信号およびシフトは二重に反復され、当該分離の半分についての反対方向の二つのコピーを生じる。一方を他方から差し引くことにより、中心ローブは増加的に干渉する。この得られた波の絶対値は、該信号の高さおよび位置の良好な推定を提供する。このプロセスは、中心ローブ分離が0.072で、位置0.20での高さが11.9の信号について、図53、図54および図55に示されている。図55における軌跡は、0.20の位置に、その最も大きい値23.25を有している。この位置は、真のデータ値と良く一致している(両者共に0.20)。図56では、同じ信号が考慮されるが、このときは一方の側に外れた異常なピークを伴っており、それは当該信号自身よりも僅かに高い。単純な最大/最小検索において、これは初期推定を妨害し易いであろう。しかし、この初期推定を使用すれば、図57に示すように、信号は位置0.20において11.6の高さのままである。図58は、真のデータ軌跡および対応する初期推定の重なりである
【0035】
図59〜図61は、挙動の良くないシステムのために、適合手順の際に境界条件を強制し得ることを描写している。これは、以下で述べる種々の方程式を使用することにより行うことができる。図59では、追加された項が2n = 16を有する時の形状が、2n = 2の場合の形状と比較される。2n = 16の場合、予想される7つの値は全て、僅かなペナルティーを用いるだけで等しく許容可能である。しかし、2n = 2の場合は過酷なペナルティーが増大し、aは予想値から更に移動する。更に鋭い拘束は、図60に示した形状をもたらす。図61に示すように、より複雑な形状を使用してもよい。
【0036】
図62は、適合とデータとの間の差が大き過ぎるために、適合が信頼できない結果を示している。
図63〜図65は、観察可能な信号を持たない走査を再適合する手順を使用して得られた結果を示している。
図66〜図67は、ここで述べた手順を使用して得られた結果を示している。図66はオリジナルデータを図示している。図67はバックグラウンドを差し引いたデータを図示している。
図68は、捕捉プローブを含んでなるSAMの表面密度に対する、種々のプラズマ処理の効果を図示している。
【0037】
図69は、種々のプラズマ処理後の金表面における汚染物のスペクトルを図示している。炭素および酸素の主要な汚染物ピークが金ピークと共に、酸素プラズマ処理のみについて、または酸素プラズマ後の水素プラズマ処理についてマークされている。
【0038】
図70A〜図70Fは、センサチャンバ内のハイブリダイゼーション速度に対する異なる混合技術の影響を図示している。図70Aは、ハイブリダイゼーション速度および増大した容積/z次元に対するチップ配向(即ち拡散ベースの速度)の影響を図示している。一つ(単一テープ)、二つ(二重テープ)、または三つ(三重テープ)のテープ層を用いてチャンバの厚さを増大することにより、増大した堆積が得られた。チップを、水平(H)または垂直(V)にしてインキュベートした。図70Bは、垂直(vdiff)または水平(hdiff)に配向されたチップを用いた拡散ベースの速度を、再循環ポンプを用いた混合(vpump)と比較している。図70Cは、拡散ベースの速度/水直配向(vdiff)を、矩形波励起(vpztsquare)またはサイン波励起(vpztsine)を用いたバブル支援PZT混合と比較している。図70Dは、拡散ベースの速度/水直配向(vdiff)を、温度勾配ベースの撹拌(TG)と比較している。図70Eは、拡散ベースの速度/水直配向を、バイオチャンネル/垂直配向における拡散ベースの速度、バイオチャンネル/水平配向における拡散ベースの速度、バイオチャンネル水平配向におけるバブル混合と比較している。図70Fは、音波ベースの混合(treat−H)を、垂直(ctrl−V)または水平(ctrl−H)のチップ配向を用いた拡散ベースの速度に対して図示している。
【0039】
図71は、信号処理アプローチの一例の概略ブロック図を示している。デジタル/アナログ変換器(DAC)は、信号源(例えば信号処理プリント回路基板上の信号発生回路、または接続されたパーソナルコンピュータから受信されたもの)からデジタル信号を受信し、該信号を、フィルターによって受信されるアナログ信号に変換する。フィルターの特性は、E−Chemセルの電極に印加される加工された信号に従って、低パス特性、高パス特性、または単一もしくは複数のバンドパス特性を与えるように改変してもよい。信号の複雑さを減少するために、この信号は望ましくはマルチプレクサ(MUX)を通して多重化され、E−Chemセルカートリッジ上の複数の補助電極に分配される。
【0040】
一組の参照電極もまた、E−Chemセルカートリッジ内に配置され、その出力は第二のマルチプレクサ(MUX)および参照増幅器(REF AMP)および抵抗器R13(110 KΩ)を通して、第一の補助増幅器の入力に戻し結合される。
最後に、一組の活性電極(この実施例では36の活性電極)が、プリント回路基板のトレースを介して、第三のマルチプレクサに結合される。この活性電極マルチプレクサの出力は、入力信号増幅器(INPUT AMP)によって増幅され、その後に更に任意の信号条件付け(フィルタリング、利得制御および/または選択)がバッファ増幅器(BUFFER AMP)を通して処理され、アナログからデジタル形態に変換されて(ADC)、それがデジタル形態で通信、処理、分析、保存等がなされ得るようになっている。
【0041】
図72は、温度制御ブロック図の実施例を図示している。マイクロプロセッサは、シリアル通信チャンネルまたはリンクを介して、外部信号源またはシンクと通信する。有利なことに、マイクロプロセッサは制御信号を発生して、オン、オフ、またはフラッシュ状態の指標をLED論理回路に与え、該回路はLEDドライバに結合して該ドライバに6スロットの夫々に信号を送信させ、これらスロットの夫々に、赤または緑の光をオン、オフ、またはフラッシュさせる。また、マイクロプロセッサはDACへの信号を発生する。この信号は増幅されて、ヒートシンクの温度を制御するヒートシンクブロワに電力を供給する。このヒートシンクにはヒートシンク温度センサが結合されており、該センサは温度信号を発生し、該信号はフィードバック様式でマイクロプロセッサにフィードバックされて、ヒートシンクブロワモータの動作または非動作を制御する。
【0042】
また、マイクロプロセッサは複数の信号を発生し、これらは複数のDAC、および各スロットのためのペルチェ温度ブロックへのドライバ増幅器に受信される。また、各ペルチェ温度ブロックには温度センサが結合されていて、検知した温度指標をマイクロプロセッサに戻して、ペルチェ温度ブロックドライブ信号をフィードバック様式で制御する。
【0043】
図73は、信号処理プリント回路基板のレイアウトの一例を図示している。各基板は、通信バス、マザーボード、または当該技術において既知の他のインターコネクトと結合するためのエッジコネクタを含んでいる。この特定の実施例における各ボードは更に、パッドセレクタ回路、メモリー、CPU/ロックイン増幅器、バッファー、シリアル通信回路、波形信号発生器、アナログ/デジタル変換器(ADC)、フィルタもしくはフィルタ回路、マスター利得回路、電流/電圧変換器、電力調節器、およびチップセレクタ(ref/mux)を含んでいる。
【0044】
[詳細な説明]
本発明は、サンプル中における標的アナライトを高スループットで分析および検出することを可能にするために、夫々が核酸またはタンパク質のような生物学的成分のアレイを含む複数のバイオチップを収容し、且つ分析するように設計された装置に向けられている。従って、例えば多くのサンプル(特に患者のサンプル)を同時に分析でき、または一つのサンプルに対して複数のアッセイを実施できる。当該装置は、バイオチップを収容するように構成された多くのカートリッジステーションを具備しており、異なる種類のバイオチップは異なる種類の成分の分析を可能にする。これらのステーションは、温度コントローラ、信号伝達システム、漏れ検出のためのセンサ、英数字ディスプレーおよび検出器を含む、広範な異なる部品を含むことができる。好ましい実施例は、電気化学的検出に依拠した電極を含むバイオチップの使用を含み、従って、当該装置および/またはステーションは、装置ボードおよびプロセッサを含むことができる。
【0045】
当該バイオチップカートリッジは、生体分子のアレイを備えた基板を含み、種々の方法で構成することができる。例えば、当該チップは、試薬を導入および除去するための入口ポートおよび出口ポートを備えた反応チャンバを含むことができる。加えて、該カートリッジは、サンプルを導入でき、試薬を添加でき、反応を行うことができ、次いで検出用アレイを含む反応チャンバにサンプルを加えることができるように、マイクロ流体部品を有するキャップまたは蓋を含むことができる。
【0046】
従って、本発明は、サンプル中における標的アナライトの存在または不存在を検出するための、組成物および方法を提供する。当業者が理解するように、サンプル溶液には多くのものが含まれる可能性があり、これには体液(実質的に全ての生物、好ましくは哺乳類、特に好ましくはヒトサンプルの血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門および膣分泌液、発汗および精液を含むが、これらに限定されない);環境サンプル(空気、農業的水および土壌サンプルを含むが、これらに限定されない);生物戦物質(biological warfare agent)サンプル;研究サンプル(即ち、核酸の場合、PCT/US99/01705に一般に記載されているように、該サンプルは標的増幅および信号増幅の両者を含む、PCR増幅反応のような増幅反応の生成物であってよい);精製ゲノムDNA、RNA、タンパク質などのような精製サンプル;原料サンプル(バクテリア、ウイルス、ゲノムDNA等)が含まれ;当業者によって理解されるように、サンプルに対して実際に如何なる実験操作が行われていてもよい。
【0047】
当該方法は、標的アナライトの検出に向けられている。ここでの「標的アナライト」もしくは「アナライト」またはその文法的均等語は、検出すべき何れかの分子または化合物、および以下に定義する結合種に結合することができる何れかの分子または化合物を意味する。適切なアナライトには、環境的もしくは臨床的化学物質、汚染物質または生体分子のような小化学分子(農薬、殺虫剤、毒素、治療剤、乱用薬物、ホルモン、抗生物質、抗体、有機材料などが含まれるが、これらに限定されない)が含まれるが、これらに限定されない。適切な生体分子には、タンパク質(酵素、免疫グロブリン、および糖タンパク質を含む)、核酸、脂質、レクチン、炭水化物、ホルモン、全細胞(病原性バクテリアのような原核細胞、および哺乳類腫瘍細胞を含む真核細胞を含む)、ウイルス、胞子などが含まれるが、これらに限定されない。特に好ましいアナライトは、酵素を含むタンパク質;薬物;細胞;抗体;抗原;細胞膜抗原および受容体(神経受容体、ホルモン受容体、栄養素受容体、および細胞表面受容体)またはそのリガンドである。
【0048】
好ましい実施例において、標的アナライトはタンパク質である。当業者が理解するように、本発明を使用して検出し得る極めて多くの可能なタンパク質標的アナライトが存在する。ここでの「タンパク質」またはその文法的均等物は、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチド、並びに誘導体および類縁体(天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸類縁体および擬ペプチド構造を含むタンパク質を含む)を意味する。側鎖は、(R)または(S)コンフィギュレーションの何れであってもよい。好ましい実施例において、アミノ酸は(S)またはL−コンフィギュレーションである。以下で述べるように、結合性リガンドとしてタンパク質を用いるときは、サンプル汚染物質による分解を遅延させるために、タンパク質類縁体を利用するのが望ましいかもしれない。
【0049】
適切なタンパク質標的アナライトには、(1)免疫グロブリン、特にIgE、IgG、およびIgM、特に治療的もしくは診断的に関連する抗体、例えば、ヒトアルブミン、アポリポタンパク質(アポリポタンパク質Eを含む)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチゾール、αフェトプロテイン、チロキシン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)に対する抗体、抗トロンビン、医薬[抗癲癇薬(フェニトイン、プリミドン、カルバリエゼピン(carbariezepin)、エトサクシミド、バルプロ酸、およびフェノバルビタールを含む)、心臓作用薬(ジゴキシン、リドカイン、プロカインアミド、およびジソピラミド)、気管支拡張剤(テオフィリン)、抗生物質(クロラムフェニコール、スルホンアミド)、抗鬱剤、免疫抑制剤、乱用薬物(アンフェタミン、メタンフェタミン、カンナビノイド、コカイン、および阿片)を含む]に対する抗体、および以下に概説する多くのウイルスまたはバクテリアに対する抗体を含むが、これらに限定されない。
【0050】
当業者が理解するように、本方法を使用して、非常に多くのアナライトを検出することができる;基本的には、以下で説明する結合性リガンドを作製できる如何なる標的アナライトも、本発明の方法を使用して検出することができる。
【0051】
好ましい実施例において、標的アナライトは核酸である。ここでの「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」の用語、またはその文法的均等語は、共有結合された少なくとも二つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は、一般にはリン酸ジエステル結合を含むが、幾つかの場合には、以下で概説するように別の骨格を有する核酸類縁体が含まれ、例えばホスホロアミダイト(Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10): 1925 (1993) and references therein; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81: 579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14: 3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Pauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 (1986))、ホスホロチオエート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19: 1437 (1991); and U. S. Patent No. 5,644,048)、ホスホロジチオエート(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 2321 (1989))、O−メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい)、およびペプチド核酸骨格および結合(see Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008 (1992); Nielsen, Nature, 365: 566 (1993); Carlsson et al., Nature 380: 207 (1996)、これら全てを本明細書の一部として援用する)が含まれる。他の類似核酸には、ロックされた核酸を含む二環構造(Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc. 120: 13252−3 (1998))、正の骨格(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097 (1995))、非イオン性骨格(米国特許第5,386,023号、同第5,637,684号、 同第5,602,240号、同第5,216,141号および同第4,469,863号; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30: 423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110: 4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, ”Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 (1994); Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996))、および非リボース骨格(米国特許第 5,235,033号および同第5,034,506号、並びにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, ”Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, Ed. Y. S. Sanghui and P. Dan Cookに記載されたものを含む)を有するものが含まれる。1以上の炭素環糖を含む核酸もまた、核酸の定義の中に含められる(Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp169−176を参照されたい)。幾つかの核酸類縁体が、Rawls, C & E News June 2,1997 page 35に記載されている。これら参照文献の全てを、本明細書の一部として本願に援用する。ETMの付加を容易にするため、または生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増大するために、リボースリン酸骨格の修飾を用いることができる。当業者が理解するように、これら全ての核酸類縁体を本発明において使用することができる。加えて、天然に存在する核酸および類縁体の混合物を作製してもよい;例えば、導電性オリゴマーもしくはETMの結合部位において、類似の構造を用いてもよい。或いは、異なる核酸類縁体の混合物、および天然に存在する核酸および類縁体の混合物を作製してもよい。
【0052】
特に好ましいのは、ペプチド核酸類縁体を含むペプチド核酸(PNA)である。これらの骨格は、天然に存在する核酸の帯電したリン酸ジエステル骨格とは対照的に、中性条件の下で実質的に非イオン性である。これは二つの利点をもたらす。第一に、PNA骨格は、改善されたハイブリダイゼーション反応速度を示す。PNA類は、ミスマッチ塩基対と完全にマッチした塩基対の融点(Tm)に大きな変化を有する。DNAおよびRNAは、内部ミスマッチのTmにおいて、典型的には2〜4℃の降下を示す。非イオン性のPNA骨格では、この降下は7〜9℃に近づく。同様に、それらの非イオン的性質により、これら骨格に結合した塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に対して比較的強い。
【0053】
これらの核酸は、特定するように一本鎖または二本鎖であってよく、または二本鎖配列または一本鎖配列の両方の部分を含んでいてもよい。該核酸はDNA(ゲノムDNAおよびcDNAの両方)、RNAまたはハイブリッドであってよく、ここでの核酸はデオキシリボ核酸およびリボ核酸の何れかの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の何れかの組合せを含む。好ましい実施例では、標的配列中にではなく、他のプローブに対して相補的に設計された核酸中にイソシトシンおよびイソグアニンを利用する。米国特許第5,681,702号に最初に記載されたように、これによって非特異的ハイブリダイゼーションが減少するからである。ここで用いる「ヌクレオシド」の用語には、ヌクレオチド、並びにヌクレオシド、ヌクレオチド類縁体、およびアミノ修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシドが含まれる。加えて、「ヌクレオシド」には天然に存在しない類似構造も含まれる。従って、例えば夫々が塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、ここではヌクレオシドと称される。
【0054】
従って、好ましい実施例では、標的アナライトは標的配列である。ここでの「標的配列」もしくは「標的核酸」またはその文法的均等語は、一本鎖の核酸上での核酸配列を意味する。標的配列は、遺伝子の一部、調節配列、ゲノムDNA、cDNA、mRNAおよびrRNAを含むRNA等であってよい。ここで概説するように、標的配列はサンプル由来の標的配列であってもよく、または増幅反応の生成物のような二次的標的であってもよい。それは如何なる長さであってもよく、配列が長いほど、より特異的であり得ると理解される。当業者が理解するように、相補的な標的配列は多くの形態を取り得る。例えば、それは大きな核酸配列、即ち、ゲノムもしくはmRNAの全部または一部の中に含まれていてもよく、就中、プラスミドもしくはゲノムDNAの制限酵素断片の中に含まれてもよい。以下で更に充分に概説するように、プローブは、サンプル中の標的配列の存在または不存在を決定するために、標的配列にハイブリダイズするように作製される。一般的に言って、この用語は当業者によって理解されるであろう。標的配列はまた、異なる標的ドメインを含んでいてもよい。例えば、サンプル標的配列の第一の標的ドメインは、捕捉プローブまたは捕捉延長プローブの一部にハイブリダイズしてもよく、第二の標的ドメインは増幅プローブ、ラベルプローブ、または異なる捕捉もしくは捕捉延長プローブなどの一部とハイブリダイズしてもよい。これら標的ドメインは、指示したように、隣接していても分離されていてもよい。特定しない限り、「第一の」および「第二の」の用語は、標的配列の5’−3’の向きに対する配列の向きを与えることを意味しない。例えば、相補的標的配列の5’−3’向きを仮定すると、第一の標的ドメインは、第二のドメインに対して5’側または第二のドメインに対して3’側の何れに位置してもよい。
【0055】
適切な配列アナライトは、(1)ウイルス類:オルソミクソウイルス(例えばインフルエンザウイルス)、パラミクソウイルス(例えば、呼吸器合胞体ウイルス、耳下腺炎ウィルス、麻疹ウィルス)、アデノウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、レオウイルス、トガウイルス(例えば風疹ウィルス)、パルボウイルス、ポックスウイルス(例えば馬痘ウィルス、牛痘ウィルス)、腸内ウイルス(例えばポリオウイルス、コクサッキーウイルス)、肝炎ウイルス(A型、B型およびC型を含む)、疱疹ウイルス(例えば単純疱疹ウィルス、水痘ゾスターウィルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス)、ロタウイルス、ノーウォーク・ウィルス、ハンタウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス(例えば狂犬病ウィルス)、レトロウイルス(HIV、HTLV−IおよびIIを含む)、パポバウイルス(例えば乳頭腫ウィルス)、ポリオーマウイルスおよびピコルナウイルスを含むが、これらに限定されない;および(2)バクテリア類:以下の病原性および非病原性の広範な興味ある原核細菌が含まれるが、これらに限定されない;バチルス菌;ビブリオ菌(例えば、コレラ菌);エシェリキア菌(例えば、エンテロトキシン産生大腸菌);赤痢菌(例えば、S. dysenteriae);サルモネラ菌(例えば、S. typhi);マイコバクテリウム菌(例えば、M. tuberculosis、M. leprae);クロストリジウム菌(例えば、C. botulinum、C. tetani、C. difficile、C. perfringens);コリネバクテリウム菌(例えば、C. diphtheriae);連鎖球菌(S. pyogenes、S. pneumoniae);ブドウ球菌(例えば、S. aureus);ヘモフィルス菌(例えば、H. influenzae);ナイセリア菌(例えば、N. meningitidis、N. gonorrhoeae);エルジニア菌(例えば、G. IambliaY. Pestis);シュードモナス菌(例えば、P. aeruginosa、P. putida);クラミジア菌(例えば、C. trachomatis);ボルデテラ菌(例えば、B. pertussis );トレポネーマ菌(例えば、T. palladium)等。
【0056】
他の適切な標的アナライトには次のものが含まれるが、これらに限定されない:(1)酵素(および他のタンパク質)、これには下記のものが含まれるが、これらに限定されない:心疾患のインディケータまたは治療剤として使用される酵素(クレアチニンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、トロポニンT、ミオグロビン、フィブリノーゲン、コレステロール、トリグリセリド、トロンビン、組織プラスミノーゲンアクチベータ(tPA)を含む);膵臓疾患のインディケータ(アミラーゼ、リパーゼ、キモトリプシンおよびトリプシンを含む);肝機能酵素およびタンパク質(コリンエステラーゼ、ビリルビン、およびアルカリホスファターゼを含む);アルドラーゼ、プロスタン酸ホスファターゼ、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、並びにHIVプロテアーゼのようなバクテリア酵素およびウイルス酵素;(2)ホルモンおよびサイトカイン(それらの多くは細胞受容体のリガンドとして働く)、例えば、エリスロポエチン(EPO)、スロンボポエチン(TPO)、インターロイキン(IL−1〜IL−17を含む)、インスリン、インスリン様成長因子(IGF−1およびIGF−2を含む)、上皮成長因子 (EGF)、トランスフォーミング成長因子 (TGF−αおよびTGF−βを含む)、ヒト成長ホルモン、トランスフェリン、上皮成長因子(EGF)、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク質、レプチン、VEGF、PDGF、繊毛神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor)、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、カルシトニン、 ヒト絨毛性ゴナドトロピン、コルチソル(cotrisol)、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、黄体形成ホルモン(LH)、プロゲステロン、およびテストステロン;(3)他のタンパク質(αフェトプロテイン、癌胎児性抗原(CEA)、癌マーカー等を含む)。
【0057】
適切な標的アナライトには糖質が含まれ、これには各種の癌マーカー、例えば乳癌(CA15−3、CA 549、CA 27.29)、ムチン様癌関連抗原(MCA)、卵巣癌(CA125)、膵臓癌(DE−PAN−2)、前立腺癌(PSA)、CEA、並びに結腸直腸癌および膵臓癌(CA 19、CA 50、CA242)のためのマーカーが含まれるが、これらに限定されない。
【0058】
他の適切な標的アナライトには金属イオン、特に重金属および/または毒性金属が含まれ、これにはアルミニウム、砒素、カドミウム、セレン、コバルト、銅、クロム、鉛、銀およびニッケルが含まれるが、これらに限定されない。
【0059】
好ましい実施例において、本発明の方法は、バクテリアのような病原体を検出するために使用される。この実施例における好ましい標的配列には、全て本明細書の一部として明示的に援用される米国特許第4,851,330号、同第5,288,611号、同第5,723,597号、同第6,641,632号、同第5,738,987号、同第5,830,654号、同第5,763,163号、同第5,738,989号、同第5,738,988号、同第5,723,597号、同第5,714,324号、同第5,582,975号、同第5,747,252号、同第5,567,587号、同第5,558,990号、同第5,622,827号、同第5,514,551号、同第5,501,951号、同第5,656,427号、同第5.352.579号、同第5,683,870号、同第5,374,718号、同第5,292,874号、同第5,780,219号、同第5,030,557号、および同第5,541,308号に一般的に記載されているように、rRNAが含まれる。
【0060】
当業者が理解するように、本発明の方法を使用して、膨大な数のアナライトを検出することができる。基本的には、以下で述べるように、如何なる標的アナライトも本発明の方法を使用して検出することができる。以下で説明する技術の多くは標的アナライトとして核酸を例示するが、当業者は、他の標的アナライトも同じシステムを使用して検出できることを理解するであろう。
【0061】
必要であれば、標的アナライトは既知の技術を使用して調製される。例えば、当業者が理解するように、既知の溶菌バッファー、エレクトロポレーション等を使用することにより、サンプルを処理して細胞を溶解し、必要に応じて精製および/または増幅する。標的アナライトが核酸であるとき、標的配列は必要に応じて増幅してもよい。適切な増幅技術は、本明細書の一部として明示的に援用するPCT US99/01705に概説されている。加えて、ハイブリダイゼーションの量または速度を増大させる技術を使用することができる;例えば、WO 99/67425および米国特許出願09/440,371号および同60/171,981号を参照されたい(これらは全て本明細書の一部として援用する)。
【0062】
標的アナライトを含むサンプルは、以下で更に詳細に概説するように、バイオチップを備えたカートリッジに添加することができる。ここでの「カートリッジ」は、バイオチップのケーシングまたはハウジングを意味する。ここで概説し、また当業者が理解するように、該カートリッジは多くの構成を取ることができ、且つ種々の材料で作製することができる。適切な材料には、ガラス繊維、テフロンTM、セラミックス、ガラス、シリコン、雲母、プラスチック(アクリル類、ポリスチレン、スチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロンTM、並びにこれらの誘導体等を含む)が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましいカートリッジ材料は、プラスチック(ポリカーボネートおよびポリプロピレンを含む)およびガラスである。
【0063】
当業者が理解するように、該カートリッジは多くの部品を具備することができ、これには反応チャンバ、入口ポート、出口ポート、熱電気部品を含む加熱素子、RFアンテナ、電磁気部品、メモリーチップ、ガスケットのようなシール部品、電子部品(インターコネクト、マルチプレクサ、プロセッサを含む)等が含まれる。
【0064】
好ましい実施例において、該カートリッジは反応チャンバを具備する。一般に、反応チャンバは、サンプルをバイオチップアレイに接触させるための空間または容積を含んでいる。該反応チャンバの容積は、アレイの大きさおよび実施されるアッセイに応じて変化することができる。一般に、反応チャンバは約1 nL〜約1 mLの範囲であり、約1〜約250μLが好ましく、約10〜約100 μLが特に好ましい。幾つかの実施例では、反応チャンバへの空気泡の導入(これは検出にとって破壊的である)を回避するために、反応チャンバは、導入されるサンプルサイズよりも小さくして僅かなオーバーフローを可能にすることにより、反応チャンバが空気を僅かしか含まず、または全く含まないことを保証する。
【0065】
好ましい実施例において、バイオチップカートリッジは、サンプルの調製、細胞溶解、稀少標的の捕捉/濃縮、サンプル洗浄、PCRを含む核酸増幅、増幅後洗浄、サンプル濃縮、試薬保存、バッファー/装置の撹拌のような、多くの種々の反応のために使用できる追加のチャンバを含むように構成することができる。他の実施例において、該反応チャンバは、以下で一般的に述べるように他の種類の反応のために構成してもよい。
【0066】
好ましい実施例において、バイオチップカートリッジの反応チャンバは、少なくとも一つの核酸増幅チャンバを含むように構成される。しかし、複数の増幅チャンバを用いてもよい。即ち、該カートリッジは約1〜約10以上の反応チャンバを備えることができ、2、3、4、5、6、7、8 または9 個の反応チャンバが好ましい。
【0067】
好ましい実施例において、該カートリッジのチャンバは生体適合性材料で製造すべきである。特に、生体分子の非特異的結合を遅延させる表面、例えば「非粘着性」表面を提供する材料が好ましい。例えば、反応チャンバがPCRまたは増幅反応のために使用されるとき、「非粘着性」表面は、反応混合物中の酵素成分が表面に付着して、当該反応に利用できなくなるのを防止する。加えて、チャンバの生体適合性は、表面積を最小化することによって改善することができる。
【0068】
生体適合性材料には、プラスチック(アクリル類、ポリスチレン、ポリスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロンTM、およびこれらの誘導体等を含む)が含まれるが、これに限定されない。他の構成には、プラスチックとプリント回路基板(以下で定義するPCB)との組合せが含まれる。例えば、チャンバの少なくとも一つの面はプリント回路基板である一方、チャンバの他の面の一以上はプラスチック製である。好ましい実施例において、チャンバの三つの面はプラスチック製であり、一つの面はプリント回路基板で作製される。加えて、ここで説明するシステムのチャンバ、チャンネル、弁、ポンプ等は、非特異的結合を低減する種々の材料でコーティングしてもよい。これには、カゼインおよびアルブミン(ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン等)のようなタンパク質、パリレン、他のポリマーなどが含まれる。
【0069】
該カートリッジの反応チャンバは、分析すべきサンプルを導入するための入口ポートを備えている。実行される反応に応じて、種々の貯蔵チャンバまたはチャンバの外部から給液される複数の入口ポートを使用してもよい。この入口ポートは、任意に、サンプルまたは試薬が反応チャンバから蒸発するのを防止または低減するためのシールを備えていてもよい。好ましい実施例(図3Cおよび図14B)において、該シールはガスケット、またはそれを通してピペットもしくはシリンジを押すことができる弁である。該ガスケットまたは弁は、ゴムもしくはシリコーン、または他の適切な材料(例えばセルロースを含有する材料)であることができる。
【0070】
反応チャンバは、種々の方法で構成することができる。好ましい実施例において、反応チャンバは、空気泡または他のサンプル不純物の導入を最小化するように構成される。従って、例えば図1に示すように、該カートリッジが垂直の角度で保持されると仮定すれば、入口ポートは反応チャンバの「底」への液体サンプルの流入を可能にし、反応チャンバの「頂部」、例えば出口ポートを通して、空気または液体の流出を可能にする。こうして、液体サンプルは反応チャンバの中を上方に流れて、アレイと接触する。従って、好ましい実施例では、反応チャンバは更に、過剰なサンプルが反応チャンバを出ることを可能にする出口ポートを具備している。幾つかの実施例において、この出口ポートは以下で更に説明する排液貯蔵ウエル、またはチップもしくはカートリッジの外部表面に連通しており、或いは、好ましい実施例では入口ポートに戻される。従って、例えば好ましい実施例では、出口ポートが、好ましくは充填位置の上の入口ポートと繋がるシステムが利用される。例えば、ピペットを用いてカートリッジに充填するときは、出口ポートから空気が反応チャンバの中に導入されないように、ピペットの先端が出口ポートの下に伸びる。加えて、カートリッジハウジングおよびバイオチップの材料は、空気泡の形成を回避するために、疎水性または親水性の点で同じになるように選択される。
【0071】
加えて、好ましい実施例において、反応チャンバおよび/または出口ポートは、任意に弁の使用を含んでいる。例えば、ガスを選択的に逃散させ且つサンプル液をチャンバ内に保持する半透膜、またはフィルタを使用してもよい。例えば、ゴルテックス (Gortex TM)のような多孔性テフロンTMは、液体は透過させないが空気を透過させる。
【0072】
好ましい実施例では、バイオチップカートリッジにおける反応チャンバ(例えばPCRチャンバ)は、該チャンバの中への液体の流れおよび該チャンバからの液体の流れを制御する一以上の弁を有している。該カートリッジにおける弁の数は、チャンネルおよびチャンバの数に依存する。或いは、該バイオチップカートリッジは、サンプルが充填された後に閉鎖またはシールできる、一以上の充填ポートまたは弁を含むように設計される。また、一つのチャンバーの中への複数の充填ポートを有することも可能である。例えば、第一のポートはサンプルを充填するために使用され、第二のポートは試薬を添加するために使用される。これらの実施例において、バイオチップカートリッジは通気孔を有していてもよい。この通気孔は種々の方法で構成できる。図1A〜図1Gに一般的に描かれた幾つかの実施例において、該通気孔は、反応チャンバの外に導通し且つ任意に弁を備えた別のポートであることができる。或いは、該通気孔は、図1Fに一般的に示したように、液体および/または空気を入り口ポートに連通させて戻すループ構造であってもよい。
【0073】
当業者が理解するように、種々の異なる弁を使用することができる。弁は、多重サイクルまたは単一サイクルの弁であることができる。「多重サイクル」弁は、該弁が2回以上開閉できることを意味する。ここでの「単一サイクル弁」、「バースト弁」または「1回弁」は、閉じた後に開き、または開いた後に閉じるが、該弁をその元の位置に戻す機構を欠いている弁を意味する。弁はまた、一方向だけの流体の流れを可能にするチェック弁、または二方向弁であってもよい。
【0074】
好ましい実施例において、チェック弁は、反応の際に液体が反応チャンバの中に流入し、および反応チャンバから流出するのを防止するように使用される。一般に、チェック弁は、液体および/または空気の一方向への流れを有するのが望ましく、他の方向への流れを有するのが望ましくないときに使用される。例えば、チャンバが充填されて圧縮されると、空気および液体は流出する。逆に、チャンバを空にするためにも同様に弁を使用できる。使用できるチェック弁のタイプには、鴨嘴弁(Vernay、www. vernav. Com)、カンチレバー、バブル弁等が含まれるが、これらに限定されない。
【0075】
好ましい実施例において、該弁は、図9Aに一般的に示した鴨嘴弁である。これらの弁は、液体を一方向に流すことができるが他の方向には流すことができない点において、「一方向」弁である。
【0076】
好ましい実施例において、当該弁はカンチレバー弁である。当業者が理解するように、当該技術において知られている異なるタイプの種々のカンチレバー弁が存在する。カンチレバー弁はまた、以下で述べるポンプシステムで使用するように構成することができる。好ましい実施例において、金属製のカンチレバー弁が使用される。この実施例では、電圧の印加によって弁を開き、または閉じることができる。図9Bを参照されたい。
【0077】
好ましい実施例では、前記カンチレバー弁を開閉するためのヒートポンプが組込まれる。この実施例では、熱が加えられるときにチェック弁がカンチレバーとして機能するように、該チェック弁は金および銅のような金属で作製される。他の実施例では、弁を引き下げるための駆動力は使用しないで、むしろ、それらが他の方向に行くのを防止する拘束力を有する。
【0078】
同様に、マイクロチャンネルの一部に空気または液体を満たした可撓性の膜を具備してなる熱駆動弁を、ヒータと共に使用することができる。熱を加えることにより、該液体が膨張してチャンネルをブロックする。図9F参照。
【0079】
他の実施例では、圧電素子(PZT)ミキサーが弁として使用される。これらはシリコン(Frauhofferから入手)、プラスチック(IMMから入手)、またはPCBで構成することができる。
【0080】
チェック弁と組合せて使用できる他の材料には、入口ポートおよび出口ポートを塞ぐするように使用できる材料が含まれる。このような材料には、ワックスまたは他のポリマー材料、例えばプルロニクス(BASF; Pluronic F−127、Sigma)またはシンペロニック(Synperonic;ICI)として商業的に知られた、ポリ (エチレンオキサイド)−ポリ(プロピレンオキサイド)−ポリ(エチレンオキサイド)トリブロック共重合体(PEO−PPO−PEO)が含まれ、これは膜またはプラグとしての使用のために溶融する。 これらの材料は、所定の温度で固体から液体へと変化する共通の特徴を有している。これらのタイプのシステムは、以下で述べるようにヒータと共に使用される。例えば、熱を加えて該材料を溶融させ、当該弁を「開く」。
【0081】
好ましい実施例において、バースト弁は、金属またはポリマーのフィルムである。好ましい実施例では自立性の金フィルムが使用され、これは支持体表面をエッチング除去することにより、以下で概説する標準の技術を使用して製造される。この金膜は、電圧およびClイオンを加えると溶解する。例えば、www. mchips. com: Santini, J. T., et al., 1999, Nature, 397: 335−338を参照されたい。この両者については、その全体を本明細書の一部として援用する。好ましい実施例では、チェック弁とワックスプラグの組合せが使用される。他の実施例では、チェック弁と金膜の組合せが使用される。
【0082】
弁を作製する他の手段には、機械的手段が含まれる。これらは屡々、二方向弁であることができる。例えば、形状記憶ワイヤを、チャンネルを塞ぐプランジャーに結合することができる。該ワイヤに電流を印加することにより、該ワイヤは収縮して、プランジャーを道から外に移動させることにより、チャンネルを開く。逆に、プランジャーをチャンネルの中に引張って、チャンネルを塞ぐことができる。図9Cを参照されたい。
【0083】
他の機械的弁には、ロータリー弁が含まれる。ロータリー弁は、図9Dおよび図9Eに示すような種々の方法で構成することができる。一つの実施例では、回転のために外力を加えなければならない(即ち、ネジドライバまたはステップモータ)。或いは、熱または電気の印加がワイヤを収縮させて弁を回転させるように、形状記憶ワイヤを使用することができる。図9Eを参照されたい。
【0084】
加えて、商業的に入手可能な弁を使用して、本発明の種々のチャンバへの液体の流れ、および該チャンバからの液体の流れを制御してもよい。商業的に入手可能な弁の例には、MEMS (micro−electro−mechanical systems)ミクロ弁(http ://www. redwoodmicro. Com)、 TiNi液体ミクロ弁(TiNi Alloy Company, San Leandro, CA)、TiNi 空気ミクロ弁(TiNi Alloy Company, San Leandro, CA)、シリコンミクロ弁(Bosch, D., et al., Sensors and Actuators A, 37−38 (1993) 684−692)が含まれる。また、商業的/慣用的な弁は、Measurement Specialities, Inc., IC Sensors Division, Militas, CA(http ://www. msiusa. com/icsensors);Plast−O−Matic Valves, Inc.(http ://www. plastomatic. com/);Barworth Inc. (http://www. barworthinc. com);Mobile Electronics Solution (http ://www. mobileelectronics. net/);Specrum Chromatograph (http ://www. lplc. Com)から入手可能であり、これらの全てを本明細書の一部として援用する。
【0085】
弁およびポンプを得るための他の供給源には、Chronos(http : l/www. memsrus. com);Institute for Microtechnology−Mainz (http ://www. imm−mainz. de/);Microsystems integration group−Swiss Fed. Inst. of technology (http://dmtwww. epfl. ch);University of Washington (hffD ://lettuce. me. washington. edu);The Berkeley Sensor and Actuator Center (BSAC)(http ://www. otl. berkeley. edu/mems. Html);University of Michigan, Microsystems R & D Laboratory (http ://www. eecs. umich. edu/MEMS/facilities. Html);Caltech, MEMS Research (http ://touch. caltech. edu/home/research/files/html/researchframe. Html) のような研究財団が含まれ、これらの全てを本明細書の一部として援用する。
【0086】
好ましい実施例では、カートリッジの一つの領域またはチャンバからもう一つの領域またはチャンバへと液体を移動させるために、「オンチップ」または「オフチップ」のポンプの何れかが使用される。ポンプの一般的な設計には、空気および/または液体が流れることができるチャンバ;入口ポートおよび出口ポート、並びに弁が含まれる。液体は、熱、圧力のような或る力を加えることにより、ポンプを通ってチャンバへと移動される。加えて、ポンプは一回使用のために、または再使用可能に設計することができる。一般に、再使用可能なポンプは、弁、即ち、一方向に流体の流れをバイアスするチェック弁を有している。単回使用のポンプは弁を有していない。従って、チャンバ内の容積を変化させ、また逆流を制限するための機構が含まれる限り、殆ど如何なるのタイプのポンプも構成することができる。例えば、PZTまたは他の圧力を介してチャンバが収縮されると、液体またはガスはチェック弁を通して該チャンバから排出される。この収縮力を除去すると、該チャンバは膨張し、ポンプ入口を通して液体を吸引する。或いは、チャンバの内側にヒータを配置することができ、またガスまたは液体の温度を上昇させて、それを膨張させることができる。膨張すると、この液体は出口を通ってチャンバから強制的に排出される。液体を冷却すると、該液体は入口を通して引き込まれる。図9Gを参照されたい。
【0087】
バイオチップカートリッジ内で液体を移動させることができる二つの主な手段がある。これらは、(1)該液体を中および外へと押すポンプを使用するもの、または(2)液体をチャンバの中または外へ引く吸引によるものである。
【0088】
一般に、吸引を行うために移動するピストンのような装置が用いられるが、ガスの冷却、真空チャンバ、およびガス消費反応を使用することもできる。吸引を使用して液体をチャンバの中または外へと移動させるときは、当該システムの何処かに真空を形成してもよい。
【0089】
好ましい実施例においては、「空気ポンプ」が、PCRチャンバから液体を移動させるために使用される。この実施例では、空気のチャンバが、「オンチップ」ヒータと共にチップの中に組込まれる。該ヒータをオンさせると、チャンバの中の空気は PV = nRTに従って膨張する。
【0090】
好ましくは、ヒータは(以下でも説明するように)チップの中央に組込まれる。幾つかの実施例では、複数の「ヒータ領域」を形成するように二以上のヒータがチップに組込まれる。これらのヒータ領域を覆って、空気チャンバまたはポケットが配置される。これらの空気チャンバは、反応チャンバの頂部まで走るチャンネルを介して、それを塞ぐ弁またはプラグを備えた反応チャンバに接続される。空気が加熱されると、該空気は膨張する。生じた圧力の形成により弁またはプラグが外されると、液体はチャンバから出口ポートを通って強制的に排出される。
【0091】
反応チャンバから液体を移動させる他の方法には、空気の代りに低沸点液体を使用することが含まれる。この実施例において、低沸点液体は加熱されると膨張し、反応チャンバの中に収容されている液体を駆逐する。或いは、化学反応を使用して、液体を反応チャンバから移動させてもよい。たとえば、自動車のエアバッグを膨張させるのに使用される化学反応、またはガスが発生する他の反応を使用して、反応チャンバから液体を移動させてもよい。
【0092】
使用できる他のタイプのポンプは、シリンジ駆動ポンプである。これらのポンプは、シリンジの背後の空気を膨張させることによって、または機械的手段によって駆動させることができる。例えば、TiNi合金、ニチノールワイヤ、または「形状記憶金属」を使用して、シリンジ駆動ポンプを機械的に駆動させることができる。ここでの「TiNi合金」、「ニチノールワイヤ」または「形状記憶金属」は、一定の転移温度を越えて加熱されるときに収縮し(即ち、通常は金属の元の長さに対して3〜5%以下)、それによって形状を変化させる金属を意味する。加熱すると形状を変化させる他の材料には、形状記憶プラスチックが含まれる。
【0093】
ポンプはまた、バネ付ピストンを使用して作製してもよい。この実施例では、解除可能なバネがカートリッジの本体内で圧縮または拘束される。例えばワックスを使用して、バネをその圧縮状態に保持してもよい。加熱するとワックスは溶融し、バネが解除され、それによってピストンを移動させ且つ液体を駆逐するのに充分な力を発生させる。他のバージョンには、所定の転移温度で固体から液体に変化する材料を組込むこと、または機械的な閉塞体をバネの通路から移動させることが含まれる。
【0094】
PZT駆動のアクチュエーションを利用するポンプも知られており、これを本発明に組込んでもよい。ここでの「PZT」は、電圧を印加すると結晶格子の再配置を受けて力および偏位を生じる、鉛、ジルコニウムおよびチタンを含んでなる材料を意味する。圧電効果と称されるこの効果は、ポンプチャンバを収縮および膨張させて、液体の正味の移動を生じさせるように使用することができる。金属の温度が一定の転移温度を越えて上昇するような電流を印加すると形状変化を受ける、形状記憶合金のような他の材料もまた使用することができる。
【0095】
加えて、商業的に入手可能なミクロポンプを使用して、カートリッジ内の一つの位置からもう一つの位置へと液体を移動させてもよい。商業的に入手可能なポンプの例には、IMM(liqanews imm. uni−mainz.de 参照)から入手可能なモールド成形プラスチックのミクロポンプ、薄膜形状記憶合金ミクロアクチュエータ(TiNi Alloy Company, San Leandro, CA)、シリコンミクロポンプ(M. Richter & J. Kruckow, aktorik/paper/2000 jahresbericht/Paper2, 16.11.00参照)が含まれる。
【0096】
加えて、チャンバの形状に基づき、空気を使用して液体を反応チャンバから押出し、または反応チャンバ内で液体を混合することができる。空気が液体または泡を圧送して混合効果を生じるかどうかは、泡の相対的サイズ、チャンバ/チャンネルの形状、および液体の表面張力によって決定される。空気/液体の界面が大きいほど、ポンピングに対して混合に有利な傾向がある。バイオチップカートリッジ内での液体の混合は、バイオチップカートリッジ内で液体を前方および後方にポンピングすることによって生じさせることができる。
【0097】
好ましい実施例において、混合は、ハイブリダイゼーションの速度を高めるために使用される。好ましい実施例において、混合は、カートリッジの背面に接着された圧電変換器を使用し、10Vp−pの5 Khz a.c.波形で励起して、音波の流れを誘起させることによって達成される。
【0098】
好ましい実施例において、混合は、チップを横切る熱勾配を形成することによって達成される。例えば、チップの底部を65℃に加熱し、且つカートリッジカバーの頂部を10℃に冷却することによって、温度勾配を生じさせてもよい。これは、二つのペルチェヒータの間にチップを配置することによって、または埋め込みヒータおよび一つのペルチェ素子もしくは他の熱電冷却装置を使用することによって達成できる。
【0099】
好ましい実施例において、混合は、オンチップのまたはチップに取り付けられた「オフチップ」のポンプを使用して、所定のチャンバ内で液体を再循環さセルことによって達成される。
【0100】
他の実施例においては、ハイブリダイゼーション速度を高めるために、バイオチャンネルに基づく混合を使用することができる。この実施例においては、泡がチップの一つの隅部に意図的に導入される。インチップまたはオフチップの熱源から熱を加えて泡の容積を交互に膨張および収縮させ、チップ内の泡の容積を変化させることによって形成される圧力流の結果として、混合が生じる。或いは、PZT装置を使用して、泡の共鳴誘導混合を行うこともできる。
【0101】
幾つかの実施例では、Covaris, Inc.によって記載されたような非接触型混合技術を使用して、混合を達成してもよい。
【0102】
好ましい実施例において、ヒータはチップ上またはチップの中に組込まれて、「オンチップ」の加熱を可能にする(加えて、以下で述べるように、装置内の「オフチップ」温度コントローラを使用してもよい)。この実施例において、反応チャンバは、該チャンバとヒータまたは温度コントローラとの間の熱伝導率を最大にするように設計される。一般に、熱質量を最小にし(即ち、熱源と接触するチャンバの面積をできるだけ小さくする)、チャンバからの液体の完全な除去を保証するための形状的制約を課し、良好な熱伝導体である材料(即ち金属)を組込み、またチャンバをチップの残りの部分から熱的に隔離する設計が好ましい。生物学的成分の非特異的結合のための表面積を減少させるために表面/容積比を最小にすることと、加熱および冷却のための迅速な熱移動速度を得るために表面積/容積比を最大にすることとの間で、トレードオフを生じることが多い。
【0103】
好ましい実施例においては、増幅チャンバをチップの残りの部分から熱的に隔離するために、空気ポケットまたは通気孔が用いられる。即ち、増幅チャンバの回りでは、カートリッジの連続性の破壊が存在する。
【0104】
好ましい実施例では、熱伝導性材料が反応チャンバの中または下に組み込まれ、ハイブリッドチャンバが形成される。例えば、異なる材料の「層」を使用することにより、効果的なヒータが構築される。従って、例えば好ましい実施例は、抵抗金属インクの形態の一以上の抵抗ヒータを利用し、これらはPC基板の第一の層に塗布できる。これらヒータには、インターコネクトによって電力が供給される。好ましい実施例では、均一な熱分布を可能にするために、熱伝導性材料、好ましくは銅のような金属の薄いシートが適用される。次いで、好ましい実施例では、銅層をプラスチックのような生体適合性材料の薄層でコートする。図10Aを参照されたい。
【0105】
ハイブリッドチャンバの全厚は、数μから数ミリメータの寸法まで変化し得る。好ましい厚さは略200ミクロンである。
【0106】
好ましい実施例では、複数の加熱ゾーンの形成を可能にするように、複数の熱ヒータが装置に組込まれる。夫々のゾーンにおける温度は、能動的または受動的制御によって維持される。設計に際しては、カートリッジ材料の熱的結合が考慮されることが多い。一つの実施例においては、検出チャンバの温度を維持すると共に、装置のもう一つの部分に独特な加熱ゾーンを構築するために、チップは、カートリッジの検出チャンバーの中に熱ヒータを含んでいてもよい。一つの実施例では、酵素反応の効率的な実行を可能にするために、これらの加熱ゾーンが維持される。もう一つの実施例では、PCR熱サイクルの際に通常使用される温度をシミュレートするために、複数の加熱ゾーンが維持される。必要な温度を実施するためには、液体を静止状態で維持して増幅チャンバの温度をサイクリングしてもよく(即ち、95−55−72)、或いは液体を異なる加熱ゾーンに亘ってポンピングして温度サイクリングを得ることもできる(図10B)。この実施例は、ガラス、プラスチック、セラミックおよびPCBのような異なる材料の基板において実現することができる。
【0107】
同様に、加熱を必要とする基板部分およびこれを必要としない基板部分が存在し得る。従って、二以上のヒータを基板に組込んでもよい。同様に、これらの加熱ゾーンは基板の他の部分から熱的に隔離されてもよく、隔離されなくてもよい。例えば、PC基板は熱的に著しく絶縁性であり、従って、ヒータおよび加熱ゾーンと、加熱を必要としない基板領域との間に距離をおくだけで充分である。他の実施例では、熱絶縁性の材料を組込んでもよい。例えば、基板がセラミック材料であるときは、図10Cに示すように、セラミックの各固体領域が「切欠き」により相互に分離されるように、セラミック基板の区画を切欠くことによって達成してもよい。
【0108】
他の実施例は、基板全体に亘る温度をモニターできるように、基板への温度センサの組込みを含んでいる。好ましい実施例において、温度センサは、シリコンダイオードを含む抵抗素子を使用して作製される。他の実施例は、キャピラリーサーモスタットおよびリミッタ(http ://www. thermodisc. com/BulbAndCapillary. Html)の使用を含んでいる。
【0109】
当業者が理解するように、この方法で使用できる種々の反応チャンバの形状が存在する。一般には、小さな孔を設け、反応チャンバを拡大して、カートリッジの「底」で入口ポートおよび反応チャンバを交差させるのが好ましい。加えて、反応チャンバの「頂部」は狭くてもよい。幾つかの実施例が図2に描かれている。こうして、反応チャンバの大きさおよび形状の好ましい実施例は、反応チャンバの円滑な充填を可能にする。好ましい実施例は、泡の形成点として働く鋭角の隅部または他の部品の使用を回避するような反応チャンバ形状を利用する。
【0110】
加えて、幾つかの実施例では、サンプルの混合を可能にするように、反応チャンバを構成することができる。例えば、サンプルおよび試薬が同時または別々にチャンバの中に導入されるときに、入口ポートおよび/または反応チャンバは、サンプルおよび試薬の撹拌を最大化する堰、チャンネルまたは他の部品を具備することができる。加えて、以下で概説するように、反応は、混合および/または分離のための磁気ビーズを利用してもよい。
【0111】
好ましい実施例において、カートリッジは、反応の際の圧力発生によりカートリッジが爆発するのを防止し、またはサンプルもしくは試薬が基板の他の部分(特に電気的検出の場合の電気的インターコネクト)に漏出するのを防止するために、シール機構および/または通気機構を具備する。当業者が理解するように、これは、種々の異なる形態を取ることができる。一つの実施例では、アレイを含むバイオチップ基板とカートリッジの間に、シート、管またはストリップを備えたガスケットが存在する。或いは、ゴムもしくはシリコーンのストリップまたは管を使用してもよい。例えば、ハウジングは、ガスケットを嵌合し、次いでハウジング、ガスケットおよびチップを一緒にクランプする窪みまたはチャンネルを備えていてもよい。更に、ガスケットをカートリッジに結合するために、接着剤を使用することができる。例えば、両面接着剤を使用できる。例えばシリコーン接着剤、アクリル系接着剤および組合せ接着剤を使用して、ガスケットをバイオチップに取り付け、次いで以下で述べるように、これをカートリッジにクランプすることができる。
【0112】
幾つかの実施例において、反応チャンバおよびバイオチップ基板は、別途シール機構が必要とされないように構成される。例えば、バイオチップ基板は、内側にアレイを備えた反応チャンバの「片側半分」として働くことができ、反応チャンバハウジングは他方の「片側半分」として働くことができる。使用する機構に応じて、これら二つの片側半分を結合するための任意の接着剤があってもよい。或いは、基板の両側にアレイが存在するときは、ハウジングが該基板を取囲んでもよい。
【0113】
カートリッジをシールするのに使用しえる任意の接着剤には、感圧接着剤、感熱接着剤等が含まれるが、これらに限定されない。カートリッジをシールする他の手段には、超音波融着、レーザ接合およびエポキシ接着剤が含まれる。
【0114】
好ましい実施例において、反応チャンバは全体がプラスチック製である。もう一つの実施例では、カートリッジの全部またはかなりの部分の下にPCBが存在する。該カートリッジはPCBに直接結合されてもよい。或いは、当該装置は、製造プロセスの際に、必要な機能の全てまたは大部分を当該装置の中に集積し、全体をPCB、セラミック、またはガラス材料で構成することができる。
【0115】
従って、これらの実施例において、反応チャンバの容積は、バイオチップ基板の追加でアレイの周囲に反応チャンバが形成されるように、カートリッジ内にウエルを形成することによって、または平坦なカートリッジを使用することによって、および定義された深さのガスケットまたは接着剤を使用することによって、またはこれら三つの組合せによって設定することができる。
【0116】
好ましい実施例において、カートリッジはキャップまたは蓋を具備している。キャップは、それがマイクロ流体工学部品を含むときには、以下で概説するように機能することができる。加えて、キャップは、生物学的材料の漏出または交差汚染を防止するように、安全目的のために設計すればよい。加えて、キャップは取外し可能に設計することができる。当業者が理解するように、キャップは広範な種々の構成を取ることができる。例えば、一つの実施例において、キャップは、アッセイの際にサンプルの蒸発を防止するように入口ポートをシールするだけである。好ましい実施例では、種々の異なるサンプル反応を可能にするように、このキャップは、サンプルの取扱いおよび試薬の保存に使用するための多くの追加の要素を含むことができる。例えば、サンプルに対して多くの操作を行って、最終的には標的アナライトの検出または定量をもたらすように、種々のマイクロ流体工学部品を当該キャップの中に構築することができる。一般的には、PCT US00/10903およびその中に概説されている参照文献を参照されたい。これらの全部を、本明細書の一部として明示的に援用する。 これらの操作には、細胞の取扱い(細胞濃縮、細胞溶解、細胞除去、細胞分離など)、所望の標的アナライトを他のサンプル成分から分離すること、標的アナライトに対する化学的もしくは酵素的反応、標的アナライトの検出などが含まれる。本発明の装置は、サンプル、排出物または試薬を操作するための一以上のウエル;これらウエルへの、およびウエル間のマイクロチャンネル(ときには流れチャンネルと称され、これには電気泳動分離マトリックスを含有するマイクロチャンネルが含まれる);流れの移動を制御するための弁;電気浸透ポンプ、電気水力学ポンプまたは電気動力学ポンプのようなオンチップポンプを含むことができる。加えて、ここで概説するように、当該装置の内部表面の一部は、非特異的結合を減少させて結合性リガンドの結合を可能するため、生体適合性のため、または流れ抵抗性等のために、必要な種々のコーティングでコートしてもよい。これらのマイクロ流体工学キャップは、当業者が理解するように、種々の方法で作製することができる。例えば、PCT US00/10903およびそこで概説されている参考文献を参照されたい。これらの全てを本明細書の一部として援用する。
【0117】
カートリッジのキャップがアッセイの一部として使用されるとき、それは、その用途に応じて何れか所定の装置に存在し、且つ必要に応じてマイクロチャンネルにより接続される一以上の種々の部品(ここでは「モジュール」と称する)を含むように構成してもよい。これらのモジュールはには、サンプル入口ポート;サンプルの導入または採取モジュール;細胞取り扱いモジュール(例えば、細胞溶解、細胞除去、細胞濃縮、細胞の分離または捕捉、細胞増殖など);分離モジュール、例えば、電気泳動、誘電泳動(dielectrophoresis)、ゲル濾過、イオン交換/親和性クロマトグラフィー(捕捉および解除)等;サンプルの化学的または生物学的改変のための反応モジュール[これには標的アナライトの増幅(例えば、標的アナライトが核酸のとき、有用な増幅技術にはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA);標準置換増幅(SDA)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、並びに本明細書の一部として援用するWO 99/37819、PCT US00/19889およびUS00/20476に概説された他の技術が含まれるが、これらに限定されない)、標的アナライトの化学的、物理的または酵素的開裂、または標的の化学的修飾が含まれる];流体ポンプ(電気浸透ポンプ、電気水力学ポンプまたは電気動力学ポンプを含むが、これらに限定されない);流体弁;加熱および冷却のための温度モジュール;アッセイ試薬のための貯蔵モジュール;混合チャンバ;および検出モジュールが含まれるが、これらに限定されない。
【0118】
加えて、これらのマイクロ流体力学部品は、ここではカートリッジのキャップに関連して説明するが、当業者が理解するように、これらモジュールおよびチャンネル(並びにここで概説する他の部品)は、カートリッジまたは装置の何処に配置されてもよい。加えて、幾つかの部品は装置の中にあってもよく、例えば、「オフチップ」ポンプは、当該装置の一以上のステーション内に配置されてもよい。
【0119】
当該カートリッジは少なくとも一つのバイオチップを含み、幾つかの実施例は、カートリッジ当り一以上のバイオチップを利用する。ここでの「バイオチップ」またはその均等語は、異なる生体分子、特に核酸およびタンパク質のアレイを含む基板を意味する。広範な種々の適切な核酸バイオチップが存在し、その中にはフォトリソグラフィー技術を使用して製造されたたもの(例えばAffymetrix GeneChipTM)、スポッティング技術を使用して製造されたもの(例えばSynteniおよびIncyte)、 プリント技術を使用して製造されたもの(AgilentおよびRosetta)、三次元「ゲルパッド」アレイ、および電子部品を含むもの(例えばNanogen)が含まれる。好ましい実施例は以下に説明されており、また、米国特許第5,591,578号、同第5,824,473号、同第5,705,348号、同第5,780,234号、および同第5,770,369号;米国特許出願 08/873号、同598 08/911,589号; WO 98/20162、W098/12430、W098/57158、WO00/16089、W099/57317、 W099/67425、WO00/24941;PCT US00/10903;WO00/38836、W099/37819、 W099/57319、およびPCT US00/20476 ; 並びに関連資料に記載されている。これらの全てを本明細書の一部として明示的に援用する。
【0120】
なお、ここに概説する電子的検出方法を使用する一つの明瞭な利点は、反応およびハイブリダイゼーションを、リアルタイムでモニタリングできることにある。即ち、蛍光に基づくシステムは、過剰(例えばバックグラウンド)な信号プローブ(または、例えば増幅反応の際に標的配列自身が蛍光でラベルされるときは、標的配列)の除去を必要とするのに対して、ここに概説する電子的方法はそれを必要としない。即ち、ETMを含まないプローブが表面に結合しなければ、未結合のプローブが除去されていなくても、信号は少ししか、または全く見られない。これは、同じアレイ上での複数の測定と共に、リアルタイムの反応モニタリングを可能にする。従って、以下での議論は主に電極アレイを含むバイオチップの使用に向けられているが、本発明には他のアレイ技術も含まれる。
【0121】
好ましい実施例において、バイオチップは、複数のアレイ位置を備えた基板を含んでいる。ここで、「基板」もしくは「固相支持体」または他の文法的均等語は、捕捉リガンドの取付けまたは結合に適した異なる個々の部位を含むように修飾できる何れかの材料を意味する。適切な基板には、金のような金属表面、以下で定義する電極、ガラスおよび修飾もしくは官能化されたガラス、ガラス繊維、テフロンTM、セラミックス、雲母、プラスチック(アクリル、ポリスチレン、スチレンと他の材料との共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリウレタン、テフロンTM、およびこれらの誘導体等を含む)、GETEK(ポリプロピレンオキシドおよびガラスファイバのブレンド)等、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、樹脂、シリカもしくはシリカベースの材料(シリコンおよび修飾シリコンを含む)、炭素、金属、無機ガラス、および種々の他のポリマーが含まれるが、プリント回路基板(PCB)材料が特に好ましい。
【0122】
本システムは、アドレス可能な検出電極のマトリックス(ここでは一般に「パッド」、「アドレス」または「マイクロ位置」と称する)が存在するアレイフォーマットにおいて、特別の有用性を見出す。ここでの「アレイ」は、アレイフォーマットの複数の捕捉リガンドを意味し、該アレイの寸法は、アレイの構成および最終用途に依存するであろう。約2〜数千の異なる捕捉リガンドを含むアレイを作製することができる。一般に、電極の寸法ならびにアレイの最終用途に応じて、アレイは2〜100,000以上を含む。好ましい範囲は、約2〜約10,000であり、約5〜約1000が好ましく、約10〜約100が特に好ましい。幾つかの実施例では、本発明の構成はアレイフォーマットでなくてもよい。即ち、幾つかの実施例では、一つの捕捉リガンドを含む構成も同様に作製できる。加えて、幾つかのアレイでは、同一もしくは異なる構成の複数の基板を使用してもよい。従って、例えば大きなアレイは、複数の小さい基板を含んでいてもよい。
【0123】
好ましい実施例において、バイオチップは、アレイを含む少なくとも一つの表面を備えた基板を具備しており、好ましい実施例では電極のアレイを具備している。ここでの「電極」は、電子装置に接続されたときに、電流または電荷を検知して、それを信号に変換できる構成を意味する。或いは、電極は、溶液中の種に対して電圧を印加し、および/または電子を通すことができる構成として定義することができる。従って、電極は、ここに記載するETMである。好ましい電極は当該技術において既知であり、金、白金、パラジウム、シリコン、アルミニウムを含む一定の金属およびその酸化物(金属酸化物電極は酸化白金、酸化チタン、酸化インジウム錫、酸化パラジウム、酸化シリコン、酸化アルミニウム、酸化モリブデン(Mo)、酸化タングステン(WO)、および酸化ルテニウムを含む);および炭素(ガラス質炭素電極、グラファイトおよび炭素ペーストを含む)が含まれるが、これらに限定されない。 好ましい電極には金、シリコン、炭素および金属酸化物電極が含まれ、金が特に好ましい。
【0124】
ここに記載する電極は平坦な表面として図示されるが、これは可能な電極コンホメーションの一つに過ぎず、単に概略的例示の目的のためだけのものである。電極のコンホメーションは、使用される検出方法およびカートリッジの構成と共に変化するであろう。例えば、光学的検出方法のためには、または核酸のアレイが作製されて、合成および検出のためにアドレス可能な配置を必要とするときには、平坦な平面的電極が好ましいかもしれない。或いは、単一のまたは低密度の分析については、電極は管の形態であってよく、これは小容積のサンプルに露出される、核酸を含んだ最大の表面積を可能にする。
【0125】
好ましい実施例において、検出電極は基板上に形成される。加えて、ここでの議論は一般に金電極の形成に向けられているが、当業者が理解するように、他の電極も同様に使用できる。当該基板は、上記で概説したように、広範な種々の材料を含むことができる。
【0126】
一般に、好ましい材料にはプリント回路基板材料が含まれる。回路基板材料は、導電層でコートされ、且つ電極およびインターコネクト(当該技術では、時にはインターコネクションまたはリードと称される)のパターンを形成するために、リソグラフィー技術(特にフォトリソグラフィー技術)を使用して加工された絶縁基板を含むものである。絶縁基板は、常にではないが、一般にはポリマーである。当該技術において知られているように、一つまたは複数の層を使用して、「二次元」(例えば、全ての電極およびインターコネクションが一つの平面内にある)または「三次元」(電極が一つの表面上にあり、インターコネクトは他方の側へと基板を貫通し、または電極が複数の表面上にある)の基板を作製してもよい。三次元のシステムは、屡々、「スルーボード」のインターコネクションが作製されるように、穿孔またはエッチングの使用後に銅のような金属の電気メッキに依存する。回路基板材料には、既に基板に取り付けられた銅箔のような箔が設けられ、必要に応じて、例えば電気メッキにより追加の銅(例えばインターコネクションのため)が加えられる。次いで、接着剤層の付着を可能にするために、銅表面は、例えばエッチングにより粗面化する必要がある。
【0127】
従って、好ましい実施例において、本発明は複数の電極、好ましくは金電極を含む基板を具備してなるバイオチップ(ここでは時には「チップ」と称する)を提供する。電極の数は、アレイについて概説した通りである。各電極は、好ましくは、ここで概説する自己集合単分子層を含んでなるものである。好ましい実施例において、単分子層形成種の一つは、ここで説明する捕捉リガンドを含んでなるものもである。加えて、各電極はインターコネクションを有しており、これは一端において前記電極に結合され、また最終的には該電極を制御できる装置に結合される。即ち、各電極は独立にアドレス可能である。
【0128】
好ましい実施例において、電極からの接続は、基板を貫通させて、ポーゴーピン等のコネクタにインターフェースしてチップから器具への接続を形成するできる所謂ランド格子アレイを製造することにより作製される。この実施例において、ポーゴーピンコネクタは、エッジカードコネクタの代りに使用される。ランド格子アレイに配置された電極を含むチップの一例は、図1H??に示されている。この実施例においては、長いインターコネクションを含むのではなく、電極アレイはPCRボードまたはセラミック基板のような基板の一つの表面であり、パッドで終端する「スルーボード」または「スルー基板」のインターコネクションが存在する。図1I??を参照されたい。カートリッジが装置の中に配置されると、これらのパッドは「ボーゴーピン」型のコネクタに接触して、チップ上のスペースを節約し、所望のときはより高いアレイ密度を可能にする。図1Jを参照されたい。幾つかの実施例では、スイッチ回路(マルチプレクサ)をポーゴーピンコネクタの中に作り込むことができる。
【0129】
回路基板材料(または他の基盤)上の検出電極は、一般に広範な種々の方法で製造される。一般には高純度の金が使用され、真空蒸着プロセス(スパッタリングおよび蒸発)または溶液析出(電気メッキまたは無電解メッキ)を介して表面に堆積することができる。電気メッキが行われるときは、基板は最初に導電性材料を含んでいなければならない。ガラス繊維回路基板には、しばしば銅箔が設けられる。基板によっては、良好な機械的安定性を保証するために、基板と金の間に接着層が使用されることが多い。従って、好ましい実施例では、クロム、チタン、チタン/タングステン、タンタル、ニッケルまたはパラジウムのような接着材料の堆積層を利用し、これは金について上述したようにして堆積することができる。電気メッキされた材料(接着金属または電極金属の何れか)が使用されるとき、任意に、商取引では屡々ブライトナーと呼ばれる粒子精製添加剤を添加して、表面堆積特性を変更することができる。好ましいブライトナーは有機種および無機種の混合物であり、コバルトおよびニッケルが好ましい。
【0130】
一般に、接着層は約100Å〜約25ミクロン(1000μインチ)の厚さである。接着金属が電気化学的に活性であれば、電極金属は「ブリードスルー(bleed−through)」を防止する厚さでコートされなければならない。接着金属が電気化学的に活性でなければ、電極金属はもっと薄くてもよい。一般に、電極金属(好ましくは金)は約500Å〜約5ミクロン(200μインチ)の厚さで堆積され、約30Å〜約50μインチが好ましい。金は、一般には電極の直径が約5ミクロン〜約5mmになるように堆積され、約100〜250ミクロンが好ましい。次いで、こうして形成された検出電極は、好ましくは洗浄され、また以下で述べるようにSAMが添加される。
【0131】
従って、本発明は、複数の金電極を具備してなる基板を作製する方法を提供する。この方法は、最初に、ニッケルまたはパラジウムのような接着金属(任意にブライトナーと共に)を、基板にコーティングすることを含む。電気メッキが好ましい。次いで、電極金属、好ましくは金が接着金属上にコートされる(この場合も電気メッキが好ましい)。次いで、電極およびそれらの関連するインターコネクションを含む当該装置のパターンが、リソグラフィー技術、特に当該技術で知られているフォトリソグラフィー技術、および湿式化学エッチングを使用して作製される。屡々、半田マスクまたはプラスチックのような非導電性の化学的抵抗性の絶縁材料が、これらフォトリソグラフィー技術を使用して形成され、電極および露出されたリードへの接続点のみが残される。該リード自身は一般にはコートされる。
【0132】
本発明の構造の一実施例において、前記半田マスクは、望ましくは水溶性材料ではなく、溶媒可溶性の材料で製造される。水溶性半田マスクは、一般的には水溶性材料の環境的利点のために、工業において標準になっている。不都合なことに、水溶液に露出される検出チップの場合、アセトニトリルのような水溶性材料が、水溶液に露出されたときに溶解される可能性がある。
【0133】
当該方法では、続いて以下で述べるSAMを添加する。好ましい実施例においては、滴下析出技術を用いて必要な化学物質、即ち、単分子層形成種(その一つは、好ましくは捕捉リガンドを含む種である)が加えられる。滴下析出技術は、「スポット」アレイを作製するために周知である。これは、各電極に異なる組成を加えるため、即ち、異なる捕捉リガンドを含むアレイを作製するために行われる。或いは、SAM種は各電極について同一であってもよく、これは滴下析出技術、または全体の基板または基板表面の溶液中への浸漬によって達成される。
【0134】
好ましい実施例では、捕捉プローブを含むSAMの析出の前に、プラズマ処理を用いて、主要な汚染物のない表面を生じさせる。この方法は、理論限界に近いパッキング密度の捕捉プローブを含むSAMを形成するために、金表面を活性化するために特に有用である(図68参照)。プラズマ法はまた、隣接するパッド上への異なる捕捉プローブの析出のためにも使用できる。
【0135】
酸素プラズマを用いたバレル型機械中でのプラズマ処理(最小イオン衝撃)は、半導体プロセスにおいて、フォトレジスト汚染物を含む有機汚染物の痕跡残渣を除去するために普通に使用されている。酸素プラズマでの処理は、正常な表面を形成するために本発明の方法で使用できるが、この処理は、金パッドを分離している絶縁体層を親水性にする。従って、汚染を伴わずにアレイをスポットするのは困難である。
【0136】
好ましい実施例においては、水素プラズマ処理が使用される。この方法は、親水性のC−O結合をC−H結合に変換するので、有機表面に疎水性を回復する。加えて、この処理は金表面に汚染を加えない。水素プラズマ処理は単独で使用することができ、または酸素プラズマ処理と組み合わせて使用することができる。図69は、チップから主要な汚染物を除去するための、酸素プラズマ処理に続く水素プラズマ処理の有効性を図示している。
【0137】
酸素プラズマ処理と水素プラズマ処理との組合せは、親水性表面の疎水性表面を形成するために、微細パターン化されたフォトレジスト材料に対して使用することができる。この疎水性表面および親水性表面は、相互に隣接していてもよく、数ミクロン離れていてもよい。
【0138】
好ましい実施例では、酸素プラズマ処理の後にCF プラズマを使用して、絶縁体にテフロンTM様化合物、即ち、C−F結合を形成し、疎水性の絶縁体表面を生じさせることができる。
【0139】
他の実施例では、化学的処理をプラズマ処理と組合せることができる。例えば、シランを用いた化学的処理を使用して、酸化物絶縁体表面を疎水性または親水性にする一方、金のような非酸化物表面を汚染せずに残すことができる。絶縁体表面が疎水性であるかまたは親水性であるかは、O−H結合を置換するシランのタイプに依存する。
【0140】
加えて、この方法は、チップ表面の化学的および生物学的液体の選択的濡れ性を向上させるために、または溶液の所定種のチップ表面への付着を防止もしくは可能にするために、プラズマ洗浄と共に使用することができる。
【0141】
バイオチップが電極を具備するときは、以下で概説する化学に加えて、チップに存在し得る種々の追加の部品が存在し、これにはインターコネクト、マルチプレクサ、リレー装置、フィルター、RFアンテナ、加熱素子、電磁気部品等が含まれるが、これらに限定されない。
【0142】
各電極は、アレイにおける各電極のための入力、および電子的応答を送信する独立のリード(インターコネクト)を含んでいる。各電極への入力信号のみを独立に変更するが、電極応答信号を変更しない能力を必要とする以前のシステムとは対照的に、本発明においては、各電極についての入力および電極応答信号の両方が独立にモニター可能であることが重要である。
【0143】
相対的に少数の電極パッドについて、および/または望ましいサイズのアレイに依存して、並列回路を使用した直接の接続を与えることが適切であるかもしれない。
【0144】
好ましい実施例において、各電極は、対応するインターコネクタを介してマルチプレクサの対応する入力に個別に接続される。従来のシステムおよび方法において提示される一つの問題は、特に、電極が高密度または近接して充填されたアレイを形成するときに、多数の電極に対して電気的接続(入力および/または出力)を与えることの困難性である。この問題に対する幾つかの解決策が認識されておる。これには、ここで概説する他の利用可能な技術の中でも、並列な回路および接続の組との同時信号処理を可能にし、また時間−ドメイン多重化法で直列に、または周波数ドメインおよび/または時間−ドメインに基づく分離技術を使用して並列もしくは直列にライン−サンプルアレイアドレッシングを可能にする回路の使用が含まれる。
【0145】
例えば、チップ上における第一の多重度の回路またはラインを、チップから導出するコネクタにおいて小さい多重度のラインに接続する好ましい方法は、チップまたはボード上の回路をボード外の回路に選択的に結合するための、マルチプレクサ(MUX)またはリレーのようなスイッチ装置を使用することである。
【0146】
マルチプレクサの数は、アレイにおける電極の数に依存するであろう。一つの実施例では一つのMUXが利用される。好ましい実施例では、複数のMUXが使用される。当業者が理解するように、これは種々の方法で行うことができる。一つの実施例では、電極の「セクター」が特定のMUXに割当てられ、従って、アレイの行または列は、それぞれ自分自身のMUXを有する。或いは、サブマルチプレクサが用いられ、例えば、行または列はそれぞれのサブマルチプレクサに接続され、該サブマルチプレクサの出力はもう一つのサブマルチプレクサに行く。
【0147】
好ましい実施例において、マルチプレクサは、コネクタパッドを介して制御信号を受け取るバイナリーカウンタを含んでいる。この制御信号は、クロック信号のような、好ましくはパルス化された信号であり、デコーダを駆動するためのシーケンシャルカウントを発生する。
【0148】
好ましい実施例において、基板上の電極の多重度を、「チップ外」へ導く少数のコネクタパッドに接続するもう一つの方法は、個々の電極の選択を可能にする行/列選択信号を使用することである。
【0149】
不運なことに、異なる電極または電極群に逐次的にアクセスする構造および方法については、時間差が結果を変更するのに充分に大きい時は、先に検知および読み出されたデータと後で検知および読み出されたデータとの間のキャリブレーションを維持するために、検知された結果の幾つかの補正または調節を必要とする可能性がある。このような調節の必要性は、アッセイ、反応速度、並びに検知および読み出される電極の数の関数でもあり得る時間分離に依存するであろう。例えば、幾つかの実施例では、5×5アレイの25の各電極を数秒間隔(例えば10秒間隔)で測定することは全く合理的であり得る。しかし、他の実施例では、最初の測定と最後の測定との間の4分の間隔は許容され得ないか、または補償するのが困難である可能性がある。
【0150】
また、電極表面のような平坦な表面またはその近傍で反応が生じるときには、反応の速度論を考慮するのが望ましい。反応が溶液中で生じるときよりも、拡散速度が重要な役割を果す可能性がある。測定を適切な時に行うためには、反応が何時または如何なる時間に亘って生じるかを理解することが重要である。これは、例えば反応速度論を行うときのように、中間反応生成物を検知すべきとき、または一連の測定が望ましいときに特に重要である。
【0151】
また、反応速度論は、駆動信号のためにも重要な考慮事項である。バイオセンサは化学反応速度論によって制限される。ここで興味のある種類の分子(DNA、DNA断片、タンパク質、および抗体等)については、各分子は媒質中での最大速度を有している。例えば、これらの分子は典型的には、約1 Hz〜10kHz、より典型的には約5Hz〜5kHzの周波数で、溶液中において能動的に駆動または移動される可能性がある。より高い周波数では当該分子は振動するだけであるのに対して、より低い周波数では、この運動は特に有用ではない。
【0152】
加えて、アッセイ容積が存在するが、これは各駆動信号数波数に関連したアッセイのアクセス可能な容積である。周波数が増大するに伴って、このアッセイ容積はサイズおよび容積において収縮する。これは、電極の分布および駆動信号周波数についての密接な関係を有している。
【0153】
反応を検知または測定するための一つの追加の考慮要件は、反応媒体(例えば溶液成分、サンプル成分、反応成分等)が電極に対して有する可能な影響である。ときには、電極が分解して不活性になり、さもなければ経時的に変化し、それによって測定の精度および均一性に影響するであろう。このような条件の下では、収集されたデータが適正に解釈されるように、検知、測定、または分析を迅速に行い、または少なくとも予め定められたタイミングに従って行うのが望ましい。
【0154】
好ましい実施例では、一以上の予備増幅器が使用される。当業者が理解するように、予備増幅器は基板の表面にあってもよく(例えば「オンボード」または「オンチップ」)、またはアレイチップの外部にある回路に設けてもよい。しかし、外部回路に与えられる信号の信号/ノイズ比を増大させるために、予備増幅器は基板上に含められるのが好ましい。
好ましい実施例において、夫々の個々の電極は関連の予備増幅器を有している。
【0155】
好ましい実施例において、当該アレイは「セクター」に分割され、ここではアレイにおける電極のサブセットが、関連のMUXおよび予備増幅器を有している。同様に、本発明の他の部品はセクターに関連している。
好ましい実施例では、インピーダンスマッチングが行われる。
【0156】
好ましい実施例ではフィルターが使用され、これには時間ドメインフィルター(time domain filters)および周波数ドメインフィルター(frequency domain filters)、並びにこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0157】
電子部品に加えて、好ましい実施例における本発明の電極は自己集合単分子層(SAM)を具備している。これらSAMの組成は、使用する検出方法によって変化するであろう。一般に、二つの基本的な検出機構が存在する。好ましい実施例において、ETMの検出は、二本鎖核酸のスタックされたπ軌道を介しての電子移動に基づいている。この基本的機構は、米国特許第5,591,578号、同第5,770,369号、同第5,705,348号、およびPCT US97/20014号に開示されており、ここでは「機構1」と称する。簡単に言うと、先の研究によって、電子移動は、二本鎖核酸のスタックされたπ軌道を介して迅速に進行することができ、一本鎖核酸を介したときには顕著に遅く進行することが示された。
【0158】
従って、これはアッセイの基礎として働く。こうして、導電性オリゴマーを介して検出電極に結合された核酸にETMを加えることによって(鎖の一方に共有結合的に、または以下で述べるハイブリダイゼーション指標の使用を介してハイブリダイゼーション複合体に非共有結合的に)、核酸および導電性オリゴマーを介してETMと電極との間の電子移動を検出することができる。
【0159】
或いは、ETMは、必ずしも核酸を介した電子移動を介さずに検出することができ、むしろSAMを含む電極上で直接検出することができる。即ち、ETMからの電子は、信号を発生するために、スタックされたπ軌道を通して移動する必要がない。上記のように、この実施例において、検出電極は好ましくは自己集合単分子層(SAM)を含んでおり、これはサンプル中の酸化還元活性種から電極を遮蔽するように働く。この実施例において、僅かな「欠陥」(時には「ミクロ導管」、「ナノ導管」、または「電気導管」と称する)を含むように処方されたSAM上のETMの存在は、直接検出することができる。この基本的なアイデアを、ここでは「機構2」と称する。本質的に、この電気導管は表面への特別なETMアクセスを可能にする。理論に拘束されるものではないが、電気導管の構成は、部分的には選択されるETMに依存することに留意すべきである。例えば、比較的疎水性のETMの使用は、疎水性の電気導管形成種の使用を可能にし、これは親水性または帯電したETMを効果的に排除する。同様に、より親水性のまたは帯電した種をSAMに使用することにより、疎水性ETMを排除するように作用することができる。
【0160】
なお、これらの欠陥は、サンプル成分と検出電極との直接の接触を可能にする「孔」から区別されることに留意すべきである。以下で更に充分に概説するように、電気導管は幾つかの一般的方法で発生させることができ、この方法にはPC回路基板上に形成された金電極のような粗い電極表面の使用;または少なくとも二つの異なる種を単分子層中に使用すること、即ち、その少なくとも一つが電気導管形成種(EFS)である「単分子層」を使用することが含まれるが、これらに限定されない。従って、標的アナライトが結合されると、ETMを含む可溶性の結合性リガンドが表面にもたらされ、電極への「電気導管」を介してETMの検出を行うことができる。本質的に、欠陥を含むSAMの役割は、溶液成分から電極を遮蔽して、電極への非特異的結合の量を低減する利益を提供しながら、電極の電気表面とETMとの電気的接触を可能にすることである。別の観点から見ると、結合性リガンドの役割は、ETMを直接検出できる表面へのETMの動員についての特異性を提供することである。
こうして、何れの実施例においても、以下で更に充分に概説するように、ETMを含むアッセイ複合体が形成され、次いで検出電極を使用して検出される。
【0161】
従って、好ましい実施例において、電極は、電気導管形成種(EFS)を含む単分子層を具備してなるものである。ここで概説するように、標的アナライトの結合(例えば、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション)の効率は、該アナライトが電極から或る距離にあるときに増大する。同様に、標的アナライトを含む生体分子の電極への非特異的結合は、単分子層が存在するときに一般に減少する。こうして、単分子層はアナライトを電極表面から離間した状態に維持する。加えて、単分子層は、帯電種を電極表面から離間した状態に維持するように働く。従って、この層は電極とETMとの間、または電極と溶媒内の帯電種との間の電気的接触を防止するのを補助する。このような接触は、サンプル中に存在し得る帯電種を介した直接的な「短絡」または間接的な短絡をもたらす可能性がある。従って、該単分子層は、最小限の「孔」が存在するように、好ましくは電極表面の均一な層に密に充填される。こうして、当該単分子層は、溶媒の電極へのアクセスをブロックするための物理的バリアとして働く。
【0162】
ここでの「単分子層」、「自己集合単分子層」または「SAM」は、表面に自然に化学吸着された分子の比較的秩序だった集合を意味し、ここでは分子が相互に略平行に且つ表面に対して概ね垂直に配向される。これら分子の大部分は当該表面に結合する官能基、および単分子層の中で隣接分子と相互作用する部分を含んでおり、比較的秩序だったアレイを形成する。「混合」単分子層は、不均一な単分子層を含んでいる。即ち、ここでは、少なくとも二つの異なる分子が単分子層を形成している。
【0163】
一般に、本発明のSAMは多くの方法で作製することができ、また使用する電極表面およびシステムに応じて多くの異なる成分を含むことができる。「機構1」の実施例の場合、好ましい実施例は二つの単分子層形成種、即ち、単分子層形成種(絶縁体または導電性オリゴマーを含む)および捕捉結合性リガンドを含む導電性オリゴマー種を利用するが、当業者が理解するように、追加の単分子層形成種を含めることもできる。「機構2」のシステムの場合、SAMの組成は検出電極表面に依存する。一般に、二つの基本的な「機構2」のシステムが記述される。即ち、金ボール電極のような「平滑な」表面を含む検出電極、およびPC基板上で商業的プロセスを使用して作製されたもののような「粗い」表面を含む検出電極である。理論に拘束されるものではないが、一般には不完全な表面、即ち「粗い」表面上に形成された単分子層は、EFSが存在しなくとも、恐らくは粗い表面上の均一な単分子層の形成が困難である事実に起因して、自然に、充分な電気導管を含む単分子層を形成する。しかし、均一な表面はより均一な単分子層の形成を可能にするから、「より平滑な」表面は、電気導管を形成するために十分な数のEFAを含めることを必要とするかもしれない。ここでも、理論に拘束されるものではないが、例えば、より柔軟な成分のバックグラウンドの中に剛性分子を含めることにより、単分子層の均一性を乱す種を含めることによって電気導管が生じる。従って、「平滑な」表面は三つの成分、即ち、絶縁種、EFS、および捕捉リガンドを含んでなる種を含有する単分子層を具備するが、例えば、捕捉リガンド種が高密度で含められるような幾つかの環境においては、捕捉リガンド種がEFSとして作用することができる。この意味で、「平滑さ」は物理的には測定されず、EFSが含められるときの測定された信号増大の関数として測定される。即ち、単分子層形成種でコートされた検出電極からの信号が、EFSを含む単分子層形成種でコートされた検出電極からの信号と比較される。EFSを含めることは電極へのETMのアクセスを促進するように働くから、その信号の増大によって、当該表面が平滑であることが示される。また、ここでの議論は、主に金電極とチオール含有単分子層形成種に向けられているが、他のタイプの電極および単分子層形成種も使用できることに留意すべきである。
【0164】
機構2の「電気導管」システムは、サンプル成分と電極表面との直接的な接触をもたらさないこと;即ち、電気導管は電極への物理的なアクセスを可能にするほど大きな孔またはホールではないことに留意すべきである。理論に拘束されるものではないが、むしろ、この電気導管は一定のタイプのETM、特に疎水性ETMを単分子層の中に充分に貫入させて、検出を可能にするように思える。しかし、幾つかの親水性種を含む他のタイプの酸化還元活性種は、電気導管が存在しても、単分子層の中に貫入しない。従って、一般に、サンプル中に存在し得る酸化還元活性種は、電気導管の結果としての実質的な信号を与えない。正確なシステムはSAMの組成およびETMの選択によって変化するが、一般に、非特異的結合を減少し、且つETM検出のための充分な電気導管をも有する適切なSAMについてのアッセイは、フェロセンまたはフェロシアニドをSAMに添加することである;前者は信号を与え、後者は信号を与えないはずである。
【0165】
従って、機構1のシステムにおいて、単分子層は、以下で更に充分に概説するように、捕捉結合性リガンドを含有する導電性オリゴマーを含んでなる第一の種と、絶縁体または導電性オリゴマーの何れかまたは両方を含有する単分子層形成種を含んでなる第二の種とを含んでいる。
【0166】
好ましい実施例において、この単分子層は、電気導管形成種を含んでいる。ここでの「電気導管形成種」または「EFS」とは、当該表面におけるETMの検出を可能にするために、単分子層の中に充分な電気導管を形成することができる、一般にはアルキル基のような絶縁体の分子を意味する。一般に、EFSは次の性質の一以上を有する:それらは、例えばアルキル鎖と比較して相対的に剛性の分子であり得る;それらは、他の単分子層形成種とは異なる空間的位置関係で電極表面に結合する(例えば、チオール基を備えた金表面に結合されたアルキル鎖は略45°の角度で結合すると考えられ、またチオールを介して金表面に結合したフェニルアセチレン鎖は90°の角度で下がると考えられる);それらは、例えばアルキル基のような分岐した基を含めることにより、またはポリエチレングリコール単位のような高度に柔軟な種を含めることにより、緊密に充填された単分子層の形成を立体的に干渉または妨害する構造を有していてもよい;または、それらは電気導管を形成するように活性化できるもの、例えば、光活性化されたときに表面から選択的に除去されて、電気導管を残すことができる光活性化種であってもよい。
【0167】
好ましいEFSには、以下で定義する導電性オリゴマー、およびフェニルアセチレン−ポリエチレングリコール種、並びに、本明細書の一部として明示的に援用する2001年5月1日に出願された米国特許出願09/847, 113号に開示されたような、非対称SAM形成ジスルフィド種が含まれる。しかし、幾つかの実施例において、EFS は導電性オリゴマーではない。
【0168】
好ましい実施例において、単分子層は導電性オリゴマーを含んでなる。ここでの「導電性オリゴマー」とは、好ましくは線形の、実質的に導電性のオリゴマーを意味し、その幾つかの好ましい実施例は、文献中では「単分子ワイヤ」と称されている。ここで「実質的に導電性の」とは、当該オリゴマーが、100 Hzで電子を移動できることを意味する。一般に、この導電性オリゴマーは、一以上のシグマ(σ)結合も含むが、導電性オリゴマーのモノマー単位の間に実質的に重なったπ軌道、即ち共役π軌道を有する。加えて、導電性オリゴマーは、関連のETMに電子を注入し、または該ETMから電子を受取る能力によって機能的に定義することができる。更に、導電性オリゴマーは、ここで定義する絶縁体よりも導電性である。加えて、本発明の導電性オリゴマーは、それ自身が電子を供与または受容する電気的活性ポリマーから区別されるべきものである。
【0169】
好ましい実施例において、当該導電性オリゴマーは約10−6〜約10Ω−1cm−1、好ましくは約10−5〜約10Ω−1cm−1の導電性Sを有し、これらのSは、約20Å〜約200Åの範囲の分子について計算される。以下で述べるように、絶縁体は約10−7以下、好ましくは約10−8未満の導電性Sを有する。一般的には、本明細書の一部として援用するGardner et al., Sensors and Actuators A 51 (1995) 57−66を参照されたい。
【0170】
導電性オリゴマーの望ましい特性には、高い導電性、本発明の組成物を合成および使用するのための有機溶媒中および/または水中での充分な溶解度、並びに、下記のときに生じる反応に対する化学的抵抗性が含まれる:即ち、i)核酸合成の際(本発明の組成物を合成する際に、導電性オリゴマーを含む核酸を核酸合成器に添加できるように)、ii)電極への導電性オリゴマーの結合の際、またはiii)ハイブリダイゼーションアッセイの際である。加えて、自己集合単分子層の形成を促進する導電性オリゴマーが好ましい。
【0171】
本発明のオリゴマーは、ここに記載する少なくとも二つのモノマーサブユニットを含んでいる。以下で更に充分に説明するように、オリゴマーにはホモオリゴマーおよびヘテロオリゴマーが含まれ、またポリマーが含まれる。
【0172】
好ましい実施例において、導電性オリゴマーは、構造式1に示された構造を有している。
構造式1
【化1】
【0173】
当業者が理解するように、ここに示した全ての構造は、追加の原子または構造を有していてもよい。例えば、構造式1の導電性オリゴマーは、電極、繊維金属錯体、有機ETM、およびメタロセンのようなETMに結合されてもよく、また核酸もしくはこれらの幾つかに結合されてもよい。他に注記しない限り、ここに図示した導電性オリゴマーは、その左側で電極に結合する。即ち、構造式1に示すように、左側の「Y」がここで説明する電極に結合される。導電性オリゴマーが核酸に結合されるべきときは、右側の「Y」が(もし存在すれば)、直接またはここで説明するリンカーの使用を介して核酸に結合される。
【0174】
この実施例において、Yは芳香族基であり、nは1〜50の整数であり、gは1またはゼロであり、eはゼロから10の整数であり、mはゼロまたは1である。gが1のとき、B−Dは隣接する結合と共役できる結合(ここでは「共役結合」と称する)であり、好ましくはアセチレンから選択され、B−Dは、好ましくはアセチレン、アルケン、置換アルケン、アミド、アゾ、C=N−(−N=C−、−CR=N−、および−N=CR−を含む)、−Si=Si−、および−Si=C−(−C=Si−、−Si=CR−、および−CR=Si−を含む)から選択される共役結合である。gがゼロのとき、Dは好ましくはカルボニルまたはヘテロ原子部分であり、該へテロ原子は酸素、硫黄、窒素、ケイ素、またはリンから選択される。従って、適切なヘテロ原子部分には、−NHおよび−NR(R はここに定義する通りである);置換硫黄; スルホニル(−SO−)、スルホキシド(−SO−);ホスフィンオキシド(−PO−および−RPO−);およびチオホスフィン(−PS−および−RPS−)が含まれるが、これらに限定されない。しかし、導電性オリゴマーが金電極に結合されるときは、以下で概説するように、硫黄誘導体は好ましくない。
【0175】
ここでの「芳香族基」またはその文法的均等語は、一般には5〜14の炭素原子(しかし、更に大きな多環構造を形成してもよい)および何等かの炭素環状ケトンまたはそのチオケトン誘導体を含んだ、単環もしくは多環の芳香族炭化水素部分を意味し、ここで遊離原子価を持った炭素原子は芳香環の一員である。芳香族基には、アリーレン基、および2以上の原子が除去された芳香族基が含まれる。この出願の目的に関して、芳香族にはヘテロ環が含まれる。「ヘテロ環」または「ヘテロアリール」は、1〜5の指示された炭素原子が、窒素、酸素、硫黄、リン、硼素、およびケイ素から選択されるヘテロ原子で置換された芳香族基(ここで、遊離原子価を持った原子は方向環の一員である)、および何れかのヘテロ環状ケトンおよびそのチオケトン誘導体を意味する。従って、ヘテロ環には、チエニル、フリル、ピロリル、ピリミジニル、オキサリル、インドリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、チアゾリル、イミドジル(imidozyl)等が含まれる。
【0176】
重要なこととして、この導電性オリゴマーの複数のY芳香族基は異なってもよく、当該導電性オリゴマーはヘテロオリゴマーであってもよい。即ち、導電性オリゴマーは一つの種類のY基のオリゴマー、または複数の種類のY基のオリゴマーを含んでいてよい。
【0177】
この芳香族基は、ここでは一般にRで示す置換基で置換されてもよい。R基は、導電性オリゴマーの充填に影響を与えるために、必要に応じて添加すればよい。即ち、R基は、単分子層におけるオリゴマーの会合を変化させるために使用することができる。R基はまた、1)オリゴマーまたは該オリゴマーを含有する組成物の溶解度を変化させるため;2)系の共役または電気化学的電位を変化させるため;および3)単分子層の表面における電荷または特性を変化させるために添加してもよい。
【0178】
好ましい実施例において、導電性オリゴマーが三つのサブユニットよりも大きいときは、R基は、溶液合成が行われるときに溶解度を増大させるのが好ましい。しかし、R基およびその位置は、以下で述べるように、表面上(特に単分子層内)での導電性オリゴマーの充填に対する影響を最小にするように選択される。一般に、単分子層内では小さいR基だけが用いられ、大きなR基は単分子層の表面より上で使用される。従って、溶解度を高めるために、例えば、単分子層内の導電性オリゴマーの一部にはメチル基を結合するのが好ましく、単分子層表面上では、より長いアルコキシ基(たとえばC3〜C10)の結合が好ましく行われる。このことは一般に、ここに説明する系について、単分子層を構成する分子の平均長に応じて、最初の二つまたは三つのオリゴマーサブユニットに対して立体的に顕著なR基の結合はなされないことを意味する。
【0179】
適切なR基には、水素、アルキル、アルコール、芳香族、アミノ、アミド、ニトロ、エーテル、エステル、アルデヒド、スルホニル、シリコン部分、ハロゲン、硫黄含有部分、リン含有部分、およびエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。ここに示した構造において、Rは、当該位置が非置換であるときは水素である。なお、幾つかの位置は、二つの置換基RおよびR’を可能にする場合があることに留意すべきである。この場合、R基および R’基は同じであってもよく、異なっていてもよい。
【0180】
ここでの「アルキル基」またはその文法的均等語は、直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味し、直鎖アルキル基が好ましい。分岐している場合、それは一以上の位置で分岐していてよく、また特定しない限り如何なる位置で分岐していてもよい。このアルキル基は、約1〜約30の炭素原子(C1〜C30)の範囲で変化し、好ましい実施例では約1〜約20の炭素原子(C1〜C20)を利用し、約C1から約C12〜C15が好ましく、C1〜C5が特に好ましいが、幾つかの実施例においてアルキル基は遥かに大きくてもよい。アルキル基の定義には、C5環および C6 環のようなシクロアルキル基、窒素、酸素、硫黄またはリンを含むヘテロ環も含まれる。また、アルキルに硫黄、酸素、窒素のヘテロ原子(ケイ素が好ましい)を含むヘテロアルキルが含まれる。アルキル基には置換アルキル基も含まれる。ここでの「置換アルキル基」は、上記で定義した1以上の置換部分「R」を更に含むアルキル基を意味する。
【0181】
ここでの「アミノ基」またはその文法的均等語は、−NH基、−NHR基、および −NR基を意味し、Rはここで定義した通りである。
ここでの「ニトロ基」は、−NO基を意味する。
ここでの「硫黄含有部分」は、硫黄原子を含む化合物を意味し、チア化合物、チオ化合物、およびスルホ化合物、並びにチオール(−SH および−SR)およびスルフィド(−RSR−)を含むが、これらに限定されない。ここでの「リン含有部分」はリンを含有する化合物を意味し、ホスフィンおよびホスフェートを含むが、これらに限定されない。ここでの「ケイ素含有部分」は、ケイ素を含有する化合物を意味する。
【0182】
ここでの「エーテル」は、−O−R基を意味する。好ましいエーテルにはアルコキシ基が含まれ、−O−(CHCHおよび−O−(CHCH が好ましい。
ここでの「エステル」は、−COOR基を意味する。
ここでの「ハロゲン」は、臭素、ヨウ素、塩素、またはフッ素を意味する。好ましい置換アルキルは、部分的または完全にハロゲン化されたアルキル、例えばCF等である。
【0183】
ここでの「アルデヒド」は、−RCHO基を意味する。
ここでの「アルコール」は、−OH基、およびアルキルアルコール −ROHを意味する。
ここでの「アミド」は、−RCONH−基、またはRCONR−基を意味する。
【0184】
ここでの「エチレングリコール」または「(ポリ)エチレングリコール」は、−(O−CH−CH−基を意味するが、エチレン基の各炭素原子は単一または二重に置換されてもよく、例えば−(O−CR−CR−であり、Rは上記の通りである。酸素の代りに、他のヘテロ原子を含むエチレングリコール誘導体(即ち、−(NCH−CH−もしくは−(S−CH−CH−、または置換基を有するもの)もまた好ましい。
好ましい置換基には、メチル、エチル、プロピル、−O−(CHCH および−O−(CHCHのようなアルコキシ基、並びにエチレングリコールおよびその誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【0185】
好ましい芳香族基には、フェニル、ナフチル、ナフタレン、アントラセン、フェナントロリン、ピロール、ピリジン、チオフェン、ポルフィリン、およびこれら夫々の置換誘導体(縮環誘導体も含む)が含まれるが、これらに限定されない。
【0186】
ここに示した導電性オリゴマーにおいて、gが1であるとき、B−Dは二つの原子または化学部分を連結する結合である。好ましい実施例において、B−Dは重畳または共役したπ軌道を含む共役結合である。
【0187】
好ましいB−D結合は、アセチレン(−C≡C−、アルキンまたはエチンとも呼ばれる)、アルケン(−CH=CH−、エチレンとも呼ばれる)、置換アルケン(−CR=CR−、−CH=CR−および−CR=CH−)、アミド(−NH−CO−および−NR−CO−、または−CO−NH−および−CO−NR−)、アゾ(−N=N−)、エステルおよびチオエステル(−CO−O−、−O−CO−、−CS−O−、および−O−CS−)、並びに他の共役結合、例えば(−CH=N−、−CR=N−、−N=CH−および−N=CR−)、(−SiH=SiH−、−SiR=SiH−、−SiR=SiH−、および−SiR=SiR−)、(−SiH=CH−、−SiR=CH−、−SiH=CR−、−SiR=CR−、CH=SiH−、−CR=SiH−、−CH=SiR−、および−CR=SiR−)から選択される。特に好ましいB−D 結合は、アセチレン、アルケン、アミド、これら三つの置換誘導体、およびアゾである。 特別に好ましいB−D結合は、アセチレン、アルケンおよびアミドである。二重結合に結合されたオリゴマー成分は、トランスもしくはシスコンホメーション、またはその混合であってよい。従って、BまたはDの何れかは炭素、窒素またはケイ素を含む。置換基はRについて上記で定義した通りである。
構造式1の導電性オリゴマーにおけるg=0のとき、eは好ましくは1であり、D部分は上記で定義したカルボニルまたはヘテロ原子部分であってよい。
【0188】
Y環について上述した通り、何れか一つの導電性オリゴマー内において、B−D結合(またはg=0のときはD部分)は全て同じであってもよく、または少なくとも一つが異なってもよい。例えば、mがゼロのとき、末端のB−D結合はアミノ結合であってよく、残りのB−D結合はアセチレン結合であってよい。一般に、アミド結合が存在するときは、可能な限り少ないアミド結合が好ましいが、幾つかの実施例では全てのB−D結合がアミド結合である。従って、Y環について上記で概説したように、例えば、核酸が導電性オリゴマーを介して結合するとき、核酸ハイブリダイゼーションのためのより大きな融通性を与えるために、以下で説明する単分子層内の導電性オリゴマーに一つの種類のB−D結合が存在してもよく、また単分子層レベルの上にもう一つの種類のB−D結合が存在していてもよい。
【0189】
ここに示した構造において、nは1〜50の整数であるが、より長いオリゴマーを使用してもよい(例えば、Schumm et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994 33 (13): 1360を参照されたい)。理論に拘束されるものではないが、表面上での核酸の効率的なハイブリダイゼーションのために、ハイブリダイゼーションは表面から或る距離において生じるべきである。即ち、特に200〜300塩基対の長いオリゴヌクレオチドについては、ハイブリダイゼーションの反応速度は表面からの距離の関数として増大する。従って、以下で更に充分に説明するように、核酸が導電性オリゴマーを介して結合するとき、導電性オリゴマーの長さは、核酸の最も近いヌクレオチドが電極表面から約6Å〜約100Åに位置するような長さであり、約15Å〜約60Åが好ましく、また約25Å〜約60Åもまた好ましい。従って、nは芳香族基のサイズに依存するであろうが、一般には約1〜20であり、約2〜約15が好ましく、約3〜約10が特に好ましい。
【0190】
ここに示した構造において、mは0または1の何れかである。即ち、mが0のとき、導電性オリゴマーはB−D結合またはD部分で終端してもよく、即ち、D原子は直接またはリンカーを介して核酸に結合される。幾つかの実施例において、例えば導電性オリゴマーが核酸のリボース−リン酸骨格のリン酸に結合するときは、リンカーのような、導電性オリゴマーと核酸の間に結合された追加の原子が存在し得る。加えて、以下で概説するように、D原子はアミノ修飾されたリボースの窒素原子であってもよい。或いは、mが1のときには、導電性オリゴマーはY(芳香族)において終端してもよい。即ち、芳香族が核酸またはリンカーに結合されてもよい。
【0191】
当業者が理解するように、多数の可能な導電性オリゴマーを利用することができる。これらには、構造式1〜構造式8の範疇に入る導電性オリゴマー、並びに当該技術において一般に知られている他の導電性オリゴマー(例えば、融合芳香族環を含む化合物、または−(CF−、−(CHF)−、および− (CFR)−のようなテフロンTM様オリゴマー含まれる)。例えば、Schumm et al., Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 1361 (1994);Grosshenny et al., Platinum Metals Rev. 40 (1) : 26−35 (1996);Tour, Chem. Rev. 96: 537−553 (1996);Hsung et al., Organometallics 14: 4808−4815 (1995);およびこれらの中に引用されている参考文献を参照されたい。これらは全て、本明細書の一部として本願に援用する。
【0192】
この実施例の特に好ましい導電性オリゴマーを下記に示す。
構造式2
【化2】
【0193】
構造式2は、gが1のときの構造式1である。構造式2の好ましい実施例には、eがゼロで、Yがピロールもしくは置換ピロールであるもの;eがゼロで、Yがチオフェンもしくは置換チオフェンであるもの;eがゼロで、Yがフランもしくは置換フランであるもの;eがゼロで、Yがフェニルもしくは置換フェニルであるもの;eがゼロで、Yがピリジンもしくは置換ピリジンであるもの;eが1で、B−D がアセチレンであり、Yがフェニルもしくは置換フェニルであるもの(下記の構造式4を参照されたい)が含まれる。また、eが1であるときの構造式2の好ましい実施例は、下記の構造式3として示される。
構造式3
【化3】
【0194】
構造式3の好ましい実施例は、Yがフェニルもしくは置換フェニルで、B−Dがアゾであるもの;Y がフェニルもしくは置換フェニルであり、B−Dがアセチレンであるもの;Y がフェニルもしくは置換フェニルであり、B−Dがアルケンであるもの;Y がピリジンもしくは置換ピリジンであり、B−Dがアセチレンであるもの;Yがチオフェンもしくは置換チオフェンであり、B−D がアセチレンであるもの;Yがフランもしくは置換フランであり、B−Dがアセチレンであるもの;Yがチオフェンもしくはフラン(または置換チオフェンもしくは置換フラン)であり、 B−Dが交互にアルケン結合およびアセチレン結合であるものである。
【0195】
ここに示した殆どの構造は、構造式3の導電性オリゴマーを利用する。しかし、構造式3のオリゴマーの何れかを、ここに示す他の構造、即ち構造式1もしくは構造式8のオリゴマー、または他の導電性オリゴマーの何れかで置換してもよく、またこのような構造式3に示すものの使用は、本発明の範囲を限定することを意味しない。
【0196】
構造式3の特に好ましい実施例には、以下に示す構造式4、5、6、および7が含まれる。
構造式4
【化4】
【0197】
構造式4の特に好ましい実施例には、nが2、mが1、Rが水素であるもの;nが3、mが0、Rが水素であるもの;および溶解度を増大させるR基を使用したものが含まれる。
構造式5
【化5】
【0198】
構造式5のようにB−D結合がアミド結合であるとき、導電性オリゴマーは擬似オリゴマーである。構造式5におけるアミド結合はカルボニルが左に示されている(即ち、−CONH−)が、その逆(即ち、−NHCO−)もまた使用できる。構造式5の特に好ましい実施例には、nが2、mが1、Rが水素であるもの;nが3、mが0、Rが水素であるもの(この実施例において、末端窒素(D原子)はアミノ修飾リボースの窒素であってもよい);および溶解度を増大させるR基を使用したものが含まれる。
構造式6
【化6】
【0199】
構造式6の好ましい実施例には、最初のnが2、二番目のnが1、mが0、全てのR基が水素であるもの、または溶解度を増大させるR基を使用したものが含まれる。
構造式7
【化7】
【0200】
構造式7の好ましい実施例には、最初のnが3、二番目のnが1〜3、mが0または1で、溶解度を増大する4基を使用したものが含まれる。
好ましい実施例において、導電性オリゴマーは構造式8に示した構造を有する。
構造式8
【化8】
【0201】
この実施例において、Cは炭素原子であり、nは1〜50の整数であり、mは0または1であり、Jは酸素、窒素、ケイ素、リン、硫黄、カルボニルまたはスルホニルからなる群から選択されるヘテロ原子であり、Gは二つの炭素原子と一緒になって、C−G−C基がアルケン(−CH=CH−)、置換アルケン(−CR=CR−)またはそれらの混合物(−CH=CR−または−CR=CH−)、アセチレン(−C≡C−)、またはアルケン(−CR−CR−、Rは水素またはここで説明した置換基である)を形成するように、アルカン、アルケン、またはアセチレンから選択される結合である。各サブユニットのG結合は、他のサブユニットのGと同じであっても異なっていてもよい。即ち、アルケン結合およびアセチレン結合の交互のオリゴマー等を使用してもよいであろう。しかし、Gがアルケン結合であるとき、オリゴマーにおけるアルカン結合の数は最小限に維持されるべきであり、導電性オリゴマー当り約6以下のσ結合が好ましい。アルケン結合が好ましく、ここには一般的に示されているが、当業者が理解するように、ここに記載した何れかの構造または実施例においてアルカン結合およびアセチレン結合が置換されてもよい。
【0202】
幾つかの実施例において、例えばETMが存在しないとき、m=0であれば、少なくとも一つのG結合はアルカン結合ではない。
【0203】
好ましい実施例において、構造式8のmはゼロである。特に好ましい実施例においては、構造式9に示すように、mはゼロであり、Gはアルケン結合である。
構造式9
【化9】
【0204】
構造式9のアルケンオリゴマー、およびここに示した他のオリゴマーは、一般的に好ましいトランスコンフィギュレーションで示されているが、シスのオリゴマー、またはトランスおよびシスの混合物を使用してもよい。上記のように、R基は電極上での組成物の充填(パッキング)、オリゴマーの親水性もしくは疎水性、および可撓性、即ち、即ちオリゴマーの回転、捻れまたは長さ方向の柔軟性を変更するために加えることができ、nは上記で定義した通りである。
【0205】
好ましい実施例においてRは水素であるが、Rはまた、アルキル基およびポリフェニレングリコールまたは誘導体であってもよい。
別の実施例において、導電性オリゴマーは異なる種類のオリゴマー、例えば構造式1および構造式8のオリゴマーの混合物であってもよい。
【0206】
加えて、幾つかの実施例では、単分子層における導電性オリゴマーの少なくとも幾つかの末端は電気的に露出される。ここで「電気的に露出される」とは、当該末端に近接してETMが配置されたとき、および適切な信号で開始した後に、ETMの存在に依存した信号が検出され得ることを意味する。導電性オリゴマーは、末端基を有していてもよく、有していなくともよい。従って、好ましい実施例において、追加の末端基は存在せず、導電性オリゴマーは構造式1〜構造式9に示した基の一つ、例えばアセチレン結合のようなB−D結合で終端する。或いは、好ましい実施例では、ここで時々「Q」として示す末端基が添加される。末端基は幾つかの理由で使用される可能性がある。例えば、ETMの検出のための導電性オリゴマーの電気的利用可能性に寄与するため、または他の理由としては、例えば非特異的結合を防止するようにSAMの表面を変更するためである。例えば、核酸がDNAまたはRNAであるときに該核酸が当該表面に付着するのを拒否または防止して、ハイブリダイゼーションを促進するように、負に帯電した表面を形成するための負に帯電した基が末端に存在してもよい。好ましい末端基には、−NH、−OH、−COOH、−CHのようなアルキル基、および(ポリ)エチレングリコールのような(ポリ)アルコキシドが含まれ、 −OCHCHOH、−(OCHCHO)H、−(OCHCHO)H、および−(OCHCHO)H が好ましい。
【0207】
一つの実施例において、異なる種類の末端基をもった導電性オリゴマーの混合物を使用することが可能である。従って、例えば幾つかの末端基は検出を容易にすることができ、また幾つかは非特異的結合を防止することができる。
【0208】
単分子層は異なる導電性オリゴマー種を含んでいてもよいが、好ましくは、異なる種は合理的に均一なSAMを形成できるように選ばれる。従って、例えば核酸が導電性オリゴマーを使用して電極に共有結合されるときは、核酸を結合するために使用される一つの種類の導電性オリゴマーと、ETMを検出するように機能するもう一つの種類の導電性オリゴマーを有することが可能である。同様に、非特異的信号を減少するのを補助するために、単分子層の中に異なる長さの導電性オリゴマーを有するのが望ましいかもしれない。従って、例えば好ましい実施例は、単分子層の残部表面の下、即ち、それが使用されるときは絶縁体層の下、または他の導電性オリゴマーのある画分の下で終端する導電性オリゴマーを利用する。同様に、異なる導電性オリゴマーの使用は、単分子層形成を促進し、または改変された性質の単分子層を作製するために行ってもよい。
【0209】
好ましい実施例において、単分子層形成種は、導電性オリゴマーの中間にアルキル部分を含む「中断された」導電性オリゴマーである。
好ましい実施例において、単分子層は、EFSとして光活性化可能な種を含有する。この一般的スキームは、本明細書の一部として援用する米国特許出願第09/626,096号の図11に示されている。光活性化可能な種は当該技術において公知であり、その中には4,5−ジメトキシ−2−ニトロベンジルエステルが含まれ、これは365 nmの光を2時間照射することにより光分解することができる。
【0210】
好ましい実施例において、単分子層は更に、絶縁体成分を含有してもよい。ここでの「絶縁体」は、実質的に非導電性のオリゴマー、好ましくは線形のオリゴマーを意味する。ここでの「実質的に非導電性」とは、該絶縁体が100Hzにおいて電子を移動させないことを意味する。絶縁体を通しての電子移動の速度は、好ましくは、ここで述べる導電性オリゴマーを通しての速度よりも遅い。
【0211】
好ましい実施例において、絶縁体は約10−7Ω−1cm−1以下の導電性Sを有しており、約10−8Ω−1cm−1未満が好ましい。一般には、Gardner et al., supra.を参照されたい。
【0212】
一般に、絶縁体はアルキルまたはヘテロアルキルオリゴマー、またはσ結合を持った部分であるが、何れか特定の絶縁体分子は、芳香族基または1以上の共役結合を含んでいてもよい。ここでの「ヘテロアルキル」は、少なくとも一つのヘテロ原子を有するアルキル基、即ち、窒素、酸素、硫黄、リン、ケイ素または硼素が鎖に含まれているアルキル基を意味する。或いは、この絶縁体は、好ましくは実質的に電子移動を阻害または遅延させるように作用する、1以上のヘテロ原子または結合が追加された導電性オリゴマーと全く同じであってもよい。
【0213】
適切な絶縁体は当該技術において知られており、−(CH−、−(CRH)−、および(CR−、エチレングリコール、または酸素原子の代りに他のヘテロ原子、即ち、窒素または硫黄を用いた誘導体(電極が金のときは、硫黄誘導体は好ましくない)が含まれるが、これらに限定されない。
【0214】
導電性オリゴマーの場合と同様に、絶縁体は、電極上での成分もしくは導電性オリゴマーのパッキング、絶縁体の親水性もしくは疎水性、および絶縁体の可撓性(即ち、回転、捻れまたは長手方向の柔軟性)を変更するために、ここで定義したR基で置換されてもよい。例えば、分岐したアルキル基を使用すればよい。同様に、特に単分子層の表面に影響を与えるために、絶縁体は上記で概説した末端基を含んでいてもよい。好ましい実施例において、SAMの中に含まれる絶縁体種は、非対称ジスルフィドを含む新規な方法および組成物を利用する。ここで概説するように、ラベルプローブから生じる信号は、SAMの挙動または性質に依存する可能性がある。本明細書の一部としてその全体を明示的に援用する、米国特許出願第60/145,912号に概説された「ナノ導管」または「電気導管」を含むSAMは、良好な信号を与える。従って、本発明は、ナノ導管を形成するためのジスルフィドに基づく非対称絶縁体を提供し、ここでのジスルフィドにおいて、一方のアームは長いアルキル鎖(または他のSAM形成種)であり、他方のアームは短いアルキル鎖または嵩高い基(例えば、極性または非極性であり得る分岐アルキル基)を含む。例示的な種および作製方法は、米国特許第09/847,113号に記載されている。また、Mukaiyama, Tetrahedron Lett. 1968, 5907;Boustany, Tetrahedron Lett. 1970, 3547;Harpp Tetrahedron Lett. 1970, 3551;およびOae, J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1977, 407を参照されたい。これらの全てを、本明細書の一部として明示的に援用する。
【0215】
単分子層を形成する種の長さは必要に応じて変化するであろう。上記で概説したように、表面から或る距離において、ハイブリダイゼーションはより効率的であるように見える。核酸が結合される種(以下で概説するように、これらは絶縁体または導電性オリゴマーの何れであってもよい)は、基本的には単分子層形成種と同じ長さであるか、またはこれよりも長くてよく、ハイブリダイゼーションのために溶媒に更にアクセス可能である核酸をもたらす。幾つかの実施例において、核酸が結合されるこの導電性オリゴマーは、単分子層よりも短くてよい。
【0216】
当業者が理解するように、単分子層を構成する異なる種の実際の組合せおよび比率は、非常に広範に変化することができ、また機構1または機構2の何れを使用するかに依存するであろう。一般に2成分系または3成分系は、機構2のシステムにとって好ましいものである。3成分系は、絶縁体または導電性オリゴマーを介して電極に結合される、捕捉プローブ含有種を含んだ第一の種を利用する。第二の種は導電性オリゴマーであり、第三の種は絶縁体である。この実施例において、第一の種は約90%〜約1%であることができ、約20%〜約40%が好ましい。核酸の場合、短いオリゴヌクレオチド標的については約30%〜約20%が特に好ましく、長い標的については約10%〜約20%が好ましい。第二の種は、約1%から約90%であることができ、約20%〜約90%が好ましく、約40%〜約60%が特に好ましい。第三の種は、約1%から約90%であることができ、約20%〜約40%が好ましく、約15%〜約30%が特に好ましい。これらの概略比率を達成するために、SAM形成溶媒中における第一の種:第二の種:第三の種の好ましい比率は、短い標的については2:2:1、長い標的については1:3:1であり、また合計チオール濃度(以下で更に充分に説明するように、これらの種を結合するために使用するとき)は500μM〜1 mMであり、833μMが好ましい。
【0217】
或いは、2成分系を使用することもできる。一つの実施例において、機構1または機構2のシステムの何れかにおいて使用するための二つの成分は、前記第一の種および前記第二の種である。この実施例において、第一の種は約1%〜約90%であることができ、約1%〜約40%が好ましく、約10%〜約40%が特に好ましい。第二の種は、約1%から約90%であることができ、約10%〜約60%が好ましく、約20%〜約40%が特に好ましい。或いは、機構1または機構2のシステムの場合、二つの成分は前記第一の種および前記第三の種である。この実施例において、第一の種は約1%〜約90%であることができ、約1%〜約40%が好ましく、約10%〜約40%が特に好ましい。第三の種は、約1%から約90%であることができ、約10%〜約60%が好ましく、約20%〜約40%が特に好ましい。
【0218】
好ましい実施例において、SAMの析出は水性溶媒を使用して行われる。全て本明細書の一部として援用するSteel et al., Anal. Chem. 70: 4670 (1998); Herne et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 8916 (1997);およびFinklea, Electrochemistry of Organized Monolayers of Thiols and Related Molecules onElectrodes, from A. J. Bard, Etectroanatytical Chemistry Series of Advances, Vol. 20, Dekker N. Y.に一般的に記載されているように、SAM形成種の析出は、屡々塩を含有する水溶液から行うことができる。
【0219】
導電性オリゴマーおよび絶縁体の共有結合は、使用される電極ならびに絶縁体および導電性オリゴマーの組成に応じて、種々の方法で達成すればよい。好ましい実施例では、ここに示したヌクレオシドまたは核酸が共有結合された結合リンカーが、電極に共有結合される。従って、結合リンカーの一端または末端はヌクレオシドまたは核酸に結合され、他端は電極に結合される。幾つかの実施例においては、末端以外の位置で結合された結合リンカーを有すること、或いは、一端で電極に結合され且つ他端で2以上のヌクレオシドに結合された分岐結合リンカーを有するのも望ましいかもしれないが、これは好ましいものではない。同様に、構造式11〜構造式13に一般的に示すように、結合リンカーは二つの部位で電極に結合されてもよい。一般には、構造式10において「A」で示すように或る種類のリンカーが使用され、ここで「X」は導電性オリゴマーであり、「I」は絶縁体であり、斜線を付した表面は電極である。
構造式10
【化10】
【0220】
この実施例において、Aはリンカーまたは原子である。「A」の選択は、部分的には電極の特性に依存するであろう。従って、例えば、金電極を使用するときは、Aは硫黄部分であってもよい。或いは、金属酸化物電極が使用されるとき、Aは、酸化物の酸素に結合したシリコン(シラン)部分であってもよい(例えば、Chen et al., Langmuir 10: 3332−3337 (1994); Lenhard et al., J. Electroanal. Chem. 78: 195−201 (1977)を参照されたい;この両者は本明細書の一部として明示的に本願に援用する)。炭素ベースの電極を使用するとき、Aはアミノ部分であってよい(好ましくは一級アミン;例えばDeinhammer et al., Langmuir 10: 1306−1313 (1994)を参照されたい)。従って、好ましいA部分には、シラン部分、硫黄部分(アルキル硫黄部分を含む)、およびアミノ部分が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施例において、当該技術で公知のような酸化還元ポリマーとのエポキシド型の結合は使用されない。
【0221】
ここでは単一部分として示したが、絶縁体および導電性オリゴマーは二以上の「A」を用いて電極に結合されてもよく;これら「A」部分は同じでも異なっていてもよい。従って、例えば電極が金電極であるとき、「A」は硫黄原子または硫黄部分であり、以下の構造式11、構造式12および構造式13に示すように、導電性オリゴマーを電極に結合するために複数の硫黄原子を使用してもよい。当業者が理解するように、他のかかる構造を形成することができる。構造式11、構造式12および構造式13において、A部分は正に硫黄原子であるが、置換硫黄部分を使用してもよい。
構造式11
【化11】
構造式12
【化12】
構造式13
【化13】
【0222】
また、構造式13と同様に、電極に結合した三つの硫黄部分と共に、単一の炭素原子で終端する導電性オリゴマーを有することも可能であり得ることに留意すべきである。加えて、ここでは常に示されてはいないが、導電性オリゴマーおよび絶縁体はまた、「Q」末端基を含んでいてもよい。
【0223】
好ましい実施例においては、当該技術で周知のように、電極は金電極であり、また結合は硫黄結合を介したものである。即ち、A部分は硫黄原子または硫黄部分である。金−硫黄結合の正確な特性は知られていないが、この結合は、本発明の目的のための共有結合と考えられる。代表的な構造が、構造式3のオリゴマーを使用して構造式14に示されているが、ここに示した全ての構造に関して導電性オリゴマー類の何れか、または導電性オリゴマー類の組合せを使用してもよい。同様に、何れの導電性オリゴマーまたは絶縁体も、ここに記載した末端基を含んでいてよい。構造式14は、硫黄原子だけを含む「A」リンカーを示しているが、追加の原子が存在していてもよい(即ち、硫黄から導電性オリゴマーまたは置換基へのリンカー)。加えて、構造式14は、Y芳香族基に結合した硫黄原子を示している、当業者が理解するように、それは同様にB−D基(即ち、アセチレン)にも結合されてよい。
構造式14
【化14】
【0224】
好ましい実施例において、電極は炭素電極、即ち、ガラス状炭素電極であり、また結合はアミン基の窒素原子を介したものである。その代表的な構造が、構造式15に示されている。ここでも追加の原子、即ち、Z型リンカーおよび/または末端基が存在していてもよい。
構造式15
【化15】
構造式16
【化16】
【0225】
構造式16において、酸素原子は金属酸化物電極のオキサイドに由来する。Si原子は、他の原子と組合されてもよい。即ち、置換基を含むケイ素部分であってもよい。SAMのための、他の電極への他の結合が当該技術において知られている。例えば、酸化インジウム錫オキサイド電極への結合については、Napier et al., Langmuir, 1997、およびインジウム錫オキサイド電極への燐酸塩の化学吸着(H. Holden Thorpeの後援, CHI conference, May 4−5,1998)を参照されたい。
【0226】
本発明のSAMは、有機溶液からの析出および水溶液からの析出を含む種々の方法で製造することができる。ここに概説する方法は、例として金電極を使用するが、当業者が理解するように、他の金属および方法も同様に使用することができる。一つの好ましい実施例では、インジウム錫オキサイド(ITO)が電極として使用される。
【0227】
好ましい実施例では、金表面が先ず洗浄される。種々の洗浄方法を使用することができ、これにはピラニア溶液(過酸化水素/流酸)もしくは王水(塩酸/硝酸)を含む化学洗浄またはエッチング溶液、電気化学的方法、炎処理、プラズマ処理、またはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
洗浄の後に、金基板はSAM種に露出される。電極がITOであるときは、SAM種はホスホン酸含有種である。これもまた種々の方法で行うことができ、それには溶液析出、気相析出、ミクロ接触印刷、スプレー析出、ニートの成分を用いた析出などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施例は、溶液中に種々のSAM種(一般にはチオール含有種)の混合物を含む析出溶液を利用する。核酸を含む混合単分子層は、通常は二段階法を使用して調製される。チオール化された核酸は、最初の析出工程の際に(一般には少なくとも一つの他の単分子層形成種の存在下で)析出され、次いで第二のチオール溶液マイナス核酸が添加される第二の工程の際に、混合単分子層形成が完了される。任意に、第二の工程は単分子層の再構成を促進するために温和な加熱を利用する。
【0228】
好ましい実施例において、析出溶液は有機析出溶液である。この実施例において、清浄な金表面が清浄なバイアルの中に配置される。全チオール濃度がマイクロモルから飽和濃度の間であるような、有機溶媒中の結合性リガンド析出溶液が調製される;好ましい範囲は約1μM〜10 mMを含み、約400μM〜1.0 mMが特に好ましい。好ましい実施例において、この析出溶液はチオール修飾DNA(即ち、結合リンカーに結合された核酸)およびチオール希釈分子(導電性オリゴマーまたは絶縁体、後者が好ましい)を含有する。希釈剤(もし存在すれば)に対する核酸の比率は、通常は1000:1〜1:1000であり、約10:1〜約1:10が好ましく、1:1が特に好ましい。好ましい溶媒は、テトラヒドロフラン(THF)、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド(DMF)、エタノール、またはこれらの混合物である。一般に、溶媒が表面と反応する官能基をもっていない限り、捕捉リガンドを溶解するための充分な極性をもった如何なる溶媒も使用することができる。電極を完全に覆うように、充分な核酸体積溶液がバイアルに添加される。金基板は、周囲温度または周囲温度よりも僅かに高い温度で、数秒〜数時間(5〜30分)の間インキュベートされる。初期インキュベーションの後、析出溶液を除去し、有機溶媒中の希釈分子のみの溶液(約1μM〜10 mM、約100μM〜約1.0 mMが好ましい)を添加する。この金基板を室温または室温よりも高い温度で、一定の期間(数秒〜数日、約10分〜約24時間が好ましい)だけインキュベートする。金のサンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒で濯いで使用する。
【0229】
好ましい実施例では、析出水溶液が使用される。上記のように、清浄な金基板を清浄なバイアルの中に配置する。全チオール濃度が約1μM〜10 mMの、水中の核酸析出溶液を調製する;約1μM〜約200μMが好ましい。この水溶液は存在する塩(飽和以下、略1 Mが好ましい)を有することが多いが、純水を使用することもできる。この析出溶液はチオール修飾核酸を含み、また屡々チオール希釈分子を含む。希釈分子に対する核酸の比率は、通常は1000:1〜1:1000であるが、約10:1〜約1:10が好ましく、1:1が特に好ましい。この核酸析出溶液は、電極表面を完全に覆うような容積でバイアルに加えられる。金基板は、周囲温度または周囲温度よりも僅かに高い温度で、1〜30分間インキュベートされるが、通常は5分で充分である。初期インキュベーションの後、析出溶液を除去し、水または有機溶媒中の希釈分子のみの溶液(約1μM〜10 mM)を添加する。この金基板を室温または室温よりも高い温度で、完全な単分子層が形成されるまで(10分〜24時間)インキュベートする。金のサンプルを溶液から取出し、清浄な溶媒で濯いで使用する。
【0230】
好ましい実施例において、析出溶液は両性イオン化合物、好ましくはベタインを含有する。好ましい実施例は、ベタインおよびTris−HCl緩衝液を利用する。
好ましい実施例では、ここで概説するように、金電極のための基板として回路基板が使用される。金表面でのSAMの形成は、一般には、先ずここで概説するように、例えば10%硫酸溶液中で30分間、洗剤溶液、王水、プラズマ処理等により回路基板を洗浄することにより行われる。硫酸処理の後、例えば2つのミリQ水浴(two Milli−Q water baths)中で各1分間の浸漬により回路基板を洗浄する。次いで、この回路基板を窒素気流下で乾燥する。好ましくは湿度チャンバ内で、一般には回路基板をX−Yテーブル上に配置し、公知のスポッティングシステムを何回でも使用して、回路基板上への析出溶液のスポッティングを行う。スポッティング液滴の大きさは、回路基板上の電極の大きさに伴って変化するであろう;例えば、250μMサイズの電極については、30ナノリットルの液滴が使用される。この容積は、電極表面を完全に覆うのに充分であるべきである。該液滴は、室温で或る時間(数秒から一晩、5分が好ましい)だけインキュベートされ、次いでミリQ水浴中で濯ぐことにより液滴が除去される。次いで、この回路基板は任意に、45℃の浴中に浸漬することにより、一般には有機溶媒、好ましくはアセトニトリル中に絶縁体を含有する第二の析出溶液で処理される。30分後、該回路基板を取出して、アセトにトリル浴中に30秒間、次いでミリQ水浴中に30秒間浸漬する。この回路基板を窒素気流下で乾燥する。好ましくは、水洗のみを用いる。
【0231】
好ましい実施例では、SAMを含む検出電極(または非電極の実施例ではアレイ上の部位)は更に、好ましくは共有結合された捕捉結合性リガンドを含んでいる。ここでの「結合性リガンド」または「結合種」とは、標的アナライトの存在についてプローブするために使用される、標的アナライトに結合する化合物を意味する。一般に、ここに記載する殆どの実施例について、標的アナライト分子当りに使用される少なくとも二つの結合性リガンドが存在する。即ち、ここで記載する検出電極に結合される「捕捉」または「アンカー」結合性リガンド(「捕捉プローブ」とも称され、特に核酸結合性リガンドと称される)と、標的アナライトに対して独立に結合し、直接的または間接的に少なくとも一つのETMを含んだ可溶性結合性リガンド(ここでは屡々「信号伝達プローブ」または「ラベルプローブ」と称される)である。しかし、蛍光ベースの核酸検出システムの場合、標的配列は一般に増幅され、増幅の際に蛍光ラベルが添加される;従って、これらのシステムは一般に二つの要素、即ち、捕捉プローブおよびラベルされた標的のみを含んでいる。ここでも、以下の議論は電極および電気化学的検出の使用に向けられているが、当業者が理解するように、蛍光に基づくシステムも同様に使用できる。
【0232】
一般に、捕捉結合性リガンドは、検出の目的で、標的アナライトの検出電極への結合を可能にする。以下で更に充分に説明するように、標的アナライトの捕捉結合性リガンドへの結合は直接的(即ち、標的アナライトは捕捉結合性リガンドに結合する)でもよく、または間接的(一以上の捕捉延長リガンドを使用してもよい)でもよい。
【0233】
好ましい実施例において、結合は特異的であり、結合性リガンドは結合対の一部である。ここでの「特異的に結合する」とは、アッセイサンプルのアナライトと他の成分もしくは汚染物との間を区別するのに十分な特異性で、リガンドがアナライトに結合することを意味する。しかし、当業者が理解するように、高度に特異的でなはい結合を使用して、アナライトを検出することが可能であろう。例えば、当該システムは異なる結合性リガンド、例えば、異なるリガンドのアレイを使用してもよく、また何れか特定のアナライトの結合は、「電子ノーズ」が働く仕方と同様に、結合性リガンドのパネルへの結合の「サイン」を介したものである。この結合は、非特異的結合を除去するための洗浄工程を含むアッセイ条件下において、アナライトが結合したままであることを可能にするのに充分であるべきである。幾つかの実施例では、例えば一定の生体分子の検出において、結合性リガンドに対するアナライトの結合定数は、少なくとも約10−4〜10−9−1であり、少なくとも約10−5〜10−9−1が好ましく、少なくとも約10−7〜10−9−1が特に好ましいであろう。
【0234】
当業者が理解するように、結合性リガンドの組成は、標的アナライトの組成に依存するであろう。広範なアナライトに対する結合性リガンドが知られており、または既知の技術を使用して容易に見出すことができる。例えば、アナライトが一本鎖核酸であるときは、結合性リガンドは一般には実質的に相補的な核酸である。或いは、本明細書の一部として援用する米国特許第5,270,163号、同第5,475,096号、同第5,567,588号、同第5,595,877号、同第5,637,459号、同第5,683,867号、同第5,705,337号および関連特許に記載されているように、実質的に如何なる標的アナライトにも結合する核酸「アプタマー(aptamers)」を開発することができる。同様に、アナライトは核酸結合性タンパク質であってもよく、また捕捉結合性リガンドは一本鎖または二本鎖の核酸である。或いは、アナライトが一本鎖または二本鎖の核酸のときは、結合性リガンドは核酸結合性タンパク質であってもよい。アナライトがタンパク質のとき、結合性リガンドにはタンパク質(特に抗体またはその断片(Fab等)を含む)、小分子、または上記のアプタマーが含まれる。好ましい結合性リガンドタンパク質には、ペプチドが含まれる。例えば、アナライトが酵素であるときは、適切な結合性リガンドには基質、阻害剤、および該酵素に結合する他のタンパク質、即ち、多重酵素(タンパク質)複合体の成分が含まれる。当業者が理解するように、好ましくは特異的に会合する何れか二つの分子は、アナライトまたは結合性リガンドとして使用することができる。適切なアナライト/結合性リガンド対には、抗体/抗原、受容体/リガンド、タンパク質/核酸、核酸/核酸、酵素/基質および/または阻害剤、糖鎖(糖タンパク質および糖脂質を含む)/レクチン、糖鎖および他の結合性パートナー、タンパク質/タンパク質、およびタンパク質/小分子が含まれるが、これらに限定されない。これらは野生型配列または誘導体配列であってよい。好ましい実施例において、この結合性リガンドは、多量化することが知られた細胞表面受容体、例えば成長ホルモン受容体、グルコース輸送体(特にGLUT4受容体)トランスフェリン受容体、上皮成長因子受容体、低密度リプタンパク質受容体、高密度リピポタンパク質受容体、レプチン受容体、インターロイキン受容体(IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL− 12、IL−13、IL−15 およびIL−17受容体を含む)、VEGF受容体、PDGF受容体、EPO受容体、TPO受容体、繊毛ニューロトロフィック因子受容体、プロラクチン受容体、およびT細胞受容体の、タンパク質の一部(特に細胞該タンパク質)である。同様に、コンビナトリアル化学法に基づいた、結合性パートナーの開発に関する広範な文献が存在する。
【0235】
この実施例において、結合性リガンドが核酸であるとき、好ましい組成および技術は、米国特許第5,591,578号、同第5,824,473号、同第5,705,348号、同第5,780,234号、および同第5,770,369号;米国特許出願第08/873, 598 号、同第08/911,589号;WO 98/20162、WO 98/12430、WO 98/57158、WO 00/16089、WO 99/57317、WO 99/67425、 WO 00/24941;PCT US00/10903;WO 00/38836、WO 99/37819 、WO 99/57319 およびPCTUS00/20476;および関連資料に概説されており、これらの全てを、全体的に本明細書の一部として明示的に援用する。
【0236】
結合リンカー(絶縁体または導電性オリゴマー)への捕捉結合性リガンドの結合方法は、一般的に当該技術で知られているようにして行われ、また結合リンカーおよび捕捉結合性リガンドの両方の組成に依存するであろう。一般に、捕捉結合性リガンドは、夫々の官能基の使用を介して結合リンカーに結合され、これは次いで結合のために使用することができる。結合のための好ましい官能基は、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、およびチオール基である。次いで、これらの官能基は直接的に、または、ここでは時々Zとして示されるリンカーの使用を介して間接的に結合される。リンカーは当該技術において周知である。例えば、ホモもしくはヘテロ二官能性リンカーが周知である(例えば、本明細書の一部として援用する1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross−linkers, pages 155−200を参照されたい)。 好ましいZリンカーにはアルキル基(置換アルキル基、またはヘテロ原子部分を含むアルキル基を含む)が含まれるがこれに限定されず、短鎖アルキル基、エステル、アミド、アミン、エポキシ基、並びにエチレングリコールおよび誘導体が好ましく、プロピル、アセチレン、およびCアルケンが特に好ましい。Zはまた、スルホンアミド結合を形成するスルホン基であってもよい。
【0237】
この方法において、タンパク質、レクチン、核酸、小有機分子、糖鎖などを含む捕捉結合性リガンドを加えることができる。
好ましい実施例は、タンパク質の捕捉結合性リガンドを利用する。当該技術において知られているように、タンパク質の捕捉結合性リガンドを結合リンカーに結合するために、多くの技術を使用することができる。タンパク質に部分を加えるための広範な技術が知られている。
【0238】
好ましい実施例は、捕捉結合性リガンドとして核酸を利用する。以下での議論の殆どは核酸に焦点を当てているが、当業者が理解するように、以下で概説する多くの技術が、同様の方法で、非核酸システムおよび金属電極以外の表面への結合に依拠したシステムにも同様に適用される。
【0239】
捕捉プローブ核酸は、「結合リンカー」を介して電極に共有結合されるが、該リンカーは、導電性オリゴマー(機構1システムのために必要とされる)または絶縁体であることができる。ここでの「共有結合される」とは、二つの部分が、σ結合、π結合および配位結合を含む少なくとも一つの結合によって結合されることを意味する。
【0240】
こうして、結合リンカーの一端は核酸(または他の結合性リガンド)に結合され、また他端(しかし当業者が理解するように、何れに付いても正確な末端である必要はない)は電極に結合される。従って、ここに示した何れの構造も、末端基として効果的に、更に核酸を含んでいてもよい。こうして、本発明は、下記の構造式17に一般的に示すように、電極に共有結合された核酸を含んだ組成物を提供する。
構造式17
【化17】
【0241】
構造式17において、左側に記載された斜線は電極を表す。ここで定義したように、Xは導電性オリゴマーであり、Iは絶縁体である。Fは、電極と導電性オリゴマーまたは絶縁体との共有結合を可能にする結合であり、結合、原子、または例えば以下で定義する「A」のような、ここで説明したリンカーを含む。Fは、導電性オリゴマーまたは絶縁体の核酸への共有結合を可能にする結合であり、またここで説明したような原子または結合であってもよい。Fは、導電性オリゴマーの一部、絶縁体の一部、核酸の一部であってもよく、または例えばここで「Z」について定義するように、両者に対して外的であってもよい。
【0242】
好ましい実施例において、捕捉プローブ核酸は、結合リンカーを介して電極に共有結合される。核酸および結合リンカーの共有結合は、幾つかの方法で達成される。好ましい実施例において、この結合は、ヌクレオチドの塩基への結合を介するもの、核酸の骨格(リボース、リン酸、または核酸類縁体骨格の類似基)への結合を介するもの、または以下で説明するように遷移金属リガンドを介するものである。以下で概説する技術は、一般には天然に存在する核酸について説明されるが、当業者が理解するように、同様の技術は核酸類縁体と共に使用してもよく、幾つかの場合には他の結合性リガンドと共に使用してもよい。同様に、ここでの殆どの構造は、結合リンカーとしての導電性オリゴマーを示しているが、アルキル鎖のような絶縁体もまた、多くの実施例において好ましいものである。
【0243】
好ましい実施例において、結合リンカーは核酸におけるヌクレオチドの塩基に結合される。これは、以下で述べるように、リンカーに応じて幾つかの方法で行うことができる。一つの実施例において、該リンカーは末端ヌクレオシド、即ち、核酸の3’−もしくは5’−ヌクレオシドに結合される。或いは、該リンカーは中間のヌクレオシドに結合される。
【0244】
塩基への結合点は塩基と共に変化するであろう。一般には、如何なる位置での結合も可能である。幾つかの実施例において、例えばETMを含有するプローブをハイブリダイゼーションに使用し得るときは(即ち、機構1のシステム)、相補的塩基に対する水素結合に関与しない位置で結合するのが好ましい。従って、結合は一般に、ウリジン、シトシンおよびチミンのようなピリミジンの5位または6位へのものである。アデニンおよびグアニンのようなプリンについては、この結合は8位を介するものである。非標準的塩基への結合は、好ましくはこれと同等の位置で行われる。
【0245】
一つの実施例において、この結合は直接的である。即ち、結合リンカーと塩基との間には介在する原子が存在しない。この実施例において、例えば、末端アセチレン結合を有する導電性オリゴマーを含んでなる結合リンカーは、塩基に直接結合される。構造式18は、構造式3の導電性オリゴマーおよび塩基としてのウリジンを使用したこの結合の一例であるが、当業者が理解するように、他の塩基および結合リンカーを使用してもよい。
構造式18
【化18】
【0246】
ここに示したペントース構造には、水素、ヒドロキシ基、リン酸基、またはアミノ基のような他の基が結合していてもよい。加えて、ここに示したペントース構造およびヌクレオシド構造は、非慣用的に、通常の表現のミラーイメージで示されている。加えて、ペントース構造およびヌクレオシド構造はまた、合成の際の必要に応じて、何れかの位置に保護基のような追加の基を含んでいてもよい。
【0247】
加えて、塩基は必要に応じて追加の修飾を含んでいてもよい。即ち、カルボニル基またはアミン基は変更または保護されてもよい。
別の実施例では、塩基としてのウリジンおよび結合リンカーとしての構造式3のオリゴマーを用いて構造式19に一般的に示すように、当該結合は、アミド結合およびアミン結合を含む何れかの数の異なるZリンカーである。
構造式19
【化19】
【0248】
この実施例において、Zはリンカーである。好ましくは、Zは約1〜約10原子の短いリンカーであり、1〜5原子が好ましく、アルケン、アルキニル、アミン、アミド、アゾ、イミン等の結合を含んでもよく、含まなくてもよい。リンカーは当該技術において知られており、例えば、周知のようにホモ−もしくはヘテロ−二官能リンカーである(本明細書の一部として援用する1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross−linkers, pages 155−200を参照されたい)。 好ましいZリンカーには、アルキル基(置換アルキル基、およびヘテロ原子部分を含むアルキル基を含む)が含まれ、短鎖アルキル基、エステル基、アミド基、アミン基、エポキシ基、エチレングリコールおよび誘導体が好ましく、プロピル、アセチレン、およびCアルケンが特に好ましいが、これらに限定されない。Zはまた、以下で述べるように、スルホンアミド結合を形成するスルホン基であってもよい。
【0249】
好ましい実施例において、核酸と結合リンカーとの結合は、核酸の骨格への結合を介して行われる。これは、リボース−リン酸骨格リボース、該骨格のリン酸、または類似の骨格の他の基への結合を含む、多くの方法によって行うことができる。
【0250】
予備的事項として、この実施例における結合の部位は、以下で更に充分に説明するように、3’もしくは5’末端のヌクレオチド、または内部のヌクレオチドであってもよい。
【0251】
好ましい実施例において、結合リンカーはリボース−リン酸骨格のリボースに結合される。これは幾つかの方法で行うことができる。当該技術において知られているように、アミノ基、硫黄基、シリコーン基、リン基、オキソ基を持ったリボースの2’または3’位置の何れかで修飾されたヌクレオシドを作製できる(Imazawa et al., J. Org. Chem., 44: 2039 (1979);Hobbs et al., J. Org. Chem. 42 (4): 714 (1977);Verheyden et al., J. Orrg. Chem. 36 (2): 250 (1971);McGee et al., J. Org. Chem. 61: 781−785 (1996);Mikhailopulo et al., Liebigs. Ann. Chem. 513−519 (1993);McGee et al., Nucleosides & Nucleotides 14 (6): 1329 (1995)、これらの全てを本明細書の一部として援用する)。これらの修飾ヌクレオシドは、次いで結合リンカーを加えるために使用される。
【0252】
好ましい実施例は、アミノ修飾ヌクレオシドを利用する。これらのアミノ修飾リボースは、次いで導電性オリゴマーへのアミノ結合またはアミン結合を形成するために使用することができる。好ましい実施例において、アミノ基はリボースに直接結合されるが、当業者が理解するように、ここで「Z」について説明したような短いリンカーが、アミノ基とリボースとの間に存在してもよい。
【0253】
好ましい実施例において、アミド結合はリボースへの結合のために使用される。好ましくは、構造式1〜構造式3の導電性オリゴマーが使用されるときは、mはゼロであり、従って導電性オリゴマーはアミド結合で終端する。この実施例において、アミノ修飾リボースにおけるアミノ基の窒素は、導電性オリゴマーの「D」原子である。従って、この実施例の好ましい結合は、構造式20に示されている(結合リンカーとして、構造式3の導電性オリゴマーを使用する)。
構造式20
【化20】
【0254】
当業者が理解するように、構造式20はアミド結合として固定された末端結合を有している。
好ましい実施例においては、ヘテロ原子結合、即ち、オキソ、アミン、硫黄等が使用される。好ましい実施例はアミン結合を利用する。ここでも、アミド結合について上述したように、構造式3の導電性オリゴマーが使用されるとき、アミノ修飾リボースの窒素は、導電性オリゴマーの「D」原子である。従って、例えば構造式21および22は、結合リンカーとして、それぞれ構造式3および構造式9の導電性オリゴマーを有するヌクレオシドを示している。ヘテロ原子として窒素を使用しているが、他のヘテロ原子を使用することもできる。
構造式21
【化21】
【0255】
構造式21において、好ましくは、mおよびtの両者がゼロではない。ここでの好ましいZは、メチレン基または他の脂肪族アルキルリンカーである。合成の理由から、この位置における1、2または3個の炭素が特に有用である。
構造式22
【化22】
【0256】
構造式22において、Zは上記で定義したとおりである。適切なリンカーにはメチレンおよびエチレンが含まれる。
【0257】
別の実施例において、結合リンカーは、核酸におけるリボース−リン酸骨格(または類縁体)のリン酸を介して核酸に共有結合される。この実施例において、結合は直接的であるか、リンカーを利用するか、またはアミド結合を介する。構造式23は直接結合を示しており、また構造式24はアミド結合を介した結合を示している(両者とも構造式3の導電性オリゴマーを利用しているが、構造式8の導電性オリゴマー並びに他の多くの結合リンカーも可能である)。構造式23および構造式24は、3’位の導電性オリゴマーを示しているが、5’位も可能である。更に、構造式23および構造式24は、両者共に天然に存在するリン酸ジエステル結合を示しているが、当業者が理解するように、リン酸ジエステル結合の非標準的類縁体もまた使用することができる。
構造式23
【化23】
【0258】
構造式23において、もし末端のYが存在すれば(即ち、m=1)、好ましくは、Zは存在しない(即ち、t=0)。もし末端のYが存在しなければ、好ましくはZが存在する。
構造式24は、ここで定義したように、末端のB−D結合がアミノ結合であり、末端のYが存在せず、Zがリンカーである好ましい実施例を示している。
構造式24
【化24】
【0259】
好ましい実施例において、結合リンカーは、遷移金属リガンドを介して核酸に結合される。この実施例において、結合リンカーはリガンドに共有結合され、該リガンドは遷移金属のための一以上の配位原子を与える。一つの実施例においては、下記の構造式25に一般的に示すように、結合リンカーが結合されているリガンドにも、核酸が結合されている。或いは、下記の構造式26に一般的に示すように、結合リンカーは一つのリガンドに結合され、核酸はもう一つのリガンドに結合される。従って、遷移金属の存在下において、結合リンカーは核酸に共有結合される。これら構造の両者とも構造式3の導電性オリゴマーを示しているが、他の結合リンカーを利用してもよい。構造式25および構造式26は、二つの代表的な構造を示している。
構造式25
【化25】
構造式26
【化26】
【0260】
ここに示した構造において、Mは金属原子であり、遷移金属が好ましい。本発明に使用するための適切な遷移金属には、カドミウム(Cd)、銅(Cu)、コバルト(Co)、パラジウム(Pd)、亜鉛(Zn)、鉄(Fe)、ルテニウム(Ru)、ロジウム(Rh)、オスミウム(Os)、レニウム(Re)、プラチナ(Pt)、スカンジウム(Sc)、チタン(Ti)、バナジウム(V)、クロム(Cr)、マンガン(Mn)、ニッケル(Ni)、モリブデン(Mo)、テクネチウム(Tc)、タングステン(W)、およびイリジウム(Ir)が含まれるが、これらに限定されない。即ち、第一のシリーズの遷移金属、白金族金属(Ru、Rh、Pd、Os、Ir およびPt)、並びに Fe、Re、W、MoおよびTcが好ましい。特に好ましいのは、ルテニウム、レニウム、オスミウム、プラチナ、コバルトおよび鉄である。
Lは共リガンド(co−ligand)であり、金属イオンの結合のための配位原子を与える。当業者が理解するように、共リガンドの数および性質は、金属イオンの配位数に依存するであろう。一座配位、二座配位、または多座配位の共リガンドを、何れの位置で使用してもよい。こうして、例えば金属が6の配位数を有し、Lが導電性オリゴマーの末端を形成するとき、Lは核酸から与えられ、rは合計6になる。従って、金属が6の配位数を有するとき、rは0(全ての配位原子が他の二つのリガンドによって与えられるとき)〜4(全ての共リガンドが一座配位のとき)の範囲であることができる。従って、一般に、rは金属イオンの配位数および他のリガンドの選択に応じて、0〜8であろう。
【0261】
一つの実施例において、金属イオンは6の配位数を有し、導電性オリゴマーに結合されたリガンドおよび核酸に結合されたリガンドの両者は、少なくとも二座配位である。即ち、rは、好ましくは0、1(即ち、残りの共リガンドは二座配位)、または2(二つの一座配位の共リガンドが使用される)である。
【0262】
当該技術において理解されるように、この共リガンドは同じであっても異なっていてもよい。適切なリガンドは二つの範疇に入る。即ち、配位原子として窒素原子、酸素原子、硫黄原子、炭素原子またはリン原子(金属イオンに応じて)を使用するリガンド(文献では一般にシグマ(σ)ドナーと称される)、およびメタロセンリガンドのような有機金属リガンド(文献中では一般にパイ(π)ドナーと称され、ここではLmと記す)である。適切な窒素供与リガンドは当該技術において周知であり、NH;NHR;NRR’;ピリジン;ピラジン;イソニコチンアミド;イミダゾール;ビピリジンおよびビピリジンの置換誘導体;ターピリジンおよび置換誘導体;フェナントロリン、特に1,10−フェナントロリン(phenと略す)、並びに4,7−ジメチルフェナントロリンおよびジピリド [3,2−a: 2’,3’−c] フェナジン(dppzと略す)のようなフェナントロリンの置換誘導体;ジピリドフェナジン; 1,4,5,8,9,12−ヘキサアザトリフェニレン(hatと略す);9,10−フェナントレンキノンジイミン(phiと略す);1,4,5,8−テトラアザフェナントレン(tapと略す); 1,4,8,11−テトラアザシクロテトラデカン(cyclamと略す)、EDTA、EGTA およびイソシアニドが含まれるが、これらに限定されない。融合誘導体を含む適切な誘導体を使用してもよい。
【0263】
幾つかの実施例では、ポルフィリンおよびポルフィリン科の誘導体を使用してもよい。例えば、Comprehensive Coordination Chemistry, Ed. Wilkinson et al., Pergammon Press, 1987, Chapters 13. 2 (pp73−98), 21.1 (pp. 813−898) and 21.3 (pp 915−957)を参照されたい。これらの全てを、本明細書の一部として本願に明示的に援用する。
【0264】
炭素、酸素、硫黄およびリンを使用した適切なシグマ供与リガンドが、当該技術において知られている。例えば、適切なシグマ炭素供与体は、本明細書の一部として援用するCotton and Wilkenson, Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, 1988に記載されている。例えば38頁を参照されたい。同様に、適切な酸素リガンドには、クラウンエーテル、水、その他が当該技術で既知のものが含まれる。また、ホスフィンおよび置換ホスフィンも適している。Cotton and Wilkenson.の第38頁を参照されたい。
【0265】
酸素供与性、硫黄供与性、リン供与性および窒素供与性のリガンドは、該ヘテロ原子を配位原子として働かせるように結合する。
【0266】
好ましい実施例では、有機金属リガンドが使用される。酸化還元部分として使用するための純粋な有機化合物、およびヘテロ環もしくは環外置換基のようなドナー原子とσ結合した、有機リガンドとの種々の遷移金属配位錯体に加えて、π結合した有機リガンドを有する広範な遷移金属有機金属化合物が利用可能である(本明細書の一部として明示的に援用する、Advanced Inorganic Chemistry, 5th Ed., Cotton & Wilkinson, John Wiley & Sons, 1988, chapter 26; Organometallics, AConcise Introduction, Elschenbroich et al., 2nd Ed., 1992, VCH; and Comprehensive Organometallic Chemistry II, A Review of the Literature 1982−1994, Abel et al. Ed., Vol. 7, chapters 7, 8,10 & 11, Pergamon Pressを参照されたい)。このような有機金属リガンドには、ビス(シクロペンタジエニル)金属化合物(即ち、メタロセン)を生じるシクロペンタジエニド陰イオン[C (−1)]、並びにインデニリド陰イオン(−1)のような種々の環置換体および環融合体が含まれる。例えば、本明細書の一部として援用するRobins et al., J. Am. Chem. Soc. 104: 1882−1893 (1982);およびGassman et al., J. Am. Chem. Soc. 108: 4228−4229 (1986)を参照されたい。これらのうちで、フェロセン[(CFe]およびその誘導体はプロトタイプ的な例であり、化学(本明細書の一部として援用するConnelly et al., Chem. Rev. 96: 877910 (1996))、電気化学(本明細書の一部として援用するGeiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 23: 1−93;およびGeiger et al., Advances in Organometallic Chemistry 24: 87)、電子移動またはは「酸化還元」反応において広範に使用されている。第一列、第二列および第三列の種々の遷移金属のメタロセン誘導体は、核酸のリボース環またはヌクレオシド塩基に共有結合される酸化還元部分としての有望な候補である。他の有力かつ適切な有機金属リガンドは、ビス(アレーン)金属化合物[ビス(ベンゼン)クロムはプロトタイプ的な例である]を生じるベンゼン、およびその環置換誘導体および融合環誘導体のような環状アレーンを含む。アリル(−1)イオンまたはブタジエンのような他のアクリルπ結合リガンドは、有力且つ適切な有機金属化合物を生じ、このような全てのリガンドは、他のπ結合およびシグマ結合リガンドと共に、金属から炭素への結合が存在する一般的な有機金属化合物類を構成する。このような化合物の種々の二量体およびオリゴマーの研究において、ブリッジ形成有機リガンド、および追加の非ブリッジ形成リガンド、並びに金属−金属結合を有するもの及び有さないものは、核酸分析における酸化還元部分の有力な候補である。
【0267】
一以上の共リガンドが有機金属リガンドであるとき、該リガンドは、一般的には該有機金属リガンドの炭素原子の一つを介して結合されるが、この結合は、ヘテロ環リガンドの他の原子を介したものであってもよい。好ましい有機金属リガンドにはメタロセンリガンドが含まれ、これは置換誘導体およびメタロセンオーファンを含む(上記Cotton and Wlkensonの第1174頁を参照されたい)。メタロセンの安定性を増大させるために、例えば、メチルシクロペンタジエニルのようなメタロセンリガンドの誘導体(ペンタメチルシクロペンタジエニルのような複数のメチル基が好ましい)を使用することができる。好ましい実施例においては、メタロセンの二つのメタロセンリガンドのうちの一方のみが誘導体化される。
【0268】
ここで述べるように、如何なる組合せのリガンドを使用してもよい。好ましい組合せには、a)全てのリガンドが窒素供与性リガンドであるもの;b)全てのリガンドが有機金属リガンドであるもの;およびc)結合リンカーの末端におけるリガンドがメタロセンリガンドであり、且つ核酸によって与えられるリガンドが窒素供与性リガンドであり、必要であれば他のリガンドは窒素供与性リガンドまたはメタロセンリガンドであるもの;またはこれらの混合物が含まれる。構造式3の導電性オリゴマーを使用したこれらの組合せは、構造式27(代表的なリガンドとしてフェナントロリンおよびアミノを使用する)、構造式28(金属−リガンドの組合せとしてフェロセンを使用する)、および構造式29(代表的リガンドとしてシクロペンタジエニルおよびアミノを使用する)に示されている。
構造式27
【化27】
構造式28
【化28】
構造式29
【化29】
【0269】
ここでも、アルキル基のような他の結合リンカーを利用してもよい。
好ましい実施例において、本発明において使用されるリガンドは、キレート化された金属イオンの酸化還元状態に応じて、変更された蛍光特性を示す。従って、以下で述べるように、これはETMと電極との間の電子移動のための追加の検出モードとして働く。
【0270】
加えて、タンパク質を検出電極に結合するために同様の方法を使用することができる。例えば、本明細書の一部として援用する米国特許第5,620,850号を参照されたい。
【0271】
好ましい実施例においては、以下で更に充分に説明するように、核酸に結合されたリガンドは、リボース−リン酸骨格におけるリボースの2’位置または3’位置に結合されたアミノ基である。このリガンドは、金属イオンに結合する多座配意のリガンドを形成するように、複数のアミノ基を含んでいる。他の好ましいリガンドには、シクロペンタジエンおよびフェナントロリンが含まれる。
【0272】
好ましい実施例において、捕捉プローブ核酸(または他の結合性リガンド)は、絶縁体を介して電極に共有結合される(即ち、結合リンカーは絶縁体である)。アルキル基のような絶縁体への核酸(および他の結合性リガンド)の結合は周知であり、塩基もしくは骨格(これら部分を含む骨格のリボースまたはリン酸を含む)、または核酸類縁体の別の骨格に対して行うことができる。
【0273】
好ましい実施例においては、表面に一以上の異なる捕捉プローブ種が存在していてもよい。幾つかの実施例においては、以下で更に充分に説明するように、一つの種類の捕捉プローブ、または一つの種類の捕捉延長プローブが存在してもよい。或いは、異なる捕捉プローブ、または複数の異なる捕捉延長プローブを備えた一つの捕捉プローブを使用することができる。同様に、比較的短いプローブ配列を含む補助的捕捉プローブを使用することが望ましいかもしれない(特に、機構2のシステムにおける核酸アナライトおよび結合性リガンドの場合)。この比較的短い配列は、該システムの成分、例えば新しい動員リンカー(recruitment linker)を「取り付け」て、表面でのETM濃度を増大させるために使用できるものである。
【0274】
好ましい実施例において、捕捉プローブの数は、核標的配列について設計および使用される。即ち、アレイの一つの電極パッドは、標的アナライトに対して一つのプローブを有していてもよく、または同じ標的配列に対して複数のプローブ(好ましくはオーバラップしないものであるが、それが必要とされる訳ではない)を有していてもよい。これは長い標的配列の場合に特に好ましい。この実施例において、少なくとも二つの異なる捕捉プローブが使用され、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、または10が好ましく、8が特に好ましい。
【0275】
従って、本発明は、標的検出システムにおいて有用な単分子層および捕捉結合性リガンドを含んでなる少なくとも一つの検出電極を具備した基板を提供する。好ましい実施例において、該組成物は更に、溶液または可溶性結合性リガンドを含んでいるが、以下で更に充分に説明するように、機構1のシステムについては、非共有結合的ハイブリダイゼーション指標の形態のETMを加えてもよい。溶液結合性リガンドは、それが標的アナライトに対して好ましくは特異的に結合する点において、捕捉結合性リガンドと同様である。溶液結合性リガンド(標的アナライトが核酸であるとき、ここでは一般にラベルプローブと称する)は、捕捉結合性リガンドと同じであっても異なっていてもよい。一般に、溶液結合性リガンドは、当該表面に対して直接には結合されない。この溶液結合性リガンドは、少なくとも一つのETMを含む動員リンカーを直接含んでいてもよく(60/190,259の図4A)、または動員リンカーは溶液結合性リガンドに直接的(図4A)または間接的(図4E)に結合する。
【0276】
従って、共有結合されたETMを含んだ動員リンカーを有する、「溶液結合性リガンド」または「可溶性結合リガンド」または「信号キャリア」または「ラベルプローブ」または「ラベル結合性リガンド」が提供される。即ち、ラベルプローブまたは溶液結合性リガンドの一部は、直接的または間接的に標的アナライトに結合し、一部は共有結合的に結合されたETMを含む動員リンカーを含んでいる。これらは、幾つかのシステム、例えば機構1の核酸システムにおいて同様である。同様に、機構1のシステムにおいて。動員リンカーは、検出プローブにハイブリダイズする核酸を含んでいる。ここでの「電子供与体部分」、「電子受容体部分」および「ETM」(ETM)の用語または文法的均等語は、一定の条件下で電子移動できる分子を意味する。電子供与体及び電子受容体の能力は相対的であることが理解されるべきである;即ち、一定の実験条件下で電子を失うことができる分子が、異なる実験条件下においては電子を受容することができるであろう。多くの可能な電子供与体部分および電子受容体部分は非常に大きいこと、および電子移動化合物の当業者は、本発明において多くの化合物を利用できるであろうことを理解すべきである。好ましいETMには、遷移金属錯体、有機ETMおよび電極が含まれるが、これらに限定されない。
【0277】
好ましい実施例において、ETMは遷移金属錯体である。遷移金属は、それらの原子が部分的または完全な電子のd殻を有するものである。本発明に使用するための適切な遷移金属は、上記に列記されている。
遷移金属は、上記で定義した種々のリガンドLと共に錯化されて、当該技術において周知の適切な遷移金属錯体を形成する。
【0278】
好ましいETMはメタロセン、特にフェロセンを含んでなるものである。
遷移金属金属錯体に加えて、他の有機電子供与体および受容体が、本発明において使用するための核酸に共有結合される。これらの有機分子には、リボフラビン、キサンテン色素、アジン色素、アクリジンオレンジ、N,N’−ジメチル−2,7−ジアザピレニウム二塩化物(DAP2+)、メチルビオロゲン、臭化エチジウム、N,N’−ジメチルアントラ(2,1,9−def.6,5,10−d’e’f)ジイソキノリン二塩化物(ADIQ2+)のようなキノン類、ポルフィリン[メソ−テトラキス(N−メチル−x−ピリジニウム)ポルフィリン四塩化物]、バルラミン青B、ビンドシェドラー緑(Bindschedler’s green)、2,6−ジクロロフェノールインドフェノール、2,6−ジブロモフェノールインドフェノール、ブリリャントクレスト青(3−アミノ−9−ジメチル−アミノ−10−メチルフェノキシアジン塩化物)、メチレンブルー、ナイル青A(アミノナフトジエチルアミノフェノキサジン硫酸)、インジゴ−5,5’,7,7’−テトラスルホン酸、インジゴ−5,5’,7−トリスルホン酸、フェノサフラニン、インジゴ−5−モノスルホン酸、サフラニンT、びす(ジメチルグリオキシマト)鉄(II)塩化物、インジュリン緋色、中性赤、アントラセン、コロネン(coronene)、ピレン、9−フェニルアントラセン、ルブレン(rubrene)、ビナフチル、DPA、フェノチアゼン、フルオランテン、フェナントレン、クリセン、1,8−ジフェニル−1,3,5,7−オクタテトラセン、ナフタレン、アセナフタレン、ペリレン、TMPD、およびこれら化合物の類縁体および置換誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【0279】
一つの実施例において、電子供与体および電子受容体は、当該技術において既知の酸化還元タンパク質である。しかし、多くの実施例において酸化還元タンパク質は好ましくない。
【0280】
特定のETMの選択は、以下で一般的に概説するように、電子移動検出の種類によって影響されるであろう。好ましいETMはメタロセンであり、フェロセンが特にこのましい。
【0281】
従って、本発明は、核酸および他の標的アナライトの検出に有用な方法および組成物を提供する。当業者が理解するように、本発明の組成物は、広範な構成で採用することができる。以下で更に充分に概説するように、本発明の好ましいシステムは次のように動作する。標的核酸配列は、(ハイブリダイゼーションにより)一般には導電性オリゴマーを含む単分子層を備えた電極に結合される。この結合は、当該表面上の捕捉プローブに対して直接行うことができ、または捕捉延長プローブを使用して間接的に行うことができる。幾つかの実施例において、標的配列自身はETMを含んでいる。或いは、次いでアッセイ複合体を形成するラベルプローブが追加される。該ラベルプローブの結合は直接的(即ち、標的配列の一部に対するハイブリダイゼーション)、または間接的(即ち、標的配列にハイブリダイズする増幅プローブに対するハイブリダイゼーション)であってよく、全ての必要な核酸がアッセイ複合体を形成する。ラベルプローブにおける第一の部分のハイブリダイゼーションの結果として、ETMを含むラベルプローブの第二の部分、即ち、「動員リンカー」が電極のSAM表面に空間的に近接されて、ETMの存在を電気的に検出することができる。
【0282】
従って、好ましい実施例において、本発明は、核酸(または他の標的アナライト)検出システムにおいて有用な、SAM形成種および捕捉プローブを含む単分子層を備えた電極を提供する。好ましい実施例において、当該組成物は更に、ラベルプローブを含有する。該ラベルプローブは、一般には一本鎖の核酸であるが、以下で更に充分に概説するように、二本鎖部分を含んでいてもよい。機構2のシステムにおいて、該ラベルプローブは、下記で定義するアッセイ複合体の成分にハイブリダイズできる第一の部分、およびアッセイ複合体の成分にハイブリダイズせず、且つ少なくとも一つの共有結合したETMを含む第二の部分を備えている。
【0283】
理論に拘束されるものではないが、「機構2」のシステムにおいては、ETMが単分子層の中にある程度貫通できる(「寄添う」)ときは、電子移動が促進されるように思える。即ち、一般に、疎水性SAMと共に使用される疎水性ETMは、帯電し、またはより親水性であるETMよりも、良好な(大きな)信号を生じると思われる。従って、例えば、溶液中のフェロセンは、この例の単分子層を貫通でき、電極が存在するときには信号を与えることができるのに対して、溶液中のフェロシアニドは僅かにしか、または全く信号を生じない。従って、一般に、機構2のシステムでは疎水性ETMが好ましいが、一以上の疎水性リガンドを有するRuおよびOs錯体のような遷移金属錯体もまた、帯電してはいるが、良好な信号を生じる。同様に、ETMと電極との間の電子移動は、リンカーまたはスペーサの使用によって促進され、これは単分子層の中に貫入するためにETMを幾分可撓性にする。従って、本発明のN6組成物は、ETMを核酸に結合する4炭素リンカーを有する。
【0284】
好ましい実施例では、複数のETMが使用される。複数のETMの使用は、信号増幅を提供し、従ってより感度のよい検出限界を可能にする。以下で述べるように、相補鎖に対してハイブリダイズする核酸上での複数のETMの使用は、結合の数および部位、並びに複数のETM間の間隔に応じてハイブリダイゼーション複合体のTmの減少を生じ得るが、ETMが動員リンカー上にあるとき、これは相補的配列に対してハイブリダイズしないから、このことは要因にはならない。従って、複数のETMが好ましく、動員リンカー当り少なくとも約2のETMが好ましく、少なくとも約10が特に好ましく、少なくとも約20〜50が特に好ましい。幾つかの例では、非常に大きな数(100〜1000)のETMを使用することができる。
【0285】
当業者が理解するように、ETMを含むラベルプローブ(または幾つかの実施例では標的)の一部(ここでは「動員リンカー」または「信号キャリア」と言う)は核酸であることができ、或いは、それはラベルプローブの第一のハイブリダイズ可能な部分をETMに結合する核酸リンカーであることができる。即ち、ラベルプローブのこの部分はハイブリダイゼーションには必要とされないので、それは核酸である必要はないが、これは合成の容易さのためにそうであってもよい。幾つかの実施例においては、以下でさらに十分に概説するように、動員リンカーは二本鎖部分を含んでいてもよい。従って、当業者が理解するように、使用できる種々の構成が存在する。好ましい実施例において、動員リンカーは核酸(類縁体を含む)であり、ETMの結合は、(1)塩基;(2)リボース、リン酸、または核酸類縁体での匹敵する構造を含む骨格;(3)以下で述べるヌクレオシド置換;または(4)以下で述べるメタロセンポリマーを介したものであることができる。好ましい実施例において、動員リンカーは非核酸であり、メタロセンポリマーまたはETM置換基を含むアルキル型ポリマー(以下で更に詳細に述べるようにヘテロアルキルを含む)であることができる。これらのオプションは、図に一般的に示されている。
【0286】
好ましい実施例において、動員リンカーは核酸であり、共有結合したETMを含んでいる。このETMは、種々の位置で核酸内のヌクレオシドに結合されればよい。好ましい実施例には、(1)ヌクレオシドの塩基への結合、(2)塩基置換としてのETMの結合、(3)リボース−リン酸骨格のリボース、リン酸部分、または核酸類縁体における類似構造への結合、および(4)メタロセンポリマーを介しての結合が含まれ、後者が好ましいが、これらに限定されない。
【0287】
加えて、以下で述べるように、動員リンカーが核酸であるときは、一次ラベルプローブの一部とハイブリダイズする第一の部分、およびここで定義する動員リンカーを含む第二の部分を有する二次ラベルプローブを使用することが望ましい。これは、米国特許出願60/190,259号の図16Hに一般的に記載されている。
【0288】
好ましい実施例では、結合リンカーの結合について上記で一般的に概説したように、ETMは核酸の塩基に結合される。結合は、内部ヌクレオシドまたは末端ヌクレオシドに対して行うことができる。
【0289】
塩基への共有結合は、選択されるETMに一部依存するであろうが、一般には、上記で述べた導電性オリゴマーの塩基への結合と同様である。結合は、一般には塩基の如何なる位置に対して行われてもよい。好ましい実施例では、ETMは遷移金属錯体であり、従って適切な金属リガンドの塩基への結合は、ETMの共有結合を導く。或いは、当業者が理解するように、同じタイプのリガンドが有機ETMの結合のために使用できるかもしれない。
【0290】
一つの実施例では、シトシンのC4結合アミノ基、アデニンのC6結合アミノ基、またはグアニンのC2結合アミノ基を遷移金属リガンドとして使用してもよい。
【0291】
芳香族基を含むリガンドは、当該技術において知られているように、アセチレン結合を介して結合することができる(本明細書の一部として援用するComprehensive Organic Synthesis, Trost et al., Ed., Pergamon Press, Chapter 2. 4: Coupling Reactions Between Sp2 and sp Carbon Centers, Sonogashira, pp521−549, and pp950−953を参照されたい)。構造式30は、金属イオンおよび他の何れか必要なリガンドにおける代表的な構造を示している。構造式30はウリジンを示しているが、ここでの全ての構造についてと同様に、他の如何なる塩基を使用してもよい。
構造式30
【化30】
【0292】
はリガンドであり、これには窒素、酸素、硫黄もしくはリン供与性リガンド、またはメタロセンリガンドのような有機金属リガンドが含まれてよい。適切なLリガンドには、フェナントロリン、イミダゾール、ビピリジン(bpy)、およびターピリジン(terpy)が含まれるが、これらに限定されない。LおよびMは上記で定義した通りである。当業者が理解するように、ここでも、リンカー(「Z」)を核酸とETMの間に含めてもよい。
【0293】
同様に、結合リンカーについてと同様に、この連結は、アミド結合を利用できるリンカーを用いて行うことができる(一般には、本明細書の一部として援用するTelser et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 7221−7226 (1989);Telser et al., J. Am. Chem. Soc. 111: 7226−7232 (1989)を参照されたい)。これらの構造は、下記の構造式31に一般的に示されており、ここでも塩基としてウリジンが使用されているが、上記で述べたように、他の塩基を使用してもよい。
構造式31
【化31】
【0294】
この実施例において、Lは上記で定義したリガンドであり、LrおよびMもまた上記で定義した通りである。好ましくは、Lはアミノ、phen、byr、およびterpyである。
【0295】
好ましい実施例において、ヌクレオシドに結合したETMはメタロセンである。即ち、構造式31におけるLおよびLは両者共にメタロセンリガンドであり、Lは上記で述べた通りである。構造式32は、メタロセンがフェロセンであり、塩基がウリジンである好ましい実施例を示しているが、他の塩基を使用してもよい。
構造式32
【化32】
【0296】
予備的データは、構造式32は、第二のアセチレン炭素原子がカルボニル酸素を攻撃してフラン様構造を形成することにより、環化し得ることを示唆している。好ましいメタロセンにはフェロセン、コバルトセンおよびオスミウモセンが含まれる。
【0297】
好ましい実施例において、ETMは核酸におけるリボース−リン酸骨格の何れかの位置、即ち、5’もしくは3’末端または何れかの内部ヌクレオシドにおいてリボースに結合される。この場合のリボースには、リボース類縁体が含まれる。当該技術で知られているように、2’もしくは3’位の何れかで修飾されるヌクレオシドを作製でき、窒素、酸素、硫黄、およびリンを含む修飾が可能である。アミノ修飾および酸素修飾されたリボースが好ましい。一般的には、本明細書の一部として援用するPCT公開公報WO 95/15971を参照されたい。これらの修飾基は、当業者が理解するように、遷移金属リガンドとして使用してもよく、或いは他の遷移金属リガンドおよび有機金属リガンドを結合するための化学的官能部分として、または有機電子供与対部分として使用してもよい。この実施例において、「Z」についてここに示したようなリンカー、またはリボースとETMとの間の導電性オリゴマーを使用してもよい。好ましい実施例は、リボースの2’位もしくは3’位での結合を利用し、2’位が好ましい。従って、例えば構造式13、構造式14および構造式15に示した導電性オリゴマーは、ETMで置換えてもよく、或いは導電性オリゴマーの自由末端にETMを加えてもよい。
【0298】
好ましい実施例においては、メタロセンはETMとして働き、また下記の構造式33に示すようにアミド結合を介して結合される。この例は、メタロセンがフェロセンであるときの好ましい化合物の合成を概説している。
構造式33
【化33】
【0299】
好ましい実施例においては、構造式34に一般的に示すように、アミン結合が使用される。
構造式34
【化34】
【0300】
Zは、ここで定義したリンカーであり、1〜16原子が好ましく、2〜4原子が特に好ましい。Tは、1または0である。
好ましい実施例においては、構造式35に一般的に示すようにオキソ結合が用いられる。
構造式35
【化35】
【0301】
構造式35において、Zはここで定義したリンカーであり、tは1または0である。好ましいZリンカーには、(CHおよび(CHCHO) のような、ヘテロアルキル基を含むアルキル基が含まれる。ここで、nは1〜10が好ましく、n=1〜4が特に好ましく、n=4が更に好ましい。
他のヘテロ原子を利用する結合もまた可能である。
【0302】
好ましい実施例において、ETMは核酸のリボース−リン酸骨格の何れかの位置にでリン酸に結合される。これは種々の方法で行うことができる。一つの実施例では、ホスホルアミド結合またはホスホルアミダイト結合のような燐酸ジエステル結合類縁体を核酸の中に組込んでもよく、ここでのヘテロ原子(即ち窒素)は遷移金属リガンドとして働く(本明細書の一部として援用するPCT公開公報WO 95/15971を参照されたい)。
【0303】
或いは、構造式23および構造式24に示した導電性オリゴマーを、ETMで置換えてもよい。好ましい実施例において、当該組成は構造式36に示した構造を有する。
構造式36
【化36】
【0304】
構造式36において、ETMは、一般的にはリンカーZの使用により、リン酸結合を介して結合される。
好ましいZリンカーには、(CHおよび(CHCHO) のような、ヘテロアルキル基を含むアルキル基が含まれる。ここで、nは1〜10が好ましく、n=1〜4が特に好ましく、n=4が更に好ましい。
【0305】
ETMがヌクレオシドの塩基または骨格に結合されるときは、以下で更に充分に概説するように、「デンドリマー」構造を介してETMを結合することが可能である。図に一般的に示すように、アルキルに基づくリンカーを使用して、各分枝の末端に1以上のETMを含む多重分岐構造を作製することができる(しかし、内部のETMの同様に使用できる)。これは一般に、複数のヒドロキシ基を含む複数の分岐点を形成し、次いでこれ使用して更なる分岐点を追加することにより行われる。次いで、ヌクレオシド置換およびメタロセンポリマー反応について以下で一般的に行われるように、ホスオルアミダイト反応において末端ヒドロキシ基を使用してETMを付加することができる。この分岐点は、内部分岐点または末端分岐点にあってよく、また化学的分岐点またはヌクレオシド分岐点であってもよい。
【0306】
好ましい実施例において、メタロセンのようなETMが「ヌクレオシド代替物」として使用され、ETMとして作用する。例えば、フェロセンの二つのシクロペンタジエン間の距離は、二本鎖核酸における二つの塩基の間の直交距離に類似している。フェロセンに加えて、他のメタロセン、例えばコバルトまたはルテニウムを含むメタロセンのような空気安定性メタロセンを使用してもよい。従って、構造式27(リボース−リン酸骨格を有する核酸)および構造式38(ペプチド核酸骨格)に一般的に示したように、メタロセン部分を核酸の骨格中に組込んでもよい。構造式37および構造式38はフェロセンを示しているが、当業者が理解するように、他のメタロセンを使用してもよい。一般に、金属としてルテニウムおよびコバルトを利用したメタロセンを含む空気安定性メタロセンが好ましい。
構造式37
【化37】
【0307】
構造式37において、Zは上記で定義したリンカーであり、一般的には、酸素のようなヘテロ原子を含む短鎖アルキル基が好ましい。一般に、以下で更に充分に説明するように、重要なのは、二本鎖核酸の最小の外乱が生じるようなリンカーの長さである。従って、メチレン、エチレン、エチレングリコール、プロピレン、ブチレンは全て好ましく、エチレンおよびエチレングリコールが特に好ましい。加えて、各Zリンカーは同じでも異なってもよい。構造式37はリボース−リン酸骨格を示しているが、当業者が理解するように、リボース類縁体およびリン酸エステル結合類縁体を含む核酸類縁体を使用してもよい。
構造式38
【化38】
【0308】
構造式38において、好ましいZ基は上記に列記した通りであり、ここでも、各Zリンカーは同じでも異なってもよい。上記の通り、他の核酸類縁体も同様に使用してよい。
【0309】
更に、上記の構造および議論はメタロセン、特にフェロセンを示しているが、この同じ一般的アイディアを使用して、メタロセンの外にETMを、ヌクレオシド代替物として、または以下で述べるようなポリマー実施例において加えることができる。従って、例えばETMがメタロセン以外の遷移金属錯体であり、1、2もしくは3(またはそれ以上)のリガンドを含むときは、追加のホスホルアミダイト基の追加を可能にするために、フェロセンについて示したのと同様に、これらリガンドを官能化することができる。この実施例において特に好ましいのは、少なくとも二つの環(例えばアリールおよび置換アリール)リガンドを含む錯体であり、ここでのリガンドの夫々は、ホスホルアミダイト化学を介して結合するための官能基を含んでいる。当業者が理解するように、ここで発生する信号の増大を可能にするために、核酸骨格の一部または核酸の「側鎖基」としてETMのポリマーを形成するこのタイプの反応は、実際には正しい化学基を含むように官能化できる如何なるETMを用いても行うことができる。
【0310】
従って、フェロセンのようなメタロセン(または他のETM)を核酸骨格の中に挿入することによって、核酸類縁体が作製される。即ち、本発明は、少なくとも一つのメタロセンを含む骨格を有する核酸を提供する。これは骨格(即ち、リボース、リン酸等)に結合されたメタロセンを有する核酸とは区別される。即ち、夫々が従来の核酸または類縁体から製造された二つの核酸(この場合の核酸は一つのヌクレオシドを含む)は、メタロセンを介して相互に共有結合される。別の見方をすれば、メタロセン誘導体または置換メタロセンが提供され、ここではメタロセンの二つの芳香族環の夫々が核酸置換基を有する。
【0311】
加えて、以下で更に充分に概説するように、ヌクレオチドが隣接するメタロセンの間にあり、および/またはヌクレオチドが隣接するメタロセンを有するように、二以上のメタロセンを骨格の中に組込むことが可能である。隣接するメタロセンが骨格に加えられるとき、これは以下で「メタロセンポリマー」として説明する方法に類似している。即ち、骨格内にメタロセンポリマーの領域が存在する。
【0312】
核酸置換基に加えて、幾つかの例では、メタロセン(またはETM)の芳香環の一方または両方に追加の置換基を加えるのが望ましい。例えば、ヌクレオシド代替物は一般に、実質的に相補的な核酸(例えば標的配列またはもう一つのプローブ配列)とハイブリダイズするプローブ配列の一部であるから、対向鎖上にある一つまたは複数の塩基への水素結合を促進するために、メタロセン環に置換基を加えることが可能である。これらは、メタロセン環の何れの位置に加えられてもよい。適切な置換基には、アミド基、アミン基、カルボン酸、およびアルコール(置換アルコールを含む)が含まれるが、これらに限定されない。加えて、これら置換基をリンカーを介して結合することもできるが、これは一般に好ましくない。
【0313】
加えて、ETM上の置換基、特にフェロセンのようなメタロセンは、ETMの酸化還元特性を変更するために加えてもよい。従って、例えば幾つかの実施例においては、以下で更に充分に述べるように、異なるプローブ上に異なる方法(即ち、塩基もしくはリボース結合)で結合された、または異なる目的(例えばキャリブレーションのため、または中間鎖として)のための、異なるETMを有することが望ましい。こうして、メタロセン上での置換基の追加は二つの異なるETMを区別することを可能にする。
【0314】
これらメタロセン骨格の核酸類縁体を作成するために、中間体成分もまた提供される。従って、好ましい実施例において、本発明は、構造式39に一般的に示したホスホルアミダイトメタロセンを提供する。
構造式39
【化39】
【0315】
構造式39において、PGは核酸合成に使用するために適した保護基であり、DMT、 MMTおよびTMT が全て好ましい。芳香族環は、メタロセンの環であってもよく、または遷移金属錯体のリガンドもしくは他の有機ETMの芳香族環であってもよい。これらの芳香族環は同じでも異なっていてもよく、また以下で述べるように置換されていてもよい。
構造式40は、フェロセン誘導体を示している。
構造式40
【化40】
【0316】
これらのホスホルアミダイト類縁体は、当該技術で知られている標準のオリゴヌクレオチドに加えることができる。
【0317】
構造式41は、フェロセンペプチド核酸(PNA)モノマーを示しており、これは当該技術において知られているPNA合成に加えることができる。
構造式41
【化41】
【0318】
構造式41において、PGはペプチド核酸合成に使用するの適した保護基であり、MMT、bocおよびFmoc が好ましい。.
これら同じ中間体化合物を使用して、ETMまたはメタロセンポリマーを形成することができ、以下で更に充分に説明するように、これらは骨格代替物としてではなく核酸に加えられる。
【0319】
好ましい実施例において、これらETMは、修飾された官能化ヌクレオチドを用いて、例えばここに概説し、または米国特許第5,124,246号に概説された「分岐DNA」の実施例と同様の「分岐」構成で、メタロセンポリマーとしてポリマーに結合される。この一般的アイディアは次の通りである。最終的には遊離ヒドロキシ基を含むことができる修飾されたホスホルアミダイトヌクレオチドが作製され、これはメタロセンのようなホスホルアミダイトETMの結合に使用できる。
【0320】
この遊離ヒドロキシ基は、塩基または骨格、例えばリボースまたはリン酸(当業者が理解するように、他の構造を含む核酸類縁体を使用することもできる)上に結合することができるであろう。この修飾ヌクレオチドが核酸の中に挿入され、何れかのヒドロキシ保護基が除去されて、遊離ヒドロキシ基が残される。メタロセンのようなホスホルアミダイトETMを追加する際には、構造式39および構造式40において上述したように、メタロセンETMのようなETMが加えられる。特にフェロセンについてここに示した「メタロセンポリマー」を含む「ETMポリマー」を形成するために、メタロセンのような追加のホスホルアミダイトETMを加えることができる。更に、幾つかの実施例では、ポリマーの末端ETMへの「キャッピング」基、例えば図12に一般的に示すようにメタロセンに最終リン酸基を付加することにより、当該ポリマーの溶解度を増大させるのが望ましい。溶解度を高めるための他の適切な「キャッピング」基は、当業者によって理解されるであろう。これらの溶解度向上基はリガンド環を含む他の場所で、例えばここで述べるようにメタロセン上においてポリマーに付加することができる。
【0321】
好ましい実施例においては、(米国特許出願09/626,096号の図に示したように)保護されたヒドロキシを含めるために、先ずホスホルアミダイトヌクレオチドにおけるリボースの2’位が官能化される。この場合はオキソ結合を介しているが、Zリンカーについてここで一般的に述べたように、如何なる数のリンカーを使用してもよい。次いで、この保護されたヌクレオチドは標準のホスホルアミダイト化学を介して、成長しつつある核酸の中に組込まれる。保護基が除去され、これにより生じた遊離ヒドロキシ基は、再度標準のホスホルアミダイト化学を使用して、フェロセンのようなホスホルアミダイトメタロセンを加えるために用いられる。核酸類縁体についても同様の反応が可能である。例えば、ペプチド核酸および構造式41に示したメタロセンモノマーを使用して、メタロセンポリマーを含むペプチド核酸構造を形成することができるであろう。
【0322】
従って、本発明は、図12および図13に一般的に示したメタロセンポリマーの「分枝」を含む核酸の動員リンカーを提供する。また、好ましい実施例は、長さが1〜約50メタロセン、好ましくは約5〜約20、特に好ましくは約5〜約10の長さのメタロセンポリマーを利用する。
加えて、動員リンカーが核酸であるときは、ETM結合の如何なる組合せを行ってもよい。
【0323】
好ましい実施例では、動員リンカーは核酸ではなく、その代りに何れかのリンカーまたはポリマーであってもよい。当業者が理解するように、一般には、ETMを含むように修飾できる如何なるリンカーまたはポリマーも使用することができる。一般には、これらのポリマーまたはリンカーは合理的に可溶性であるべきであり、またETMを付加するための適切な官能基を有するべきである。
【0324】
ここで使用する「動員ポリマー」は、共有結合された少なくとも二つまたは三つのサブユニットを含んでなるものである。これらモノマーサブユニットの少なくとも或る部分は、ETMの共有結合のための官能基を含んでいる。幾つかの実施例にでは、サブユニットにETMを共有結合させるために、カップリング部分が用いられる。結合のための好ましい官能基はアミノ基、カルボキシ基、オキソ基、およびチオール基であり、アミノ基が特に好ましい。当業者が理解するように、広範な動員ポリマーが可能である。
【0325】
適切なリンカーには、ヘテロアルキルリンカー(ポリエチレングリコール型構造を含む)、置換アルキルリンカー、アリールアルキルリンカー等を含むアルキルリンカーが含まれるが、これらに限定されない。ポリマーについて上記したように、これらリンカーはETMを結合するための一以上の官能基を含むであろう。これは、当業者が理解するように、例えば周知のホモもしくはヘテロ二官能リンカー(本明細書の一部として援用する1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross−linkers, pages 155−200を参照されたい)を使用することによって行われるであろう。
【0326】
適切な動員ポリマーには、アミノスチレンのような官能化スチレン、官能化デキストランおよびポリアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。好ましいポリマーは、ポリリジンのようなポリアミノ酸(ポリDアミノ酸およびポリLアミノ酸の両方)であり、リジンおよび他のアミノ酸を含むポリマーが特に好ましい。他の適切なポリアミノ酸は、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リジンとグルタミンもしくはアスパラギン酸との共重合体、並びにリジンとアラニン、チロシン、フェニルアラニン、セリン、トリプトファンおよび/またはプロリンとの共重合体である。
【0327】
好ましい実施例において、動員リンカーは上記で述べたメタロセンポリマーを含んでなるものである。
ラベルプローブへの動員リンカーの結合は、当業者が理解するように、動員リンカーの組成に依存するであろう。動員リンカーが核酸であるとき、それは一般に、ラベルプローブの第一の部分を合成する際に形成され、必要に応じてETMを含有するヌクレオシドが組込まれる。或いは、ラベルプローブの第一の部分および動員リンカーは別々に作製され、次いで結合される。例えば、二本鎖核酸の区画を形成する相補的な重なり区画が存在し、次いで、これは例えば当該技術において公知のソラレン(psoralen)によって化学的に架橋することができる。
【0328】
非核酸動員リンカーが使用されるとき、該動員リンカーにおけるリンカー/ポリマーの結合は、一般には、当業者が理解するような標準的な化学的技術を使用して行われるであろう。例えば、アルキルに基づくリンカーが使用されるとき、この結合は、核酸への絶縁体の結合と同様であることができる。
【0329】
加えて、線形(例えばアルキルリンカーと一緒に結合された核酸切片)または分岐形態(ETMを含んでもよく、また更に分岐してもよいアルキル分枝を有する核酸)の、核酸および非核酸の混合物である動員リンカーを得ることが可能である。
【0330】
好ましい実施例において、それはETMを担持した標的核酸自身であり、ラベルプローブの動員リンカーではない。例えば、以下で更に詳細に述べるように、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の際、成長しつつある核酸の中に、本発明のETMを含む三リン酸ヌクレオチドを酵素的に付加することが可能である。当業者が理解するように、幾つかの酵素は一般に修飾核酸に寛容であるが、本発明の修飾核酸の幾つか、例えば「ヌクレオシド代替物」の実施例およびおそらく幾つかのリン酸結合は、成長しつつある核酸の中への取り込みを可能にする酵素によって認識されるかも知れず、認識されないかも知れない。従って、この実施例における好ましい結合は、ヌクレオチドの塩基またはリボースへの結合である。
【0331】
従って、当該技術において周知のように、例えば標的配列のPCR増幅は、一般に該配列の中にランダムに取り込まれたETMを含んだ標的配列を生じるであろう。従って、本発明のシステムは、米国特許出願第60/190, 259号の図16A、図16Bおよび図16Dに一般的に記載されているように、これらETMを使用した検出を可能にするように構成することができる。
【0332】
或いは、以下で更に詳細に概説するように、核酸、例えば標的核酸の末端に、ETMを含むヌクレオシドを酵素的に付加することが可能である。この実施例においては、効果的な「動員リンカー」が標的配列の末端に付加され、次いでこれを検出のために使用することができる。従って、本発明は、導電性オリゴマーおよび捕捉プローブの単分子層を備えた電極、並びにアッセイ複合体の成分にハイブリダイズできる第一の部分およびアッセイ複合体の成分にハイブリダイズしない第二の部分を含む標的配列を利用し、また少なくとも一つの共有結合した電子移動部分を含む構成を提供する。同様に、これら構成物を利用する方法もまた提供される。
【0333】
また、プローブ配列、即ち、相補的配列にハイブリダイズするように設計された配列に結合されたETMを有することも可能である。従って、ETMは非動員リンカーに結合されてもよい。例えば、アッセイ複合体の成分(例えば第一の部分)にハイブリダイズしないラベルプローブの区画、または上記で概説した標的配列に付加されたETMが存在してもよい。これらのETMは、位置およびシステムに応じて、幾つかの実施例における電子移動検出のために使用でき、または使用できない。例えば、幾つかの実施例において、例えば、米国特許出願60/190,259号の図16Aに示されているように、ランダムに組込まれたETMを含む標的配列が捕捉プローブに直接ハイブリダイズされるときは、捕捉プローブにハイブリダイズする部分にETMが存在するかもしれない。もし捕捉プローブが導電性オリゴマーを使用して電極に結合されれば、これらのETMは、先に述べたように電子移動を検出するために使用することができる。或いは、これらETMは特異的に検出されないかもしれない。
【0334】
同様に、幾つかの実施例では、動員リンカーが核酸であるときは、幾つかの例において、動員リンカーの幾つかまたは全てが二本鎖であるのが望ましいかもしれない。一つの実施例では、第一の動員リンカーにハイブリダイズできるような、第一の動員リンカーに対して実質的に相補的な第二の動員リンカーが存在し得る。好ましい実施例において、第一の動員リンカーは、共有結合されたETMを含んでいる。別の実施例においては、第二の動員リンカーがETMを含み、第一の動員リンカーはこれを含まず、従ってETMは、第一の動員リンカーへの第二の動員リンカーのハイブリダイゼーションによって表面に動員される。更にもう一つの実施例では、第一および第二の動員リンカーの両者がETMを含んでいる。なお、上記で述べたように、多数のETMを含む核酸は充分にハイブリダイズしないかもしれないことに留意すべきである。即ち、ETMの結合部位およびETMの特性によっては、Tmが低下する可能性がある。従って一般には、ハイブリダイズ鎖上に複数のETMを使用するときは、一般に約5未満、好ましくは約3未満が存在し、或いは、ETMは良好な反応速度を可能にするために、介在するヌクレオチドが充分にハイブリダイズできるように十分に遠くに離間されるべきである。
【0335】
一つの実施例では、非共有結合で結合されたETMを使用することができる。一つの実施例において、ETMはハイブリダイゼーションの指標である。ハイブリダイゼーション指標は、Millan et al., Anal. Chem. 65: 2317−2323 (1993): Millan et al., Anal. Chem. 662943−2948 (1994)(この両者は本明細書の一部として明示的に援用される)の方法と同様に、二本鎖核酸に優先的に且つ通常は可逆的に結合するETMとして作用する。この実施例において、表面でのETMハイブリダイゼーション指標と二本鎖核酸との結合によるETMの局所濃度の増大は、導電性オリゴマーを含む単分子層を使用してモニターすることができる。ハイブリダイゼーション指標には、インターカレータ並びにマイナーおよび/またはメジャーな溝結合部分が含まれる。好ましい実施例ではインターカレータが使用される。何故なら、インターカレーションは一般に二本鎖核酸の存在においてのみ生じ、二本鎖核酸の存在のみがETM濃度を決定するからである。インターカレート性の金属錯体ETMは当該技術において既知である。同様に、メチレン青、のようなメジャーまたはマイナーな溝結合性部分も、この実施例において使用することができる。
【0336】
同様に、本発明のシステムは、本明細書の一部として明示的に援用するNapier et al., Bioconj. Chem. 8: 906 (1997)に一般的に記載されているような、非共有結で結合されたETMを利用してもよい。この実施例では、DNAの存在の結果としての、一定の分子の酸化還元状態における変化(即ち、ルテニウム錯体によるグアニン酸化)を、導電性オリゴマーを含むSAMを使用して検出することができる。
【0337】
従って、本発明は、導電性オリゴマー(一般には捕捉プローブ、およびETMを含有する標的配列またはラベルプローブの何れかを含む)を含んでなる単分子層を備えた電極を提供する。本発明のプローブは、標的配列(以下で述べるように、サンプルの標的配列または他のプローブ配列)に対して相補的に設計され、標的配列および本発明のプローブのハイブリダイゼーションが生じるようになっている。以下で概説するようにこの相補性は完全である必要はない。即ち、標的配列と本発明の一本鎖核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害する何れかの数の塩基対ミスマッチが存在していてもよい。しかし、最低のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でさえもハイブリダイゼーションが生じ得ないほど変異が大きければ、その配列は標的配列に対して相補的ではない。ここでの「実質的に相補的」とは、通常の反応条件下でハイブリダイズするように、プローブが標的配列に対して充分に相補的であることを意味する。
【0338】
一般に、本発明の核酸組成物は、オリゴヌクレオチドプローブとして有用である。当業者が理解するように、当該プローブの長さは、標的配列の長さ並びにハイブリダイゼーションおよび洗浄条件と共に変化するであろう。一般に、オリゴヌクレオチドプローブは約8〜約50ヌクレオチドの範囲に亘り、約10〜約30が好ましく、約12〜約25が特に好ましい。幾つかの場合には、非常に長いプローブ、例えば50乃至200〜300ヌクレオチドの長さのプローブを使用してもよい。従って、ここでで述べる構造において、ヌクレオシドは核酸で置換えてもよい。
【0339】
本発明においては、高ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、および低ストリンジェンシー条件を含む種々のハイブリダイゼーション条件を使用することができる。例えば、本明細書の一部として援用するManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et alを参照されたい。このハイブリダイゼーション条件は、当該技術において知られているように、非イオン性骨格、例えばPNAを使用するときにも変化する可能性がある。加えて、標的結合の後に架橋剤を添加して、ハイブリダイゼーション複合体の二つの鎖を架橋結合、即ち共有結合してもよい。
【0340】
当業者が理解するように、本発明のシステムは、米国特許出願09/626,096号の図に一般的に示されているように(次の段落における図は、米国特許出願09/626,096号の図を参照する)、多数の異なる構成を取ることができる。一般に、使用できる三つのタイプのシステムが存在する:(1)標的配列自身がETMでラベルされるシステム(図16A、図16Bおよび図16Dを参照されたい);(2)ラベルプローブが標的配列に直接ハイブリダイズするシステム(図6Cおよび図16Hを参照されたい);および(3)ラベルプローブが、例えば増幅プローブの使用を介して、間接的に標的配列にハイブリダイズされるシステム(図16E、図16Fおよび図16Gを参照されたい)。
【0341】
一般に、核酸および他の標的アナライトの両者のための、ここに概説する全てのシステムについて、本発明は、少なくとも標的アナライトおよび捕捉結合リガンドを含んでなるアッセイ複合体を提供する。核酸標的配列について、ここでの「アッセイ複合体」とは、少なくとも一つのラベル(好ましくは本発明の電気的方法におけるETM)を含み且つ検出を可能にするプローブ、および標的を含む核酸を含んでなるハイブリダイゼーション複合体の集合を意味する。このアッセイ複合体の組成は、ここで概説する異なるプローブ成分の使用に依存する。アッセイ複合体はまた、米国特許出願09/626, 096号およびここに概説したように、使用する構成に応じて、ラベルプローブ、捕捉延長部ローブ、ラベル延長プローブ、および増幅プローブを含んでもよい。
【0342】
このアッセイは一般的には、標的の存在下においてのみ、ラベルプローブハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にするストリンジェントな条件下で実施される。ストリンジェンシーは、熱力学的変数である工程パラメータ(温度、ホルムアミド濃度、塩濃度、無秩序塩濃度、pH、有機溶媒濃度などを含むが、これらに限定されない)を変更することによって制御することができる。
【0343】
これらのパラメータもまた、米国特許第5,681,697号に一般的に概説されたように、非特異的結合を制御するためにも使用される。従って、例えば初期ハイブリダイゼーション工程が、標的配列とラベル延長体および捕捉延長プローブとの間で行われるときは、より高いストレンジンシー条件で一定のステップを行うのが望ましい。特異的結合に有利な条件でこの工程を実施することにより、非特異的結合を減少させることができる。
【0344】
ここに概説した反応は、当業者が理解するように、種々の方法で達成することができる。反応の成分は、以下で概説する好ましい実施例に従って、同時に、または何れかの順序で逐次的に添加すればよい。加えて、この反応は種々の他の試薬を含むことができる。これらには、最適なハイブリダイゼーションおよび検出を促進するために、および/または非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を低減するために使用できる塩、緩衝液、中性タンパク質(例えばアルブミン)、洗浄剤等のような試薬が含まれる。また、サンプル調製法および標的の純度に応じて、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等のような、アッセイの効率を改善する試薬を使用してもよい。
【0345】
従って、本発明は、捕捉結合性リガンド(例えば捕捉プローブ)が共有結合されたバイオチップを提供する。このバイオチップは、本発明のカートリッジの中に組込まれ、次いでアッセイを実行するために、本発明の多重化装置のステーションの中に嵌め込まれる。
【0346】
好ましい実施例において、バイオチップは、広範な方法でカートリッジの残りの部分に取付けられる。一つの実施例において、バイオチップはカートリッジの一部上に直接作製されて、システムの中に組込まれる。或いは、ここで概説するように、バイオチップがカートリッジの残りの部分とは異なる基板上に形成されるときは、二つの基板の組成および構成に応じて、使用できる種々の取付け機構が存在する。例えば、バイオチップがプリント回路基板材料上に形成されるときは、孔の中に挿入され、続いて溶融(例えば溶媒または熱を使用して)されるる「ピン」または「ロッド」を存在させることができる。同様に、表面と表面との熱融合または溶媒融合を行えばよい。或いは、接着剤を使用して、これら二つを一緒に接着することができる。同様に、これらの技術は、ガスケットのような追加のシール部品と共に使用することができる。或いは、このバイチップは、モールド成形されたプラスチック製スナップ装置のような部品を使用して、カートリッジの中にスナップ嵌合してもよい。
【0347】
本発明は更に、カートリッジを装置のステーションの中にロードする前に、サンプルをロードするためのカートリッジのホルダを提供する。一般に当業者が理解するように、ホルダは、カートリッジおよびキャップ(もし存在すれば)の構成に応じて広範な方法で構成すればよい。例えば、標準の試薬取扱い器具を使用できるようにカートリッジを整列させるホルダが好ましい。図に示すように、96ウエルフォーマットに基づく多重チャンネルピペットマン(mulltichannel pipettemen)またはロボットシステムの使用を可能にするホルダが好ましい。このホルダはまた、容易な使用、或いは試薬および/または緩衝液成分のために配置されたキャップを含むことができる。一般に、ホルダは、アッセイに使用される化学薬品および試薬に対して抵抗性の材料から製造される。
【0348】
本発明のカートリッジは、多重化装置のステーションの中に挿入されるように設計される。当業者が理解するように、また以下で説明するように、本発明の装置は、望ましい成分、最終用途、最終的な望ましい器具の大きさ等に応じて、広範なコンホメーションを取ることができる。
【0349】
夫々の多重化装置は、カートリッジが挿入される多くの異なったステーションを有している。このカートリッジ/ステーションの対は、「スナップイン」ロックの使用、カートリッジが特定の向きでのみ装置に適合するような非対称性、異なる寸法のカートリッジ用の異なる大きさのステーションを含むように、種々の方法で構成することができる(例えば、幾つかの稀なアッセイでは特別な取り扱いを必要とする可能性があり、これらアッセイのための特別なステーションで設計され得る)。この実施例はまた、カートリッジの存在または不存在を検出し、またはカートリッジが適正に配置されているかどうかを検出するする電子センサを利用することができる。
【0350】
一般に、装置当りのステーションの数は、所望の使用と共に変化するであろう。好ましい実施例は少なくとも二つまたは三つのステーションを利用し、少なくとも5〜100が好ましく、約25〜50が特に好ましく、48が特別好ましい。一般に、当該装置は、ステーションの行および列を備えたマトリックス状にレイアウトされる。
【0351】
ここで概説するように、各ステーションは多くの異なる機能部分を有することができ、これには電子部品へのインターコネクト、温度コントローラ、信号伝達システム、漏れ検出のためのセンサ、英数字ディスプレー、および検出器が含まれるが、これらに限定されない。
【0352】
好ましい実施例において、カートリッジが検出電極に依存するバイオチップを含むとき、該ステーションは、チップと装置との間の電子通信を可能にするために、バイオチップに適合するインターコネクトを具備する。
【0353】
好ましい実施例において、各ステーションは個々の温度コントローラを具備する。この文脈における「温度コントローラ」または「サーモコントローラ」は、カートリッジ(従ってカートリッジ内のサンプル)を加熱および冷却できる素子を含んでいる。一般に、当該システムのサイズおよび機能を考慮すれば、小さく、迅速な温度コントローラを利用するのが望ましい。ペルチェシステムを含む、広範な種類の公知の適切な温度コントローラが存在する。
一般に、温度コントローラは、サンプルを0〜約100℃に、且つ0.01℃/秒〜10℃/秒の速度で加熱できるべきである。
【0354】
なお、温度コントローラは、アッセイの後に、カートリッジ内の生物学的材料を破壊するために使用できることに留意すべきである。即ち、健康医療作業者および実験室作業者の潜在的に危険なサンプルへの露出を最小限にし、またこれら材料の廃棄を容易にするのが望ましいことが多い。温度コントローラは、消費されたサンプルを或る時間だけ極めて高い温度に加熱して、サンプルを死滅または破壊するように使用することができる。加えて、他の一般に過酷な試薬(強酸、強塩基等)の添加に関連した加熱にも使用することができる。更に、幾つかの実施例では、液体蒸発後に、チャンバの中にポンピングされるプラズマを発生させて全ての生物学的物質を破壊するために、RFアンテナが使用される。
【0355】
一つの実施例では、各ステーションが個々の温度コントローラを備えるのではなく、一組のステーション(例えば行または列)が温度コントローラを共有する。別の実施例では、この多重化装置は一つの温度コントローラを具備している。
【0356】
好ましい実施例において、本発明の装置は「Statスロット」を含んでおり、ここではシーケンスとして実行されるのではなく、カートリッジを一つのステーションの中に入れて、直ちに読むことができる。一般に、このステーションでの温度は予め設定することができる。
【0357】
好ましい実施例において、当該装置のステーションは信号伝達システムを含んでいる。例えば、カートリッジまたはアッセイの状態(カートリッジの存在または不存在、進行中のアッセイ、エラー、アッセイの完了など)を示すために、各ステーションにおいて光、特に着色光のシステムを使用することができる。加えて、光の構成はコードであってもよい(特に色盲の人々のため)。アッセイ中のカートリッジのためには二つの光、アッセイの完了のためには閃光等である。ここでも、これらの信号伝達システムは各ステーションにあってもよく、一組のステーションにあってもよい。
【0358】
好ましい実施例において、本発明の装置は、データまたは他の情報を表示することを可能にする英数字ディスプレーを含んでいる。例えば、このディスプレーは、如何なるカートリッジ(例えばHIVパネル、HCVパネル、感染病パネル、乳癌SNPパネル等)が挿入されたか、またはカートリッジに関する他のデータ(ロット番号またはバッチ番号等)をオペレータに示すために、以下で述べるバーコード読取り器と共に使用することができる。加えて、このディスプレーは、アッセイ結果等をオペレータに与えるために使用することができる。信号伝達システムに関して、ディスプレーは各ステーションにあってもよく、または一組のステーションもしくは全体の装置について一つのディスプレーがあってもよい。
【0359】
好ましい実施例において、当該装置の各ステーションは、バイオチップ上での電気泳動または誘電泳動(dielectrophoresis)を可能にするように構成してもよい。即ち、本明細書の一部として援用するW099/67425および米国特許出願09/171,981号に一般的に記載されているように、アナライトの濃縮および/またはアレイ表面への移動を可能にするための、追加の電極または電子部品が存在してもよい。同様に、W099/67425および米国特許出願09/171,981号に記載されているように、電気泳動または誘電泳動電極はバイオチップ上に含められてもよい。
【0360】
好ましい実施例において、当該装置(或いは各ステーション)は、カートリッジ上の対応するバーコードを読取るためのバーコード読取り器を備えている。これらのバーコードは広範囲の種々の目的で使用することができ、それにはサンプルの同定(例えば患者の番号またはコード)、行われているアッセイ、チップのバッチ番号、キャリブレーション情報、サイクル時間を含むアッセイプロトコール、および信号処理要件等が含まれるが、これらに限定されない。
【0361】
加えて、バーコードは機器を制御するために使用することができる。例えば、機器制御はキーボード、マウス、またはバーコード読取り器を通して行えばよい。従って、例えばカートリッジ上に、チップの同定を示すバーコードが存在し、またカード上にはアッセイを開始し、アッセイを停止し、データをダウンロードするために走査するバーコードが存在してもよい。好ましい実施例において、バーコードコマンドのカードは、ここに概説する装置の引出しまたは保存区画に存在する。
【0362】
好ましい実施例において、各ステーションはメモリーチップ読取り器を備えている。ここでもまた、この実施例では各カートリッジがメモリーチップを具備しており、該メモリーチップはサンプル情報(例えば患者の番号またはコード、行われるアッセイ、チップのバッチ番号、キャリブレーション情報、アッセイプロトコール等)、またはユーザーインターフェースが如何に見えるか(例えば、数ではなく「HIV陽性」)等を有する。
【0363】
好ましい実施例では、如何なるアッセイがなされたか、そのデータ、結果等の情報をカートリッジに加えるためのメモリーチップ書込み器を、各ステーションが備えている。
【0364】
好ましい実施例において、各ステーションは患者情報をコード化するために、カートリッジに関するコード化成分を有する。患者情報、特に雇用および保険の問題に関して、患者情報の秘密保持についての関心が増大している。従って、例えば幾つかの実施例では、本発明の装置はオペレータがアッセイの結果を知ることを可能にしないであろう。むしろ、この出力はアッセイが正しく行われたこと、および実行可能な回答が受信されたことの確認であり、行われた実際のアッセイまたは結果に関しては何も言わないであろう。アッセイ結果自体は患者情報と共にコード化され、以下で概説する処理、デコード化または保存のために遠隔位置に送信される。
【0365】
好ましい実施例において、当該装置は、試薬、カートリッジ、キャップ、ホルダ、ピペットマン等の保存を可能にする引出しまたは保管区画を含んでいてもよい。
【0366】
好ましい実施例において、例えば、アッセイに蛍光色素を使用するときは、蛍光読取り器が使用される。好ましい実施例において、当該装置は各ステーションンに読取り器を備えている。或いは、好ましい実施例において、当該装置は読取り器を移動させることにより、またはステーションを当該装置内の一つの読取り器に移動させることにより、移動される一つの読取り器を備えている。従って、幾つかの実施例では、ステーション、カートリッジまたは読取り器の移動を可能にするためのモーター、プーリー、コード等が存在する。
【0367】
好ましい実施例において、本発明の装置は、各ステーションまたは一組のステーションにおいて液体をロードまたはアンロードするための、液体取扱い部品を備えている。この液体取扱いシステムは、何れかの数の部品からなるロボットシステムを含むことができる。加えて、ここに概説する幾つかまたは全ての工程を自動化してもよい。例えば、当該システムは完全にまたは部分的に自動化することができる。
【0368】
当業者が理解するように、使用できる広範な種々の部品が存在し、これには一以上のロボットアーム;マイクロプレートを配置するためのプレートハンドラー;カートリッジおよび/またはキャップを備えたホルダ;非交差汚染プレート上のウエルのために、蓋を除去および再配置するための自動化された蓋またはキャップハンドラー;使い捨ての先端部を有するサンプル分配アセンブリー;サンプル分配のための洗浄可能な先端部アセンブリー;96ウエルのロードブロック;冷却された試薬ラック;マイクロタイタープレート用ピペット位置(任意に冷却される);プレートおよび先端部のための集積タワー;およびコンピュータシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【0369】
完全にロボット化された微小流体力学システムは、スクリーニング適用の全工程を実行するための高スループットピペッティングを含む、液体、粒子、細胞、および微生物の自動化されたハンドリングを含んでいる。これには液体、粒子、細胞、および微生物の操作、例えば吸引、分注、混合、希釈、正確な容積輸送、検索、およびピペット先端部の廃棄、および一回のサンプル吸引で複数のデリバリーを行うための同一容量の反復ピペッティング等が含まれる。これらの操作は、液体、粒子、細胞、および微生物の交差汚染のない輸送である。この器具は、マイクロプレートサンプルのフィルター、膜、および/または娘プレートへの自動化された複製、高密度移送、全プレートのシリアル希釈、および高容量操作を行う。
【0370】
好ましい実施例においては、化学的に誘導体化された粒子、プレート、カートリッジ、チューブ、磁性粒子、またはアッセイ成分に対する特異性をもった他の固相マトリックスが使用される。マイクロプレート、チューブ、または何等かの固相マトリックスの結合表面は、非極性表面、高極性表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質またはペプチドを結合する親和性媒体、組換えタンパク質AまたはGのような表面固定されたタンパク質、ヌクレオチド樹脂またはコーティング、および本発明に有用な他の親和性マトリックスを含んでいる。
【0371】
好ましい実施例では、マルチウエルプレートのためのプラットホーム、マルチチューブ、ホルダ、カートリッジ、微小チューブ、深いウエルプレート、微小遠心チューブ、冷凍バイアル、矩形ウエルプレート、フィルタ、チップ、光ファイバ、ビーズ、および種々用容積をもった他の固相マトリックスもしくはプラットホームが、追加の能力のためにグレードアップ可能なモジュールプラットホーム上に収容される。このモジュールプラットホームは、変速軌道震盪器を含んでおり、またサンプル供給、サンプルおよび試薬希釈、アッセイプレート、サンプルおよび試薬容器、ピペット先端部、および能動洗浄ステーションのための多位置作業デッキを含んでいる。
【0372】
好ましい実施例では、サンプルを0℃〜100℃でインキュベートする正確な温度制御を与えるための、制御可能なブロックまたはプラットホームのような熱交換器の温度を安定化させるために、温度サイクラーおよび温度調節システムが使用される。これは、ステーション温度コントローラに加えて、またはこれに追加して用いられる。
【0373】
好ましい実施例においては、一つもしくは複数の磁気プローブ、親和性プローブ、または液体、粒子、細胞および微生物を自動的に操作するピペッタを備えた互換性ピペットヘッド(単一チャンネルまたはマルチチャンネル)が用いられる。多重ウエルまたは多重チューブの磁気分離器またはプラットホームが、液体、粒子、細胞および微生物を操作する。
【0374】
幾つかの実施例において、例えば電気的検出が行われないときに、この機器には検出器が含まれるであろう。該検出器は、ラベルおよびアッセイに応じて広範な異なる検出器であることができる。好ましい実施例において、有用な検出器には、複数の蛍光チャンネルを備えた顕微鏡;一つおよび二つの波長終点および反応速度能力を備えた蛍光、紫外および可視スペクトル検出、蛍光共鳴エネルギー転移(RFET)、発光、消光、2光子励起、および強度再分配を与えるプレート読取り器;データおよびイメージを捕捉し、定量可能なフォーマットに変換するCCDカメラ;およびコンピュータワークステーションが含まれる。
【0375】
これらの機器は、マルチウエルのプレートもしくはチューブの中での細胞培養増殖および形質転換のため、または危険な操作のために、滅菌層流または湿気フードの中に嵌め込むことができ、または自己収容システムの中に閉じ込めることができる。生きた細胞アッセイの時間シリーズのために温度、湿度、およびガスが制御される制御された増殖条件の下で、生きた細胞を増殖させることができる。自動化された細胞の形質転換および自動化されたコロニーピッカーは、所望の細胞の迅速なスクリーニングを容易にすることができる。
【0376】
フローサイトメトリーまたはキャピラリー電気泳動フォーマットは、磁気ビーズおよび他のビーズ、粒子、細胞、並びに微生物を個別に捕捉するために使用することができる。
【0377】
汎用のハードウエアおよびソフトウエアは、多くの応用のために器具の適合を可能にする。ソフトウエアプログラムモジュールは、方法の創出、変更および実行を可能にする。システム診断モジュールは、器具の整列、正しい接続およびモーター動作を可能にする。カスタマイズされた器具、実験室器具、並びに液体、粒子、細胞および微生物の移送パターンは、異なるアプリケーションの実行を可能にする。これらのデータベースは、方法およびパラメータの保存を可能にする。ロボットコンピュータインターフェースは、これら器具の間の通信を可能にする。
【0378】
好ましい実施例において、このロボット装置は、バスを介してメモリーおよび一組の入力/出力装置(例えばキーボード、マウス、モニター、プリンタ等)と通信する中央演算ユニットを含んでいる。ここでも、これは以下で概説するように、本発明の多重化装置のためのCPUに加えて、またはその代りに設けることができる。中央演算ユニットと、メモリー、入力/出力装置、およびバスとの間の一般的な相互作用は当該技術において公知である。従って、実行すべき実験に応じて、種々の異なる方法がCPUメモリーの中に保存される。
【0379】
これらの自動液体ハンドリングシステムは、緩衝液、試薬、サンプル、洗浄液、ラベルプローブのようなアッセイ成分等を含む、何れかの数の異なる試薬を利用することができる。
【0380】
好ましい実施例において、本発明の装置は漏れ検出のためのセンサを含んでいる。これらは一般には二つのタイプ、即ち、抵抗の電気的測定、または光もしくは検出可能なタグを用いたアッセイのスパイキングである。これは、生物学的危険物質または腐蝕性化学薬品が試験される幾つかの実施例において、特に重要である。
【0381】
好ましい実施例において、本発明の装置は、ここで概説するように、信号処理、論理回路を含んだデジタルロックイン等を含んだ、種々の分析を行うために使用できる装置ボードを備えている。
【0382】
好ましい実施例において、本発明の装置は、ここで概説するように、信号処理、論理回路を含んだデジタルロックイン等を含んだ、種々の分析を行うために使用できる装置ボードを備えている。
【0383】
好ましい実施例において、本発明のシステムは、付随するメモリーを備えたプロセッサまたは中央演算ユニット(CPU)を具備している。この付随メモリーはオンボードメモリーであることができ、プロセッサおよびオプションのメモリーは、外部メモリーバスを介してプロセッサに結合される。このプロセッサ(CPU)は、装置自身の中に物理的に収容することができ、ケーブルを介して装置に接続することができ、または無線技術を使用して接続することができる。装置当り一以上のCPUが存在してもよく、または複数の装置の間で一つのCPUを共有してもよい。
【0384】
例えば、一つの実施例において、本発明のシステムは、CPUおよび付随メモリーが搭載されたマザーボードを提供する。このマザーボードは、望ましくは、単一の処理回路が形成されたプリント回路カードに搭載可能な一つまたは複数のエッジコネクタに、機械的および電気的に接続するコネクタを提供する。このエッジコネクタは、マザーボードに信号および電源接続を提供する。一つの実施例において、このCPUおよびメモリーは、オペレーティングシステムと共に、他で説明するメニューもしくはコマンド駆動の動作および分析をサポートする。プロセッサの中、および/または信号処理プリント回路カード部品内で実行されるソフトウエアおよび/またはファームウエアは、当該装置、デバイスおよびシステムの動作を制御するために使用される。
【0385】
更にもう一つの実施例において、本発明のシステムは、外部のパーソナルコンピュータに結合されるコンピュータ周辺機器の様式で構成および動作される。このタイプの実施においては、各信号処理プリント回路カードが、別個の通信チャンネルもしくはリンク(例えば一以上のシリアル、パラレル、SCSI、ファイアワイヤ、ブルートゥース、または他の配線もしくは無線の通信チャンネルもしくはリンク)によってパーソナルコンピュータに接続されてもよく、或いは、複数の信号処理プリント回路カードが、より少ない数の通信チャンネルもしくはリンクを共有するように多重化されてもよい。典型的には、複数の信号処理プリント回路カードが、マザーボードまたは他の相互接続構造によって提供される通信バスを介して、相互に接続される。各信号処理ボードは、信号処理カードの間または信号処理プリント回路カードの間でプロセッサに向けられる通信が、信号処理カードで同定され、且つそれに従って解釈および/またはルーティングされるように、独特のアドレス(ローカルまたはグローバルに独特の)を有することができる。PCは、器具を制御し、且つ該器具からデータを収集するアプリケーションプログラムを含んでいる。当業者は、ここに提供される説明を考慮して、ここに記載するデバイスおよび装置のように、デジタルおよび/またはアナログ回路を使用する特別の器具を接続するための多くの方法が存在することを理解するであろう。従って、ここでは更なる詳細については説明しない。
【0386】
一つの特別の実施例では、プリント回路に基づく六つの別々の信号処理カードの夫々に六つのセンサスロットを有する装置が、RS−232もしくはRS−485シリアルリンクのような少なくとも一つのシリアルインターフェースを介して、パーソナルコンピュータに接続される。有利なことに、パーソナルコンピュータおよび装置の夫々には、バンド幅を増大するために複数のかかるシリアルポートが設けられている。一つの実施例では、三つのシリアル入力/出力インターフェースが設けられる。
【0387】
更にもう一つの実施例において、プロセッサまたはCPUは、付随メモリーと共に各信号処理プリントボードに直接設けられてもよい。
好ましい実施例において、本発明の装置は、グローバル・ポジショニング・システム(GPS)のような当該技術で公知の位置特定装置を含んでいる。これは、農業および細菌戦争、並びに問題の遠隔診断において特別の用途が存在する可能性がある。
【0388】
好ましい実施例において、本発明の装置は、装置から離れた場所へデータ、アッセイ結果、患者情報等を通信するための部品を含んでいる。従って、データおよび他の関連情報(バーコード情報、アッセイの条件およびプロトコール、オペレータ確認、時間スタンプ等)を、一般情報蓄積所、病院、医師の事務所、医学センター、薬局、政府センター、保険プロバイダー等に送信するのを可能にするために、例えば一以上のモデム(電話モデムおよびケーブルモデムを含む)、インターネットカード、赤外ポート等を当該装置に含めてもよい。
【0389】
好ましい実施例において、本発明の装置は、物理的電子接続または通信接続の不存在下で該データ送信を可能にするために、無線通信システムのための部品を含んでいる。加えて、無線受信機を含めることもできる。
【0390】
従って、本発明は、サンプルおよび標的アナライトを多重化分析するための方法および組成物を提供する。サンプル(生サンプルまたは処理されたサンプル(たとえば増幅されたもの、精製されたもの等)を本発明のカートリッジの中にロードし、オプションのキャップを着け、カートリッジを当該装置のステーションの中にロードする。必要に応じて追加の試薬が加えられ、アッセイ複合体が形成される。
【0391】
少なくとも標的配列およびラベルプローブを含んでなる本発明のアッセイ複合体が形成されたら、電子的始動で検出が進行する。機構または理論に限定されるものではないが、検出は、ETMから電極への電子の移動に基づいている。
【0392】
電子移動の検出、即ち、ETMの存在は、一般には電気的(電圧が好ましい)に開始される。アッセイ複合体に電位が印加される。印加された電位の正確な制御および変動は、電位差計、並びに3電極システム(一つは参照電極、一つはサンプル(または作業)電極、一つは対向電極)、または2電極システム(一つはサンプル電極、一つは対電極)の何れかを介したものであることができる。これは印加された電位とシステムのピーク電位とのマッチングを可能にし、該ピーク電位は、一部はETMの選択に依存し、また一部は他のシステム部品、単分子層の組成および完全性、および如何なるタイプの参照電極を使用するかに依存する。上述したように、フェロセンは好ましいETMである。
【0393】
幾つかの実施例では、本明細書の一部として明示的に援用するWO00/16089に一般的に記載されているように、共還元剤(co−reductants)または共酸化剤(co−oxidants)が使用される。
【0394】
単分子層の表面におけるETMの存在は、種々の方法で検出することができる。種々の検出方法を使用すればよく、これには次のものが含まれるが、これらに限定されない:蛍光、燐光、ルミネッセンス、化学ルミネッセンス、エレクトロルミネッセンスおよび屈折率を含む光検出(酸化還元状態が変化する際のスペクトル変化の結果としての);電気的検出(電流測定電圧測定、キャパシタンスおよびインピーダンスを含むが、これらに限定されない)。これらの方法には、ACもしくはDC電流、パルス法、ロックイン技術、フィルタリング(高パス、低パス、バンドパス)に基づく時間依存性または周波数依存性の方法、並びに時間分解蛍光法を含む時間分解技術が含まれる。
【0395】
一つの実施例において、ETMから電極への効率的な電子移動が、ETMの酸化還元状態における定型的変化を生じる。ビピリジン、ピリジン、およびイミダゾール環を含むルテニウムの錯体を含んだ多くのETMでは、酸化還元状態におけるこれらの変化がスペクトル特性の変化と関連している。これら分子の還元状態と酸化状態との間で、吸光度の顕著な差が観察される。例えば、Fabbrizzi et al., Chem. Soc. Rev. 1995 pp197−202を参照されたい。
【0396】
この実施例において、可能な電子供与体および電子受容体には、光活性化または光開始について上記で列記した全ての誘導体が含まれる。好ましい電子供与体および電子受容体は、酸化および還元の際に特徴的な大きいスペクトル変化を有し、電子移動の高感度モニタリングをもたらす。このような例には、好ましい例として、Ru (NHpy およびRu(bpy)im が含まれる。なお、吸光度によってモニターされる供与体および受容体のみが、理想的スペクトル特性を有する必要があることを理解すべきである。
【0397】
好ましい実施例において、電子移動は蛍光定量的に検出される。ルテニウム錯体を含む多くの遷移金属錯体は、異なる蛍光特性を有する。従って、各酸に結合した電子供与体および電子受容体の酸化還元状態における変化は、例えばRu (4,7−ビフェニル−フェナントロリン) 2+ での蛍光を使用して、非常に感度よくモニターすることができる。この化合物の形成は、標準の蛍光アッセイ技術を使用して容易に測定することができる。例えば、レーザーに誘起された蛍光は、標準の単一セル蛍光計、フロースルー「オンライン」蛍光計、または96ウエルの免疫アッセイについて市販されているものに類似した、多サンプル「プレート読取り器」において記録することができる。
【0398】
或いは、蛍光は、溶液中または光ファイバーに結合された核酸プローブと共に、光ファイバーセンサを使用して測定できる。蛍光は、光ファイバーに結合された光倍増管または他の光検出機器を使用してモニターされる。このシステムの利点は、アッセイできる非常に小さい容積である。
【0399】
加えて、モレキュラーダイナミクス社(Molecular Dynamics)が販売する蛍光撮像器(Fluorlmager)のような走査型蛍光検出器は、固相表面にアレイ化された修飾核酸分子の蛍光をモニターするために理想的に適している。このシステムの利点は、数千の異なる核酸プローブで覆われたチップを使用して、一度に走査できる莫大な数の電子移動プローブである。
【0400】
多くの遷移金属錯体は、大きなストークスシフト(Stokes shift)をもった蛍光を示す。適切な例には、ルテニウムのような遷移金属のビス−およびトリス−フェナントロリン錯体、およびビス−およびトリス−ビピリジル錯体が含まれる(Juris, A., Balzan, V., et. al. Coord. Chem. Rev., V. 84, p. 85−277,1988を参照されたい)。好ましい例は、効率的な蛍光(合理的な高量子収率)並びに低い再構成エネルギーを示す。これらの例には、Ru (4,7−ビフェニ−フェナントロリン) 2+、Ru (4,4’−ジフェニル−2,2’−ビピリジル) 2+、およびプラチナ錯体が含まれる(本明細書の一部として援用するCummings et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 1949−1960 (1996)を参照されたい)。或いは、ハイブリダイゼーションに関連した蛍光の減少を、これらのシステムを使用して測定できる。
【0401】
更なる実施例においては、電子移動検出の基礎として、電気化学ルミネッセンスが使用される。Ru (bpy)のような幾つかのETMの場合、直接のルミネッセンスは励起状態の崩壊を伴う。この性質における変化は核酸ハイブリダイゼーションに関連しており、単純な光増倍管装置でモニターすることができる(Blackburn, G. F. Clin. Chem. 37: 1534−1539 (1991); and Juris et al., supraを参照されたい)。
【0402】
好ましい実施例においては、電流測定、電圧測定、容量、およびインピーダンスを含む電気的検出が使用される。適切な技術には、電解重量法;電量分析(制御された電圧電量分析および定電流電量分析を含む);ボルタンメトリー(周期的ボルタンメトリー、パルスボルタンメトリー(正常パルスボルタンメトリー、矩形波ボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、Osteryoung矩形波ボルタンメトリー、および電量分析パルス技術を含む);ストリッピング分析(陰イオンストリッピング分析、陽イオンストリッピング分析、矩形波ストリッピングボルタンメトリー);コンダクタンス測定(電解コンダクタンス、直接分析);時間依存性電気化学分析(クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、周期的クロノポテンシオメトリーおよびアンペロメトリー、ACポログラフィー(AC polography)、クロノ重量分析、およびクロノクーロメトリー);ACインピーダンス測定;キャパシタンス測定;ACボルタンメトリー;および光電気化学が含まれるが、これらに限定されない。
【0403】
好ましい実施例において、電子移動のモニタリングは、電流測定的検出を介するものである。この検出方法は、問題の標的遺伝子を含むサンプル中において、核酸が結合した電極と参照(対向)電極との間に電位(別の参照電極に対して)を印加することを含む。標的核酸の存在または不存在下のサンプル中には、異なる効率での電子移動が含まれる。即ち、標的核酸の存在または不存在およびラベルプローブは、異なる電流を生じることができる。
【0404】
電子移動をアンペロメトリーで測定するための装置は、感受性電流の検出を含み、また電圧電位を制御する手段(通常はポテンショスタット)を含む。この電圧は、ラベルプローブ上の電子供与性錯体の電位に関して最適化される。可能な電子供与性錯体には先に述べたものが含まれ、鉄、オスミウム、プラチナ、コバルト、レニウム、およびルテニウムの錯体が好ましく、鉄の錯体が最も好ましい。
【0405】
好ましい実施例では、別の電子検出モードが利用される。例えば、ポテンショメトリー(またはボルタンメトリー)測定は、非ファラデープロセス(正味の電流なし)が含まれ、pHおよび他のイオン検出器において慣用的に利用される。同様のセンサーが、ETMと電極との間の電子移動をモニターするために使用される。加えて、絶縁体および導電体の他の性質(例えば抵抗、導電性、インピーダンスおよびキャパシタンス)を使用して、ETMと電極との間の電子移動をモニターできるであろう。最後に、電流を発生する如何なるシステムも小さい磁界を発生し、幾つかの実施例ではこれをモニターすることができる。
【0406】
なお、本発明の組成物において観察される高速電子移動の一つの利益は、時間分解能によって、吸光度に基づくモニターの信号/ノイズ結果を大きく向上できることにある点を理解すべきである。例えば電子移動のパルス化された開始および検出器の「ロックイン」増幅器、並びにフーリエ変換の使用を通して特定遅延の信号を増幅させることによって、本発明の高速電子移動は、高い信号、並びに電子移動の開始および完了の間での定型的遅延の両方をもたらす。
【0407】
好ましい実施例において、電子移動は交流電流(AC)法を使用して開始される。理論に拘束されるものではないが、電極に結合したETMは、抵抗およびキャパシタを含んだ回路を横切るAC電圧に対して、一般に同様に反応する。
【0408】
信号を増大させ、ノイズを減少させ、またはバックグラウンドノイズ中で信号を更に明瞭に、もしくは検出可能にするために使用できる種々の技術が存在する。即ち、バックグラウンドノイズ中の信号をより良く認識するために役立つことができる如何なる技術も、本発明における用途を見出すことができる。これらの技術は、一般に三つの方法に分類される。即ち(1)開始信号を印加するためのタイプもしくは方法における変化(即ち、サンプル信号を最大化または同定するために、「入力」を変動させる);(2)データ処理、即ち、サンプル信号を最大化または識別するために「出力」信号に対して使用される技術;および(3)アッセイ自身、即ち、サンプル信号のより良い同定を可能にする電極表面またはシステム部品に対する変化である。従って、例えば適切な「入力」AC法には、複数の周波数を使用すること;AC振幅を増大すること;矩形波ACVの使用;特殊なまたは複雑化された波形の使用等が含まれるが、これらに限定されない。同様に、適切な「出力」AC法には、より高次の高調波周波数をモニターすること;位相分析またはフィルター;バックグラウンド差引き技術(インピーダンス分析、および信号認識またはピーク認識技術を含むが、これらに限定されない);デジタルフィルタリング技術;バンド幅狭窄技術(ロックイン検出スキーム、特にデジタルロックインを含む);高速フーリエ変換(FFT)法;相関および/または畳み込み(convoution)技術;信号平均化;スペクトル分析;等が含まれるが、これらに限定されない。更に、アッセイ成分の変更は、非並列式に変更されるサンプル信号およびノイズ信号を生じるように行うことができる;即ち、これら二つの信号は相互に対して非線形的に応答する。これらの技術は、本明細書の一部として明示的に援用するWO00/16089および O’Connor et al., J. Electroanal. Chem. 466 (2): 197−202 (1999)に記載されている。
【0409】
一般に、非特異的に結合したラベルプローブ/ETMは、ETMを含むラベルプローブに正しい向きで特異的に結合するときよりも、インピーダンスにおける差(即ち、より高いインピーダンス)を示す。好ましい実施例では、この非特異的に結合した物質は洗い流されて、無限大の有効インピーダンスを生じる。従って、以下で述べるように、AC検出は感度の増大、およびバックグラウンドノイズを「フィルター除去」する能力を含む幾つかの利点を与える。特に、ETM含有プローブの非特異的結合と、標的特異的アッセイ複合体形成との間でのインピーダンス(例えばバルクインピーダンスを含む)変化をモニターすることができる。
【0410】
従って、AC開始および検出方法を使用するとき、ETMの存在の結果として、システムの周波数応答が変化する。ここでの「周波数応答」とは、電極とETMとの間の電子移動の結果としての信号の変調を意味する。この変調は、信号周波数に応じて異なる。周波数応答には、一以上の周波数でのAC電流、位相シフト、DCオフセット電圧、誘導電流インピーダンス等が含まれる。
【0411】
標的配列およびラベルプローブを含むアッセイ複合体が形成されたら、好ましくは少なくともサンプル電極(本発明の複合体を含む)および対向電極を介して、第一の入力電気信号がシステムに印加され、電極とETMとの間での電子移動を開始させる。また、参照電極および作業電極に電圧が印加される3電極システムを使用してもよい。第一の入力信号は、少なくともAC成分を含んでなるものである。該AC成分は、振幅および周波数が可変のものである。一般に、本発明で使用するために、AC振幅は約1 mV〜約1.1 Vで変化し、約10 mV 〜約800 mVが好ましく、約10 mV〜約500 mVが特に好ましい。AC周波数は、約0.01 Hz〜約100 MHzで変化し、約10 Hz〜約10 MHzが好ましく、約100 Hz〜約20 MHzが特に好ましい。
ACおよびDC信号の組合せを使用することは、驚くべき感度および信号の最大化を含む種々の利点を与える。
【0412】
好ましい実施例において、第一の入力信号はDC成分およびAC成分を含んでいる。即ち、作業電極および対向電極の間のDCオフセットと電圧は、ETMの電気化学的電位を通して掃引される(例えばフェロセンが使用されるとき、この掃引は一般には0〜50 mVである)(或いは、作業電極が接地され、対向電極が0〜50 mVで掃引される)。この掃引を使用して、システムの最大応答が見られるDC電圧を同定する。これは、一般にはETMの電気化学的電位またはその近傍である。この電圧が決定されたら、掃引電圧または一以上の均一なDCオフセット電圧を使用すればよい。約−1 V〜約+1.1 VのDCオフセット電圧が好ましく、約−500 mV 〜約+800 mVが特に好ましく、約−300 mV〜約500 mVが特別好ましい。好ましい実施例において、DCオフセット電圧はゼロではない。DCオフセット電圧の頂点において、可変振幅および可変周波数のAC信号成分が印加される。ETMが存在し、AC外乱に応答できるならば、電極およびETMの間の電子移動によるAC電流が生じるであろう。これらの電圧は、Ag対AgCl参照電極についての意味のある数である。
【0413】
従って、本発明の装置は、好ましくはAC電流およびDC電流を供給できる電圧源を提供する。
定義されたシステムについて、ETM核酸の存在および不存在(即ち、標的配列の存在)の間を区別するためには、単一の入力信号を印加することで十分であろう。
【0414】
或いは、複数の入力信号が印加される。ここで概説するように、これは複数の周波数、複数のDCオフセット電圧、もしくは複数のAC振幅、またはこれらの何れかまたは全ての組合せを含む、種々の形態を取ることができる。
【0415】
従って、好ましい実施例においては、複数のDCオフセット電圧が用いられるが、上記で概説したようにDC電圧掃引が好ましい。これは単一の周波数で行ってもよく、または二以上の周波数で行ってもよい。
【0416】
好ましい実施例では、AC周波数が変化される。異なる周波数においては、異なる分子が異なる方法で応答する。当業者が理解するように、周波数を増大することは一般に出力電流を増大させる。しかし、電極とETMとの間を電子が移動できる速度よりも周波数が大きいときは、より高い周波数は出力信号の喪失または減少をもたらす。幾つかの点において、周波数はETMと電極との間の電子移動の速度よりも大きく、従って出力信号もまた降下するであろう。
【0417】
好ましい実施例においては、小さいAC電圧をもった複数の周波数が印加されて、夫々の基本が評価される。或いは、好ましい実施例は、大きなAC電圧をもった幾つかの周波数を利用して、夫々の高調波を評価する。同様に、好ましい実施例は、大きなAC電圧をもった幾つかの周波数を利用する。この場合、システムに対する異なる周波数の影響が、個々の周波数における出力の合計とは異なる出力を生じることができる。
【0418】
一つの実施例において、検出は、一つの周波数での出力信号の一つの測定を利用する。即ち、標的配列の不存在下、従ってETMを含有するラベルプローブの不存在における当該システムの周波数応答は、特定の高い周波数において非常に低く予め決定することができる。この情報を使用することにより、特定の周波数での如何なる応答も、アッセイ複合体の存在を示すであろう。従って、一つの入力信号を使用することが必要なだけであり、周波数応答における如何なる応答も、ETMが存在し、従って標的配列が存在することを示す指標である。
【0419】
好ましい実施例においては、当該システムの非線型性を増大させるために、入力信号およびデータ処理工程が行われる。即ち、例えばフェロセンの応答は非線形的に反応し、バックグラウンドにおけるよりも上の信号において高調波応答を生じる;このACボルタンメトリーからの高調波信号は、電気化学的セルの非線形応答による高調波歪みの最もありうる結果である; 本明細書の一部として援用するYap, J. of Electroanalytical Chem. 454: 33 (1998)を参照されたい。従って、この非線形性を増大させる何等かの技術が望まれる。好ましい実施例においては、より高い高調波信号を増大させるための技術が使用される;従って、印加された波形の基本周波数および複数の基本周波数(即ち、より高い高調波)の両方で、または一方だけで、周波数感受性のロックイン検出が行われる。バックグラウンドキャパシタンスはAC信号に対して比較的線型に応答する(制限波入力AC電圧は比較的歪みのない制限波出力を生じる)から、バックグラウンドには、極めて僅かだけ上の高調波電流が発生する。これは、信号/ノイズ比における劇的な増大を与える。こうして、より高い高調波周波数、特に三次、四次および五次高調波(しかし、二次〜十次以上の高調波も使用できる)における検出は、標的分子からの信号を圧倒し得る非誘導電流プロセス(二重層充電のような)に関連した、バックグラウンドの劇的な抑制を生じることが示される。この方法において、より高次の高調波周波数および位相における当該システムの評価は、検出限界および信号の明瞭さにおける顕著な改善を導くことができる。しかし、幾つかの実施例では、より高次の高調波の分析は望ましくない。
【0420】
従って、好ましい実施例では、非線形の高調波応答を増大させる一つの方法は、AC外乱の振幅を増大または変化させることであるが、これは基本周波数のモニターにも同様に使用することができる。理論に拘束されるものではないが、振幅を増大させることは、駆動力を非線形的に増大させるように見える。従って、一般に、当該周波数でのより高い過大電位の使用を通して、同じシステムが如何なる信号周波数においても改善された応答(即ち、より高い出力信号)を与える。加えて、これは例えば、最適なスペーシング構成をもたないような遅いシステムにおいて、応答を誘導するために使用してもよい。
【0421】
好ましい実施例において、当該システムの測定は少なくとも二つの別々の振幅または過大電位で行われ、複数の振幅での測定が好ましい。上記で述べたように、振幅における変化の結果としての応答の変化は、当該システムの同定、キャリブレーションおよび定量の基礎を形成し得る。加えて、一以上のAC周波数を同様に使用することができる。
【0422】
好ましい実施例では、矩形高調波AC電圧が使用される; 本明細書の一部として援用するBaranski et al., J. Electroanal. Chem. 373: 157 (1994)を参照されたい。しかし幾つかの実施例では、これは好ましくない。これは幾つかの潜在的利益を与える。例えば、矩形波はデジタル的に形成するのが容易であり、矩形波のパルス形状は、充電キャパシタンスに対する更に良好な識別を可能にすることができる。正弦高調波ACボルタンメトリーにおいて、誘導電流応答は充電キャパシタンスよりも非線形であることができるから、高調波信号はより良好な信号:バックグラウンドを与える。この同じ概念が、SW高調波AC電圧にも適用される。この二つの技術の間の重要な相違は、AC波形の周波数スペクトルである。特異な周波数正弦波形は正に基本周波数を含むのに対して、特異矩形波は基本周波数並びに全ての奇高調波(odd harmonics)を含む。この技術は、キャパシタンス電流に対する誘導電流の比が高くなる偶高調波(even harmonics)を見ている。全ての奇高調波は単一のAC電圧ピークを有する一方、全ての偶高調波は二重のAC電圧ピークを有する。これは、不可逆的酸化還元結合を有するシステムの正弦高調波AC電圧の場合とは反対である。
【0423】
好ましい実施例では、多重周波数AC電圧が使用される。このアイディアは、電気化学的セルをAC電圧式に励起するために、同じ振幅または異なる振幅をもった多重周波数からなる波形を形成するためのものである。この方法は、セル応答を分析するための高速フーリエ変換またはジョイント時間−周波数変換の利益を受ける。多重周波数AC電圧のJTFTスペクトルは、駆動(または基本)周波数、並びにそれらの高調波成分に関する情報を提供する。幾つかの可能なデータ解析は、(1)基本周波数の応答を比較すること;(2)全ての高調波周波数を比較すること;(3)全ての励起周波数のうち、一つの特定の高調波周波数応答を比較すること;および(4)標準の単一周波数AC電圧によって可能な全ての分析である。
【0424】
従って、好ましい実施例では、実例において一般的に概説する高速フーリエ変換が行われる。フーリエ変換分析は、正弦波電気化学が行われるときに、信号:ノイズ比を改善し、また望ましい信号を分離するために好ましい方法である。典型的なAC技術は、主周波数のみの測定に依存する。より高次の高調波における正弦波ボルタンメトリー(および他の入力)の所見は、主に速度論に基づく信号の識別を可能にする。例えば、高速および低速の酸化還元事象は、主周波数において同様のピークを与えるであろう(AC周波数が高過ぎないことを条件とする)。しかし、より高次の高調波においては、幾つかの酸化還元分子が信号を発生する一方、他の分子は信号を発生しない。FFT分析を使用すると、正弦波入力に対する応答の種々の全周波数成分を一度に観察することができる。
【0425】
同様に、好ましい実施例では、ジョイント時間−周波数変換(JTFT)が行われる。
好ましい実施例では、デジタルロックイン技術が使用される。過去において、電気化学的セルからのデジタル化された生データは、高速フーリエ変換または幾分複雑な形のジョイント時間−周波数変換分析によって分析されてきた。これらの方法の主な欠点は、周波数変換技術に付随する莫大な計算処理時間である。他方、デジタルロックインは単純で且つ迅速である。原理的には、デジタルロックインはアナログロックインと同一である。前者の場合、バンド幅狭窄プロセスは、周波数は入力電圧と同じであるが位相が90°シフトした正弦波を、セル応答に乗じることによって数学的に行われる。この技術は、一度に一つの周波数だけしか分析できないので、そのアナログ対応法と同じ制限を有する。しかし、アナログロックインとは異なり、他の周波数も逐次的に(或いはより強力なプロセッサを用いて並列に)分析することができる。次式(1)の入力電圧
【数1】
について、セルの応答は本質的に
【数2】
で与えられる。
【0426】
周波数(n ω)についての電圧依存性係数Iを見出すために、我々は、この応答に2 Sin (ωn t)および−2 Cos (ωn t) を乗じ、且つローパスフィルタを適用して、実数成分および虚数成分を得る。この例で使用されるローパスフィルタリングは、単純な移動平均過程である。数学的には、当該プロセスは次式のように表される。
【数3】
好ましい実施例では、電流ベクターのバックグラウンド差引き、および位相の最適化が行われる。
【0427】
好ましい実施例では、相関および/または畳み込み技術が使用される。この実施例では、同じ電極の多くの走査が行われる。単一の走査におけるピークを探すのではなく、多くの走査を調べて、これら走査の間の共通の相関を調べる。例えば、ノイズにおけるバンプは、フェロセンが存在しなくても、ネガティブについて180 mV付近に現れる可能性がある。しかし、周波数が走査されれば、同じバンプが同じ場所に現れることはあり得ないであろう。従って、好ましい実施例では多くの周波数で走査し、それらの全てにピークが生じた場合だけをポジティブにカウントする。これは非常に単純な相関であり、より複雑な相関も同様に行ってよい。
【0428】
好ましい実施例においては、信号認識およびバックグラウンド差引きを使用して信号の修復が行われる。この実施例において、このアイディアはセル応答を二つの和関数に適合させることであり、一方は信号を記述するものであり、他方はバックグラウンドキャパシタンス電流をモデル化するものである。これらの関数が構築されたら、この適合されたバックグラウンドキャパシタンス電流を差し引くことによって、信号は応答から容易に修復される。この信号認識スキームは、信号が比較的よく知られた属性および形状を有する如何なるシステムにも適用可能である。以下の例は、このようなスキームを本発明のシステムに如何にして適合できるかを例示するものである。
【0429】
電気化学セルからの応答は、ロックイン増幅器または均等なバンド幅狭窄技術を用いて処理することができる。これは、或る形態のバンド幅狭窄技術を使用して、信号をバックグラウンドに対して増大する多くの方法の一つである。
【0430】
好ましい実施例では、信号のスペクトル分析が行われる。この実施例において、周波数ドメインにおけるフィルタリング技術は、信号の平均、分散、密度、自己相関関数、および電力スペクトル密度を使用し、これを本発明のシステムに適用して、信号/ノイズ比を向上させる(本明細書の一部として援用するSchwarz et al., Signal Processing: Discrete Spectral Analysis, Detection, and Estimation, N. Y. McGraw HIII, 1975を参照されたい)。
【0431】
好ましい実施例では、デジタルフィルタリング技術が使用される。これには適合フィルタ、ウィーナー(Weiner)フィルタリング、カルマン(Kalman)、有限インパルス応答、無限インパルス応答、狭帯域フィルタリングなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0432】
好ましい実施例では整合フィルターが使用される;本明細書の一部として援用する Ziemer et al., ”Principles of Communication Systems, Modulation and Noise ”, 4th Ed. John Wiley & Sons Inc., New York, 465−471,1988; および Helstrom, C. W., ”Statistical Theory of Signal Detection ”, Pergamon Press, Oxford, 112−115,1968を参照されたい。その最も単純な形態において、整合フィルターは、測定された応答(信号+ノイズ)サンプルを、或る対応する公知の信号振幅によって重み付けし、これら二つの信号を畳み込んで、信号をノイズに対して向上させる信号処理技術である。
【0433】
好ましい実施例においては、ウィナーフィルタが使用される(本明細書の一部として援用するPress, supra; and Elliot et al., Fast Transforms: Algorithm, Analysis, Applications N. Y. Academic Press (1982)を参照されたい)。ウィナーフィルタリングは、「汚れた」信号からノイズまたはバックグラウンドを除去する最適なフィルタを発見することを含んでいる。この信号処理法は、フーリエ変換技術と共に実施される。このアイデアは次の通りである。ノイズに対する信号が劣り、またバックグラウンドが大きいため、器具からの出力は「信頼できない」信号である。
【数4】
ここで、s(t)は信号であり、n(t)はノイズである。なお、後で分かるようにs(t)は信号ではなく、それは或る既知の応答関数r(t)と共に畳み込まれた真の「信頼できる」信号u(t)である(酸化還元結合を有するCMSシステムの場合、u(t)はネルンスト関数(Nernstian)である)。即ち
【数5】
である。
【0434】
周波数空間では、当該反応は次のとおりである:
【数6】
ここで、S、R、およびUは、夫々s、rおよびuのフーリエ変換である。信頼できる信号は、最適フィルターφ(t)またはそのフーリエ対応物Φ(ω)を見出すことによって修復され、これは、測定された信号c(t)またはC(ω)に適用され、次いでr(t)またはR(ω)により逆畳込み(deconvolved)されるときに、次式を用いて信頼できる信号u(t)またはU(ω)に近似した信号を生じる。
【数7】
【0435】
一般に、最適フィルターは下記のように定義される
【数8】
好ましい実施例では、カルマンフィルターが使用され、これは帰納評価フィルタ技術であり、ノイズの存在下において変化する信号の現在値を追跡する。Kalman et al., A NewApproach to Linear Filtering and Prediction Problems, Trans. ASME J. Basic Engineering, Seires D, 82, March 35,1960; Elliot Ed. Handbook of Digital Signal Processing: Engineering Applications, Academic Press, San Diego, p908,1987; Chui et al., Kalman Filtering: with Real Time Applications, Springer−Verlag, New York, 1987を参照されたい;これらの全てを本明細書の一部として明示的に援用する。
【0436】
好ましい実施例において、この非線形高調波応答は、非対称性の応答を誘導することによって増大される。好ましい実施例において、これは、不可逆的酸化還元対を有するシステムを使用することによって行われる。例えば、フェロセンは、非常に可逆的な酸化還元対である。従って、フェロセンは所定の点でのAC電圧によって限界を定められ、該電圧が上昇すると酸化され、下降すると還元される。しかし、半可逆的または非可逆的な酸化還元対を用いると、例えば、分子は電圧の上昇によって酸化され、下降の際には還元されない(または部分的に還元されない)、逆も同様である。これは、一定の周波数において更に大きな非線形性を生じるであろう。
【0437】
これを実行する方法の三つの例は、WO00/16089に一般的に記載されているように、ルミノールのように酸化形態で分解されるETM分子を使用すること、共酸化または酸化還元媒介を使用すること、および酵素結合媒介を使用することである。
【0438】
好ましい実施例において、電子移動は交流(AC)法を使用して開始される。加えて、AC技術の使用は、ETM以外のもの、即ち、望ましくない信号を「ロックアウト」または「フィルタリング」することにより、如何なる単一周波数においてもバックグラウンド信号の顕著な減少を可能にする。即ち、溶液中の電荷キャリアまたは酸化還元活性分子の周波数応答は、その拡散係数および電荷移動係数によって制限されるであろう。従って、高周波数において、電荷キャリアは、その電荷を電極へ移動させるために充分に速く拡散しない可能性があり、および/または、電荷移動速度は充分に速くないかも知れない。これは、良好な単分子層を有していない、即ち、部分的または不充分な単分子層を有する実施例において、即ち、溶媒が電極にアクセス可能な場合に特に顕著である。上記で概説したように、DC技術においては、電極が溶媒にアクセス可能な「孔」の存在は、溶媒電荷キャリアによるシステムの「短絡」を生じる可能性、即ち、それらが電極に到達してバックグラウンド信号を発生する可能性がある。しかし、本発明のAC技術を使用すれば、単分子層が存在しても存在しなくても、溶液中の一以上の荷電粒子の周波数応答を防止できる一以上の周波数を選択することができる。血液のような多くの生物学的液体は、電流滴定検出法を妨害し得るかなりの量の酸化還元活性分子を含んでいるので、このことは特に重要である。
【0439】
好ましい実施例において、当該システムの測定は少なくとも二つの周波数で行われ、複数の周波数での測定が好ましい。複数の周波数は走査を含む。例えば、出力信号(例えばAC電流)を1〜20 Hzのような低い入力周波数で測定し、その応答を10〜100 Hzのような高周波数での出力信号と比較することにより、ETMの存在と不存在との間での周波数応答の差が示されるであろう。好ましい実施例において、この周波数応答は、少なくとも2、好ましくは少なくとも約5、更に好ましくは少なくとも約10の周波数で測定される。
【0440】
入力信号を送信して電子移動を開始した後に、出力信号が受信または検出される。出力信号の存在および大きさは、入力信号の過電圧/振幅;入力AC信号の周波数;介在する媒質の組成;DCオフセット;当該システムの環境;ETMの性質;溶媒;および塩の種類および濃度を含む多くの因子に依存するであろう。所定の入力信号における出力信号の存在および大きさは、一般に、ETMの存在または不存在、単分子層の表面からのETMの配置および距離、並びに入力信号の特性に依存するであろう。幾つかの実施例においては、非特異的結合と、ラベルプローブを含有する標的特異的アッセイ複合体の形成とを、インピーダンスに基づいて識別することが可能である。
【0441】
好ましい実施例において、出力信号はAC電流を含んでいる。上記で概説したように、出力電流の大きさはパラメータの数に依存するであろう。これらのパラメータを変化させることによって、当該システムは多くの方法で最適化することができる。
【0442】
一般に、本発明において発生されたAC電流は、約1フェムトアンペア〜約1ミリアンペアの範囲に亘り、約50フェムトアンペア〜約100マイクロアンペアが好ましく、約1ピコアンペア〜約1マイクロアンペアが特に好ましい。
【0443】
好ましい実施例において、出力信号は、入力信号に対してAC成分が位相シフトしている。理論に拘束されるものではないが、本発明のシステムは、位相シフトに基づく検出を可能にするのに充分に均一であり得ると思われる。即ち、それを介して電子移動が生じる本発明の複合生体分子は、標準の電子成分と同様、位相シフトを決定できるようにAC入力に対して均一に反応する。これは、ETMの存在と不存在との間の差、および/または、ラベルプローブを含有する標的特異的アッセイ複合体の存在とラベルプローブのシステム部品への非特異的結合との間の差の基礎として役立つ。
【0444】
この出力信号はETMの存在に特徴的である。即ち、出力信号は、標的特異的なアッセイ複合体の存在に特徴的である。好ましい実施例において、検出の基礎は、アッセイ複合体が形成された結果としての、当該システムの誘導電流インピーダンスにおける差である。誘導電流インピーダンスは、電極とETMとの間のシステムのインピーダンスである。誘導電流インピーダンスは、バルク溶液と電極との間のインピーダンスであるバルクもしくは誘電体インピーダンスとは全く異なる。多くの因子が誘導電流インピーダンスを変化させる可能性がある。これはバルクインピーダンスに影響する可能性はなく、逆も同様である。従って、このシステムにおいて、核酸を含有するアッセイ複合体は一定の誘導電流インピーダンスを有し、これは就中、ETMと電極との間の距離、それらの電子的性質、および介在する媒質の組成に依存するであろう。本発明の方法において重要なことは、ETMと電極との間の誘導電流インピーダンスが、ETMを含むラベルプローブが電極に特異的または非特異的に結合されるかどうか応じて著しく異なることである。
【0445】
従って、本発明は更に、本発明の組成物を使用してアナライトを検出するための、電子的な素子または装置を提供する。この装置は、少なくとも第一の測定電極またはサンプル電極、および第二の測定電極または対向電極を有する、サンプル溶液を収容するためのアッセイチャンバを含んでいる。3電極システムもまた有用である。第一および第二の測定電極は、液体試験サンプルの存在下で二つの電気泳動電極が電気的に接触し得るように、試験サンプル収容領域に接触する。
【0446】
好ましい実施例において、この装置はまた、ここで説明したような、結合リンカーを介して共有結合された一本鎖核酸捕捉プローブと、導電性オリゴマーを含む単分子層とを含んだ検出電極を具備している。
【0447】
当該装置は更に、試験チャンバに、即ち測定電極に接続されたAC電圧源を備えている。好ましくは、このAC電圧源は、同様にDCオフセット電圧を供給することができる。
【0448】
好ましい実施例において、当該装置は更に、入力信号および出力信号を比較できるプロセッサを備えている。このプロセッサは前記電極に結合され、また出力信号を受取って、標的核酸の存在を検出するように構成されている。
【0449】
製造されたら、本発明の多重化装置およびカートリッジは、広範な種々の適用に用途を見出す。特に、本発明の組成物は、ハイブリダイゼーションアッセイにおける用途が存在する。当業者が理解するように、単一種の核酸(即ち、単一の核酸配列)または複数の核酸種を有する電極を製造することができる。
【0450】
最近、多形DNAマーカーを使用することによって、遺伝的変異と発現型との関係の分析に焦点が当てられている。以前の研究は、短い直列反復配列(STR)を多形位置マーカーとして利用した。しかし、最近では一塩基多形(SNP)の使用に焦点が当てられており、これはヒトのゲノムDNAにおいてはキロ塩基当りで1を越える平均頻度で生じる。幾つかのSNP、特にコード配列中またはその周囲にあるSNPは、治療的関連のある多形変種および/または疾患素因の直接的原因である可能性が高い。臨床的に重要な発現型を生じる周知の多くの多形が存在する。例えば、apoE2/3/4変種は、アルツハイマー病および他の疾患の異なる関連リスクに関係している(Cordor et al., Science 261 (1993)を参照されたい)。SNP遺伝子部位の多重PCR増幅と、これにに続くオリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションは、少なくとも数百のSNPを同時に遺伝子タイピングするための、正確で且つ信頼性のある方法であることが示されている。
【0451】
本発明は、電極上での電気化学的検出を使用して、特定の位置での標的核酸の配列を決定する方法に向けられている。本発明は、好ましくは変異検出のための電極アレイを使用した、配列の相違または変化(例えばSNP)の検出を含む。
【0452】
当該技術で知られているように、標的核酸における特定の位置での塩基の同一性を検出または決定するために使用できる多くの技術が存在し、これには温度、標的配列に対する完全および不完全なプローブの競合ハイブリダイゼーション、例えば一塩基延長技術を使用した合成による配列決定(時には「ミニシーケンシング」と称される)、オリゴヌクレオチドリガーゼ増幅(OLA)反応、ローリングサークル増幅(RCA)、対立遺伝子PCR、競合ハイブリダイゼーション、およびインベーダーTM技術が含まれるが、これらに限定されない。加えて、本発明は、表面結合アレイの新規な性質を利用し、また非特異的結合を減少させるために「競合体 (competimer)」を使用する新規な発明に向けられている。
従って、本発明の組成物は、種々の研究、臨床、品質管理、またはフィールド試験設定に用いることができる。
【0453】
好ましい実施例では、遺伝子診断におけるプローブが使用される。例えば、非ポリープ性結腸癌の遺伝子、BRCA1乳癌遺伝子、種々の癌に関連した遺伝子であるP53、発症前の患者の容易なスクリーニングを可能にするアルツハマー病の大リスクを示すApo E4遺伝子、嚢胞性線維症遺伝子、または当該技術で周知の他の何れかの遺伝子のような標的配列を検出するために、ここに開示した技術を使用してプローブを作製することができる。
【0454】
追加の実施例では、本発明の複合体を使用してウイルスおよび細菌の検出が行われる。この実施例において、プローブは、種々の細菌およびウイルスから標的配列を検出するように設計される。例えば、現在の血液スクリーニング技術は、抗HIV抗体の検出に依存している。ここに開示される方法は、臨床サンプルの直接的スクリーニング、特に高度に保存されたHIV配列の検出を可能にする。加えて、これは、抗ウイルス療法の効果を評価する改善された方法として、患者の中で循環するウイルスの直接的なモニタリングを可能にする。同様に、白血病に関連するウイルス、即ち、HTLV−IおよびHTLV−IIはこの方法で検出することができる。結核、クリミジアおよび他の性伝染疾患のような細菌感染もまた、例えばリボゾームRNA(r−RNA)を標的配列に使用して検出することができる。
【0455】
好ましい実施例において、本発明の核酸には、水サンプルおよび食品サンプルのスクリーニングにおいて、毒性細菌のためのプローブとしての用途が存在する。例えばサンプルを処理し、細菌を溶菌してその核酸(特にrRNA)を放出させ、次いで菌株を認識するようにプローブが設計される。これら菌株にはサルモネラ菌、カンビロバクター菌、コレラ菌、レーシュマニア菌、大腸菌の腸毒素株、およびレジオネラ病菌のような病原株が含まれるが、これらに限定されない。同様に、本発明の組成物を使用して、微生物での環境浄化戦略を評価してもよい。
【0456】
更なる実施例において、当該プローブは、犯罪現場DNAを被害者および容疑者から得たサンプルと一致させる、法医学的「DNA指紋タイピング」のために有用である。
【0457】
追加の実施例において、アレイにおけるプローブはハイブリダイゼーションによる配列決定のために使用される。
【0458】
従って、本発明は、極めて特異的且つ感受性のプローブを提供する。これは、幾つかの実施例では、ハイブリダイズしなかったプローブを除去することなく標的配列を検出する。これは自動化された遺伝子プローブアッセイに有用であろう。
【0459】
或いは、本発明の組成物はPCRにおいて成功裏に遺伝子増幅を検出し、首尾よくPCR反応を可能にして、標的配列の存在または不存在を同定するするために有用である。この方法において、PCRは幾つかの方法で使用することができる。たとえば、一つの実施例では、PCR反応は当該技術で知られているようにして行われ、次いで導電性オリゴマーを介して電極に共有結合された、ETMを備えた標的核酸を含む本発明の組成物が添加され、続いて標的核酸の検出が行われる。或いは、導電性オリゴマーを備えた電極および標的核酸の存在下で、またはこれらを後で添加し、ETMでラベルされたヌクレオチドを使用してPCRが行われる。ETMを含むPCR生成物の電極組成物への結合は、電子移動を介しての検出を可能にする。最後に、導電性ポリマーを介して電極に結合された核酸は、ETMでラベルされた第二のプライマーの添加と共に、PCRプライマーの一つであってよい。伸長は、ETMおよび電極が共有結合された状態で二本鎖核酸をもたらす。この方法において、本発明は標的核酸のPCR検出のために使用される。
【0460】
好ましい実施例において、このアレイはmRNA検出のために使用される。好ましい実施例は、mRNAの3’−ポリアデニル化テールの近くにハイブリダイズする捕捉プローブ、または捕捉延長プローブを利用する。これは、一つの種の標的結合性プローブ、即ち、mRNA標的のポリAテールに結合するポリTを含むプローブの使用を可能にする。一般に、このプローブは検出プローブ(または他のプローブ)に結合する第二の部分、好ましくは非ポリTを含むであろう。これは、一つの標的結合性プローブの製造を可能にし、行われる異なるプローブ合成の量を減少することを可能にする。
【0461】
好ましい実施例において、制限酵素およびライゲーション法の使用は、「汎用性」アレイの作製を可能にする。この実施例では、PCT US97/20014の図7に一般的に示されているように、単分子層は制限エンドヌクレアーゼ末端を含む捕捉プローブを含んでいる。核酸の相補的部分を利用する一方、「粘着末端」を残すことにより、何れかの数の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むアレイが作製される。標的サンプルを一以上のこれら制限酵素で処理することにより、標的がアレイに結合することを可能にする。これは、標的の配列を知ることなく行うことができる。この標的配列は、所望に応じて、リガーゼのような標準の方法を使用してライゲートすることができ、また標的配列は標準のラベルまたは本発明の方法を使用して検出することができる。
【0462】
本発明は、核酸の敏感な検出をもたらし得る方法を提供する。好ましい実施例では、10×10未満の分子が検出され、10×10未満が好ましく、10×10未満が特に好ましく、10×10未満が特別好ましく、10×10未満が最も好ましい。当業者が理解するように、これは標的配列とリポータ分子との間の1:1の関係を取る。各標的配列について1より多くのリポータ分子(即ち、電子移動部分)が使用されれば、感度は上昇するであろう。
【0463】
全ての特許出願を含めて、ここに引用した全ての参照文献は、本明細書の一部として、その全体が本願に援用される。
【0464】
[実施例]
例1
<信号分析>
本発明は、電気化学的技術を利用して、種々の生物学的および化学的標的を検出する。一般に、これらの技術は有益な、または特徴的な形状、サイズおよび位置に関する信号を生じる。信号の特徴を認識するコンピュータプログラムを作成することにより、我々は、バックグラウンド事象から信号を識別し、正確な検出のために必要な関連情報を抽出することができる。
【0465】
<モデルへの適合>
与えられた測定方法から生じ得る信号を記述する方程式のファミリー、および一組の境界条件を設計することが一般に可能である。この数学的記述は「モデル」と呼ばれる。時には、このモデルは根底に存在する化学的理論に基づいているが、多くの場合、それは単純に、観察された信号属性を適合させる近似であってもよい。殆どの場合、この方法は「非線形」であり、基本多項式よりも複雑な方程式を含んでいる。
【0466】
データを非線型モデルに適合させる幾つかの方法が存在するが、それらは共通して以下のステップを含んでいる:1)当該モデルによって記述されない何れか共通の属性の迅速な検出;2)初期推定;3)必要に応じて繰り返される反復した改善および評価;4)もし存在すれば、共通のエラー適合の検出および補正;および5)適合の質を判断するための最終評価。適合が選択されたら、更なるデータ解析に使用するために、重要なパラメータの値を抽出することができる。
【0467】
<AC信号を記述するためのベクトル表記>
この報告で記載する信号認識法を示す一例として、私は、現在のところ我々の最も共通した電気化学的技術、即ち、四次高調波でモニターされる交流電流(AC)ボルタンメトリーを使用する。この技術は、その振幅(高さ、R)および位相(位置、θ)を入力DC電圧の関数として変化させる、AC信号(正弦波)を生じる。我々が既知の周波数でモニターする限り、それはこのような波を定義する二つの値を取るだけである。図16は正弦波およびその対応するベクトル表記を示している。
【0468】
これらの二つの値は、Rおよびθであることができるが、図に示すように、それらは振動の1/4、即ち90°離れた(X,Y)対であってもよい。このようなシステムの可視化を単純にするための一つの方法は、図17に四つの図に例示したベクトル表記と呼ばれるものを使用することである。
【0469】
値(R,θ)および(X,Y)は異なるが、同じベクトルを記述する互換可能な方法であることを理解するのが重要である。ベクトル自身は、正弦波、従ってデータを表すものである。更に、ダッシュを付した値およびダッシュを付していない値(グラフの右側の値 vs 左側の値)の間の差は、(例えば、極座標図における破線の相対的位置によって示されるように)参照フレームの回転のみである。この回転もデータを変化させないが、後述する通り有用であることができる。
【0470】
ベクトルの一つの重要な属性は、ベクトルが、対応する波と同様に正確に加算されることである。例えば、二つのベクトルが大略反対方向を向いていれば、それらを加算したときに、それらは相互に打消し合い、小さい残留ベクターのみが残る。これは、「減殺的干渉」を有するような方法で、如何にして二つの波を一緒にするのが可能であるかを正確にモデル化しており、ここでは、得られた振幅が夫々の入力よりも小さい。全ての波が同じ周波数を有する限り、ベクトルはそれらの相互干渉をモデル化するであろう。
【0471】
ACボルタンメトリーにおいて、我々は、所定の周波数における振動を入力電圧の関数としてモニターする。ベクトル表記は、何れの信号においても正弦波的挙動を正確にモデル化するから、我々の適合の既述において、私はデータをベクトルとしてのみ説明する。
【0472】
<XおよびYにおける適合の選択>
ベクトルデータを得る何れかの実験の際に、科学者はRの値だけ(Rおよびθの両方が記録される時であっても)を積極的にモニターすることが普通である。これは、システムおよび実験の設定に応じて、参照フレームが一つの器具からもう一つの器具へ、または或る日から次の日へと変化し得るからである。しかし、Rは参照フレームと共には変化しない。(極座標においては、参照フレームの回転はθを変化させるだけであることを想起されたい)
しかし、単一の認識が働くために、我々はモデル、即ち、我々が観察を期待する形状の数学的記述を必要とする。形状が単純で且つ変化が小さいほど、この記述および認識は容易である。図18および図19は、四次高調波ACボルタンメトリー(AC電圧−4)についてのRおよびθの軌跡の例である。
【0473】
R空間における4ローブ形状は、中から大の信号が特徴であるが、バックグラウンドに対して信号が収縮するに伴ってR空間信号は捻れる。更に、より大きい信号での走査の8つの軌跡は、小さい信号での走査とは全く異なる。図20および図21は、より小さい信号の例を示している。
【0474】
この複雑な(R,θ)の挙動は、信号およびバックグラウンドの両方を含むベクトル軌跡の特徴である。我々が、信号ベクトルS(Rおよびθによって記述される)をバックグラウンドベクトルB(Rおよびθによって記述される)と共に有していれば(ここでSはベクトルSを表し、BはベクトルBを表す)、データは
【数9】
である。ベクトルDはRおよびθによって記述され(ここでDはベクトルDを表す)、これらは次式のように信号値およびバックグラウンド値に対する依存性を有する。
【数10】
【0475】
Rおよびθの軌跡の複雑さは、θがそうであるように、Rが全ての四つのパラメータ(R、θ、Rおよびθ)に依存する事実から来るものである。しかし、我々が極座標の変わりに直交座標を使用してデータを記述すれば、ベクトルDはXおよびYによって記述され、これらは次式の通りである。
【数11】
および
【数12】
【0476】
直交座標を使用することは、ベクトルSおよびベクトルBのパラメータに対するベクトルDのパラメータの依存性を単純化する。この単純さは、先に示した同じ例を、今度は図22および図23(中サイズの信号)、並びに図24および図25(小さい信号)に示したように、(X,Y)としてグラフ化したときに示される。
【0477】
より小さい信号は、今度は中程度の信号と定性的に同様であり、従って、同じ数学的方法によって更に記述され易い。このため、我々はXおよびYにおける適合を選択する。(モデルの着想および適合における計算の単純さのために、我々は、両方の大きさを同時に適合させる代りに、XおよびYにおいて独立に適合させることを選択する。
【0478】
<AC電圧−4をとるモデル>
我々は、AC電圧−4信号で示される特徴的な形状を、幾つかの異なる数学的表現と比較した。4ローブのプロファイルは、我々がピーク形状の三次導関数に関する方程式を使用することを直接示唆し、多くの比較の後に、われわれはガウス関数の三次導関数(G’’’)がAC電圧−4信号の非常に良好な近似であると結論した。バックグラウンドについては、我々が観察した異なる形状の大部分を説明するために、多項式(P)が充分であるはずである。(多項式の次数(従ってその形状を記述するのに必要なパラメータの数)は、走査の長さに依存するであろう。走査が長ければ、同じ走査特徴を説明するためにより高次の多項式を必要とするであろう)。これは、下記の方程式に翻訳され、ここでベクトルI(V)はデータであり、ベクトルI(V)は信号であり、ベクトルI(V)はバックグラウンドである。なお、I(V)はベクトルI(V)を表し、I(V)はベクトルI(V)を表し、I(V)はベクトル、I(V)を表す。
【数13】
これは、AC電圧−4モードのために我々が使用した下記の最終的な方程式を導く:
X(V)=G’’’(V)+P(V)
および
Y(V)=G’’’(V)+P(V)
【0479】
我々はまた、二以上のラベル(電圧空間内のそれらの位置によって区別される)を備えたシステムのための適合プロセスを作成した。それらは上記で説明したものと類似のモデルを使用するが、根底をなす前庭として二以上の信号を仮定している。
【数14】
【0480】
なお、境界条件として、ガウス導関数G’’’およびG’’’は夫々三つのパラメータを有している:一つは高さ、一つは幅、一つは位置(電圧における)である。この高さは限定がなく、信号伝達している電気化学的ラベルの数にのみ対応する。しかし、真の電気化学的信号を表すためには、適合の幅が合理的範囲内になければならない。更に、独立のXおよびYの適合における信号は、それらの両者が同じ電気化学的ラベルに対応すると仮定するためには、それらが相互に近接して(電圧空間において)いなければならない。これらの境界条件に、如何にして意味のある適合をとらせることができるかについては後述する。
【0481】
<最適位相>
先に述べたように、参照フレームの選択は任意である。データに関する限り、一つの(X,Y)対はもう一つの回転された(X’,Y’)対と同様に良好である。しかし、このモデルは正確な理論的記述ではなく実体に対する近似であることが多いから、該モデルは好ましい参照フレームを強要するかもしれない。これは、上記で述べたAC電圧−4システムについて該当する。
【0482】
一例として、バックグラウンドに比較して大きな信号を有する一つのAC電圧−4の軌跡を考察してみよう。二次元グラフにおいて、電圧の関数としてのデータベクトルの先端(10 mV毎に一つの点)をプロットすれば、図28に示す結果が生じる。
【0483】
上記で示したように、X軸およびY軸がこの信号を跨ぐように参照フレームを選択すれば、図27および図28に示すように、信号はXおよびYの両方に対して強く寄与する。
【0484】
しかし、信号に対して概ね平行および垂直に一対の軸を選択すれば(図26に示した軸に対して45°回転される)、図29および図30に示すように、垂直ベクトルに対しては非常に少しの信号しか寄与しない。
【0485】
更に、AC電圧−4モデルについて我々が選んだ4ローブ形状は、垂直軌道の6ローブを記述しないことを理解することができる。平行および垂直な(X,Y)対を使用してデータを適合させようとすれば、我々は、平行成分からの信号を抽出できるだけであり、我々の二次元データの一方を失うことになるであろう。
【0486】
X軸およびY軸を一般的に評価する機器は、AC入力駆動力の存在に基づいている。この選択は電気化学的システムを考慮に入れていないから、上記で述べた平行/垂直の問題を生じる可能性がある。従って、上記モデルに基づく信号認識については、存在する如何なる電気化学的信号をも挟むように取った、新たな一対の軸を選択するのが最良の方策である。
【0487】
このような軸を選択するために、我々は、信号向きを測定する方法を必要とする。我々は、一つの線を極座標における信号に適合させることはできるであろうが、X信号およびY信号は相互に独立であるから、基本的な線形適合を使用することはできない。例えば、Y軸に沿って整列された信号を想定してみよう。我々が線型の最小二乗適合(最も普通の適合法)を試みるとすれば、得られる線は信号に沿わずにX軸に沿うことになり、適合線よりも上にある点の数と下にある点の数が等しくなるであろう。これは、Y方向の値としてだけ考慮したときに、当該データはX依存性をもたないからである。
【0488】
しかし、非線型適合作業は反復法であるから、我々が使用したいと思うよりも多くの処理時間を必要とするであろう。それよりもむしろ、我々は、より単純な数学的操作を含む迅速な方法を使用するであろう。このような一つの方法は、ベクトル和を使用することである。図31に示した三つの点をグループ化することを考えよう。
【0489】
これらの点をベクトルと看做せば、我々は、それらの座標を加算することによってそれらを足し合せることができる。このベクトル和は下記の座標を有するであろう。
【数15】
このベクトル和は、これらのデータを通り且つ(0,0)を通過する最適な線についての合理的な角度を提供する。
【数16】
【0490】
我々は、この角度を「最適位相」と称する。我々の例について、この加算は図32に示されている。図33は、これら三つのサンプルのデータ点が当該線の周囲に集まる仕方を示している。これらについて、最適位相は64°である。
【0491】
この方法の一つの利点は、その結果が元のデータ点のベクトル長さで重み付けされることである。即ち、データ点の大きさが小さければ(信号が存在しない走査の切片を表しているときのように)、それは最適位相の値に対して小さい影響しかもたない。例えば、サンプル群に対して小さいデータ点を加えると、その結果は図34および図35に示される。この新しい点は、最適位相を3°未満だけ変化させる。
【0492】
所望であれば、小さい値には少ない重み付けを与えることが可能である。最適位相についてのより一般的な表現は、個々のデータ点のベクトル長さ(r)で重み付された和を有する。nの値を増大させれば、小さいデータ点の重みは益々少なくなる。しかし、我々の現在の全ての適合プログラムにおいて、我々は、nがゼロのままである場合と均等な、上記に記載した方程式を使用する。
【数17】
【0493】
我々は、この方法を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算することができるが、考慮しなければならない複雑さが存在する。多くの技術(AC電圧−4を含む)について、電気化学的信号は、上記で述べた計算が完了したときに、その一部が相互に相殺し合うように適合される。これを回避するために、我々は先ずデータの半分を180°回転させる。図26に示したデータをとると、我々は、図36に示したデータを使用して最適位相を計算する。得られた線は、図37において、元のデータの上に重ねられる。
【0494】
図36および図37に引かれた線の角度(101°)は、この適合についてX軸およびY軸を選ぶために使用されたもの(±45°)である。しかし、不運なことに更なる複雑さが存在し得る。回転された切片と未回転の切片との間を分割する線に対して信号が異なる向きであれば、上記で述べた操作は適正な角度をもたらさないかも知れない。例えば,上記の信号を取ってそれを時計回りに101°回転させると、その最適位相は0°になるはずである。しかし、実際の計算値は、図38に示すように−48°で終わる。
【0495】
これを防止するために、我々は、それが信号に対して平行ではなくもっと垂直な回転境界を選ぶ必要がある。我々は、信号線が主として0°に沿っているか、または主として90°に沿っているかを最初に決定することによって、そのように行うことができる。90°に近い信号座標の絶対値のベクトル和を取れば、得られる角度
【数18】
は45°よりも大きくなるであろう。他方、上記の場合に、我々は45°未満である10°の角度を見出し、この信号はより0°に沿っていると結論する。従って、我々は、信号の半分を90°軸の遠い側から回転させる。このベクトル和は、今度は最適位相のための合理的な値、即ち、期待値である0°に類似した1°を生じる。
【0496】
一つの最後の複雑さは、我々は全体の走査についての最適位相を見出したいのではなく、むしろ走査において存在する何等かの電気化学的信号についての最適位相を見出したいと欲する事実である。我々は、如何なるバックグラウンドも無視したいと欲する。不運なことに、信号が小さければ、最適位相計算はバックグラウンドの位相によって支配されるであろう。これを回避するために、我々はベクトル和を計算する前に、バックグラウンド差引きを行う。
【0497】
例えば、図24および図25によって表される走査を調べれば、我々はバックグラウンドによる大きな寄与を知ることができる。この走査を二次元で調べれば、我々は全体の走査の位相が主として120°に沿っている(図41)ことを知ることができる。
【0498】
しかし、多項式を全体の走査(夫々が0°軸および90°軸に沿った)に適合させるために必要な高速計算を実行すれば、我々は、バックグラウンドを図42および図43に示したように近似することができる。この例において、我々はAC電圧−4の対称性を我々に有利に使用している。もし、信号がバックグラウンドよりも上および下に等しい寄与を有していれば(何れかの偶高調波AC電圧の場合にそうであるように)、多項式適合は信号の中心線に従う傾向を有するであろう。これにより、走査への多項式適合はバックグラウンドの優れた推定値になる。該多項式を計算するために、我々は現在、「一般的な多項式特異値分解適合(general polynomial singular value decomposition fit)」を使用している。
【0499】
次いで、このバックグラウンドの近似を差引いて、図44および図45に示すように、この走査を遥かに高純度の信号である何物かに変換することができる。図46は、これを二次元プロットとして表しており、ここから我々は、この節で先に概説した技術を使用して、今度は略70°の最適位相を計算することができるであろう。
【0500】
要約すると、X軸およびY軸を選択するための基本的手順は次の通りである。
1.近似バックグラウンドを0°および90°の夫々に沿って適合させる。これらを当該走査から差引いて、信号により支配される残りの軌跡を残す。
2.全ての座標の絶対値(0°および90°に沿った)を取る。ベクトル和を計算する。その角度(θabs)が0°または90°に近接しているかどうかを決定する。
3.θabsが0°に近接していれば、全てのデータ点を90°軸の左側に選択する。もし90°に近接していれば、全てのデータ点を0°軸の下に取る。これらを180°回転させる。(計算の単純化のために、我々は0°軸および90°軸を境界として使用した。もし更に正確なθabsの決定が必要であれば、我々はその代りに、θabs±90°の範囲外にある一組の点を回転させることができる)。
4.ベクトル和を計算する。その角度が「最適位相」(θopt)である。
5.θoptから45°のX軸およびY軸を選択する。
【0501】
<モデル化されない挙動のチェック>
全体の処理時間を減少させるためには、或る走査が、モデルからの何等かの大きな偏位を有していて、その適合を無意味にするかどうかを早く知ることが最良である。ACボルタンメトリー(四次高調波)において我々が遭遇した一つのこのような特徴は、金属汚染物のストリッピングによって起きる鋭いピークであった。図47は、R空間に表示された一例を示している。
【0502】
図48および図49に示すように、XおよびY(最適位相から45°)にはこの鋭いスパイクの特徴が明瞭に残っている。
【0503】
この特徴の対称性は、それを我々の正常な信号から区別する;即ち、AC電圧−4の信号はバックグラウンドの上下に等しい部分を有しているが、このスパイクは有していない。
【0504】
この対称性をモニターする一つの迅速ではあるが大まかな方法は、近似バックグラウンドを分離し(最適位相を決定するために行ったように)、次いで基底線よりも上にあるの点の分布を、それよりも下の分布と比較することである。例えば、上記のY軌跡から多項式を差し引けば、図50および図51に示した結果が得られる。
【0505】
近似バックグラウンドよりも上および下にある分布を調べれば、我々は、図52に示すように、スパイクの存在が、大きな範囲の値をバックグラウンドラインの上よりもその下に存在させることを見出す。
【0506】
この例において、当該ラインの下にあるデータの標準偏差は、その上にある標準偏差よりも約21/2倍大きい。AC電圧−4信号は仮想バックグラウンドの回りに均一に分布し、従って1に近い比を有するから、我々は、これをAC電圧−4信号の期待値からの対称的差の指標として解釈することができる。アクセス可能な値の範囲を設定することによって、この大まかな方法は、大きなスパイクを伴う走査の迅速な検出および排除を可能にする。我々は現在のところ、2.25未満および1/2.25を越える比が、更なる適合のために許容可能であると考えている。しかし、この値は走査長のような異常なパラメータに依存し得ることを知るのが重要である。
【0507】
<初期推定>
反復適合手順は全て、出発点、当該データを適合させるであろう当該モデルの方程式値の初期推定を必要とする。次いで、反復(次の節で述べる)が、これら推定を段階的に改善する。単純なモデルのシステムの場合、一つの予め定められた初期推定のみが必要とされることが多い。その場合、この推定は全ての可能なデータの充分な出発点である。しかし、複雑な形状を含むモデル(AC−4について我々が使用するモデルのような)については、夫々の個々の走査に基づく正確な初期推定が、より迅速な適合を導くことができ、また、エラー適合を生じる如何なる傾向をも低減または排除することができる。
【0508】
ここでも再度、我々は対称性を我々に有利に使用する。第一に、その分布が基底ラインの上下で均一に分布している対称な信号について、我々は高速多項式適合を使用して、バックグラウンドのための初期推定を計算することができる。先の節で概説した最適位相計算でもそうであったように、この多項式は如何なる信号の中心線にも適合する傾向があり、従って良好なバックグラウンドを推定するであろう。より良好なバックグラウンド推定を得るための改善は、エッジを「釘付け」し、それによってエッジ効果を低減することにより行われる。
【0509】
このバックグラウンドを差引くと、残留するもの(「残り」)は殆どが信号(もし存在すれば)のはずである。この信号を評価するために、我々は、所定の測定技術および化学システムが、一般に特徴的挙動をもった信号を生じるとの事実から始めることができる。AC電圧−4を用いてプロービングされるセンサの場合、全ての信号は同様の幅を有する。従って、最も共通した幅に基づく所期推定が適切である。
【0510】
信号位置および信号高さの残りのパラメータを推定するために、我々は再度、公知のAC電圧−4の対称性を、今回は特徴的な幅の知識と組合せて使用することができる。我々は二つの大きい中央ローブの間の平均分離を知っているから、我々は、信号を複製して、その二つのコピーを該分離の半分だけ反対向きにシフトさせることができる。次いで、一方を他方から差引けば、中央ローブは増加的に干渉する。この得られた波の絶対値は、信号の高さおよび位置の良好な見積りを提供する。このプロセスは、0.072の中心ローブ分離で、0.20の位置にある高さ11.9の信号について、図53、図54および図55に示されている。
【0511】
図55における軌跡は、0.02の位置にその最大値23.25を有している。この位置は真のデータ値と良く適合する。(両者共に0.20)。増加的干渉高さは中心ピーク信号高さの約2倍であるはずであり、これは干渉プロットが1/2×23.25 = 11.6の初期推定を与えることを意味する。これは、入力値から僅か3%の差である。(この差は、上記プロセスに用いたシフトが0.062で、サンプル信号の実際の0.072分離から異なっていたために生じる)。
【0512】
上記の方法(我々が生データにおける最大および最小について単純に検索したものとは違って)の一つの重要な利点は、それが信号の予想された幅および対称性を備えた特徴のみを増幅することである。上記と同じ信号であるが、今度は該信号自身よりも僅かに高い一方の側に異常にピークオフした信号を考慮しよう。(図56参照)。単純な最大/最小検索においては、これは初期推測を妨害し易いであろう。しかし、上記で概説した手順を使用すれば、初期推測は、図57に示すように、0.20の位置における高さが11.6のままである。
【0513】
従って、我々は、全てのパラメータ(信号の高さ、位置および幅、プラスバックグラウンド)の初期推定を計算する方法を有しており、これは1)迅速(線型)適合法を使用して多項式を計算すること;2)一組における最大数を検索すること、および3)単純な計算、のみを含んでいる。この技術の能力の一例として、図58は、実際のデータ軌跡と対応する初期推定の重ね合わせを示している。
【0514】
<最適化およびダイナミックレンジ>
初期推定が行われると、我々は、多くの標準的な非線形回帰アルゴリズムの何れかを使用して、適合を最適化することができる。(我々は現在のところ、Levenberg−Marquardt法に基づくバージョンを使用している。これは、Chapter 15 of Numerical Recipes in C : The Art of Scientific Computing, second edition, by W. H. Press, S. A. Teukolsky, W. T. Vetterling, and B. P. Flannery, Cambridge UniversityPress, New York (1992)に記載されている。 これはJournal of the Society, for Industrial and Applied Mathematics, 11 (1963) 431−441において、「最大隣接(maximum neighborhood)」法 として、D. W. Marquardtにより最初に提示された)。 それらは詳細においては異なるが、基本的な手順は全て同じである。初期推定が実際のデータと比較され、「エラー」を最小化する試みにおいて、当該適合はこの比較に基づいて変更される。我々は、エラーにおける連続的な減少が「精度」(予め設定された定数)よりも小さくなるまで反復する。この場合、適合は「収束」したと言われる。しかし、データが当該モデルによって記述される全体の形状に適合しなければ、この適合に対する変更がエラーを減少させない可能性がある。(これは例えば、走査が、信号および信号らしく見えるノイズの何れをも含まないときに起きるであろう)。もし、「最大数の反復」以内で前記精度(予め設定された定数)よりも小さくならなければ、この適合は「分散」したと言われる。
【0515】
このエラーおよび精度は、屡々、それらの値が単位を有するように定義される。例えば、データがピコアンペアで測定された電流であれば、該エラーおよび精度はピコアンペアの二乗である。これは、全ての予想信号が同様のサイズであるときに最も有用である。何故なら、それは絶対的な意味で全てを考慮し、適合を小さい特徴に対して最適化しようとしないからである。しかし、定量分析技術は、一般に広いダイナミックレンジを必要とする。例えば、高さがピコアンペアの二つの信号を、10憶ピコアンペアの二つの信号を検査するのと同じ容易さで検査する必要があるかもしれない。このようなダイナミックレンジを達成するために、我々はデータを信号の高さについての初期推定に対して正規化する。これは、形状およびバックグラウンドノイズだけが適合に影響する状態で、小さい信号を大きい信号と丁度同様に適合させることを可能にする。
【0516】
<バックグラウンド条件および重み付け>
モデルの選択について議論するときに、境界条件の問題の方が先に生じた。幾つかのシステムについて、一定のパラメータは一定の範囲内でのみ合理的であり得る。例えば、AC電圧−4について、センサ信号の中央の二つのローブの幅は常に110〜265 mVにあり、最も普通には150〜200 mVの間にある。これらの境界を実施する幾つかの方法があり、ここではその内の二つを議論する。
【0517】
或る走査についての初期推定が非常に正確であれば、その走査の信号はバックグラウンドに対してかなり大きく、一般に、適合手順は信号の中に適正にロックするであろう。境界条件を実施することは必要ないであろう。しかし、信号が存在せず、または信号が覆い隠されるときは、パラメータを、それらが許容可能な範囲の外にドリフトさせることが可能である。次に、挙動の良いシステムの場合、このドリフトを示す唯一の適合は真の信号を有していない。従って、我々は、許容し得ない値での適合を捨象し、バックグラウンドだけを含む対応の走査を考慮する。(以下の「Quantitation of Negatives」を参照されたい。これは、我々の現在のソフトウエアにおいて最も広く使用される方法である。
【0518】
しかし、挙動がそれほど良くないシステムの場合、我々は、該事実の後ではなく、その適合自身の際に境界条件を実施する方を好む。我々は、夫々の拘束されたパラメータについてのエラーを記載する追加の項を方程式に加え、そのパラメータが望ましい範囲から逸れたときに適合を課することによって、これを行うことができる。例えば、Eが非線型回帰技術によって定義されたエラーであれば、またパラメータaが或る予測された値
に近接するように拘束されるべきであれば、我々は、EをE’で置換えることができる:ここで、kが或る定数であり、nが整数であるとして、
【数19】
である。
【0519】
反復最適化の際、目的はエラーを最小化することである点を想起されたい。我々が上記の方程式を使用するとき、aが
から遠いとエラーはより大きくなり、従って適合は好ましくなくなる。我々は、パラメータを標準誤差Eに対して拘束するのに(また他の何れかのパラメータの拘束に対して)如何に重要であるかを決定するために、kの値を使用することができる。このnの値は、一定の範囲の値が如何に望ましくないかに影響する。例えば、図59のグラフにおいて、我々は、加えられた項が2n=16を有するときの形状を、2n=2の時の形状と比較する。2n=16の場合、予測された±7内のa値は全て同様に許容可能であり、僅かなペナルティーが加えられるに過ぎない。しかし、2n=2の場合、aが予測値から更に移動するに伴って増大する過酷なペナルティーが存在する。
【0520】
追加される項の形態に関しては、それが常に正である限り、厳しい条件は存在しないことに留意するのが重要である。例えば、aに対してはその真の値に近い更に鋭い拘束を求めるが、遠く離れる時にはそれほど大きな依存性を求めないならば、我々は次のような表現を使用することができるであろう。
【数20】
この方程式は、図60に示したような形状を導く。
【0521】
更に多くの複雑な形状を使用してもよい。例えば、我々のAC−4中心ローブ対(先に述べた)の場合について、我々は図61に示した形状を使用したいと考えるかもしれず、これは次式によって定義される。
【数21】
ここで、nは昇りステップ、mは降りステップ、sはステップの位置、bはステップの高さ、cはこれらステップのコントロールである。
【0522】
適合の種々の切片を走査の中にロックするために、エラーを使用するもう一つの方法がある。エラーEの数学的定義(屡々、平均二乗エラーまたはMSEと呼ばれる)は下記の通りである。
【数22】
【0523】
この方程式において、Nはデータ点の数であり、Fはデータ点数iの適合の値であり、Dは対応するデータ値であり、σはこのデータ値の標準偏差である。該標準偏差はDにおける不確実さの尺度であり、一般には、幾つかの異なる測定を平均してDを生じるときにのみ知られる。(平均されていないデータについて、またはその平均情報が失われているデータについて、σの値=1と仮定すると、全ての値は等しい確実さで知られているという)。σで割ることにより、我々は、データ値が第一の場所で不確実であれば、より大きな適合エラーが所定の点について許容可能であると言っている。
【0524】
データ値における如何なる不確実さとも関係なく、我々は同じ種類の操作を使用して、夫々の点についての重み付けwを導入することにより、一定のデータ範囲において他のデータ範囲よりも更に密接にデータを調和させるように、適合を実施することができる。大きいw(より重い重み付け)を有するデータ点は、小さいwを有するデータ点よりも更に密接に適合するであろう。
【数23】
(なお、これはσ/wに等しい別の標準偏差を導入するのと全く同じである)
【0525】
次に、これは直接的に、適合の信号部分を重み付けの大きい領域に存在させるように実施される訳ではない。それは、他の走査切片に比較して、この領域において該適合を全体として更に緊密に実施するに過ぎない。しかし、信号を記述する方程式は、バックグラウンドを記述する方程式よりも更に局在化されており、それらは一般的には遥かに多くの曲率を示すことができる。このため、予想される信号位置の周囲に大きな重み付けwを与えることは、信号をその値の近傍にロックインさせる傾向にある。
【0526】
初期推定は、このように良好な適合を計算するときの重要な因子であるから、我々は当該ステップにおいて同様に重み付けを使用する必要がある。これを達成するために、我々は、その方法に応じ、重み付けwに基づいて又はEを形成するために加えた項に基づき、「初期推定」の節で説明した|シフトおよび差引き|値に或る関数を乗じることができる。
【0527】
<欠陥適合の検出および補正>
適合への最適化および収束を完了した後にも、当該適合が不適正にロックインされた可能性がある。例えば、エッジ効果が存在し得る。即ち、コンピュータは走査領域外のデータを有するから、当該領域外のデータについて何等かの形状をとることは完全に随意である。このため、この適合手順は、走査のエッジにおける異常なバックグラウンド振動が実際の信号であると結論する可能性がある。この種の適合は捨象される必要があり、或いは、おそらく上記で述べた重み付けを使用することによって回避される。
【0528】
他の可能なエラーも補正することができる。例えば、AC電圧−4において、我々はXおよびYで独立に適合を行う。このため、小さい信号について、又は不安定なバックグラウンドでの走査については、X又はYの何れかにおいて、プログラムが信号の正しくないローブの中にロックされる可能性がある。即ち、この適合は、サテライトピークおよび中心ピークを、二つの中心ピークとして指定するかもしれない。これは、それ自身を、XおよびYにおいて実質的に異なる信号位置に対する適合として顕在化させるであろう。これらの場合、我々は、予測された位置から遠すぎる位置にロックされた操作(XまたはY)を取上げ、再適合することができる。我々は、新たな初期推定を正しくない適合(バックグラウンドおよび信号幅を維持するが、信号位置を訂正する)に基づかせ、反復最適化を再開する。これによって問題が修復されなければ(または位置における元の相違が非常に大きければ)、一般に、それは我々が信号ではなくノイズの中にロックしたことを意味しており、従って我々はこの適合を廃棄する。
【0529】
<適合の適切さの判断>
適合が収束され、共通の欠陥を含むこれらの適合が捨象または訂正されたら、我々は、当該適合が過大なエラーを有するかどうかを判断する必要がある。即ち、我々は、我々が現実の信号の中にロックしたことを確認する必要がある。例えば、図62に示したグラフを調べてみよう。
【0530】
当該適合はデータの平均経路に緊密にに追随し得るが、上記の場合、適合とデータの間の差が大き過ぎるので、この適合は信頼性がない。走査に過大なノイズが存在する。我々は、許容可能なエラーEについて閾値を設定することにより、これを定量的に判断することができる。AC電圧−4の場合、我々はXおよびYにおいて独立に適合させるから、我々はR空間において許容され得る最大ノイズについての閾値を設定する。
【数24】
【0531】
当該適合が真の信号の中にロックされたとみなされるために、Eは、或る実験的に決定された値よりも小さくなければならない。
【0532】
<ネガティブの定量>
全ての上記手順が完了したら、多くの走査は適合発散を有しており、または廃棄される。これらは観察可能な信号をもたないものとして分類され、モデルとしてバックグラウンドのみを使用して再適合される。例えば、図63はR複合成分
【数25】
である。図64においては、バックグラウンド多項式を差引いたR複合成分
【数26】
である。
【0533】
バックグラウンドが適合された後、残留ノイズ内に隠されている可能性のある最大信号のサイズの定量的見積りを抽出するのが望ましいことが多い。ソフトウエアは形状を認識するから、我々が考えることが必要な全ては、モデル化された信号の形状に類似したノイズにおける振動である。(AC電圧−4において、信号は電圧空間における特徴的な周期を有している:中心ローブは、通常は約0.16ボルト内で1サイクルを完結する)。バックグラウンド適合を差引き、且つ残りの部分だけを調べることにより、我々は低周波数のバックグラウンドを除去する。高周波数ノイズを除去するために(従って、信号らしき振動を考慮して)、我々は、残りの部分をローパスフィルタに通す。AC電圧−4のための適切なフィルターパラメータを決定するために、我々は、信号を伴う数千のファイルのXおよびY軌跡の電力スペクトルを平均した。これにより、平均周波数(V−1)プロファイルが得られ、我々はこれを使用して、全ての信号を通過させる適切なパラメータを選択する。我々は、通常はIFIRローパスフィルタを使用する。(補間されたFIRフィルターは、Y. N. Neuvo et al.によって、IEEE Trans. Acoust., Speech, Signal Processing, vol. ASSP−32, pp. 563−570, June 1984に記載されている)。このフィルターを通過した如何なる走査も、隠蔽された信号を表し得る振動のみを保持している。図65は、フィルターされた信号らしいノイズを示しており、先の例からの残留部分(Raw)の上に描かれている。
【0534】
AC電圧−4については、ベクトル信号はXおよびYにおいて独立に適合されているから、フィルターされた残留分は次のようにして定量することができる。
【数27】
RMS測定はsqrt[2]によって処理されて、中心ピーク測定値に変換される。我々は、これを残留電流値iと称する。
【0535】
は、走査の全体に如何に多くの信号らしきノイズが存在するかの見積りを与えるが、1)フィルタによる何等かの減衰、2)我々の信号が走査の全長に亘って広がるのではなく、走査の一つ領域に局在化される事実、および3)ノイズから信号を抽出するときに非線形最適化の如何なる可能な限界をも説明しない。このため、i単独では、可能な最大の隠蔽信号を過小評価するであろう。従って我々は、C*irが隠蔽されている可能性のある最大のピーク高さ(i)に等しくなるように、倍数因子「C」を含める。(Cの値を見出すために、我々は多くの異なる実験からの数千のファイルについてi/iを計算した。Cは信号が消滅するi/iに等しく設定された)。上記実施例において、可能な最大の失われた信号はC*=7.57×10−12である。
【0536】
<バックグラウンド差引きおよび情報抽出>
信号を含む走査について適合を得たら、我々は、データ解析のために必要な全ての情報で武装される。ガイドとしてのモデルを使用して、我々は、適合パラメータを使用してバックグラウンド単独のための方程式を計算し、これをデータから差引くすることができる。例えばAC電圧−4において、我々はXおよびYにおいて多項式を差し引くことができる。図66はオリジナルデータであり、図67はバックグラウンドを差引いたデータである。
【0537】
我々は、興味ある値を計算することもできる。例えば、AC電圧−4について、我々はXおよびYにおいて適合した値に基づいて、ピーク高さiおよびピーク位置Eを計算することができる。
【数28】
このようにして、我々は全体の走査を、実験的に意味のある数の単純なサブセットに減少させることができる。
【0538】
<結論>
我々は、データ走査を全て、実験的に意味のある情報が抽出される少数のパラメータに低減するための、適合の自動化方法を考案した。我々は二次元のベクトルデータに焦点を当てたが、ここで説明する方法の単純化されたバージョンは1−D走査に適用される。概説した手順における重要なステップには、1)モデルを想定すること;2)ベクトル和を使用して最適位相を計算すること;3)当該モデルに従わない挙動をチェックすること;4)初期推定を作成し、信号の固有の特性を使用して異常なノイズの効果を最小化すること;5)おそらくは重み付けスキームを実施しながら、この適合を最適化するために反復すること;6)境界条件を実施すること;7)欠陥のある適合を検出および補正すること;8)適合の適切さを判断すること;および9)意味のある定量的情報を抽出することが含まれる。このプロセスに従うようにコンピュータをプログラミングすることによって、我々は、一回の走査から、次を測定するための手段を要するものよりも少ない時間で、意味のあるデータを抽出する自動化された方法を誘導した。
【0539】
[実施例2]
ノイズを有するデジタル化された既知周波数の正弦波からの、位相および振幅の迅速な抽出
正弦波を生じる極めて清浄なシステムにおいて、そのゼロ交差を見出すことにより波動の位相を決定することができ、また局部的最大および最小を見出すことにより、その振幅を測定することができる。これらの極値を見付けるのが過大に困難であれば、その代りに波動のRMSを計算することができ、この場合、振幅は抽出されたRMS値の2倍の平方根であろう。しかし、純粋な正弦波は、ここに記載するシステムのような現実世界のシステムでは稀である。信号におけるノイズは、値を抽出する方法として、最大、最小、およびゼロ交差を見出すのを困難にする。更に、RMS法は周波数に関係なくパワーを測定して標的信号の振幅を減少させるので、高周波数ノイズが支配的になって、真の信号が埋没してしまう。
【0540】
非線形回帰技術は、ノイズを含む信号から信頼性をもって値を抽出できるが、それらは反復プロセスであり、従って多くのコンピュータ処理時間を要する。この例では、和(および差)のみを使用し、次いで再正規化および基本座標変換を使用する。従って、それは極めて迅速である。また、全てのデータ縮小(1サイクル当り或る大きな数の点から、1サイクル当り二つの点へ)を含む和は、埋め込み装置の中に容易にプログラムすることができ、従って、データ取得装置(例えば本発明の機器)からデータ処理および保存装置(例えばコンピュータ)へのより迅速なデータ転送を可能にする。
【0541】
以下の方程式は、1サイクル当り4n個の点を有するようにデジタル化された既知周波数の正弦波信号から、位相および振幅を抽出するために使用される。
を生じる加算は、如何なるランダムなノイズをも平均化する手段であり、ファームウエアの中にプログラムするのに充分に簡単である。
【0542】
もし(直交座標において)我々が
【数29】
をプロットすれば、起点にセンタリングされた大きさRの円が形成されることになる。我々が円の1/4だけをプロットすれば、我々は一つの円の半分からの値(yについて第一のクオーター、およびxについて第二のクオーター)を使用することになる。このサブセットについて、我々は、
と称するyおよびxの平均値を計算することができる。
【数30】
【0543】
これらの値は、1/4円の弧の僅か内側の点を表し、その角度は弧の掃引を二等分し、また我々はそれから元の位相および振幅を復元することができる。
【数31】
【0544】
なお、これら平均値を計算するとき、全体の円からの情報を含めるために、我々は、sin (x) = −sin (x +π/2) の事実を単純に使用して同じ結果を見出すことができる。
【数32】
【0545】
我々は、この挙動を次のように活用することができる:第一に、AC信号を取得し、所望の周波数成分の中にロックする。1サイクル当りの点の数が均等に4分割されるように、取得速度を選択する。それは、nが整数の場合に4nと書くことができる。第一のn点は第一の1/4サイクルに対応し、第二のn点は第二の1/4サイクルに対応する等である。
【0546】
我々が、サイクルの第一クオーター内にあるn個のデータ点を加え、それらから第三クオーター内にある全てのn点を差引くと、我々は、上記で述べた
と称する正規化されていない値を得るであろう。同様に、第二クオーター内にある点を一緒に加え、第四クオーター内にある点を差引くと、
を生じるであろう。これらのデータから位相および振幅を抽出するために、我々は、上記のφおよびRについての方程式において、
で置換えるが、デジタル化のために幾つかの変更が必要とされる。
【数33】
ここで、
【数34】
である。
【0547】
Rについての上記方程式において、Cは次の値を有している。
【表1】
【0548】
(nが非常に大きくなるに伴って、これら方程式は連続的な場合について上記で述べたものに近づく。1/nがゼロになれば、C infについて挙げた0.900316の値は、実際には二つのp.i.の平方根の2倍である)。
【0549】
既述したφおよびCについての方程式は、我々が、1サイクル当り4n個の点を有するようにデジタル化された周波数既知の正弦波信号から、位相および振幅を抽出できる手順を記述している。XおよびYを形成する加算は、如何なるランダムなノイズをも平均化する手段であり、またそれらをファームウエアの中にプログラムできるほど充分に単純である。
【0550】
[実施例3]
eSensorTMチップ上でのDNAハイブリダイゼーションアッセイは、10 nM範囲の標的濃度について、典型的には4〜6時間のインキュベーションを必要とする。この時間は、大容量(即ち、0.5 mL)カートリッジにおける拡散ベースのハイブリダイゼーション時間に基づいて選択された。しかし、より小さい容積のカートリッジ(即ち、100μL)については、4〜6時間のインキュベーション時間は、飽和ハイブリダイゼーション信号を達成するためには不充分である。従って、DNAハイブリダイゼーションを促進させるために、eSensorチップにおいて多くの異なる対流混合技術が評価された。
【0551】
<実験プロトコールおよび材料>
HFE−H が、アッセイシステムのモデルとして選ばれた。サンプルまたはチップの特性の変動を排除するために、使用した全てのチップおよび試薬は、同じストックからのものであった。
【0552】
使用したチップ: Duc 668
捕捉プローブ: D2002
標的濃度: 10 nM(他に特定しない限り)
信号伝達プローブ: D2005およびD2004(夫々300 nM )
ハイブリダイゼーション緩衝液: 標準のプロトコールに従って調製されたもの
加熱システム: 使用した混合器の種類応じて異なる加熱方法を用いた。例えば、チップを対流オーブン中でインキュベートし、またはチップ加熱装置上での加熱を用いた。
コントロール: コントロールとして、拡散に基づくハイブリダイゼーションを使用した。
【0553】
<チップの水平 vs 垂直配向>
チップを加熱する方法: 35℃の対流オーブン
100μ容量のカートリッジのための水平配向でインキュベートされたチップにおいて、遅いハイブリダイゼーション反応速度が観察された。10 nMの標的濃度において、水平でインキュベートされたチップは5時間で飽和信号値に達しなかった。しかし、標的濃度が100 nMに増大されると、5〜6時間以内に飽和信号値が観察された。
【0554】
チャンバーの厚さを増大させることもまた、増大した容積/zディメンジョンにより、水平にインキュベートされたチップの特性を改善させた。図70Aを参照されたい。
垂直にインキュベートされたチップはより良い特性を発揮し、10 nM標的濃度について2〜3時間で飽和信号値に達した。
【0555】
<再循環ポンプ>
加熱の方法:35℃の対流オーブン
チップを、合計デッド容積が略7μL(8〜100μLのチップ容積の10%未満)の微小口径ピーク管を使用して、ミニ蠕動ポンプに取付けた。液体は、略100μL/minで再循環させた。ポンプ、配管およびチップの全体のアセンブリーを、35℃のオーブンの内側に配置した。測定は、オーブンの内側にeSensorTM−600ボードを配置することにより、リアルタイムで行った。ポンピングされたチップについての飽和信号が1時間以内に得られた。図70Bを参照されたい。
【0556】
<バブル支援ピエゾ(PZT)混合>
カートリッジのカバーに、ハイブリダイゼーション緩衝液をチップに添加するときのバブル部位として働く直径500μmの孔を穿孔した。圧電変換素子を、カートリッジの背面に接着し、5 Khz a.c.で10Vp−pの波形で励起させた。この装置は二つのモード、即ち、矩形波または正弦波の励起波形で動作された。PZTに基づくチップは、拡散制御よりも良好な特性で動作し、飽和に達するまでに2.5時間を要した。図70Cを参照されたい。
【0557】
<温度勾配に基づく混合>
チップの底を65℃に加熱し、カートリッジカバーの頂部を10℃に冷却することにより、組み立てられたチップを横切る温度勾配を形成した。この温度勾配は、二つのペルチェヒータの間にチップをジャケッティングすることにより形成された。拡散制御チップは、対流オーブンではなくペルチェヒータを使用して加熱された。ペルチェヒータの使用は、飽和信号が2時間以内に観察されるように、垂直拡散制御チップにおけるハイブリダイゼーション反応速度を改善した。温度勾配混合が使用されたチップは、更に良好な特性で動作し、1時間以内に飽和値に達した。図70Dを参照されたい。
【0558】
<バブルポンプに基づく混合を用いたバイオチャンネル>
接着テープを略1mm幅の薄いストリップに切断し、これらストリップをeSensorTMチップの頂部に配置することにより、eSensorTMチップの頂部にマイクロチャンネルを配置した。該チップの一方の隅にバブルを意図的に導入した。次いで、このバブルは、バブル領域を加熱および冷却してバブル容積を交互に膨張および収縮させることにより、混合を高めるために利用された。このアプローチは、チップ内のバブルの容積を変化で形成された圧力流により、混合を可能にする。しかし、マイクロチャンネルの追加はチップ容積を略20μLだけ減少させ、このシステムに更に遅い反応速度をもたらす。このバブルポンプの使用は反応速度を促進するが、この反応速度は他の混合技術で見られるようには良好でなかった。典型的な結果は図70Eに示されている。
【0559】
<音波の流れ>
Covaris, Inc.社所有の技術を使用して、チップ内で混合を発生させた。この方法においては、液体ジェットがチップカートリッジを取囲み、これを通して音波がチップに伝達される。このシステムでは温度制御は現在のところ可能でないので、20μLの非標準的カートリッジを使用し、温度制御なしでアッセイを行った。このシステムを使用することにより、混合を使用したかどうかに関係なく、飽和信号レベルは低下した。典型的な結果は図70Fに示されている。
【0560】
<結論>
【表2】

【図面の簡単な説明】
【図1A】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1B】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1C】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1D】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1E】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1F】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1G】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1H】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1I】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1J】
異なる検出チャンバの実施例を示している。
【図1K】
ボードを貫通してポーゴピンコネクタと接触するコネクタを備えたバイオチップを示している。
【図2A】
カートリッジを構成する部品を示している。
【図2B】
カートリッジを構成する部品を示している。
【図2C】
カートリッジを構成する部品を示している。
【図3A】
サンプルをロードする際にカートリッジを保持するために使用されるカートリッジホルダの頂面図を示している。
【図3B】
サンプルをロードする際にカートリッジを保持するために使用されるカートリッジホルダの斜め正面図を示している。
【図3C】
キャップを備えたカートリッジの図を示している。
【図3D】
キャップを備えたカートリッジの図を示している。
【図3E】
幾つかのカートリッジアセンブリーの側面を、それらがカートリッジホルダの中に現れる状態で示している。
【図4A】
多重化装置の図を示している。
【図4B】
多重化装置の図を示している。
【図5】
カートリッジ内部の温度センサを用いてサンプル温度をモニターするように設計された、電気回路の概略図を示している。
【図6】
温度制御論理回路示している。
【図7】
多重化装置のレイアウトを図示している。
【図8】
多重化装置を制御するために使用されるソフトウエアアプリケーションののブロック図である。
【図9A】
本発明において使用し得る弁を示している。
【図9B】
本発明において使用し得る弁を示している。
【図9C】
本発明において使用し得る弁を示している。
【図9D】
本発明において使用し得る弁を示している。
【図9E】
本発明において使用し得る弁を示している。
【図9F】
本発明において使用し得る弁を示している。
【図9G】
汎用ポンプ設計を示している。
【図10A】
バイオチップの側面図であり、ヒータがチップに組込まれた実施例を示している。
【図10B】
バイオチップにおける温度ゾーンを形成する一つの手段を示している。
【図10C】
埋設されたヒータおよび対応するエッジコネクションを備えたセラミック製のバイオチップを示している。
【図11】
バーコードを読取るためのバーコード読取り器を示している。
【図12】
バーコード使用のシナリオを記載している。
【図13】
本発明の装置と組合せたバーコード使用の利益を強調している。
【図14A】
カートリッジを取付けるための位置合わせ孔を備えた、バイオチップの好ましい実施例を示している。
【図14B】
カートリッジを取付けるための位置合わせ孔を備えた、バイオチップの好ましい実施例を示している。
【図15A】
多重化装置のステーションに挿入されたカートリッジの中への、ピペットチップを用いたサンプルの注入を示している。
【図15B】
カートリッジをバイオチップに取付けるための別の実施例を示している。
【図15C】
カートリッジをバイオチップに取付けるための別の実施例を示している。
【図16】
正弦波およびその対応するベクトル表示を示している。
【図17】
図16に示した正弦波のベクトル表示を用いた視覚的表現を示している。
【図18】
四次高調波ACEボルタンメトリーについてのRおよびθの軌跡の例である。
【図19】
四次高調波ACEボルタンメトリーについてのRおよびθの軌跡の例である。
【図20】
バックグラウンドの大きさに対して信号が収縮するときに、R空間信号が歪むことを示している。
【図21】
バックグラウンドの大きさに対して信号が収縮するときに、R空間信号が歪むことを示している。
【図22】
直交座表の使用が、ベクトルSおよびベクトルBに対するベクトルDのパラメータの依存性をどのように単純化するかを示している。
【図23】
直交座表の使用が、ベクトルSおよびベクトルBに対するベクトルDのパラメータの依存性をどのように単純化するかを示している。
【図24】
直交座表の使用が、ベクトルSおよびベクトルBに対するベクトルDのパラメータの依存性をどのように単純化するかを示している。
【図25】
直交座表の使用が、ベクトルSおよびベクトルBに対するベクトルDのパラメータの依存性をどのように単純化するかを示している。
【図26】
バックグラウンドに対する大きな信号を有するAC電圧−4の軌跡を描いている。
【図27】
X軸およびY軸が信号を跨ぐように参照フレームが選択されるときの結果を示している。
【図28】
X軸およびY軸が信号を跨ぐように参照フレームが選択されるときの結果を示している。
【図29】
信号に対して概ね平行および直交する一対の軸(図26に描いた軸に対して45°回転される)が選択されるときに観察される信号を示している。
【図30】
信号に対して概ね平行および直交する一対の軸(図26に描いた軸に対して45°回転される)が選択されるときに観察される信号を示している。
【図31】
ベクトル加算法を示している。
【図32】
ベクトル加算法を示している。
【図33】
ベクトル加算法を示している。
【図34】
ベクトル加算法を示している。
【図35】
ベクトル加算法を示している。
【図36】
ベクトル和を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算するときに、考慮しなければならない複雑さを図示している。
【図37】
ベクトル和を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算するときに、考慮しなければならない複雑さを図示している。
【図38】
ベクトル和を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算するときに、考慮しなければならない複雑さを図示している。
【図39】
ベクトル和を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算するときに、考慮しなければならない複数を図示している。
【図40】
ベクトル和を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算するときに、考慮しなければならない複雑さを図示している。
【図41】
ベクトル和を使用して、信号を適合させるための最適位相を計算するときに、考慮しなければならない複雑さを図示している。
【図42】
多項式を全体の走査(夫々は0および90°軸に沿う)に適合させるために必要な高速計算を実行するときに得られる結果を図示している。
【図43】
多項式を全体の走査(夫々は0および90°軸に沿う)に適合させるために必要な高速計算を実行するときに得られる結果を図示している。
【図44】
多項式を全体の走査(夫々は0および90°軸に沿う)に適合させるために必要な高速計算を実行するときに得られる結果を図示している。
【図45】
多項式を全体の走査(夫々は0および90°軸に沿う)に適合させるために必要な高速計算を実行するときに得られる結果を図示している。
【図46】
多項式を全体の走査(夫々は0および90°軸に沿う)に適合させるために必要な高速計算を実行するときに得られる結果を図示している。
【図47】
モデル化されない属性が如何にして検出されるかを図示している。
【図48】
モデル化されない属性が如何にして検出されるかを図示している。
【図49】
モデル化されない属性が如何にして検出されるかを図示している。
【図50】
モデル化されない属性が如何にして検出されるかを図示している。
【図51】
モデル化されない属性が如何にして検出されるかを図示している。
【図52】
モデル化されない属性が如何にして検出されるかを図示している。
【図53】
反復適合法のための出発点として必要な、初期推定プロセスを図示している。
【図54】
反復適合法のための出発点として必要な、初期推定プロセスを図示している。
【図55】
反復適合法のための出発点として必要な、初期推定プロセスを図示している。
【図56】
反復適合法のための出発点として必要な、初期推定プロセスを図示している。
【図57】
反復適合法のための出発点として必要な、初期推定プロセスを図示している。
【図58】
反復適合法のための出発点として必要な、初期推定プロセスを図示している。
【図59】
挙動の良くないシステムのために、適合手順の際に境界条件を強制し得ることを描写している。
【図60】
挙動の良くないシステムのために、適合手順の際に境界条件を強制し得ることを描写している。
【図61】
挙動の良くないシステムのために、適合手順の際に境界条件を強制し得ることを描写している。
【図62】
適合とデータとの間の差が大き過ぎるために、適合が信頼できない結果を示している。
【図63】
観察可能な信号を持たない走査を再適合する手順を使用して得られた結果を示している。
【図64】
観察可能な信号を持たない走査を再適合する手順を使用して得られた結果を示している。
【図65】
観察可能な信号を持たない走査を再適合する手順を使用して得られた結果を示している。
【図66】
ここで述べた手順を使用して得られた結果のオリジナルデータを図示している。
【図67】
ここで述べた手順を使用して得られた結果のバックグラウンドを差し引いたデータを図示している。
【図68】
捕捉プローブを含んでなるSAMの表面密度に対する、種々のプラズマ処理の効果を図示している。
【図69】
種々のプラズマ処理後の金表面における汚染物のスペクトルを図示している。
【図70A】
センサチャンバ内のハイブリダイゼーション速度に対する異なる混合技術の影響を図示している。
【図70B】
センサチャンバ内のハイブリダイゼーション速度に対する異なる混合技術の影響を図示している。
【図70C】
センサチャンバ内のハイブリダイゼーション速度に対する異なる混合技術の影響を図示している。
【図70D】
センサチャンバ内のハイブリダイゼーション速度に対する異なる混合技術の影響を図示している。
【図70E】
センサチャンバ内のハイブリダイゼーション速度に対する異なる混合技術の影響を図示している。
【図70F】
センサチャンバ内のハイブリダイゼーション速度に対する異なる混合技術の影響を図示している。
【図71】
信号処理アプローチの一例の概略ブロック図を示している。
【図72】
温度制御ブロック図の実施例を図示している。
【図73】
信号処理プリント回路基板のレイアウトの一例を図示している。

Claims (12)

  1. a)i)入口ポート、および
    ii)増幅反応混合物の流出を制御する弁を含む出口ポート
    を含む核酸増幅チャンバと;
    b)ポンプと
    を具備するバイオチップカートリッジ。
  2. 更に、ヒータを具備する請求項1に記載のバイオチップカートリッジ。
  3. 更に、基板及び電極アレイを備えた検出チャンバーを有し、前記基板及び前記電極アレイ夫々が、
    i)自己集合単分子層、および
    ii)捕捉結合性リガンド
    を含み、
    前記電極のプロセッサへの電気的接続を可能にするインターコネクトを更に具備してなる請求項1記載のバイオチップカートリッジ。
  4. 前記反応混合物がPCR単位複製配列(amplicon)であることを特徴とする請求項1記載のバイオチップカートリッジ。
  5. 前記反応混合物が、等温核酸増幅反応の生成物であることを特徴とする請求項1記載のバイオチップカートリッジ。
  6. 前記増幅反応がNASBA、SDA、RCA、およびTMAからなる群から選択されることを特徴とする、請求項5に記載のバイオチップカートリッジ。
  7. 前記弁がチェック弁であることを特徴とする請求項1記載のバイオチップカートリッジ。
  8. 前記チェック弁が鴨嘴弁であることを特徴とする請求項2記載のバイオチップカートリッジ。
  9. 前記チェック弁がカンチレバー弁であることを特徴とする請求項2記載のバイオチップカートリッジ。
  10. 前記弁がバースト弁であることを特徴とする請求項1記載のバイオチップカートリッジ。
  11. 前記ポンプが空気ポンプであることを特徴とする請求項1記載のバイオチップカートリッジ。
  12. a)一以上の抵抗ヒータと、
    b)熱伝導性層と、
    c)プリント回路基板と、
    d)半田マスク層と、
    を具備するバイオチップ。
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