JP2006223125A - 反応容器、遺伝子多型検出方法及び装置、並びに診断方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】
種々の測定を自動化するのに適する試薬キットとして使用される反応容器を提供する。
【解決手段】
好ましい形態では、樹脂プレート４０は弾性フィルム４２で被われており、その上部にはダイヤフラム構造のキャップ１８を備えたサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０が形成されている。サンプル注入部４４に生体サンプルを注入し、ストッパ５８を外し、流路の適当な箇所を閉じ、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６を交互に押すことによってサンプルとＰＣＲ反応試薬を混合してＰＣＲ反応部５４に保持させ、所定の温度サイクルによりＰＣＲ反応を行なわせる。その後、流路の適当な箇所を閉じ、タイピング試薬収容部４８と混合部５０を交互に押して反応液とタイピング試薬を混合した後、その反応液をプローブ配置部３０に送り、対応するプローブで蛍光を検出することによりＳＮＰを検出する。
【選択図】 図４

Description

本発明は医療現場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床を行なうのに適する反応容器と、それを用いて人間を初めとする動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出するための遺伝子多型検出方法及びそのための自動解析装置や自動遺伝子解析装置、並びにその遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を行なう方法及びその装置に関するものである。

遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。

ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特許文献２参照。）。

ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。
特表２００２−５３３０９６号公報 特開２００１−２９９３６６号公報 特開２００２−３００８９４号公報 特許第３４５２７１７号公報 Hsu T. M., Law S. M, Duan S, Neri B. P., Kwok P. Y., "Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug;47(8):1373-7

本発明の第１の目的は、遺伝子多型検出に限らないが、種々の測定を自動化するのに適する試薬キットとして使用できる反応容器を提供することである。

本発明の第２の目的は、本発明の反応容器を使用して反応を自動的に検出する方法と装置を提供することである。

本発明の第３の目的は、本発明の反応容器により特に遺伝子多型検出用の試薬キットを構成し、それを用いて遺伝子多型を検出する方法とそのための自動解析装置を提供することである。

本発明の第４の目的は、その遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断を行なう自動的に行なう方法とそのための装置を提供することである。

第１の目的を達成するための本発明の反応容器は、平板状の基板内に形成され、サンプル又はサンプルと試薬との反応液を流路に沿って第１反応部に移送して反応させる反応容器であって、基板内に形成され、流路を介して反応部に接続され、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっている液溜め部を備え、前記キャップは弾性変形可能な上部部材とその周縁の枠体とからなり、前記キャップは上方からの押圧により前記液溜め部の容積を可変することができ、その液溜め部を押さえることで液を反応部に移送させるようにしたものである。

前記弾性変形可能な部材はダイヤフラム構造であることが好ましい。
前記弾性変形可能な部材はＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）又はＳｉゴムを含む柔軟性をもつ素材を用いるようにする。

流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備えていることが好ましく、バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、液溜め部を押さえることで液を移送させるようにする。

本発明の反応容器の一形態は、サンプルと試薬を混ぜて反応させる反応容器であって、平板状の基板内に形成され、サンプルが注入され又は収容し、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっているサンプル収容部と、前記基板内に形成され、試薬を収容し、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっている試薬収容部と、前記サンプル収容部と前記第１反応部の間及び前記試薬収容部と前記第１反応部の間を接続するとともに、各部間には上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有する流路と、を備えている。

サンプルは予め収容しておくこともできるが、通常はこの反応容器を試薬キットとして使用し、その都度サンプルをサンプル収容部に注入して測定を行なう。そのために、サンプル収容部のキャップは、前記枠体が前記液溜め部の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取りつけられるように取りつけられていることが好ましい。

サンプルと試薬を混ぜて反応させた後、希釈して第２の反応部に導いてさらに反応を行なわせる用途もある。そのような用途に対処するために、この反応容器は、前記基板内に形成され、希釈液を収容し、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっている希釈液収容部と、前記基板内に形成され、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっている空の空間からなる希釈部と、前記希釈部で希釈された反応液が導かれる第２反応部と、をさらに備え、前記流路は前記希釈液収容部及び希釈部にも接続しているとともに、前記希釈部と第２反応部の間も接続しており、それら各部間にも上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有するものとすることができる。

この反応容器を使用する反応の１つとして遺伝子増幅がある。そのような用途に適する本発明の反応容器は、試薬収容部に収容された試薬が遺伝子増幅試薬であり、第１反応部が遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であり、この反応容器がその遺伝子増幅反応の試薬キットを構成する。

この反応容器を用いる目的の主なものに遺伝子多型検出がある。そのような目的に適した反応容器の一例は、前記サンプル収容部に注入又は収容されるサンプルは生体サンプルであり、前記試薬収容部に収容された試薬は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬であり、前記第１反応部は遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であり、前記基板内に形成され、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容し、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっているタイピング試薬収容部と、前記基板内に形成され、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっている空の空間からなる混合部と、前記混合部で混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持された、第２反応部としてのプローブ配置部と、をさらに備え、前記流路は前記タイピング試薬収容部及び混合部も接続しているとともに、前記混合部と前記プローブ配置部の間も接続しており、それら各部間にも上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有し、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している。

増幅反応部は温度を変化させるサイクルを繰り返すことから基板の熱伝導性が高い方が好ましい。そのために、増幅反応部の基板肉厚が他の部分よりも薄くなっていることが好ましい。

遺伝子多型検出の目的に適した反応容器の他の例は、前記液溜め部が複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部であって、枠体が液溜め部の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取りつけられるようになっており、その液溜め部には遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるようになっており、第１反応部は前記液溜め部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している。

遺伝子多型検出の目的に適した反応容器のさらに他の例は、前記液溜め部が遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるサンプル収容部と、複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部とを備えたものであり、両収容部は流路で接続されており、いずれかの収容部と第１反応部の間が流路で接続されており、前記サンプル収容部の枠体は前記液溜め部の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取りつけられるようになっており、第１反応部は前記液溜め部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、前記流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備え、前記バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記液溜め部を押さえることで液を移送させることができ、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している。

第２の目的を達成するための本発明の反応検出方法は、請求項１から８のいずれかに記載の反応容器を用い、液溜め部の押圧によりサンプル又はサンプルと試薬との反応液を流路に沿って反応部に移送して反応させ、その反応結果を検出する。

その反応検出方法を実現する本発明の検出装置は、その反応容器を装着するとともに、各部を所定の温度に制御する検査試薬キット装着部と、キャップ及びバルブ部を押さえることにより、液の移送を行なう送液装置と、反応容器の反応後の反応液部分に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、検査試薬キット装着部の温度制御、送液装置の送液動作、並びに蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部と、を備えている。

送液装置の一例はバルブ部を押すピンチバルブ軸と、キャップを押すアーム機構とを備えており、ピンチバルブ軸は下げる方向に押す操作ごとに進行位置と後退位置に交互に固定されるノック機構の先端に押圧用のピンを備えたものである。

第３の目的を達成するための本発明の遺伝子多型検出方法は、生体サンプルを複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応液に作用させ、ゲノムＤＮＡを増幅させる増幅工程と、その増幅工程で増幅させたゲノムＤＮＡに対し、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を作用させて前記複数の多型部位の塩基を判別するタイピング工程とを含んでいる。

すなわち、遺伝子多型検出方法の一例は、請求項９又は１０に記載の反応容器を用い、次の工程を備えて遺伝子多型を検出する。
（Ａ）前記サンプル収容部にサンプルを注入する工程、
（Ｂ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記サンプル収容部と試薬収容部を交互に押すことでサンプルと遺伝子増幅試薬の混合液を作成して前記増幅反応部へ供給する工程、
（Ｃ）その混合液を前記増幅反応部で遺伝子増幅反応させる工程、
（Ｄ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記タイピング試薬収容部と混合部を交互に押すことで前記増幅反応部での遺伝子増幅反応終了液とタイピング試薬を混合する工程、及び
（Ｅ）前記工程（Ｄ）で混合された反応液を前記プローブ配置部へ送って蛍光を検出する工程。

遺伝子多型検出方法の他の例は、請求項１１に記載の反応容器を用い、次の工程を備えて遺伝子多型を検出する遺伝子多型を検出する。
（Ａ）前記液溜め部にサンプルを注入する工程、
（Ｂ）前記工程（Ａ）でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液を前記プローブ配置部へ送って蛍光を検出する工程。

遺伝子多型検出方法のさらに他の例は、請求項１２に記載の反応容器を用い、次の工程を備えて遺伝子多型を検出する。
（Ａ）前記サンプル収容部にサンプルを注入する工程、
（Ｂ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記サンプル収容部とタイピング試薬収容部を交互に押すことでサンプルとタイピング試薬を混合する工程、
（Ｃ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記工程（Ｂ）で混合された反応液を前記プローブ配置部へ送って蛍光を検出する工程。

ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生体サンプルには複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の２倍の種類のプライマーが必要になる。しかし、２つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位それぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの２つの多型部位の間にはプライマーを結合させず、２つの多型部位の配列の両側にのみプライマーを結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずしも多型部位の種類の数の２倍になるわけではない。本発明における「複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが１つの多型部位をはさんで結合する場合だけでなく、２又はそれ以上の多型部位をはさんで結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーという意味で使用している。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはＳＮＰである。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノムＤＮＡなどである。

増幅工程はＰＣＲ法などを使用することができる。その場合、ＰＣＲ法を２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下で行なうのが好ましい。その場合、遺伝子増幅試薬はＰＣＲ反応試薬である。

ＳＮＰのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノムＤＮＡの調整が必須であり、そこに手間とコストがかかる。ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法だけに着目すれば、前処理なしで血液などのサンプルから直接ＰＣＲ反応を行なわせる方法も提案されている。そこでは、遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子を含むサンプル中の遺伝子包含体もしくは遺伝子を含むサンプルそのものを遺伝子増幅反応液に添加して、添加後の該反応液のｐＨが８.５−９.５（２５℃）で遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献４参照。）。

既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしようとする複数のＳＮＰ領域をＰＣＲ法で増幅するために、最初に採取するＤＮＡ量は少なくてすむが、ＰＣＲ法で増幅する前に予め生体サンプルからＤＮＡを抽出しておくという前処理が必要である。そのためにその前処理に時間と手間がかかる。
直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
前記タイピング工程はインベーダ法やタックマンＰＣＲ法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。

第３の目的を達成するための本発明の遺伝子多型検出装置の一例は、請求項７又は８に記載の反応容器を装着するとともに、その反応容器の増幅反応部の温度を遺伝子増幅のための温度に制御する増幅部、及びプローブ配置部の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部を備えた検査試薬キット装着部と、その反応容器のサンプル収容部、試薬収容部、タイピング試薬収容部、混合部及びバルブ部を押さえることにより、各部間の液の移送及び混合部からプローブ配置部への液の移送を行なう送液装置と、プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、増幅部及びタイピング反応部の温度制御、送液装置の送液動作、並びに蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部と、を備えている。

前記送液装置の一例は、サンプル収容部、試薬収容部、タイピング試薬収容部、混合部又はバルブ部を押すピンチバルブ軸を備え、このピンチバルブ軸が、下げる方向に押す操作ごとに進行位置と後退位置に交互に固定されるノック機構の先端に押圧用のピンを備えたものである。

遺伝子多型検出装置の他の例は、請求項１１に記載の反応容器を装着するとともに、その反応容器のプローブ配置部の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部を備えた検査試薬キット装着部と、その反応容器のタイピング試薬収容部を押さえることによりプローブ配置部への液の移送を行なう送液装置と、プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、タイピング反応部の温度制御、送液装置の送液動作及び蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部と、を備えている。

遺伝子多型検出装置のさらに他の例は、請求項１２に記載の反応容器を装着するとともに、その反応容器のプローブ配置部の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部を備えた検査試薬キット装着部と、その反応容器のサンプル収容部、タイピング試薬収容部及びバルブ部を押さえることにより、各部間の液の移送及びプローブ配置部への液の移送を行なう送液装置と、プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、タイピング反応部の温度制御、送液装置の送液動作及び蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部と、を備えている。

第４の目的を達成するために、本発明の診断方法は、特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値をデータベースとして用意しておき、本発明の遺伝子多型検出方法により検出された多型の結果に基づいてそのデータベースから診断値を読み出す診断方法である。

また、本発明の診断装置は、本発明の遺伝子多型検出装置と、特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値を記憶したデータベースと、前記遺伝子多型検出装置により検出された多型結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出して表示する表示装置と、を備えている。

図１は本発明の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。生体サンプル２は例えば１μＬを採取し、それにＰＣＲ反応試薬４を１０μＬ程度添加する。ＰＣＲ反応試薬４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのバッファ液、４種類のデオキシリボヌクレオチド、その他必要な試薬が添加されており、サンプル２と混合したときにｐＨが８.５−９.５になるように調製されている。

生体サンプル２とＰＣＲ反応試薬４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行わせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。生体サンプルはゲノム抽出操作を施したものであってもよいが、ここではゲノム抽出操作を施していないものを使用する。ゲノム抽出操作を施していない生体サンプルであっても、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。

ＰＣＲ反応終了後、タイピング試薬としてインベーダ試薬６が添加される。インベーダ試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通であることが多い。

次に、インベーダ試薬６が添加された反応液をタイピング反応部のプローブ配置部８に添加して反応をさせる。プローブ配置部８の各部位には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダプローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。

インベーダ法については、特許文献３の段落［0032］から［0034］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものが用意されており、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。

本発明で用いる増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものであり、かつ核酸抽出操作を施していない生体サンプルから直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる。そのため、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。

ＰＣＲ反応試薬は、ｐＨ緩衝液、ＭｇＣｌ₂、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び熱安定性合成酵素を含む。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。

ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応試薬の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。

合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、TaqＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。

タイピング工程で使用するインベーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダプローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。

本発明の反応容器は、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっている液溜め部を備えているので、送液動作が容易になり、その反応容器を用いて反応を自動的に検出する装置の送液機構が簡単になる。
流路に上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備えれば、送液動作の制御が容易になる。

この反応容器を用いた遺伝子多型検出方法によれば、複数の多型部位が増幅されたＤＮＡサンプルについて、又は生体サンプルについてはそれから目的とする複数の多型部位を同時に増幅させた後に、それらの多型部位を同時にタイピングするので、多型のタイピングを簡単な工程で短時間に行なうことができる。
本発明の診断方法は得られた多型のタイピングを基にしてデータベースから診断値を読み出すので、医療現場で使用するのが可能になる。

本発明の検出装置では、タイピング試薬、又は遺伝子増幅反応試薬とタイピング試薬、又はさらに希釈液まで予め収容され、プローブ配置部が一体として形成された検査試薬キットを使用するので、簡便な測定装置によって目的とする複数の多型のタイピングを自動的に実行することができるようになる。
本発明の診断装置では、多型のタイピングからそれに基づいた診断値の表示までを自動的に実行することができるようになる。

図２は反応容器の第１の実施例である。（Ａ）は平面図、（Ｂ）は斜視図、（Ｃ）は断面図である。
この反応容器はＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液を注入し、インベーダ反応によりＳＮＰを検出するものであり、蛍光測定を行なうことのできる基板１０上に薄層フィルム１２が接合され、液溜め部１４と、流路を介してそれにつながるチャンバ１６が基板１０に形成されたものである。液溜め部１４、流路及びチャンバ１６は上部が薄層フィルム１２で被われている。基板１０は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。

液溜め部１４は上方からの押圧により弾性変形可能なキャップ１８で覆われて容積が可変になっている。液溜め部１４はタイピング試薬が収容されたタイピング試薬収容部となっている。キャップ１８は弾性変形可能な上部部材１５と周縁の枠体１９とからなっており、枠体１９が液溜め部１４の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取り付けられる。このキャップはスクリューキャップでもよい。
サンプル注入時は、キャップ１８を取り外しＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液をタイピング試薬収容部１４に注入する。
キャップ１８の内側はダイヤフラム構造になっているので、上から押すと蓋のダイヤフラム面が下がり、封入されている液は流路に押し出される。

タイピング試薬収容部１４と流路は、流路の一部が塞がれていて、タイピング試薬収容部１４の内部の圧力がある圧力以上になると、その塞がれている部分が開き、タイピング試薬が流路の方へ流出するようになっている。流路の一部を塞ぐ方法は、例えば接着による方法、熱溶着による方法などを採用することができる。そのようにして閉塞された流路を開くための圧力は、例えば１．５〜２．０ｋｇ／ｃｍ²である。

チャンバ１６は広い面積の凹部に複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部となっている。チャンバ１６において、符号１６ａで示されるドットはそれぞれ個別のプローブ配置部を示している。チャンバ１６の端部でタイピング試薬収容部１４の反対側には空気抜きのための穴２０が空けられている。

この反応容器では、タイピング試薬収容部１４のキャップ１８を外して、外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液がピペットなどにより注入される。その後キャップ１８が再び被せられ、この反応容器が検出装置に装着され、サンプル反応液とタイピング試薬が混合する。

検出装置において希釈部のキャップ１８が上方から押圧されることにより、タイピング試薬収容部１４の容積が減少し、希釈液中のサンプル反応液とタイピング試薬との反応液がチャンバ１６に導かれ、プローブ配置部１６ａのプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
チャンバ１６の寸法は、例えば幅が２．５ｍｍ、長さが５〜２５ｍｍ、深さが１００μｍ、内容積が１．５〜５０μＬである。

図３は反応容器の第２の実施例を示したものである。基板２２の内部にタイピング試薬収容部１４、混合部２８、及びプローブ配置部３０がこの順に配置され、それぞれの間が流路で接続されている。この場合も、タイピング試薬収容部１４と流路は、流路の一部が塞がれていて、タイピング試薬収容部１４の内部の圧力がある圧力以上になると、その塞がれている部分が開き、タイピング試薬が流路の方へ流出するようになっている。流路の一部を塞ぐ方法は、例えば接着による方法、熱溶着による方法などを採用することができる。そのようにして閉塞された流路を開くための圧力は、例えば１．５〜２．０ｋｇ／ｃｍ²である。基板２２は後の実施例の図４に示されるように、樹脂プレートとその上を被う弾性フィルムとからなっている。混合部２８は効率よく攪拌できるように、蛇行流路にしたり、流路の広い部分と狭い部分を繰り返すなどの構成が好ましい。プローブ配置部３０は、特に限定されるものではないが、１又は複数個のプローブが固定された複数個の凹部が流路に沿って直列に配列されたものが４列設けられており、プローブ配置部３０の端部には空気抜きのための穴３２が開けられている。プローブ配置部３０はＤＮＡとプローブとの反応に必要な温度に制御される。タイピング試薬収容部１４と混合部２８の間の流路にはＰＣＲ反応液を注入するためのサンプル注入口２６が設けられ、注入時以外は栓で閉じることができるようになっている。

図３の反応容器ではサンプル注入口２６からＰＣＲ反応液が注入されて、そのサンプル注入口２６が塞がれた後、この反応容器が検出装置に装着される。装着装置ではタイピング試薬収容部１４が押されて、タイピング試薬とＰＣＲ反応液が混合部２８へ送られて混合される。その後、プローブ配置部３０へ送られ、所定のプローブでＳＮＰが蛍光により検出される。
タイピング試薬収容部１４を押すことでタイピング試薬とＰＣＲ反応液を混合する作業は、装置外で手作業で行なってもよい。

図４は反応容器の第３の実施例を表わしたものである。（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は液収容部の断面図、（Ｄ）はＰＣＲ反応部の断面図である。
図４の反応容器は、樹脂プレート４０とその表面を覆う弾性フィルム４２とからなっている。樹脂プレート４０にはサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０が４つの凹部として形成され、それぞれの上部が弾性フィルム４２で被われている。プローブ配置部３０は図３のものと同じであり、またプローブ配置部３０の他端部にはエアー抜きのための穴３２が開けられている。樹脂プレート４２は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。

サンプル注入部４４と混合部５０の間の流路と、ＰＣＲ反応試薬収容部４６とタイピング試薬収容部４８の間の流路との間を結んで、さらに流路５４が形成されている。流路５４はＰＣＲ反応部となる部分である。

混合部５０とプローブ配置部３０の間も流路で結ばれている。サンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０はそれぞれ弾性変形可能なキャップで覆われ、それらの容積が可変になっている。サンプル注入部４４のキャップ１８は着脱可能であり、サンプルを注入する際にキャップ１８が開けられる。

ＰＣＲ反応部５４は熱伝導率をよくするためにその樹脂プレートの下面側が図４（Ｃ）に示されるように肉厚が薄くなっている。その部分の肉厚は、例えば０．２〜０．３ｍｍである。
サンプル注入部４４のキャップ１８は取り外し可能であり、混合部５０のキャップは取り外す必要がないため固定されている。

サンプル注入部４４は使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。ＰＣＲ反応試薬収容部４６にはＰＣＲ反応試薬が１０〜２０μＬ収容されている。タイピング試薬収容部４８にはタイピング試薬が４０μＬ程度収容されている。また、使用前の状態ではＰＣＲ反応試薬収容部４６とタイピング試薬収容部４８及びＰＣＲ反応部５４の間がストッパ５８で抑えられて試薬の移動が阻止されている。流路は上部が弾性フィルム４２で覆われているので、上方から押すことにより流路のその部分を閉塞することができる。

この反応溶液はＳＮＰ検出用の試薬キットとして用意され、サンプル注入部４４のキャップを外して核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入する。使用にあたってストッパ５８を外し、流路の適当な箇所を閉じ、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６を交互に押すことによってサンプルとＰＣＲ反応試薬を混合し、その混合液をＰＣＲ反応部５４に保持させる。ＰＣＲ反応部５４で所定の温度サイクルによりＰＣＲ反応を行なわせる。その後、流路の適当な箇所を閉じ、タイピング試薬収容部４８と混合部５０を交互に押すことによって、ＰＣＲ反応終了後の反応液とタイピング試薬を混合し、その後混合液を混合部５０に保持させる。
その後、混合部５０の反応液をプローブ配置部３０に送り、対応するプローブで蛍光を検出することによりＳＮＰを検出する。

以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
ヒト新鮮血液１μＬに対して、ＰＣＲ反応試薬２４μＬを用いて、ＰＣＲを行なう。ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。

タイピング試薬としてインベーダ試薬を使用する。そのインベーダ試薬としては、インベーダーアッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナルバッファー、フレットプローブ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素及びアレル特異的プローブを特許文献３の段落［００４６］に記載されているような濃度に調製されたものである。

図５は図４の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型遺伝子多型検出装置の一実施例を示したものである。装置内に上下に一対のヒートブロック６０と６２が配置されて検査試薬キット装着部を構成しており、図４の反応容器４１にサンプルが注入されたものが５枚平行に下側ヒートブロック６０上に並べて設置される。これらのヒートブロック６０，６２は、矢印で示されるＹ方向に移動することができる。

下側のヒートブロック６０はＰＣＲ反応部５４の温度を所定の温度サイクルになるように制御する増幅部と、プローブ配置部３０の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部とを備えている。増幅部の温度は、例えば９４℃、５５℃及び７２℃の３段階にその順に変化させられ、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。タイピング反応部の温度は、例えば６３℃に設定されている。

またヒータブロック６０の下部には蛍光検出を行なう検出器６４が配置されており、検出器６４は図の矢印Ｘ方向に移動してプローブ配置部３０からの蛍光を検出する。ヒータブロック６０には蛍光検出のために開口が設けられている。検査試薬キット装着部によるプローブ配置部３０のＹ方向移動と、検出器６４のＸ方向移動により各プローブでの蛍光検出を行なう。

反応容器の各部を押して容積を変化させたり、流路上の一部を押して閉じるために、送液装置として送液アーム６６が設けられている。送液アーム６６は下方向に押すアクチュエータ６８を備えている。ヒートブロック６２にはその下に配置された反応容器４１の流路上の所定の箇所を押すためのピンチバルブ軸と、エアー抜きの穴３２を閉じるためのシールバルブ軸が埋め込まれている。また、アクチュエータ６８がサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０を押すことができるように、ヒートブロック６２には該当する位置に開口が設けられている。アクチュエータ６８でそれらのピンチバルブ軸、並びにサンプル注入部４４、ＰＣＲ反応試薬収容部４６、タイピング試薬収容部４８及び混合部５０を押すことにより送液動作を行なう。

図６は上側ヒートブロック６０に埋め込まれたピンチバルブ軸７０ａ〜７０ｅとシールバルブ軸７０ｆの位置を示したものである。（Ｂ）に示されるように、ピンチバルブ軸は流路上で５箇所の位置７０ａ〜７０ｅに配置されており、シールバルブ軸はエアー抜きの穴３２の位置に配置されている。

ピンチバルブ軸７０ａ〜７０ｅ及びシールバルブ軸の一例は、図７（Ａ）に示されるノック機構部の先端にピン７２を備えたものである。ピンチバルブ軸７０ａ〜７０ｅのノック機構部は、カム筒７４、ノック棒７６及び回転子７８を備えたカーン式ノック式機構と同等のものである。カム筒７４にはカム溝８０が設けられ、カム溝８０はノック棒７６とかみ合っている。８２はバルブ軸リフィールで、回転子７８の先端側にはめ込まれ、バネ８４により上方向に付勢されている。ピン７２はバルブ軸リフィール８２の先端にバネ８６により先端方向に付勢されて取り付けられている。
シールバルブ軸は、図７（Ｂ）に示されるように、ピンチバルブ軸のピン７２の先端にエアー抜きの穴３２を塞ぐためのシール部８８を設けたものである。

図８は検出器６４を詳細に示したものである。検出器６４は励起光源として４７３ｎｍのレーザ光を発するレーザダイオード（ＬＤ）や発光ダイオード（ＬＥＤ）９２を備え、そのレーザ光を反応容器４１のプローブ配置部の底面に集光して照射する一対のレンズ９４，９６を備えている。レンズ９４はレーザダイオード９２からのレーザ光を集光して平行光にするものであり、レンズ９６は平行にされたレーザ光を反応容器４１の底面に収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ９６はまた、反応容器４１から発生する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ９４，９６の間にはダイクロイックミラー９８が設けられており、ダイクロイックミラー９８は励起光を透過させ、蛍光を反射させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー９８の反射光（蛍光）の光路上にはさらにダイクロイックミラー１００が配置されている。ダイクロイックミラー１００は５２５ｎｍの光を反射し６０５ｎｍの光を透過するように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー１００による反射光の光路上には５２５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０２と光検出器１０４が配置され、ダイクロイックミラー１００による透過光の光路上には６０５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０６と光検出器１０８が配置されている。この２つの検出器１０４，１０８による２種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置に固定されたインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えばＦＡＭ，ＲＯＸ，ＶＩＣ，ＴＡＭＲＡなどを使用することができる。

次に、この実施例の動作について説明する。
図４に示される状態は未使用の状態の試薬キットを示したものである。
（サンプル注入）
まずサンプル注入部４４のキャップ４４ａが開けられて、ピペット４５によりサンプルが注入され（図９参照。）、その後、キャップが閉じられる。ストッパ５８が外されて図５の検出装置に装着される。

（サンプルとＰＣＲ反応試薬の混合）
検出装置では図１０に示されるようにアクチュエータ６８がピンチバルブ軸７０ｂ，７０ｄを押し、その部分の流路を閉じる。ピンチバルブ軸は押されて先端が前進した状態又は後退した状態になると、アクチュエータによる押圧を解除しても、次に押圧されるまではその状態を維持する。そして、図１０と図１１に示されるように、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６を上から交互にアクチュエータ６８で押すことによって、ＰＣＲ反応部５４を通って両部４４，４６間で液を往復させながら混合する。混合液はＰＣＲ反応部５４にも存在する。

（ＰＣＲ反応）
図１２に示されるようにピンチバルブ軸７０ａ，７０ｂ，７０ｃ及び７０ｄにより流路を４箇所で閉じ、ＰＣＲ反応部５４にサンプルとＰＣＲ反応試薬との混合液を閉じ込める。その状態で所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ反応を行なわせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。サンプルはゲノム抽出操作を施していないものであるが、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。

（タイピング反応液との混合）
ＰＣＲ反応終了後、図１３〜図１５に示されるように、ピンチバルブ軸７０ａ、７０ｃ及び７０ｅにより流路のその部分を閉じ、タイピング試薬収容部４８と混合部５０をアクチュエータ６８で交互に押すことによってタイピング試薬がＰＣＲ反応部５４を通過するようにし、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。

（プローブ配置部への送液）
図１６に示されるようにピンチバルブ軸７０ｂにより流路のその部分を閉じ、混合部５０をアクチュエータ６８で押すことによって混合部５０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。

（インベーダ反応）
図１７に示されるように、ピンチバルブ軸７０ｅにより流路のその部分を閉じ、シールバルブ軸７０ｆによりエアー抜き用の穴３２を閉じて、プローブ配置部３０に反応液を溜めた状態でインベーダ反応を起こさせる。インベーダ反応は温度が例えば６３℃に設定されて行なわれる。所定のプローブに該当するＳＮＰがあればその部分が発色するので、反応容器の下側から検出器６４で励起光を照射し蛍光を検出する。

図１８は検出装置の他の実施例を表わしたものであり、送液アーム１１０に反応容器上の所定の部分を押圧する２つのアクチュエータ１１２，１１４と、流路の所定の位置に対応して設けられた７個のピンチバルブ軸１１６ａ，１１６ｂ，１１６ｃ，１１６ｄ，１１６ｅ，１１６ｆ，１１６ｇを備えた例である。図５の検出装置では、流路を押さえるピンチバルブ軸は検査試薬キット装着部を構成する上側ヒートブロック６２に埋め込まれていたが、この実施例では上側ヒートブロック６２には該当する位置に穴をあけておき、ピンチバルブ軸は送液アーム１１０に設けてアクチュエータ１１２，１１４とは異なる別のアクチュエータにより押圧して作動させる。
次にこの実施例による動作を説明する。

（サンプル注入）
まずサンプル注入部４４のキャップが開けられて、サンプルが注入され、その後、キャップが閉じられる。ストッパ５８が外されて検出装置に装着される（図１８参照。）。

（サンプルとＰＣＲ反応試薬の混合）
この工程では、サンプル注入部４４とＰＣＲ反応試薬収容部４６をＰＣＲ反応部５４を介して導通させ、タイピング試薬収容部４８との間、及び混合部５０との間を閉じるように流路を押した状態でサンプルとＰＣＲ反応試薬を混合させる。そのために、図１９に示されるように送液アーム１１０を位置決めしピンチバルブ軸１１６ｂ，１１６ｄによりそれらの下の流路を閉じた状態でアクチュエータ１１２によりＰＣＲ反応試薬収容部４６を押す動作と、図２０に示されるように送液アーム１１０を位置決めしピンチバルブ軸１１６ｄ，１１６ｆによりそれらの下の流路を閉じた状態でアクチュエータ１１２によりサンプル注入部４４を押す動作とを交互に繰り返す。これによってＰＣＲ反応部５４を通って両部４４，４６間で液を往復させながら混合する。混合液はＰＣＲ反応部５４にも存在する。

（ＰＣＲ反応）
図２１に示されるように流路の閉塞を解除し、ＰＣＲ反応部５４にサンプルとＰＣＲ反応試薬との混合液が存在している状態で所定の温度サイクルを繰り返し、ＰＣＲ反応を行なわせる。

（タイピング反応液との混合）
ＰＣＲ反応終了後、図２２に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ａ、１１６ｂ及び１１６ｃによりそれらの下の流路を閉じ、タイピング試薬収容部４８をアクチュエータ１１２で押す動作と、図２３に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ｃ、１１６ｄ及び１１６ｅによりそれらの下の流路を閉じ、混合部５０をアクチュエータ１１２で押す動作とを繰り返すことによって、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
その後、図２４に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ａ、１１６ｂ及び１１６ｃによりそれらの下の流路を閉じ、タイピング試薬収容部４８をアクチュエータ１１２で押して混合液を混合部５０に移動させる。

（プローブ配置部への送液）
図２５に示されるように送液アーム１１０を位置決めし、ピンチバルブ軸１１６ｇによりその下の流路を閉じ、混合部５０をアクチュエータ１１４で押して混合部５０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。

（インベーダ反応）
図２６に示されるように流路の閉塞を解除し、プローブ配置部３０に反応液を存在させた状態でインベーダ反応を起こさせる。所定のプローブに該当するＳＮＰがあればその部分が発色するので、反応容器の下側から検出器６４で励起光を照射し蛍光を検出する。この例では、空気抜きのための穴３２を閉じていない。その場合、反応液の蒸発によりインベーダ反応に影響が出ないようにするために、一例として蒸発をしてもインベーダ反応に影響が出ないだけの反応液量を穴３２に存在させておくのが好ましい。

図２７は反応容器の第４の実施例を示したものである。この反応容器では、サンプルとして外部でＰＣＲ反応を終了させた反応液を使用する。この反応容器は、液溜め部としてサンプル注入部１２０とタイピング試薬収容部４８が設けられ、プローブ配置部３０が設けられている。タイピング試薬収容部４８及びプローブ配置部３０は上記の実施例のものと同じである。

サンプル注入部１２０は外部でＰＣＲ反応を終了させた反応液を注入するために着脱可能なキャップで被われており、そのキャップは上方からの押圧により弾性変形可能で容積が可変になっている。サンプル注入部１２０とタイピング試薬収容部４８の間が流路１２２を介して接続されており、サンプル注入部１２０とプローブ配置部３０との間が流路１２２を介して接続されている。流路１２２，１２４も上記の実施例と同様に弾性フィルムにより被われていて、上方から押圧することによりその部分を閉塞することができる。

この反応容器は、使用前の状態では流路１２２がストッパ１２６で押さえられてサンプル注入部１２０とタイピング試薬収容部４８の間が閉塞されている。
この反応容器の動作を説明する。送液アームは上記のいずれの実施例のものも使用することができるが、ここでは、図５の実施例のものを使用するものとする。

（ＰＣＲ反応終了後のサンプル注入）
図２７に示されるように、流路１２４を閉じ、サンプル注入部１２０のキャップを開けて、ピペット４５により、外部でＰＣＲ反応を終了させた反応液を注入する。注入量は約１μＬとする。その後、サンプル注入部１２０のキャップを閉じる。

（タイピング反応液との混合）
次に、ストッパ１２６を外し、ピンチバルブ軸で流路１２４を閉じた状態で、図２８のようにアクチュエータ６８でタイピング試薬収容部４８を押す動作と、図２９のようにアクチュエータ６８でサンプル注入部１２０を押す動作を繰り返すことによって、ＰＣＲ反応を完了した反応液とタイピング試薬とを混合する。
その後、図３０に示されるようにタイピング試薬収容部４８をアクチュエータで押して混合液をサンプル注入部１２０に移動させる。

（プローブ配置部への送液）
図３１に示されるように流路１２２をピンチバルブ軸で閉じ、サンプル注入部１２０をアクチュエータ６８で押してサンプル注入部１２０にある反応液をプローブ配置部３０へ送液する。
（インベーダ反応）

図３２に示されるようにピンチバルブ軸７０ｅにより流路のその部分を閉じ、シールバルブ軸７０ｆによりエアー抜き用の穴３２を閉じて、プローブ配置部３０に反応液を存在させた状態でインベーダ反応を起こさせる。所定のプローブに該当するＳＮＰがあればその部分が発色するので、反応容器の下側から検出器で励起光を照射し蛍光を検出する。

本発明は遺伝子解析の研究や臨床分野において、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。

本発明の検出方法を概略的に示すフローチャート図である。 反応容器の第１の実施例を示す図であり、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は斜視図、（Ｃ）は断面図である。 反応容器の第２の実施例を示す平面図である。 反応容器の第３の実施例を示す図であり、（Ａ）は断面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は液収容部の断面図、（Ｄ）はそのＰＣＲ反応部の断面図である。 図４の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型遺伝子多型検出装置の一実施例を示す概略斜視図である。 （Ａ）は同検出装置のピンチバルブ軸などの位置を示す斜視図、（Ｂ）はピンチバルブ軸などと反応容器との位置関係を示す平面図である。 （Ａ）はピンチバルブ軸を示す断面図、（Ｂ）はシールバルブ軸の先端部を示す断面図である。 同検出装置における検出器を示す概略構成図である。 一実施例におけるサンプル注入動作を示す平面図である。 同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるプローブ配置部への送液動作を示す平面図である。 同実施例におけるインベーダ反応動作を示す平面図である。 他の実施例におけるサンプル注入動作を示す平面図である。 同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるサンプルとＰＣＲ反応試薬の混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるプローブ配置部への送液動作を示す平面図である。 同実施例におけるインベーダ反応動作を示す平面図である。 さらに他の実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル注入動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるＰＣＲ反応後のサンプル液とタイピング反応液との混合動作を示す平面図である。 同実施例におけるプローブ配置部への送液動作を示す平面図である。 同実施例におけるインベーダ反応動作を示す平面図である。

符号の説明

２ サンプル
４ ＰＣＲ反応液
６ インベーダ試薬
８ プローブ配置部
１４ 希釈液収容部
１６ チャンバ
１６ａ，３０ プローブ配置部
１８ キャップ
２６ サンプル注入口
２８ 混合部
４１ 反応容器
４４，１２０ サンプル注入部
４６ ＰＣＲ反応試薬収容部
４８ タイピング試薬収容部
５０ 混合部
５４ ＰＣＲ反応部
６０，６２ ヒートブロック
６４ 検出器
６６，１１０ 送液アーム
６８，１１２，１１４ アクチュエータ
７０ａ〜７０ｅ，１１６ａ〜１１６ｇ ピンチバルブ軸
７０ｆ シールバルブ軸

Claims (29)

1. 平板状の基板内に形成され、サンプル又はサンプルと試薬との反応液を流路に沿って第１反応部に移送して反応させる反応容器であって、
   前記基板内に形成され、流路を介して第１反応部に接続され、上方がキャップで被われている液溜め部を備え、
   前記キャップは弾性変形可能な上部部材とその周縁の枠体とからなり、
   前記キャップは上方からの押圧により前記液溜め部の容積を可変することができ、前記キャップを押さえることで液を第１反応部に移送させるようにした反応容器。
2. 前記弾性変形可能な部材はダイヤフラム構造である請求項１に記載の反応容器。
3. 前記弾性変形可能な部材はＰＤＭＳ又はＳｉゴムを含む柔軟性をもつ素材である請求項２に記載の反応容器。
4. 前記流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備え、
   前記バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記液溜め部を押さえることで液を移送させるようにした請求項１から３のいずれかに記載の反応容器。
5. 前記液溜め部としてサンプルが注入され又は収容したサンプル収容部と、試薬を収容した試薬収容部とを備え、
   前記流路はサンプル収容部と前記第１反応部の間及び前記試薬収容部と前記第１反応部の間を接続するとともに、各部間にはバルブ部を有する請求項４に記載の反応容器。
6. 前記サンプル収容部のキャップは前記枠体が前記液溜め部の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取りつけられるようになっている請求項５に記載の反応容器。
7. 前記液溜め部として希釈液を収容した希釈液収容部と空の空間からなる希釈部とをさらに備え、
   この反応容器は前記希釈部で希釈された反応液が導かれる第２反応部をさらに備え、
   前記流路は前記希釈液収容部及び希釈部も接続しているとともに、前記希釈部と第２反応部の間も接続しており、それら各部間にもバルブ部を有する請求項５又は６に記載の反応容器。
8. 前記試薬収容部に収容された試薬は遺伝子増幅試薬であり、
   前記第１反応部は遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であって、この反応容器が試薬キットを構成している請求項５から７のいずれかに記載の反応容器。
9. 前記サンプル収容部に注入又は収容されるサンプルは生体サンプルであり、
   前記試薬収容部に収容された試薬は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬であり、
   前記第１反応部は遺伝子増幅試薬とサンプルを混合し、増幅反応を行う増幅反応部であり、
   前記基板内に形成され、前記複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容し、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっているタイピング試薬収容部と、
   前記基板内に形成され、上方からの押圧により弾性変形可能なキャップで被われて容積が可変になっている空の空間からなる混合部と、
   前記混合部で混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持された、第２反応部としてのプローブ配置部と、をさらに備え、
   前記流路は前記タイピング試薬収容部及び混合部も接続しているとともに、前記混合部と前記プローブ配置部の間も接続しており、それら各部間にも上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を有し、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している請求項５又は６に記載の反応容器。
10. 前記増幅反応部の基板肉厚が他の部分よりも薄くなっている請求項８又は９に記載の反応容器。
11. 前記液溜め部は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部であり、前記キャップの前記枠体が前記液溜め部の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取りつけられるようになっており、前記液溜め部には遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるようになっており、
    第１反応部は前記液溜め部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している請求項１から３のいずれかに記載の反応容器。
12. 前記液溜め部として遺伝子増幅反応を終了したサンプルが注入されるサンプル収容部と、複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部とを備え、両収容部は流路で接続されており、いずれかの収容部と第１反応部の間が流路で接続されており、
    第１反応部は前記液溜め部でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液が導かれ、前記複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発する複数のプローブが個別に保持されたプローブ配置部であり、
    前記サンプル収容部の前記枠体は前記液溜め部の周囲にはめ込まれることで着脱可能に取りつけられるようになっており、
    前記流路は上方からの押圧により閉塞することのできる弾性変形可能な部材からなるバルブ部を備え、前記バルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記液溜め部を押さえることで液を移送させることができ、
    この反応容器が遺伝子多型検出用の試薬キットを構成している請求項１から３のいずれかに記載の反応容器。
13. 対象とする多型が一塩基多型である請求項９から１２のいずれかに記載の反応容器。
14. 前記サンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプルである９から１３のいずれかに記載の反応容器。
15. 前記遺伝子増幅試薬はＰＣＲ反応試薬である請求項９から１４のいずれかに記載の反応容器。
16. 前記タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である請求項９から１５のいずれかに記載の反応容器。
17. 請求項１から８のいずれかに記載の反応容器を用い、前記液溜め部の押圧によりサンプル又はサンプルと試薬との反応液を流路に沿って第１反応部に移送して反応させ、その反応結果を検出する反応検出方法。
18. 請求項９又は１０に記載の反応容器を用い、次の工程を備えて遺伝子多型を検出する遺伝子多型検出方法。
    （Ａ）前記サンプル収容部にサンプルを注入する工程、
    （Ｂ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記サンプル収容部と試薬収容部を交互に押すことでサンプルと遺伝子増幅試薬の混合液を作成して前記増幅反応部へ供給する工程、
    （Ｃ）その混合液を前記増幅反応部で遺伝子増幅反応させる工程、
    （Ｄ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記タイピング試薬収容部と混合部を交互に押すことで前記増幅反応部での遺伝子増幅反応終了液とタイピング試薬を混合する工程、及び
    （Ｅ）前記工程（Ｄ）で混合された反応液を前記プローブ配置部へ送って蛍光を検出する工程。
19. 請求項１１に記載の反応容器を用い、次の工程を備えて遺伝子多型を検出する遺伝子多型検出方法。
    （Ａ）前記液溜め部にサンプルを注入する工程、
    （Ｂ）前記工程（Ａ）でタイピング試薬とサンプルが混合された反応液を前記プローブ配置部へ送って蛍光を検出する工程。
20. 請求項１２に記載の反応容器を用い、次の工程を備えて遺伝子多型を検出する遺伝子多型検出方法。
    （Ａ）前記サンプル収容部にサンプルを注入する工程、
    （Ｂ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記サンプル収容部とタイピング試薬収容部を交互に押すことでサンプルとタイピング試薬を混合する工程、
    （Ｃ）前記流路の少なくとも１箇所のバルブ部を押さえることで所定の流路部分を塞ぎ、前記工程（Ｂ）で混合された反応液を前記プローブ配置部へ送って蛍光を検出する工程。
21. 前記サンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプルである請求項１８に記載の遺伝子多型検出方法。
22. 特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値をデータベースとして用意しておき、
    請求項１８から２１のいずれかに記載の方法により検出された多型の結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出す診断方法。
23. 請求項１から１６のいずれかに記載の反応容器を装着するとともに、各部を所定の温度に制御する検査試薬キット装着部と、
    前記キャップとバルブ部の一方又は両方を押さえることにより、液の移送を行なう送液装置と、
    前記反応容器の反応後の反応液部分に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出装置と、
    前記検査試薬キット装着部の温度制御、前記送液装置の送液動作、並びに前記蛍光検出装置の検出動作を制御する制御部と、
    を備えた検出装置。
24. 前記送液装置はバルブ部を押すピンチバルブ軸と、前記キャップを押すアーム機構とを備えており、前記ピンチバルブ軸は下げる方向に押す操作ごとに進行位置と後退位置に交互に固定されるノック機構の先端に押圧用のピンを備えたものである請求項２３に記載の検出装置。
25. 前記検査試薬キット装着部は請求項９又は１０に記載の反応容器を装着するとともに、前記増幅反応部の温度を遺伝子増幅のための温度に制御する増幅部、及び前記プローブ配置部の温度をＤＮＡと前記プローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部を備え、
    前記送液装置は前記サンプル収容部、試薬収容部、タイピング試薬収容部、混合部及びバルブ部を押さえることにより、各部間の液の移送及び前記混合部から前記プローブ配置部への液の移送を行なう、ことにより遺伝子多型を検出する請求項２３又は２４に記載の検出装置。
26. 前記サンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプルである請求項２５に記載の検出装置。
27. 前記検査試薬キット装着部は請求項１１に記載の反応容器を装着するとともに、前記プローブ配置部の温度をＤＮＡと前記プローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部を備え、
    前記送液装置は前記タイピング試薬収容部を押さえることにより前記プローブ配置部への液の移送を行なう、ことにより遺伝子多型を検出する請求項２３又は２４に記載の検出装置。
28. 前記検査試薬キット装着部は請求項１２に記載の反応容器を装着するとともに、前記プローブ配置部の温度をＤＮＡと前記プローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応部を備え、
    前記送液装置は前記サンプル収容部、タイピング試薬収容部及びバルブ部を押さえることにより、各部間の液の移送及び前記プローブ配置部への液の移送を行なう、ことにより遺伝子多型を検出する請求項２３又は２４に記載の検出装置。
29. 請求項２５から２８のいずれかに記載の検出装置と、
    特定の多型又は複数の多型の組合せについての診断値を記憶したデータベースと、
    前記遺伝子多型検出装置により検出された多型結果に基づいて前記データベースから診断値を読み出して表示する表示装置と、を備えた診断装置。

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