JP4751720B2 - 遺伝子解析装置 - Google Patents

Description

本発明は医療現場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床を行なうのに適する反応容器を用いた遺伝子解析装置に関するものであり、例えば人間を初めとする動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、例えばＳＮＰ（一塩基多型）などを検出するための反応容器を扱う遺伝子解析装置に関するものである。

遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。

ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特許文献２参照。）。

ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量の核酸を用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、核酸及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ（登録商標）法又はタックマン（登録商標）ＰＣＲ(polymerase chain reaction)法を用いる（特許文献３参照。）。

本発明者らは、試薬収容部一体型でかつタイピング用の複数のプローブがそれぞれ小さな凹部からなるウエルに配置されている反応容器で、試薬収容部のシール材を貫通して分注する方式のものを提案している。そこでは、ウエルの大きさは、例えば直径が１００μｍ〜２ｍｍ、深さが５０μｍ〜１．５ｍｍである。

また、その反応容器には微量の反応液を扱う増幅反応部としてＰＣＲ反応部が設けられているが、そのＰＣＲ反応部は反応部となる流路とそれにつながる分注ポートとからなる。ＰＣＲ反応部は樹脂プレートにより構成することもでき、樹脂プレートと弾性プレートにより構成することもできる。弾性プレートを使用する場合は分注ポートを弾性プレートにより構成するのが好ましい。弾性プレートはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）やシリコーンゴムなどからなり、分注ポートに使い捨て可能なチップで分注する際、ポート壁面が弾性変形するので密着性がよく、液漏れがない。

ＰＣＲ反応部のＰＣＲ反応領域は熱交換が容易になるように、プレート断面は流路と外表面との厚みが例えば０．１〜０．５ｍｍに薄くなっている。ＰＣＲ反応部で扱う増幅反応液であるＰＣＲ反応液の量は、例えば０．１μＬ〜５μＬ程度と微量である。
特表２００２−５３３０９６号公報 特開２００１−２９９３６６号公報 特開２００２−３００８９４号公報 特許第3452717号公報 Hsu T. M., Law S. M, Duan S, Neri B. P., Kwok P. Y., "Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection", Clin. Chem., 2001 Aug;47(8):1373-7

提案中の反応容器を使用する遺伝子解析装置では、反応容器において遺伝子増幅反応を終了した増幅反応終了液を分注装置のノズルから吸引した後、同じ分注装置のノズルを用いて、次の検体のＰＣＲ反応に関わるＰＣＲ用試薬やサンプル溶液などの溶液を吸引する。この場合、分注装置として遺伝子増幅反応の前後を通して共通の分注装置を使用する場合は、ノズルの先端に使い捨て可能な分注チップを取り付け検体ごとに付け替えたとしても、分注装置のノズルやシリンジ内部のエアロゾルや飛沫を介して、遺伝子増幅反応前の増幅反応液に増幅反応終了液が混入し、コンタミネーションが発生するという問題があった。この段階でコンタミネーションが発生すると、それに起因した誤差までもが遺伝子増幅反応によって増幅されてしまうため、結果として遺伝子解析結果に大きな誤差が生じるという問題があった。
本発明は、遺伝子解析装置において、遺伝子増幅反応前の増幅反応液が増幅反応終了液によって汚染されるのを防止して、解析精度を向上させることを目的としている。

本発明の遺伝子解析装置は、少なくとも増幅反応部を基板に備えた反応容器を装着する装着部と、増幅反応部内の増幅反応液に遺伝子増幅反応をさせるために増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部と、分注チップにより増幅反応液を増幅反応部へ分注し、遺伝子増幅反応終了後に増幅反応終了液を増幅反応部から他の部分へ移送する分注装置とを備えたものであり、分注装置が遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱う第１分注部と、遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱う第２分注部とを備えている遺伝子解析装置である。

反応容器の好ましい一例は、増幅反応部を備えた基板に、凹部として形成され不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部をさらに備えたものである。
反応容器のさらに好ましい一例は、増幅反応部を備えた基板に、凹部として形成され複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容しフィルムで封止された遺伝子増幅試薬収容部をさらに備えたものである。

反応容器のさらに好ましい一例は、増幅反応部を備えた基板に、凹部として形成されタイピング試薬を収容しフィルムで封止されたタイピング試薬収容部と、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部とを備えたものである。

本発明の遺伝子解析装置は、遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱う分注部と、遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱う分注部とを別のものとしたので、分注装置のノズルやシリンジ内部のエアロゾルや飛沫を介して増幅反応終了液によって別の検体が汚染されることを防ぐことができる。

図１は本発明が適用される遺伝子解析装置の一例を概略的に示したのである。
図１には表わされていないが、少なくとも増幅反応部を基板に備えた反応容器を装着する装着部を備えている。さらに、図１に示されるように、吸引及び吐出を行なって反応容器の液の移送を行なうために第１、第２の２つのノズル２８−１，２８−２を備えている。第１のノズル２８−１は遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱うもの、第２のノズル２８−２は遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱うものである。それらのノズル２８−１，２８−２は先端に使い捨て可能な分注チップを装着した状態で液の吸引と吐出を行なう。液の吸入は分注チップ内で行なわれる。分注チップは検体ごとに付け替えられる。それらのノズル２８−１，２８−２を移動させて液の分注を行なうために分注部１１２を備えている。制御部１１８は少なくとも分注部１１２の分注動作を制御する。

ノズルによる吸引と吐出の動作は、ノズルの先端に分注チップを装着した状態で行なわれるので、動作時の説明でノズルというときは先端に分注チップを装着した状態のものを意味している。

反応容器の好ましい一例は、遺伝子多型診断用反応容器であって、試薬収容部として複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部、及びタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部を備え、反応部として遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部を備え、さらに複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を備えたものである。そして、増幅反応部が基板内部に形成された流路をもち、その流路の端部に開口形状のポートをもつ流路型反応部となっている。その場合、この反応容器処理装置は、さらに、増幅部として、図１に示されるように、増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部１２０と、プローブ配置部の温度をサンプルのゲノムＤＮＡとタイピング試薬との反応液をプローブ配置部のプローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部１１０と、各プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部６４とを備え、制御部１１８は増幅反応温度制御部１２０の温度制御、タイピング反応温度制御部１１０の温度制御、及び蛍光検出部６４の検出動作も行なうものとなる。

タイピング反応としてインベーダ（登録商標）反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御部１１０はインベーダ（登録商標）反応のための温度調節部となる。
遺伝子増幅反応としてＰＣＲ反応を使用する場合は、増幅反応温度制御部１２０はＰＣＲ反応のための温度サイクル用の温度調節部となる。
制御部１１８を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部１１８にパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１２２を接続してもよい。

本発明による多型検出の対象は特に限定されないが、例えばｃＤＮＡ、ヒトを含む様々な生物の遺伝子、ウイルス及び細菌を含む様々な微生物の遺伝子などが挙げられる。したがって、これら核酸の配列をもつものを核酸増幅のための鋳型核酸とすることができる。また、これら多型検出の対象となる遺伝子としては、ＤＮＡの遺伝子であるかＲＮＡの遺伝子であるかを問わない。
これらの遺伝子を含むサンプルも特に限定されない。すなわち、生体試料、生体由来試料、抽出核酸試料などに対して多型検出を行なうことができる。ここで、生体試料や生体由来試料は、核酸の抽出操作を行なわず、核酸包含体（例えば細胞、真菌、細菌、ウイルスなど、核酸を内部に含有する膜構造体）を維持した形態の試料である。生体試料の例としては、臓器、組織、体液、排泄物などが挙げられる。体液には、血液試料、髄液、唾液、乳などが含まれる。血液試料には、全血、血漿、血清などが含まれる。排泄物には、尿、便などが含まれる。生体由来試料は、生体試料から回収した核酸包含体である。核酸包含体の回収方法は特に限定されないが、遠心・超遠心操作、ポリエチレングリコールなどの共沈剤、吸着担体などを用いた方法が挙げられる。抽出核酸試料は、核酸の抽出操作を行なった試料であり、抽出後さらに核酸を精製した試料であってもよい。抽出方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤などを用いた方法が挙げられる。精製方法としては、フェノール／クロロホルム、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズ、磁気ビーズ、タンパク凝集作用を有する試薬などを用いた方法が挙げられる。
本発明で検出できる多型は、特に限定されず、ＳＮＰ及び複数ヌクレオチドからなる配列にわたる多型の両方を含む。本発明においては、多型にはさらに変異も含む。具体的には、本発明で検出できる多型の例としては、ＳＮＰ、挿入多型、欠失多型、反復配列多型などが挙げられる。
ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生体サンプルには複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の２倍の種類のプライマーが必要になる。しかし、２つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位それぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの２つの多型部位の間にはプライマーを結合させず、２つの多型部位の配列の両側にのみプライマーを結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずしも多型部位の種類の数の２倍になるわけではない。本発明における「複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが１つの多型部位をはさんで結合する場合だけでなく、２又はそれ以上の多型部位をはさんで結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーという意味で使用している。
遺伝子増幅試薬の一例はＰＣＲ反応試薬である。

ＳＮＰのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノムＤＮＡの調整が必須であり、そこに手間とコストがかかる。核酸を増幅するＰＣＲ法だけに着目すれば、前処理なしで血液などのサンプルから直接ＰＣＲ反応を行なわせる方法も提案されている。そこでは、サンプル中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子を含むサンプル中の遺伝子包含体、すなわち生体由来試料、もしくは遺伝子を含むサンプルそのもの、すなわち生体試料を増幅反応液に添加して、添加後の該反応液のｐＨが８.５−９.５（２５℃）で遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献４参照。）。

既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしようとする複数のＳＮＰ領域をＰＣＲ法で増幅するために、最初に採取する核酸量は少なくてすむが、ＰＣＲ法で増幅する前に予め生体サンプルから核酸を抽出しておくという前処理が必要である。そのためにその前処理に時間と手間がかかる。

直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ（登録商標）法やタックマン（登録商標）ＰＣＲ法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ（登録商標）試薬又はタックマン（登録商標）ＰＣＲ試薬である。

図１４は本発明で使用する反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用して遺伝子多型を検出する際の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ（登録商標）法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。

ＰＣＲ反応試薬４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのｐＨ緩衝液、４種類のデオキシリボヌクレオチド類、熱安定性合成酵素、及びＭｇＣｌ₂、ＫＣｌ等の塩類などの必要な試薬が添加されている。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。本発明で用いることのある増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものである。生体サンプルは核酸抽出操作を施しているものであってもよく、核酸抽出操作を施していないものであってもよい。ここで、核酸抽出操作を施していない生体サンプルとは、上述した生体試料、生体由来試料、及び、加熱処理又は凍結処理などの操作によって核酸包含体の膜構造を破壊した状態の生体試料若しくは生体由来試料を含む。核酸抽出操作を施していない生体サンプルから直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる場合には、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、サンプル２と混合したときに２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。

ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応試薬の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。

合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。

ＰＣＲ工程では、生体サンプル２とＰＣＲ反応試薬４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行なわせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。生体サンプルは核酸抽出操作を施したものであってもよいが、ここでは核酸抽出操作を施していないものを使用する。核酸抽出操作を施していない生体サンプルであっても、ＰＣＲ温度サイクルの高温下で核酸が血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬が核酸に接触して反応が進む。

ＰＣＲ反応終了後、タイピング試薬としてインベーダ（登録商標）試薬６が添加される。インベーダ（登録商標）試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通であることが多い。

次に、インベーダ（登録商標）試薬６が添加された反応液を複数のプローブ配置部８に添加して反応をさせる。各プローブ配置部８には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダ（登録商標）プローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダ（登録商標）プローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。

インベーダ（登録商標）法については、特許文献３の段落［0032］から［0034］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものを用意すれば、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。

タイピング工程で使用するインベーダ（登録商標）法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダ（登録商標）プローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。

図２は本発明の遺伝子解析装置で使用する反応容器の例である。（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。
平板状の基板１０の同じ側に試薬収容部１４及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体収容部１６が凹部として形成されている。基板１０の同じ側にはさらに、反応部１８も形成されている。試薬収容部１４と不揮発性液体収容部１６はフィルム２０で封止されており、試薬と不揮発性液体をノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム２０を取り除いてノズルで吸入するか、又はそのフィルム２０をノズルで貫通可能なものとしておいてノズルを貫通させてノズルで吸入する。
基板１０の表面は、フィルム２０上から、試薬収容部１４、不揮発性液体収容部１６及び反応部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。

反応液よりも比重の低い不揮発性液体としては、ミネラルオイル（鉱油）、植物油、動物油、シリコーンオイル又はジフェニルエーテルなどを用いることができる。ミネラルオイルはペトロラタムから蒸留により得られる液体の炭化水素混合物であり、流動パラフィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物油としてはタラの肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油又はサメの肝油などを用いることができる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油などを用いることができる。
実施例では、不揮発性液体としてミネラルオイルを使用し、以後、不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。

この反応容器の具体的な用途の一例は、反応容器内でサンプルからＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させた後に、インベーダ（登録商標）反応によりＳＮＰを検出する遺伝子多型診断用試薬キットとなったものである。図２を参照して、その遺伝子多型診断用試薬キットとしての実施例を詳細に説明する。

平板状の基板１０ａの同じ側に、サンプル注入部１２、ＰＣＲ終了液注入部３１、遺伝子増幅試薬収容部３０、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６が凹部として形成されている。基板１０ａの同じ側にはさらに、増幅反応部３２と複数のプローブ配置部１８も形成されている。

サンプル注入部１２は核酸抽出操作を施していない生体サンプル又は核酸抽出操作を施した生体サンプルが注入されるものであるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。ＰＣＲ終了液注入部３１は増幅反応部３２でＰＣＲ反応を終了した反応液とタイピング試薬とを混合するためのもので、使用前の状態では空の状態で提供される。

遺伝子増幅試薬収容部３０は複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬として、ＰＣＲ反応試薬を２〜３００μＬ収容している。タイピング試薬収容部１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を１０〜３００μＬ程度収容している。ミネラルオイル収容部１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを２０〜３００μＬ収容している。これらの遺伝子増幅試薬収容部３０、タイピング試薬収容部１４及びミネラルオイル収容部１６はノズルで貫通可能なフィルム２０で封止されている。そのようなフィルム２０は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどの樹脂との積層膜などであり、容易に剥がれないように融着や接着により貼りつけられている。
増幅反応部３２はＰＣＲ反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。

各プローブ配置部１８は複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。各プローブ配置部１８の凹部の大きさは、例えば直径が１００μｍ〜２ｍｍ、深さが５０μｍ〜１.５ｍｍの円形である。

基板１０の表面は、フィルム２０上から、サンプル注入部１２、ＰＣＲ終了液注入部３１、遺伝子増幅試薬収容部３０、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６、増幅反応部３２及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。このシール材２２もアルミニウム箔、アルミニウムと樹脂との積層膜などであるが、貼りつけ強度はフィルム２０よりは弱く、粘着剤などにより剥離可能な程度に貼りつけられている。

基板１０は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板１０の厚さは０.３〜４ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍである。低自蛍光性の観点から基板１０の厚さは薄い方が好ましい。

増幅反応部３２の部分の断面を拡大して図３に示す。図３は図２のＹ−Ｙ線位置での断面図である。図３に示されるように、増幅反応部３２はその両端にポート３４ａ，３４ｂをもち、ポート３４ａ，３４ｂはノズル２８の先端形状に対応した形状の上方向に開いた開口３６ａ，３６ｂをもち、ノズル２８の先端に密着できるようにＰＤＭＳやシリコーンゴムなどの弾性素材で構成されている。

増幅反応部３２は熱伝導率をよくするためにその部分の基板１０ａの下面側が、図２（Ｃ）、図３に示されるように肉厚が薄くなっている。その部分の肉厚は、例えば０．１〜０．５ｍｍである。
増幅反応部３２は基板内に形成された流路状の反応室３３と、反応室３３が構成されている流路の両端につながり、上方に向かって開口したポート３４ａ，３４ｂを備えている。

図４（Ａ）は流路状の反応室３３ａの第１の形態を表わしたものであり、その反応室３３ａを構成する流路はポート３４ａ，３４ｂの間に直線状に延びている。
図４（Ｂ）は流路状の反応室３３ｂの第２の形態を表わしたものであり、その反応室３３ｂを構成する流路はポート３４ａ，３４ｂの間で「コ」状に折れ曲がっている。
増幅反応部３２の平面状の部分には上下から温度調節ユニット３７ａ，３７ｂが接触して反応室３３ａ，３３ｂ内の反応液の温度を制御し、増幅反応を起こさせる。

この反応容器の使用方法を示す。
図５に示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１８及び遺伝子増幅試薬収容部３０を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。

サンプル注入部１２にサンプル２５がピペット２６などにより０.５〜２μＬ、例えば１μＬ注入される。サンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が遺伝子解析装置に装着される。
また、遺伝子解析装置には使い捨て可能な分注チップがセットされる。

遺伝子解析装置において、分注装置がノズル２８−１，２８−２に使い捨て可能な分注チップを装着する。ノズル２８−１，２８−２はその先端に分注チップを装着して分注動作を行なう。
第１の分注部のノズル２８−１がフィルム２０を貫通して遺伝子増幅試薬収容部３０に挿入されてＰＣＲ反応試薬が吸入され、ＰＣＲ反応試薬はそのノズル２８−１によりサンプル注入部１２に２〜２０μＬ移送される。サンプル注入部１２ではノズル２８−１による吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とＰＣＲ反応試薬が混合されてＰＣＲ反応液となる。

次に、そのＰＣＲ反応液がノズル２８−１により吸入されるが、このとき図６に示されるように、分注チップ内にミネラルオイル３９、ＰＣＲ反応液３８、ミネラルオイル３９の順に吸引し、分注チップ内では上層にミネラルオイル３９、中間層にＰＣＲ反応液３８、下層にミネラルオイルの３層になる状態にする。

次に、増幅反応部３２へ注入される。すなわち、図７（Ａ）に示されるようにノズル２８−１が増幅反応部３２の一方のポート３４ａに挿入されてその分注チップ内の３層の液がそのまま注入されて、注入された液は図７（Ｂ）に示される状態になる。この状態は、注入されたＰＣＲ反応液３８が、増幅部の遺伝子増幅反応温度制御領域にのみ配置される状態であり、そのような状態になるように制御装置により分注装置でのミネラルオイル３９、ＰＣＲ反応液３８及びミネラルオイル３９の分注量が制御される。また、この状態は、増幅反応部３２での反応中にＰＣＲ反応液３８が蒸発するのを防ぐために、ＰＣＲ反応液３８の両端がミネラルオイル３９で閉じられた状態となる。

ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応終了液３８ａがポート３４ａ又は３４ａから第２の分注部のノズル２８−２により回収される。このとき、ミネラルオイル３９／ＰＣＲ反応終了液３８ａ／ミネラルオイル３９の３層のまま、又はミネラルオイル３９／ＰＣＲ反応終了液３８ａの２層で回収される。ここで、回収を容易にするために、図８（Ａ），（Ｂ）に示されるように、増幅反応部３２の一方のポート３４ａからミネラルオイルが注入されてもよい。ＰＣＲ反応終了液３８ａは他方のポート３４ｂに押しやられる。そこで、そのポート３４ｂにノズル２８−２が挿入され、ＰＣＲ反応終了液３８ａがノズル２８−２に吸入される。ＰＣＲ反応終了液３８ａの回収に際しては、ノズル２８−２にはミネラルオイル３９／ＰＣＲ反応終了液３８ａ／ミネラルオイル３９の３層を吸入してもよく、又はミネラルオイル３９／ＰＣＲ反応終了液３８ａの２層を吸入してもよい。ポート３４ａ，３４ｂはその開口３６ａ，３６ｂの形状がノズル２８−２の形状に合わせて形成され、かつ弾性素材で形成されているので、ノズル２８−２がポート３４ａ，３４ｂに密着して液漏れを防ぎ、ＰＣＲ反応液の注入と回収の操作が容易である。
ここで、ポート３４ａから注入する液体はミネラルオイル４０に限らず、他の液体であってもよく、好ましくは比重が反応液と同じか反応液よりも低い液体である。

ノズル２８−２により増幅反応部３２から回収された反応終了後のＰＣＲ反応終了液３８ａはＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。このとき、ＰＣＲ終了液注入部３１には回収した液のうちのミネラルオイル３９層を捨ててＰＣＲ反応終了液３８ａのみ分注してもよいし、そのままミネラルオイル３９ごと分注してもよい。ミネラルオイル３９は次工程の反応を阻害しない。

次に、図９に示されるように、ノズル２８−２がフィルム２０を貫通してタイピング試薬収容部１４に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はそのノズル２８−２によりＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。ＰＣＲ終了液注入部３１ではノズル２８−２による吸入と吐出が繰り返されることにより、ＰＣＲ反応終了液とタイピング試薬が混合される。

その後、ＰＣＲ反応液とタイピング試薬との反応液がノズル２８−２により各プローブ配置部１８へ０.５〜４μＬずつ分注される。各プローブ配置部１８にはノズル２８−２によりミネラルオイル収容部１６からミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注される。プローブ配置部１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１８への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部１８ではミネラルオイルが反応液の表面を被い、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。

以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの反応容器に限定されるものではない。
ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。

タイピング試薬としてインベーダ（登録商標）試薬を使用する。そのインベーダ（登録商標）試薬としては、インベーダ（登録商標）アッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナルバッファー、フレットプローブ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素及びアレル特異的プローブを特許文献３の段落［００４６］に記載されているような濃度に調製されたものである。

図１０（Ａ）は上記の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型遺伝子解析装置に本発明を適用した実施例を示したものである。
図１０（Ａ）の分注装置はＺ方向に移動する送液アームに取りつけられた共通の分注ユニット６６に第１の分注部のノズル２８−１と第２の分注部のノズル２８−２を備えており、両分注部のノズル２８−１と２８−２は同時に移動する。第１のノズル２８−１は遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱うもの、第２のノズル２８−２は遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱うものである。

図１０（Ａ）の２つのノズル２８−１，２８−２にはともに分注チップ７０，７１が装着可能であるが、分注動作を行うときは使用されるノズルにのみ分注チップを装着する。使用中のノズルの分注チップが反応容器の増幅反応部などに挿入されたときでも他方のノズルには分注チップが装着されていないので、分注チップが装着されていないノズルは反応容器と接触しない。
図１０（Ａ）の実施例では、送液アームは１台ですむので、この駆動機構が簡単なものとなる、小型で低コストな装置を提供する上で有利である。

一方、図１０（Ｂ）の分注装置は比較例であり、Ｚ方向に移動するそれぞれの送液アームに取りつけられた分注ユニット６６−１，６６−２が設けられ、分注ユニット６６−１に第１の分注部のノズル２８−１が設けられ、分注ユニット６６−２に第２の分注部のノズル２８−２が設けられている。この比較例では両方のノズル２８−１，２８−２がそれぞれ独立して移動することができるので、両ノズル２８−１，２８−２にともに分注チップ７０，７１を装着しておくことができる。
図１０（Ｂ）の比較例では、両方のノズル２８−１，２８−２に分注チップ７０，７１を装着しておくことができるので、遺伝子増幅反応の前後で分注チップを付け替える必要がなく、操作が簡単になる。
分注部は図１では符号１１２で示されている。

図１０（Ａ），（Ｂ）の遺伝子解析装置内には、ヒータとして上下に一対のヒートブロック６０と６２が配置されている。反応容器４１を装着する反応容器装着部として、下側ヒートブロック６０上に図２に示された反応容器４１がスライドして所定の位置に位置決めされる案内部が形成されていることにより構成されたものが設けられている。反応容器装着部には反応容器４１にサンプルが注入されたものが５枚平行に並べて設置される。これらのヒートブロック６０，６２は、矢印で示されるＹ方向に移動することができる。

下側のヒートブロック６０は増幅反応部３２の温度を所定の温度サイクルになるように制御する増幅反応温度制御部を構成している。また、両ヒートブロック６０，６２は、プローブ配置部１８の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部を備えている。増幅反応温度制御部とタイピング反応温度制御部は、図１ではそれぞれ符号１２０，１１０で示されている。増幅反応温度制御部の温度は、例えば９４℃、５５℃及び７２℃の３段階にその順に変化させられ、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。タイピング反応温度制御部の温度は、例えば６３℃に設定されている。

図１１に示されるように、タイピング反応温度制御部を構成する上側のヒートブロック６２はプローブ配置部に対応する位置にのみ開口１５０をもち、下側のヒートブロック６０でタイピング反応温度制御部を構成する部分もプローブ配置部に対応する位置にのみ開口１５２をもっている。ヒートブロック６２上にはタイピング反応温度制御部カバー１５４が被せられており、そのカバー１５４にもヒートブロック６２の開口１５０の位置にのみ開口１５６が開けられている。開口１５０，１５６を介してノズル２８−２で反応容器４１のプローブ配置部へ反応液を分注する。

図１２はノズル２８（２８−１，２８−２）の先端部を表わしたものである。ノズル２８はその先端に使い捨て可能な分注チップ７０，７１が着脱可能に装着される。（Ａ）はノズル２８に分注チップ７０，７１が装着されていない状態、（Ｂ）はノズル２８に分注チップ７０，７１が装着された状態を表わしている。ノズル２８は分注チップ７０，７１内への液の吸入と吐出を行なう。そのため、ノズル２８はその先端に分注チップ７０，７１を装着する外形寸法をもつ装着部２８ａと、その装着部２８ａの先端にあって、分注する液と接触しない長さで装着部２８ａよりも外形寸法の小さい突出部２８ｂとを備えている。

図１１に示されるように、ヒータブロック６０の下部には蛍光検出を行なう蛍光検出部６４が配置されており、蛍光検出部６４は反応容器４１の下面側からヒータブロック６０の開口１５２を介してプローブ配置部に励起光を照射し、反応容器４１の下面側でヒータブロック６０の開口１５２を介してプローブ配置部からの蛍光を検出する。蛍光検出部６４は図９の矢印Ｘ方向に移動してブローブ配置部１８からの蛍光を検出する。反応容器装着部によるプローブ配置部１８のＹ方向移動と、蛍光検出部６４のＸ方向移動により各ブローブでの蛍光検出を行なう。

図１０（Ａ），（Ｂ）に戻って説明すると、ヒートブロック６０，６２、蛍光検出部６４及び送液アーム６６，６６−１，６６−２の動作を制御するために、それらの近くに制御部１１８が配置されている。制御部１１８はＣＰＵを備えて、動作のためのプログラムを保持している。制御部１１８はヒートブロック６０，６２により実現されるタイピング反応温度制御部１１０や増幅反応温度制御部１２０の温度制御、蛍光検出部６４の検出動作、並びに分注部１１２の送液アーム６６，６６−１，６６−２の分注動作及び増幅反応終了液の回収動作を制御する。

図１３は蛍光検出部６４を詳細に示したものである。蛍光検出部６４は励起光源として４７３ｎｍのレーザ光を発するレーザダイオード（ＬＤ）や発光ダイオード（ＬＥＤ）９２を備え、そのレーザ光を反応容器４１のプローブ配置部の底面に集光して照射する一対のレンズ９４，９６を備えている。レンズ９４はレーザダイオード９２からのレーザ光を集光して平行光にするものであり、レンズ９６は平行にされたレーザ光を反応容器４１の底面に収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ９６はまた、反応容器４１から発生する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ９４，９６の間にはダイクロイックミラー９８が設けられており、ダイクロイックミラー９８は励起光を透過させ、蛍光を反射させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー９８の反射光（蛍光）の光路上にはさらにダイクロイックミラー１００が配置されている。ダイクロイックミラー１００は５２５ｎｍの光を反射し６０５ｎｍの光を透過するように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー１００による反射光の光路上には５２５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０２と光検出器１０４が配置され、ダイクロイックミラー１００による透過光の光路上には６０５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０６と光検出器１０８が配置されている。この２つの光検出器１０４，１０８による２種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置に固定されたインベーダ（登録商標）プローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えばＦＡＭ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、Redmond Redなどを使用することができる。

図１１の検出器６４は１光源による励起光で励起し、２波長の蛍光を測定するように構成されているが、検出器６４としては２波長の蛍光測定のために異なる励起波長で励起できるように２光源を使用するように構成してもよい。

本発明は種々の化学反応の測定のほか、例えば遺伝子解析の研究や臨床分野において、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰなどを検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。

本発明が適用される反応容器処理装置を概略的に示すブロック図である。 反応容器の例を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ線位置での拡大断面図である。 同反応容器における増幅反応部を図２（Ｂ）のＹ−Ｙ線位置で示す拡大断面図である。 （Ａ），（Ｂ）はそれぞれ増幅反応部の例を透視図として示す斜視図である。 同反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の前半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。 分注ノズル先端の分注チップへの液のＰＣＲ反応液の吸入方法を示す工程図である。 （Ａ），（Ｂ）は分注ノズルから増幅反応部への液の注入方法を示す正面断面図である。 （Ａ），（Ｂ）は増幅反応部から分注ノズルへのＰＣＲ反応終了液の回収方法を示す正面断面図である。 同反応容器を使用したＳＮＰ検出方法の工程の後半部を示す図であり、（Ａ）は正面図、（Ｂ）は平面図である。 （Ａ），（Ｂ）はそれぞれ本発明の遺伝子解析装置の実施例を示す概略斜視図である。 同実施例におけるタイピング反応温度制御部を示す断面図である。 同実施例におけるノズル先端部を表わした正面図であり、（Ａ）はノズルに分注チップが装着されていない状態、（Ｂ）はノズルに分注チップが装着された状態を表わしている。 同実施例における蛍光検出部を示す概略構成図である。 本発明が関係することのあるＳＮＰ検出方法を概略的に示すフローチャート図である。

符号の説明

２ サンプル
４ ＰＣＲ反応試薬
６ インベーダ（登録商標）試薬
８ プローブ配置部
１０ａ 基板
１２ サンプル注入部
１４ タイピング試薬収容部
１６ ミネラルオイル収容部
１８ プローブ配置部
２０ フィルム
２２ シール材
２８−１，２８−２ 分注ノズル
３０ 遺伝子増幅試薬収容部
３１ ＰＣＲ終了液注入部
３２ 増幅反応部
３４ａ，３４ｂ ポート
３６ａ，３６ｂ ポートの開口
３８ ＰＣＲ反応液
３８ａ ＰＣＲ反応終了液
４１ 反応容器
６０，６２ ヒートブロック
６４ 蛍光検出部
６６，６６−１，６６−２ 分注ユニット
７０，７１ 分注チップ
１１０ タイピング反応温度制御部
１１２ 分注部
１１８ 制御部

Claims (4)

1. 少なくとも増幅反応部を基板に備えた反応容器を装着する装着部と、前記増幅反応部内の増幅反応液に遺伝子増幅反応をさせるために増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部と、分注チップにより増幅反応液を前記増幅反応部へ分注し、遺伝子増幅反応終了後に増幅反応終了液を前記増幅反応部から他の部分へ移送する分注装置とを備え、
   前記分注装置は遺伝子増幅反応前の増幅反応液を扱う第１分注部と、遺伝子増幅反応終了後の増幅反応終了液を扱う第２分注部とを備えており、
   前記第１分注部は分注チップが着脱可能に装着される第１ノズルを備え、第２分注部は他の分注チップが着脱可能に装着される第２ノズルを備え、第１ノズル及び第２ノズルは共通の分注ユニットに取りつけられて同時に移動するように構成されているとともに、分注動作を行うノズルにのみ分注チップが装着される遺伝子解析装置。
2. 前記反応容器は、前記基板に、凹部として形成され前記不揮発性液体を収容しフィルムで封止された不揮発性液体収容部をさらに備えたものである請求項１に記載の遺伝子解析装置。
3. 前記反応容器は、前記基板に、凹部として形成され複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容しフィルムで封止された遺伝子増幅試薬収容部をさらに備えたものである請求項１又は２に記載の遺伝子解析装置。
4. 前記反応容器は、前記基板に、凹部として形成されタイピング試薬を収容しフィルムで封止されたタイピング試薬収容部と、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部とを備えた遺伝子多型診断用反応容器である請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子解析装置。

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