JPH1090186A - 化学発光の測定方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ジオキセタン化合物と、これを基質とし得る
酵素との液体中の反応により生じる化学発光の発光量を
測定する際に、前記酵素の量に対する発光量を再現性よ
く測定できる測定方法及び測定キットを提供することを
課題とする。 【解決手段】 ジオキセタン化合物と、これを基質とし
得る酵素との液体中の反応により生じる化学発光を測定
する方法であって、前記反応液の表面を、この液体より
も比重の低い他の液体で覆って前記反応を行う。また、
ジオキセタン化合物と、標識物質等と、反応媒体となる
液体と、これよりも比重の低い他の液体を含めて上記測
定方法を利用する測定キットとする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光の測定方
法及びキットに関し、特に、ジオキセタン化合物とこれ
を基質とし得る酵素との反応により生じる化学発光の発
光量を再現性よく測定する方法及びキットに関する。

【０００２】

【従来の技術】化学発光法といわれる測定方法には、ア
クリジウムエステル系、ルミノール系、ジオキセタン化
合物を用いる系などが知られている。これらのうち、ジ
オキセタン化合物、特に１，２−ジオキセタン化合物を
用いる化学発光法として、ＡＭＰＰＤ、ＣＳＰＤ、Ｌｕ
ｍｉｇｅｎＰＰＤ又はＡＭＰＧＤ（ＡＭＰＰＤ、ＣＳＰ
ＤはＴｒｏｐｉｘ社の商標、ＬｕｍｉｇｅｎＰＰＤはＬ
ｕｍｉｇｅｎ社の商標、ＡＭＰＧＤはＴｒｏｐｉｘ社の
商標）等の１，２−ジオキセタン含む試薬に対して特定
の酵素を作用させることにより発光を行わしめる方法が
あり、化学発光法のなかでも最も高感度な測定系のひと
つとして知られている（特公平５−４５５９０号公
報）。また、上記のような１，２−ジオキセタン化合物
を用いた測定系に、発光増強剤（エンハンサー）として
タンパク質、蛍光物質、水溶性ポリマー、界面活性剤等
を添加した系もよく知られている（特開平５−１１５３
００号公報、特公平７−７３５１５号公報）。

【０００３】上記のようなジオキセタン化合物を用いた
化学発光法は、さまざまな物質の測定方法に応用されて
おり、特に、抗原、抗体、ＤＮＡなどに直接又はビオチ
ンなどを介して間接結合した酵素に対して基質となるジ
オキセタン化合物を作用させることにより、それにより
生じた化学発光の発光量から酵素ひいてはその酵素と結
合した抗原、抗体、ＤＮＡなどの量を定量する目的で行
われることが多い。従って、ジオキセタン化合物に作用
する酵素の量に対して、化学発光の発光量が安定して再
現されることが測定方法として重要である。

【０００４】しかし、ジオキセタンを用いた化学発光に
よる測定方法は、上記の通り高感度な測定方法である一
方で、実際には測定の再現性があまりよくない、すなわ
ち、酵素の量に対する発光量が安定しないということが
あった。

【０００５】そこで、測定条件の調節等により再現性の
向上が試みられた。例えば、反応液の温度を一定にする
ため、反応液を入れた試験管や複数のウエルを有するマ
イクロプレートやトレー等の容器を一定温度のブロック
上に置いたり、一定温度の気流中に置いたりする等の方
法が採られた。

【０００６】しかしこれらの方法では、個々の試験管又
は個々のウエルごとに測定結果がばらついてしまう等、
測定方法として満足のいくものではなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、ジオキセタン化合物と、これを
基質とし得る酵素との液体中の反応により生じる化学発
光の発光量を測定する際に、前記酵素の量に対する発光
量を再現性よく測定できる測定方法及び測定キットを提
供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ジオキセタン
化合物とこれを基質とし得る酵素との液体中の反応によ
り生じる化学発光が、それまで考えられていた以上に温
度の変化に対して極めて敏感であって、反応中に反応液
面から水分の蒸発が起こると、その気化熱による反応液
の温度変化でさえ化学発光の発光量の変動につながるこ
とを見出した。すなわち、反応液を入れた個々の試験管
又はマイクロプレートの個々のウエルごとの置かれた位
置の違い等によって反応液の水分蒸発に差が生じるた
め、発光量の再現性が低くなることを見出した。

【０００９】そこで、反応液の蒸発による温度変化を防
ぐ手だてとして、試験管やマイクロプレート等の容器の
開口部にカバーをかぶせたり、粘着テープを貼ったりす
ることが考えられる。しかし、このような操作は、実際
の測定ではかなり煩雑であり、特に近年の発達した検
査、測定の自動化システムでは極めて困難な問題であ
る。

【００１０】発明者らは、更に研究を押し進めた結果、
反応液の表面を、この液体よりも比重の低い他の液体で
覆うことにより、反応液からの液体の蒸発を簡便かつ効
果的に抑制し、正確な測定が可能となることを見出し、
本発明を完成させるに至った。

【００１１】すなわち、本発明は、ジオキセタン化合物
と、これを基質とし得る酵素との液体中の反応により生
じる化学発光を測定する方法であって、前記反応液の表
面を、この液体よりも比重の低い他の液体で覆って前記
反応を行うことを特徴とする方法、及び、測定対象物質
である抗原又は抗体を、これらに特異的に結合する抗体
又は抗原と結合させ、抗原−抗体反応をジオキセタン化
合物と、これを基質とし得る酵素との反応により生じる
化学発光を利用して検出することにより、前記測定対象
物質を検出するためのキットであって、 （イ）ジオキセタン化合物と、 （ロ）下記〜から選ばれるいずれかと、 測定対象物質である抗原に結合する抗体、及び、標識
物質で標識された前記抗原もしくはその類似物質、 測定対象物質である抗原に結合する抗体、及び、標識
物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗原に結合
する第２の抗体、 標識物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗原
に結合する抗体、及び、前記抗原もしくはその類似物
質、 測定対象物質である抗体に結合する抗原、及び、標識
物質で標識され、かつ、前記抗原に結合する抗体、 測定対象物質である抗体に結合する抗原、及び、標識
物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗体に結合
する抗体、（但し、前記標識物質は、前記ジオキセタン
化合物を基質とし得る酵素又はこの酵素が直接的又は間
接的に結合し得る物質である。） （ハ）前記ジオキセタン化合物と前記酵素との反応媒体
となる液体と、 （ニ）前記液体よりも比重の低い他の液体と、を含むキ
ット、である。

【００１２】以下に、本発明を詳細に説明する。

【００１３】＜１＞本発明の化学発光の測定方法 本発明の方法は、ジオキセタン化合物と、これを基質と
し得る酵素との液体中の反応により生じる化学発光を測
定する方法であって、前記反応液の表面を、この液体よ
りも比重の低い他の液体で覆って前記反応を行うことを
特徴とする。すなわち、反応液よりも比重の低い液体で
反応液を覆う以外は、通常広く用いられている酵素反応
により化学発光を測定する方法と特に変わるところはな
い。

【００１４】本発明で用いられるジオキセタン化合物お
よびこれを基質とし得る酵素は、これらが液体中で反応
し、化学発光を生じるものを組み合わせればよい。ジオ
キセタン化合物として具体的には、１，２−ジオキセタ
ンが挙げられる。また、更に具体的には、１，２−ジオ
キセタンの中でも３−（２’−スピロアダマンタン）−
４−メトキシ−４−（３”ホスホリルオキシ）フェニル
１，２−ジオキセタン）（以下、「ジオキセタン化合物
１」という）、ジソジウム３−（４−メトキシスピロ
｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）
トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン｝−４−イ
ル）フェニルホスフェイト（以下、「ジオキセタン化合
物２」という）、４−メトキシ−４−（３−ホスホリル
オキシフェニル）スピロ（１，２−ジオキセタン−３，
２’−トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン）二ナ
トリウム塩（以下、「ジオキセタン化合物３」とい
う）、（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−
４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシフェニ
ル）−１，２−ジオキセタン（以下、「ジオキセタン化
合物４」という）、等が好ましく用いられ、特に好まし
くは、ジオキセタン化合物１〜３が挙げられる。

【００１５】上記ジオキセタン化合物１〜４を含む試薬
は、各々順に、ＡＭＰＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ社の商標）、
ＣＳＰＤ（Ｔｒｏｐｉｘ社の商標）、ＬｕｍｉｇｅｎＰ
ＰＤ（Ｌｕｍｉｇｅｎ社の商標）、ＡＭＰＧＤ（Ｔｒｏ
ｐｉｘ社の商標）として市販されている。

【００１６】ジオキセタン化合物を基質とし得る酵素
は、上記ジオキセタン化合物等との組み合わせにより選
べばよく、具体的には、ジオキセタン化合物１〜３はア
ルカリホスファターゼの基質であり、ジオキセタン化合
物４はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質であって、各々
酵素反応により化学発光を生じる。

【００１７】ジオキセタン化合物とそれを基質とし得る
酵素との反応は、水溶液中にて生じさせる。この反応液
には、緩衝剤としてＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、ジエタノールア
ミン、２メチル−２−アミノ−１−プロパノール等、発
光増強剤（エンハンサー）としてタンパク質、蛍光物
質、水溶性ポリマー、界面活性剤等を添加してもよい。

【００１８】化学発光を生じさせる反応は、通常の化学
発光を利用した測定法と同様である。すなわち、ジオキ
セタン化合物とこれを基質とし得る酵素とを水溶液に混
合することにより行えばよく、用いられるジオキセタン
化合物、酵素または化学発光を利用して測定しようとす
る測定対象物質等の条件により、温度等の測定条件を適
宜調節して行えばよい。ジオキセタン化合物及びこれを
基質とし得る酵素などの種類にもよるが、一般的には、
ジオキセタン化合物とそれを基質とし得る酵素との反応
に好ましい温度は４〜５０℃であり、特に好ましい温度
は３０〜４０℃である。

【００１９】本発明では、化学発光を生じさせる反応液
の表面を、この液体よりも比重の低い他の液体で覆って
化学発光反応を生じさせる。ここで反応液の表面とは、
反応液を試験管等の容器に入れた際に、その反応液が空
気と接触する面のことである。本発明ではその表面を上
記他の液体で覆い、反応液から水分等が蒸発し気化熱に
よって反応液の温度が変化することを抑制する。従っ
て、化学発光の測定に影響を及ぼさない程度に反応液の
気化を抑制し、反応液の温度変化を抑制すればよい。従
って、必ずしも反応液の表面の全面を覆う必要はない
が、通常は、反応液の表面の全面を覆うことが望まし
い。

【００２０】なお、反応液の気化抑制による温度変化の
抑制の他、従来から一般的に行われている温度制御手
段、例えば、一定温度のブロックの上に反応液を入れた
容器を置く等の手段を併せて用いることによって、反応
液の温度を特定の温度に設定するとともにその温度変化
を抑制することができる。なお、反応液の温度変化は、
±０．４℃以内に抑制されることが好ましく、±０．１
℃以内に抑制されることが特に好ましい。

【００２１】また、反応液の表面を覆う前記他の液体に
は、前記した反応液よりも比重の低いものを用いる。ま
た、この液体は無色透明であることが望ましいが、化学
発光の測定に障害とならない程度に透明な液体であれば
よい。また、この液体の沸点は高いほどよく、少なくと
も１１０℃以上であることが好ましく、より好ましくは
１２０℃以上である。

【００２２】また、この液体は不揮発性であることが望
ましいが、反応液を覆う液体自身の気化により化学発光
に影響を及ぼすほど反応液に温度変化が生じなければ、
揮発しにくい液体でもよい。また、臨床検査診断装置等
を用いて反応液表面を覆う液体を自動添加する場合は、
粘度の低いものを用いることが望ましい。具体例とし
て、好ましくは、ミネラルオイル、シリコンオイル、大
豆油、流動パラフィン、ジフェニルエーテルおよび炭素
数が１２〜１８のアルカン等が挙げられ、特に好ましく
は、ミネラルオイルが挙げられる。

【００２３】本発明においては、ジオキセタン化合物と
酵素との反応により化学発光を生じさせ、その発光量を
測定する。化学発光の発光量は、通常、化学発光の初期
から終期まで又は所定時間の発光強度の総量を測定して
得られるが、発光強度の最大値をもって発光量とする等
してもよい。化学発光の発光量は、一般的に発光量の測
定に通常用いられる測定機器、測定具等により測定すれ
ばよい。

【００２４】本発明の方法は、いわゆる化学発光法を改
善したものであり、化学発光の測定方法を利用した抗
原、抗体、ＤＮＡ等の目的物質の検出や定量に好適に適
用され、抗原又は抗体を測定対象物質とする際にはいわ
ゆるサンドイッチアッセイ法、競合法等の方法を問わず
好適に適用される。

【００２５】測定対象がＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸であ
る場合には、測定対象物質にハイブリダイズし得る、す
なわち前記核酸と相補的な塩基配列を有するＤＮＡまた
はＲＮＡを酵素又は酵素が結合し得る標識物質で標識す
ればよい。また、測定対象が抗原又は抗体である場合に
は、測定対象である抗原もしくは抗体と同一又は類似の
抗原もしくは抗体、又はこれらに結合する抗体もしくは
抗原又はこれらに類似の抗体もしくは抗原を、酵素又は
酵素が結合し得る標識物質で標識すればよい。

【００２６】本発明の方法を利用した抗原又は抗体の測
定法については、本発明の測定キットとともに、以下で
詳しく説明する。

【００２７】＜２＞本発明の測定キット 次に、本発明の測定キットについて説明する。本発明の
測定キットは、上記本発明の化学発光の測定方法を利用
して抗原、抗体を検出又は定量するものである。

【００２８】本発明のキットは、測定対象物質である抗
原又は抗体を、これらに特異的に結合する抗体又は抗原
と結合させ、抗原−抗体反応をジオキセタン化合物と、
これを基質とし得る酵素との反応により生じる化学発光
を利用して検出することにより、前記測定対象物質を検
出するためのキットであって、反応液よりも比重の低い
液体を含む以外は、通常広く用いられているキットと特
に変わるところはない。

【００２９】本発明のキットは、 （イ）ジオキセタン化合物と、 （ロ）下記〜から選ばれるいずれかと、 測定対象物質である抗原に結合する抗体、及び、標識
物質で標識された前記抗原もしくはその類似物質、 測定対象物質である抗原に結合する抗体、及び、標識
物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗原に結合
する第２の抗体、 標識物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗原
に結合する抗体、及び、前記抗原もしくはその類似物
質、 測定対象物質である抗体に結合する抗原、及び、標識
物質で標識され、かつ、前記抗原に結合する抗体、 測定対象物質である抗体に結合する抗原、及び、標識
物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗体に結合
する抗体、（但し、前記標識物質は、前記ジオキセタン
化合物を基質とし得る酵素又はこの酵素が直接的又は間
接的に結合し得る物質である。） （ハ）前記ジオキセタン化合物と前記酵素との反応媒体
となる液体と、 （ニ）前記液体よりも比重の低い他の液体と、を含む。

【００３０】測定対象物質が抗原であれば、前記（ロ）
は、〜から選ばれ、また、測定物質物質が抗体であ
れば、前記（ロ）は、及びから選ばれる。本発明の
キットは、いわゆるサンドイッチアッセイ法や競合法
等、通常の化学発光を利用したイムノアッセイに適用し
うるものであり、例えば、前記を含むキットは抗体を
固相化した競合法に、を含むキットは一方の抗体を固
相化したサンドイッチ法に、を含むキットは抗原を固
相化した競合法に、を含むキットは抗原を固相化した
競合法に、を含むキットは抗原を固相化した間接法
に、各々使用される。

【００３１】競合法による抗原測定用のキットに含まれ
る抗原の類似物質とは、抗体に対する結合特性が類似し
たものであり、抗原と競合して抗体に結合するものであ
ればよい。同様に、競合法による抗体測定用のキットに
含まれる抗体は、測定対象である抗体と同一であっても
よく、同じ抗原に結合するものであれば異なる抗体であ
ってもよい。また、抗体はポリクローナル抗体を用いて
もモノクローナル抗体を用いてもよい。

【００３２】標識物質は、前記ジオキセタン化合物を基
質とし得る酵素又はこの酵素が直接的又は間接的に結合
し得る物質である。すなわち、抗体又は抗原を、酵素を
直接結合させることにより標識してもよく、ビオチン、
アビジン等の標識物質を結合させ、これにアビジン又は
ビオチンを結合させた酵素を結合させることにより、間
接的に酵素を結合させてよい。

【００３３】抗原又は抗体を、酵素又は酵素が結合し得
る標識物質で標識するには、通常タンパク質の標識に用
いられている方法を適用することができる。本発明の測
定キットにおけるジオキセタン化合物およびそのジオキ
セタン化合物を基質とする酵素は、前記＜１＞に記載し
たのと同様であり、測定対象とする抗原又は抗体に応じ
て、適宜選択すればよい。アルカリフォスファターゼや
β−ガラクトシダーゼ等の酵素は、市販されているもの
を用いることができる。

【００３４】本発明のキットは、抗原または抗体を担体
に固相化させたものを要素として含め、いわゆる固相法
用の測定キットとすることができる。担体としては、ガ
ラスビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリスチレンチュー
ブ、ポリスチレンチューブ、ポリスチレンプレート、ラ
テックス粒子または磁性鉄粒子等が好ましい。例えば、
ポリスチレンビーズ（以下、「ビーズ」という。）を用
いるのであれば、その大きさは直径３〜１０ｍｍ程度が
好ましい。固相法によれば、測定対象物質とそれ以外の
遊離抗原または抗体等とを容易にＢ／Ｆ分離できる測定
キットとなる。

【００３５】ジオキセタン化合物とこれを基質とし得る
酵素との反応は水溶液中で生じさせる。この時の反応媒
体となる水溶液は、化学発光の測定に支障とならない程
度に透明であれば他に特に制限はない。本発明の測定方
法のところでも述べたが、この水溶液には、必要に応じ
てＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、ジエタノールアミン、２メチル−
２−アミノ−１−プロパノール等の緩衝剤およびタンパ
ク質、蛍光物質、水溶性ポリマー、界面活性剤等の発光
増強剤を混合してもよい。

【００３６】これらの緩衝剤、発光増強剤等は反応媒体
とは別体としておいて、使用時に添加するように固形、
粉末等の剤形にしておいてもよいし、反応媒体中に予め
混合しておいてもよい。

【００３７】また、上記反応媒体にジオキセタン化合物
およびこれを基質とし得る酵素等が混合された反応液よ
りも比重の低い他の液体は、本発明の測定方法のところ
で説明したような性質のものでよく、好ましくは、ミネ
ラルオイル、シリコンオイル、大豆油、流動パラフィ
ン、ジフェニルエーテルおよび炭素数が１２〜１８のア
ルカン等が挙げられ、特に好ましくは、ミネラルオイル
が挙げられる。なお、これらの液体は化学発光を生じさ
せる反応媒体に予め添加しておいてもよいし、化学発光
反応時に添加するように反応媒体とは別体としておいて
もよい。

【００３８】なお、これらの他にも、所望の測定対象物
質により、通常用いられる添加物質等を本発明の測定キ
ットに含めてもよい。本発明の化学発光の測定法及び本
発明のキットを用いて測定可能な対象物質としては、Ｔ
ＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）、ＰＲＬ（プロクラチ
ン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）、ＦＳＨ（濾胞刺激ホ
ルモン）、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）、Ｔ３
（トリヨードチロニン）、Ｔ４（チロキシン）、ＰＴＨ
（副甲状腺ホルモン）、コルチゾール、エストラジオー
ル、プロゲステロン、テストステロン等のホルモン；Ａ
ＦＰ（αフェトプロテイン）、ＣＥＡ（がん胎児性抗
原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＣＡ１９−９、ＣＡ
１２５、フェリチン等の腫瘍マーカー；ＰＡＰ（前立腺
酸性フォスファターゼ）、ＣＫ−ＭＢ等の血中酵素；イ
ンターロイキングループ、ＥＰＯ（エリスロポイエチ
ン）等のサイトカイン等が挙げられる。

【００３９】これらの他、本発明は、Ｂ型肝炎関連抗原
若しくは抗体検査、Ｃ型肝炎若しくはＨＩＶの抗体検査
または抗ＤＮＡ抗体等の自己免疫検査等の臨床検査に適
用することも可能である。

【００４０】

【発明の実施の形態】以下、ヒト血清中のＴＳＨ等のホ
ルモンを定量する場合を取り上げて、本発明の化学発光
の測定法及びキットの実施の形態を説明する。

【００４１】＜１＞ホルモンの測定 ＴＳＨ等のホルモンに結合する抗体を、アルカリフォス
ファターゼ等の酵素を結合させて標識化抗体を得る。抗
体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよ
い。この標識化抗体は、ホルモンに対して十分な量とな
るように水溶液に溶かしておけばよい。

【００４２】一方、標識化抗体とは別に、測定対象物質
に結合する抗体を担体に固相化させる。好ましい担体と
しては、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、ポリスチ
レンチューブ、ポリスチレンプレート、ラテックス粒子
および磁性鉄粒子等が挙げられる。例えば、ポリスチレ
ンビーズ（以下、「ビーズ」という。）を用いるのであ
れば、その大きさは直径３〜１０ｍｍ程度が好ましい。
固相化させる抗体は、測定対象物質に結合するものであ
れば、標識化抗体と同一であっても異なるものであって
もよく、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で
もよい。ただし、標識化抗体、固相化させる抗体がとも
にモノクローナル抗体とする場合には、エピトープの異
なるものを用いる必要がある。なお、抗体の固相化は通
常の方法に従って行えばよい。

【００４３】上記抗体を固相化したビーズをマイクロプ
レート等の容器に入れる。マイクロプレートのように複
数のウエルを有するものでは、１つのウエルの直径が５
〜１５ｍｍ、深さが５〜５０ｍｍ程度のものが好まし
く、１つのウエルに対しては１個のビーズを入れればよ
い。なお、容器は上記のようなマイクロプレートに限ら
ず、一般的なチューブでもよい。

【００４４】この後、ホルモンを含む試料、例えばヒト
血清を各ウエルに入れる。試料の量にもよるが、１ウエ
ルが上記のようなサイズであれば標識化抗体を含む溶液
は、１〜５００μＬ添加すればよい。次に標識化抗体を
含む溶液を添加して反応させ、ビーズに固相化した抗体
と標識物質とを測定対象物質であるホルモンに結合させ
る。尚、試料と標識化抗体は、同時にウエルに添加して
もよい。

【００４５】反応後、容器に入っている溶液を吸引除去
する。除去後、蒸留水を添加、吸引除去を１〜２０回繰
り返して十分に洗浄し、Ｂ／Ｆ分離を行う。Ｂ／Ｆ分離
終了後、標識物質に結合している酵素の基質となるジオ
キセタン化合物を含む溶液を添加する。ジオキセタン化
合物として好ましくはジオキセタン化合物１〜３が挙げ
られ、これらを基質とする酵素としてはアルカリフォス
ファターゼが好ましい。ジオキセタン化合物を含む溶液
は、１０〜５００μＬ添加することが好ましい。

【００４６】また、緩衝液として、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ、
ジエタノールアミンまたは２メチル−２−アミノ−１プ
ロパノール等を添加することが望ましい。緩衝液のｐＨ
はヒト血清中のホルモンを測定する場合であれば４〜１
１とすることが好ましい。更に、発光増強剤としてＢＳ
Ａ等のタンパク質、共存性フルオレセイン界面活性剤等
の蛍光物質、カチオン性界面活性剤等の界面活性剤また
は水溶性ポリマー等を必要に応じて１種または２種以上
添加してもよい。

【００４７】上記ジオキセタン化合物を含む反応液に、
この反応液よりも比重の低い液体を添加して反応液の表
面を覆う。反応液表面を覆う液体としては、ミネラルオ
イル、シリコンオイル、大豆油、流動パラフィン、ジフ
ェニルエーテルまたは炭素数が１２以上のアルカン等が
好ましく用いられ、特に好ましくはミネラルオイルが用
いられる。添加量は、前記反応液が空気と接触しないよ
うに反応液の表面全体を覆うことが望ましく、具体的に
は、厚さ０．１〜１０ｍｍの層とすることが好ましい。

【００４８】ジオキセタン化合物と酵素が反応すること
により化学発光が生じる。一般的には、反応液の温度を
４〜５０℃とすることが好ましく、３０〜４０℃とする
ことが特に好ましい。反応液を所定の温度にするために
は一般的な恒温器を用いればよい。

【００４９】化学発光の発光量の測定は、一般的な発光
量の測定器を用いて通常の方法に従って行えばよい。

【００５０】＜２＞測定キット 上記のような本発明の方法を簡便に作業性よく行うため
の測定キットとして、具体的には、以下のような測定キ
ットを挙げることができる。 ＜ＴＳＨ測定キット＞次に示すように各要素を調製し
て、ＴＳＨ測定キットを得る。

【００５１】ＣＳＰＤ；11.0 mg/ml、200 μl（緩衝液
(0.1M:シ゛メタノールアミン、1.0 mM:MgCl₂）及び発光増進剤（エ
ンハンサー）を含む。pH10.0）（ベーリンガーマンハイ
ム社より市販されている） ミネラルオイル；２００μｌ 標識物質；３３０μｇ／ｍｌ（アルカリフォスファターセ゛標識ヤキ゛抗
TSHホ゜リクローナル抗体） ポリスチレンビーズ；１個（マウス抗TSHモノクローナル抗体を表
面に固相化）

【００５２】なお、各物質の量は測定する検体の数など
によって必要に応じて決めればよい。また、上記の他、
マイクロプレート、チューブ等の容器を付け加えてもよ
い。

【００５３】本発明の測定キットによって、化学発光を
利用した抗原、抗体等の測定を作業性よく行うことがで
きる。

【００５４】

【実施例】以下に本発明の方法、効果等を臨床免疫検査
のＴＳＨ測定系の実施例によって示す。但し、本発明
は、以下の実施例により限定されるものではない。

【００５５】＜ヒト血清中のＴＳＨの測定＞ＣＳＰＤ
（11.0 mg/ml、200 μl（緩衝液(0.1M:シ゛メタノールアミン、1.0
mM:MgCl₂）及び発光増進剤（エンハンサー）を含む。p
H10.0）（ベーリンガーマンハイム社より購入した）、
マウス抗ヒトＴＳＨモノクローナル抗体を固相化したポ
リスチレンビーズ、アルカリフォスファターゼで標識し
たヤギ抗ヒトＴＳＨポリクローナル抗体を含む液体、Ｐ
ＢＳ緩衝液（濃度５０ｍＭ、ｐＨ７．４）及びミネラル
オイルを、上述のＴＳＨ測定キットより得た。

【００５６】また、化学発光を生じさせる反応液等を入
れる容器として反応プレート（１列１０ウエル×５段。
ウエル直径１２ｍｍ、深さ２５ｍｍ）を用意した。反応
プレートの１ウエルごとに、マウス抗ヒトＴＳＨモノク
ローナル抗体を固相化したポリスチレンビーズ１個ずつ
入れた。

【００５７】ポリスチレンビーズの入った各ウエルに、
試料としてヒト血清７５μＬと、アルカリホスファター
ゼで標識したヤギ抗ヒトＴＳＨポリクローナル抗体を含
む液体１５０μＬとを加え、室温で９０分反応させた。

【００５８】反応後、試料及びヤギ抗ヒトＴＳＨポリク
ローナル抗体を含む溶液を各ウエルから吸引除去し、前
記ポリスチレンビーズを蒸留水１ｍＬで４回洗浄してＢ
／Ｆ分離を行った。

【００５９】Ｂ／Ｆ分離の後、基質としてＣＳＰＤを２
００μＬとミネラルオイル２００μＬとを各ウエルごと
に添加し、３７℃、５０分間静置した。この間に生じた
化学発光の発光量を光度計を使用して各ウエルごとに測
定した。

【００６０】また、ミネラルオイルを反応液に添加せ
ず、それ以外は上記と同様の方法で測定した場合を比較
例として行った。表１にミネラルオイルを添加した場合
（本発明）、表２にミネラルオイルを添加しなかった場
合（比較例）の測定結果を示す。

【００６１】表中の測定値は、反応プレートの各ウエル
の位置にそれぞれ対応させて表示し、列には１〜１０、
段には０、１０、２０、３０、４０の番号をつけた。ま
た、反応プレートの各列ごと、各段ごと及びプレート全
体について測定値の平均値、標準偏差、ＣＶ値（変動係
数）を求め、測定値のバラつきを比較した。

【００６２】表１及び表２から、ミネラルオイルを添加
した場合の方が、ミネラルオイルを添加しない場合より
も発光量測定値のＣＶ値が小さく、測定値のバラつきが
小さいことが明らかとなった。すなわち、化学発光を生
じさせる反応液にミネラルオイルを添加することによ
り、化学発光の測定の再現性が向上することが明らかと
なった。

【００６３】

【表１】

【００６４】

【表２】

【００６５】

【発明の効果】本発明の方法又は測定キットによれば、
ジオキセタン化合物と、これを基質とし得る酵素との液
体中の反応により生じる化学発光の発光量を測定する際
に、前記酵素の量に対する発光量を再現性よく測定で
き、また、作業性よく測定することが可能である。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ジオキセタン化合物と、これを基質とし
   得る酵素との液体中の反応により生じる化学発光を測定
   する方法であって、前記反応液の表面を、この液体より
   も比重の低い他の液体で覆って前記反応を行うことを特
   徴とする方法。
2. 【請求項２】 前記他の液体が、不揮発性である請求項
   １記載の方法。
3. 【請求項３】 前記不揮発性の液体が、ミネラルオイ
   ル、シリコンオイル、大豆油、流動パラフィン、ジフェ
   ニルエーテル及び炭素数が１２〜１８のアルカンからな
   る群より選ばれる請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 ジオキセタン化合物が、１，２−ジオキ
   セタン化合物である請求項１〜３のいずれか１項に記載
   の方法。
5. 【請求項５】 １，２−ジオキセタン化合物が、３−
   （２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−
   （３”ホスホリルオキシ）フェニル１，２−ジオキセタ
   ン、ジソジウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジ
   オキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ
   ［３．３．１．１^3,7］デカン｝−４−イル）フェニル
   ホスフェイト、４−メトキシ−４−（３−ホスホリルオ
   キシフェニル）スピロ（１，２−ジオキセタン−３，
   ２’−トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン）二ナ
   トリウム塩、（２’−スピロアダマンタン）−４−メト
   キシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ
   フェニル）−１，２−ジオキセタンからなる群より選ば
   れる請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 １，２−ジオキセタン化合物が、３−
   （２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−
   （３”ホスホリルオキシ）フェニル１，２−ジオキセタ
   ン、ジソジウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジ
   オキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ
   ［３．３．１．１^3,7］デカン｝−４−イル）フェニル
   ホスフェイト、４−メトキシ−４−（３−ホスホリルオ
   キシフェニル）スピロ（１，２−ジオキセタン−３，
   ２’−トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン）二ナ
   トリウム塩からなる群より選ばれ、酵素がアルカリホス
   ファターゼである請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 １，２−ジオキセタン化合物が、（２’
   −スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−
   β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシフェニル）−１，２
   −ジオキセタンであり、酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダー
   ゼである請求項５記載の方法。
8. 【請求項８】 測定対象物質である抗原又は抗体を、こ
   れらに特異的に結合する抗体又は抗原と結合させ、抗原
   −抗体反応をジオキセタン化合物と、これを基質とし得
   る酵素との反応により生じる化学発光を利用して検出す
   ることにより、前記測定対象物質を検出するためのキッ
   トであって、 （イ）ジオキセタン化合物と、 （ロ）下記〜から選ばれるいずれかと、 測定対象物質である抗原に結合する抗体、及び、標識
   物質で標識された前記抗原もしくはその類似物質、 測定対象物質である抗原に結合する抗体、及び、標識
   物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗原に結合
   する第２の抗体、 標識物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗原
   に結合する抗体、及び、前記抗原もしくはその類似物
   質、 測定対象物質である抗体に結合する抗原、及び、標識
   物質で標識され、かつ、前記抗原に結合する抗体、 測定対象物質である抗体に結合する抗原、及び、標識
   物質で標識され、かつ、測定対象物質である抗体に結合
   する抗体、（但し、前記標識物質は、前記ジオキセタン
   化合物を基質とし得る酵素又はこの酵素が直接的又は間
   接的に結合し得る物質である。） （ハ）前記ジオキセタン化合物と前記酵素との反応媒体
   となる液体と、 （ニ）前記液体よりも比重の低い他の液体と、を含むキ
   ット。
9. 【請求項９】 反応媒体となる液体よりも比重の低い他
   の液体が、不揮発性である請求項８記載の測定キット。
10. 【請求項１０】 前記不揮発性の液体が、ミネラルオイ
    ル、シリコンオイル、大豆油、流動パラフィン、ジフェ
    ニルエーテル及び炭素数が１２〜１８のアルカンからな
    る請求項９記載の測定キット。
11. 【請求項１１】 ジオキセタン化合物が、１，２−ジオ
    キセタン化合物である請求項８〜１０のいずれか１項に
    記載の測定キット。
12. 【請求項１２】 １，２−ジオキセタン化合物が、３−
    （２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−
    （３”ホスホリルオキシ）フェニル１，２−ジオキセタ
    ン、ジソジウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジ
    オキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ
    ［３．３．１．１^3,7］デカン｝−４−イル）フェニル
    ホスフェイト、４−メトキシ−４−（３−ホスホリルオ
    キシフェニル）スピロ（１，２−ジオキセタン−３，
    ２’−トリシクロ［３．３．１．１^{3, 7}］デカン）二ナ
    トリウム塩、（２’−スピロアダマンタン）−４−メト
    キシ−４−（３”−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ
    フェニル）−１，２−ジオキセタンからなる群より選ば
    れる請求項１１記載のキット。