CN116027019A

CN116027019A - 一种用于化学发光免疫分析的添加剂及其用途

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Publication number: CN116027019A
Application number: CN202211689793.3A
Authority: CN
Inventors: 张闻; 周广亮; 陈烨; 陈远昊; 吴江龙; 陈媛
Original assignee: Ningbo Rui Bio Technology Co ltd
Current assignee: Ningbo Rui Bio Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-12-23
Also published as: CN116027019B

Abstract

本发明公开了一种用于化学发光免疫分析的添加剂，所述添加剂包括试剂R1、防腐剂和缓冲液，所述缓冲液为Good’s缓冲液，所述试剂R1为二甲基聚硅氧烷、二甲基硅油、羟基硅油、聚醚型聚硅氧烷或纳米二氧化硅的一种，所述试剂R1的质量分数为1%‑20%。本发明提供的添加剂应用到吖啶酯化学发光免疫检测中，能够改善吖啶酯类化合物的发光特征性曲线，产生更多的光信号，适配于不同检测系统的需要。同时可以降低免疫反应之外的非特异性信号，提升未参与反应的吖啶酯类化合物的清洗效果，实现提升检测系统的灵敏度及精密度的需求。

Description

一种用于化学发光免疫分析的添加剂及其用途

技术领域

本发明涉及化学发光免疫分析技术领域，具体涉及一种用于化学发光免疫分析的添加剂及其用途。

背景技术

化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法，吖啶酯类化学发光剂是目前常见的标记物之一。吖啶酯化学发光为闪光型，在加入启动剂0As后发射光强度达到最大，半衰期为0.9s，2s内发光基本结束，可以实现快速检测，同时对信号检测仪灵敏度要求也较高。

吖啶酯的光激发反应分为两个步骤，过氧化氢阴离子在酸性条件下，加成到吖啶盐的9号位上，随后，离开基团X通过四面体二氧环丁烷中间体进行分子内电荷转移，迅速分解，并产生吖啶酮和化学光，具体反应机理如下所示：

目前市场上主流的化学发光分析仪在检测过程中对标记物的发光特征性曲线设定有各自的标准，仪器厂商通常在仪器内设置固定的发光曲线读取及判定条件，使用相配适的激发液才可生成能够被仪器正确判读的发光特征性曲线。在实际化学发光免疫分析操作中，仪器识别到与设定不符的发光特征性曲线时，会报告以下类似错误如“RLU低于规格，不能计算测定结果”、“本底的读取超出规格，无法测定”及“未能执行检测，起用的读取故障”，“败预点亮比率测试信号失败”或虽未报错但仪器由于曲线形状错误报值严重偏差引起测试结果的精密度不可接受等问题。这就造成不同厂商仪器之间的试剂无法相互配适，导致试剂价格高昂，甚至形成垄断的情况。

如图4所示，Anand等作者2014年发表的Effect of branch in gin remotesubstituent son light emission and stability of chemiluminescent acridiniumesters文章中提到，吖啶酯激发液中可以适当加入一些表面活性剂，可以显著提高吖啶酯的产光效率，降低激发反应的活化能，提前化学发光反应时间及有效增强反应产生的光信号值。

上述报道虽然提拱了一种思路，但是表面活性剂的添加是在仪器厂商中提供的激发液中添加的，是固定的组分，实验人员无法进行调整，因此仍然无法从根本上解决发光特征曲线的改善和不同仪器的兼容问题。

开发一种能够改善化学发光特征曲线的添加剂成为目前亟需解决的问题，以实现使用常用的吖啶酯原料，在不同仪器设定参数的条件下均可满足各自的发光特性需求，从而兼容不同测试平台的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于化学发光免疫分析试剂的添加剂及其用途，不改变激发液的前提下，解决目前使用常规吖啶酯原料进行发光反应时，改变仪器设定的发光曲线读取及判定条件时，发光曲线出现异常，且短时间内产生光信号较少的问题。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于化学发光免疫分析的添加剂，其特征在于，所述添加剂包括试剂R1、防腐剂和缓冲液；

所述缓冲液为Good’s缓冲液，所述试剂R1为二甲基聚硅氧烷、二甲基硅油、羟基硅油、聚醚型聚硅氧烷或纳米二氧化硅的一种或几种；

所述添加剂中试剂R1的体积分数为1％-20％。

进一步地，所述添加剂还包括试剂R2，所述试剂R2为丙二醇、乙二醇、1，2-丙二醇或一缩二丙二醇中的一种或几种，所述添加剂中试剂R2的体积分数为5-30％。

进一步地，所述试剂R1为二甲基聚硅氧烷，所述二甲基聚硅氧烷的粘度为5cst。

进一步地，所述添加剂中二甲基聚硅氧烷的体积分数为10％。

进一步地，所述试剂R2为1，2-丙二醇，所述添加剂中1，2-丙二醇的体积分数为20％。

进一步地，所述防腐剂为Proclin300、叠氮钠、凯松或庆大霉素的一种。

进一步地，所述添加剂中防腐剂的体积分数为0.01-0.2％。

进一步地，所述Good’s缓冲液为MES、PIPES、MOPSO、MOPS、HEPES、HEPPSO或EPPS缓冲液中的一种，所述Good’s缓冲液的浓度为10-100mM，所述Good’s缓冲液的pH为6.0-8.0。

一种用于化学发光免疫分析的添加剂的用途，所述添加剂用于吖啶酯化学发光免疫检测体系中，将所述添加剂加入到含有吖啶酯偶联抗体的标记试剂中；

所述添加剂与含有吖啶酯偶联抗体的标记试剂的体积比为0.1％-5％。

进一步地，所述添加剂与含有吖啶酯偶联抗体的标记试剂的体积比为0.5％-2％。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的一种用于化学发光免疫分析试剂的添加剂，可以用于吖啶酯化学发光免疫检测体系中，将添加剂用于稀释含有吖啶酯偶联抗体的标记试剂，可以改善直接化学发光系统吖啶酯类化合物的发光特征性曲线，可以短时间内产生更多的光信号，同时可以降低免疫反应之外的非特异性信号，提升未参与反应的吖啶酯类化合物的清洗效果，实现提升检测系统的灵敏度及精密度的需求。

2、本发明提供的一种用于化学发光免疫分析的添加剂，用于稀释含有吖啶酯标记的抗体试剂，与固相试剂和样本进行免疫分析检测时，能够适应仪器在不同参数设定下的检测体系，避免检测过程中出现发光曲线异常而报错问题，提高了检测效率。

3、本发明提供的一种用于化学发光免疫分析的添加剂，具有分散性好，长期储存不会出现析出问题，同时能够增强免疫反应的效果，避免由于吖啶酯类化合物标记抗体后，抗体蛋白表面增加了疏水性作用，影响抗原抗体特异性识别。

4、本发明提供的一种用于化学发光免疫分析的添加剂，所述添加剂中还包括防腐剂，在不影响化学发光反应的前提下能够保持添加剂的长久储存。

附图说明

图1为本发明实施例一中各方案溶液用于化学发光免疫检测的发光信号图；

图2为本发明实施例二中检测低值CV时报告错误的异常发光曲线图；

图3为本发明实施例二中检测低值CV时的正常发光曲线图；

图4为现有技术中在吖啶酯激发液中加入表面活性剂对产光效率的影响。

具体实施方式

为了更清楚说明本发明的技术方案，具体的实施方式说明如下：

实施例一

本实施例中选取的待标记的检测抗体为单克隆心肌肌钙蛋白I(cTnI)抗体1，cTnI测定试剂盒采用直接化学发光技术的双位点夹心免疫测定法进行检测：

先将样本和标记有吖啶酯的cTnI检测抗体混合，孵育后加入交联有抗cTnI捕获抗体的磁性微球混合，形成“捕获抗体交联的磁性微球-抗原-吖啶酯标记的检测抗体”复合物。然后进行分离清洗，添加酸性试剂和碱性试剂到反应混合物中，激发化学发光反应。样本中cTnI的浓度和系统检测的相对发光值(RLU)成比例，通过校正曲线可计算心肌肌钙蛋白I的浓度。

在本实施例中，吖啶酯标记物存储液的配制方法如下：

使用无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)将吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)溶解后定容至浓度5～10mg/ml，作为标记物存储液。

吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1的制备方法如下：

吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)标记物分子上存在活性基团琥珀酰亚胺(-NHS)，可特异性的与待标记抗体上的伯氨基团直接反应，不需用化学交联剂。

具体步骤为：

将上述制备的标记物存储液以摩尔比10：1的比例与单克隆cTnI抗体1直接混合，以100mM PBS缓冲液pH7.4作为反应介质，37℃孵育2小时。

孵育后的标记物抗体混合液使用脱盐柱PD Multi Trap G-25进行分离纯化，得到吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1。

配制如下方案溶液：

方案1：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃，稀释液pH为6.5；

方案2：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃、0.01％二甲基聚硅氧烷(黏度为5cSt)，稀释液pH为6.5；

方案3：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃、0.02％二甲基聚硅氧烷(黏度为5cSt)，稀释液pH为6.5；

方案4：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃、0.04％二甲基聚硅氧烷（黏度为5cSt)，稀释液pH为6.5；

方案5：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃、0.08％二甲基聚硅氧烷(黏度为5cSt)，稀释液pH为6.5；

方案6：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃、2％Triton X-100，稀释液pH为6.5；

预激发液：4.5mM硝酸溶液、含1.32％过氧化氢、0.05％Triton X-100。

激发液：1.4％氢氧化钠溶液，含2％聚乙二醇单辛基苯基醚。

使用上述方案1-方案6配制的溶液，将吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1稀释至100ng/ml。采用全自动免疫检验系统用预激发液与激发液对发光标记物进行激发化学发光反应。吸取稀释后的各标记抗体液10ul置于空的反应杯中，在光度计中原位发光，以激发液加入后以0.1s时间间隔，采用光度计对单位间隔内的发光量进行统计，从而得到发光的开始时间以及总发光量，具体结果如图1所示。

根据图1的结果，可以看出，使用方案1配制的溶液对吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1进行稀释后，激发液加入到与预激发液混合发光标记物偶联的抗体中之后，通过激发液的激发和化学发光分析仪检测，在激发后的一段时间内获得的总发光量是最少的；而使用方案2一方案6配制的溶液对吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1进行稀释后，通过激发液的激发和化学发光分析仪检测，能更快激发得到光信号；与含有高浓度Triton X-100的添加剂相比，含有较低浓度二甲基聚硅氧烷（黏度为5cSt)的添加剂溶液便能够激发到更多的光信号，检测仪器为迎凯i2910全自动化学发光免疫分析仪。

因此，在使用仪器检测前，使用含有一定浓度二甲基聚硅氧烷(黏度为5cSt)的添加剂能够改变吖啶酯标记的抗体在激发液激发后的发光特征性曲线。以激发后累计获得95％发光总量的时间为例，各方案的数据如下表1所示。

表1

结合图1和表1的结果，使用方案2-方案5配制的溶液对吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1进行稀释后，通过激发液的激发和化学发光分析仪检测，能够在更短时间内累计获得95％发光总量。

实施例二

本实施例以cTnI测定试剂盒采用直接化学发光技术的双位点夹心免疫测定法进行检测的检测过程为例。

其中，固相载体为磁性微球，捕获抗体和检测抗体为抗人cTnI小鼠单克隆抗体，发光物为吖啶酯。

第一步反应，将样本和交联有抗人心肌肌钙蛋白I捕获抗体的磁性微球混合，样本中的心肌肌钙蛋白I结合到磁性微球上。洗涤后进行第二步，加入标记有吖啶酯的抗人心肌肌钙蛋白I检测抗体，形成“捕获抗体交联的磁性微球-抗原-吖啶酯标记的检测抗体”复合物。再次洗涤后，添加激发液到反应混合物中，激发化学发光反应。样本中心肌肌钙蛋白I的浓度和系统检测的相对发光值(RLU)成比例，通过校正曲线可计算心肌肌钙蛋白I的浓度。

捕获抗体交联的磁性微球的制备：

固相磁珠的偶联选用羧基修饰的磁性微球，采用EDC/NHS交联法对磁性微球进行活化及偶联。

具体步骤为：

向10mi，10mg/ml的磁性微球(粒径：3μm)中加入10mg/ml的EDC 50ul和10mg/ml的NHS 50ul，充分混合，以100mM MES pH6.0缓冲液作为反应介质，37℃培育20分钟，得到活化后的磁性微球。

向10mg/ml活化后的10ml磁性微粒加入10mg需要交联的单克隆cTnI抗体2，以100mM MES pH6.0缓冲液作为反应介质，37℃震荡培育2小时，得到包被有单克隆cTnI抗体2的磁性微粒。

磁力吸附去除上清，加入0.5％的BSA和0.9％NaCL，pH8.0的Tris溶液，对宝贝有单克隆cTnI抗体2的磁性微粒进行重悬，水浴超声震散沉淀物，震荡封闭4小时。

之后使用磁分离设备将缓冲液中分散的磁珠吸附，使磁珠与缓冲液分离，使用移液器吸弃液体部分，加入新的上述缓冲液之后利用涡旋混匀将磁珠重悬，再加水浴超声2分钟清洗3次。最终一次，使用稀释液将弃掉上清的偶联有单克隆cTnI抗体2的磁性微球定容至0.5mg/ml。稀释液组分为：20mM/L PBS，0.5％CASEIN、0.2％TW-20、0.9％NaCl、5％海藻糖、0.1％NaN₃，稀释液pH为7.4。以此偶联有单克隆cTnI抗体2的磁性微球的溶液作为固相试剂组分。

配制添加剂母液I：：20mM MOPS缓冲液pH7.0，其中加入10％二甲基聚硅氧烷(5cSt)，0.1％防腐剂PC-300。

配制添加剂母液II：：20mM MOPS缓冲液pH7.0，其中加入10％二甲基聚硅氧烷(5cSt)，20％l，2-丙二醇，0.1％防腐剂PC-300。

配制下述溶液：

溶液1：基础稀释液：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃，pH值为6.5；

溶液2：在溶液1中加入0.2％添加剂母液I；

溶液3：在溶液1中加入0.5％添加剂母液I；

溶液4：在溶液1中加入2.0％添加剂母液I；

溶液5：在溶液1中加入0.2％添加剂母液II；

溶液6：在溶液1中加入0.5％添加剂母液II；

溶液7：在溶液1中加入2.0％添加剂母液II；

上述加入添加剂母液的比例为体积百分比。

使用上述配制的溶液1-溶液7，分别作为实施例一中吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1的稀释溶液，将吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1稀释为300ng/ml，作为标记试剂组分使用。

以本实施例制备的固相试剂组分搭配标记试剂组分作为一组，在迎凯i2910全自动化学发光免疫分析仪上使用。具体搭配组合如下表2所示：

表2

以样本稀释液：20mM PBS，4％BSA，2％H海藻糖，5mM EDTA，0.05％PC-300，稀释液pH为7.2，将肌钙蛋白I纯品配制成5000pg/ml、30pg/ml以及空白样本(样本稀释液)并作为样本进行检测。重复测定10次，得出10次测量结果的RLU值，根据公式(1)计算变异系数CV。

用空白样本作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值，计算其平均值

和标准差(SD)，得出

将

所对应的RLU值代入空白样本与30pg/ml浓度-RLU值两点回归拟合得到的一次方程中得到对应的浓度值，即为空白限(LOB)。

式中：CV-变异系数；S-标准偏差；Xi-第i次的测定值；

-试剂测定结果的平均值；i-1，2，3，……，n；n-测定次数。

将迎凯i2910全自动化学发光免疫分析仪的发光曲线读取及判定条件设为以下三种情况：

情况一：读取10000ms时间内发光信号峰的面积为发光强度，曲线闪光峰值时间设为2750ms±250ms。

情况二：读取8000ms时间内发光信号峰的面积为发光强度，曲线闪光峰值时间设为2700ms±100ms。

情况三：读取6000ms时间内发光信号峰的面积为发光强度，曲线闪光峰值时间设为2800ms±100ms。

具体的，使用上述标记试剂组分和固相试剂组分搭配的组合在检测仪器的发光曲线读取及判定条件为情况一的参数条件下，进行上述实验条件对灵敏度和CV的影响如下表3所示。

表3

通过上表3的数据可以了解到，使用含有添加剂的稀释液对标记抗体进行稀释后和固相试剂组分以及空白样本在仪器上检测时，能够降低检测数据的CV值，同时其检测的最小浓度呈降低的趋势，说明该仪器的灵敏度在增高。

使用上述组合在情况二的参数条件下，使用肌钙蛋白I纯品配制成的5000pg/ml、30pg/ml及空白样本进行精密度测试。

以组合1也即基础稀释液作为标记抗体稀释液，在免疫分析仪进行测试过程中，全程报告错误，无法检测低值、高值以及灵敏度相关数据，无法正常进行后续的样本检测。虽然使用组合2、组合3、组合5、组合6进行检测时同样有一定几率发生报错，但是在一定的浓度范围内，使用组合4及组合7便可顺利进行测试，且组合7的精密度优于组合4。

具体的，不同实验条件对灵敏度和CV的影响如下表4所示。

表4

使用上述组合在检测仪器设定发光曲线读取及判定条件为情况三的参数条件下，使用肌钙蛋白I纯品配制成的5000pg/ml、30pg/ml及空白样本进行精密度测试。

以组合1、组合2及组合5作为标记抗体稀释液，在进行测试过程中，低值部分出现发光曲线形状错误；使用组合7作为标记抗体稀释液的时候有一定几率发生发光预点亮错误。使用组合3、组合4及组合6，可顺利进行测试，但组合6的结果优于组合3、组合4。

具体的，该不同实验条件对灵敏度和CV的影响如下表5所示。

表5

实施例三

配制添加剂母液III：：20mM MOPS缓冲液pH7.0，其中加入5％二氧化硅(单分散，无孔，400纳米)，0.1％叠氮钠。

配制添加剂母液Ⅳ：：20mM MOPS缓冲液pH7.0，其中加入5％二氧化硅(单分散，无孔，400纳米)，，30％乙二醇，0.1％叠氮钠。

配制下述溶液：

溶液a：基础稀释液：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃，pH值为6.5；

溶液b：在溶液1中加入0.5％添加剂母液III；

溶液c：在溶液1中加入2.0％添加剂母液III；

溶液d：在溶液1中加入5.0％添加剂母液III；

溶液e：在溶液1中加入0.5％添加剂母液Ⅳ；

溶液f：在溶液1中加入2.0％添加剂母液Ⅳ；

溶液g：在溶液1中加入5.0％添加剂母液Ⅳ。

上述加入添加剂母液的比例为体积百分比。

使用上述配制的溶液a-溶液g，分别作为实施例一中吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1的稀释溶液，将吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1稀释为300ng/ml，作为标记试剂组分使用。

以实施例二制备的固相试剂组分搭配标记试剂组分作为一组，分别迎凯i2910全自动化学发光免疫分析仪的发光曲线读取及判定条件设为情况二时使用。具体搭配组合如下表6所示：

表6

其他操作步骤同实施例二，进行免疫分析检测时，不同实验条件对灵敏度和CV的影响如下表6所示。

表6

以组合A、组合B及组合E作为标记抗体稀释液，在进行测试过程中，整个检测过程报错；使用组合D、组合F和组合G作为标记抗体稀释液可顺利进行检测。

因此，使用常规稀释液稀释标记抗体进行检测，出现报错的现象可以通过使用含有不同浓度添加剂的稀释液稀释标记抗体，进而顺利开展实验。

实施例四

配制添加剂母液V：20mM MOPS缓冲液pH7.0，其中加入0.1％二甲基聚硅氧烷(5cSt)，3％1，2-丙二醇，0.1％防腐剂PC-300。

配制下述溶液：

溶液①：基础稀释液：50mM MES缓冲液、0.5％BSA、0.2％TW-20、0.9％NaCl、0.05％NaN₃，pH值为6.5；

溶液②：在溶液1中加入0.01％添加剂母液V；

溶液③：在溶液1中加入0.5％添加剂母液V；

溶液④：在溶液1中加入10.0％添加剂母液V。

上述加入添加剂母液的比例为体积百分比。

使用上述配制的溶液①-溶液④，分别作为实施例一中吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1的稀释溶液，将吖啶酯标记的单克隆cTnI抗体1稀释为300ng/ml，作为标记试剂组分使用。

以实施例二制备的固相试剂组分搭配标记试剂组分作为一组，分别在迎凯i2910全自动化学发光免疫分析仪的发光曲线读取及判定条件设为情况二时使用。具体搭配组合如下表6所示：

表6

其他操作步骤同实施例二，在迎凯i2910全自动化学发光免疫分析仪进行免疫分析，具体的，不同实验条件对灵敏度和CV的影响如下表6所示。

表6

在上述组合条件下进行检测时，仪器均出现报错的情况，无法进行常规检测。

Claims

1.一种用于化学发光免疫分析的添加剂，其特征在于，所述添加剂包括试剂R1、防腐剂和缓冲液；

所述添加剂中试剂R1的体积分数为1%-20%。

2.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂还包括试剂R2，所述试剂R2为丙二醇、乙二醇、1，2-丙二醇或一缩二丙二醇中的一种或几种；所述添加剂中试剂R2的体积分数为5-30%。

3.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述试剂R1为二甲基聚硅氧烷，所述二甲基聚硅氧烷的粘度为5cst。

4.根据权利要求3所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂中二甲基聚硅氧烷的体积分数为10%。

5.根据权利要求2所述的添加剂，其特征在于，所述试剂R2为1，2-丙二醇，所述添加剂中1，2-丙二醇的质量分数为20%。

6.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述防腐剂为Proclin300、叠氮钠、凯松或庆大霉素的一种。

7.根据权利要求6所述的添加剂，其特征在于，所述添加剂中防腐剂的体积分数为0.01-0.2%。

8.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，所述Good’s缓冲液为MES、PIPES、MOPSO、MOPS、HEPES、HEPPSO或EPPS缓冲液中的一种，所述Good’s缓冲液的浓度为10-100mM，所述Good’s缓冲液的pH为6.0-8.0。

9.根据权利要求1-8任一项所述的添加剂的用途，其特征在于，所述添加剂用于吖啶酯化学发光免疫检测体系中，将所述添加剂加入到含有吖啶酯偶联抗体的标记试剂中；

所述添加剂与含有吖啶酯偶联抗体的标记试剂的体积比为0.1%-5%。

10.根据权利要求9所述的添加剂的用途，其特征在于，所述添加剂与含有吖啶酯偶联抗体的标记试剂的体积比为0.5%-2%。