JPH0472564A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野Ｊ 本発明は不溶性担体粒子を用いる発光免疫測定法に関す
る。

［従来の技術１ 従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が種々の疾病
の早期検出法や、極微量の物質の検出法として知られて
いる。高感度な免疫測定法には種々の方法があり、抗体
又は抗原に標識物質として放射性同位体（ＲＩ）、酵素
、蛍光物質、発光物質などを結合して用いるラジオイム
ノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）
、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ
（ＬＩＡ）などに分類される。また、ラテックス等の不
溶性担体粒子に担持された抗体または抗原と、それに対
応する抗原または抗体とを反応させその反応に伴う反応
混合物の透過光の変化から抗原抗体反応の速度を測定す
る方法（ＬＰＩＡ）が知られている。

［発明が解決しようとする問題点Ｊ しかし、かかる従来技術においては種々の問題を持つ。

たとえば、ＲＩＡは■の取り扱いおよび廃棄に対する制
約がある。ＬＰＩＡは簡便性、操作性などに優れた方法
ではあるが、検出感度の改良が望まれている。ＥＩＡ、
　ＦＩＡなとは取り扱いの安全性については有利である
が、検出感度はＲＩＡに若干劣る。また、ＥＩＡは酵素
反応を伴うため取扱いもＦＩＡはと簡便ではない。

ＦＩＡにおける検出感度の改良法として、特開昭５９　
＋　１２２９５０号公報には蛍光性微粒子を用いた免疫
測定法が述べられている。即ち、通常ＦＩＡで用いられ
る標識抗原または標識抗体のかわりに蛍光物質を含有さ
せたコロイド粒子に抗原または抗体を担持させることに
より、蛍光物質の数を増やすことができるため、高感度
な検出が期待される。

しかしながら、赤血球凝集反応をはじめとして、ラテッ
クス凝集反応、ゼラチン凝集反応などのいわゆる粒子凝
集反応では非特異的な凝集を伴う非特異反応が特に多く
見られることが知られている。即ち、被測定抗原または
抗体が試料液中に全く存在しないにもかかわらず存在す
るように、また実際に存在するよりも多く存在するよう
に観測してしまう現象である。この原因としては粒子と
固相との非特異的吸着、粒子同志の非特異的凝集、また
非特異的に反応する物質を含むいわゆる非特異検体によ
る反応などが知られている。そのため、粒子の凝集を利
用する方法でなくとも粒子を用いる限りにおいては、こ
れらの非特異的反応に注意する必要がある。

たとえば、非特異検体の例として、間節リウマチ患者の
多くには、血中にリウマトイド因子とよばれる物質が存
在する。これは一種の自己抗体で、イムノグロブリンの
内のＩｇＧ画分と反応する性質を持ったＩｇＭまたはＩ
ｇＧタイプ抗体であり、他種動物のＩｇＧとも交差反応
を示すものである。

従って、ＩｇＧを担持させたラテックスではりウマトイ
ド因子による非特異凝集が起きることになる。

そこで、現在、実用化されているラテックス凝集法を利
用した試薬では、ＩｇＧ分子から、リウマトイド因子と
反応するＦｃ部分をペプシン酵素処理して除去すること
により非特異反応を低減させている。また、Ｆ　（ａｂ
’　）２と反応する検体も少数存在するので、この場合
は反応系に免疫しでいないウサギから調製したＦ　（ａ
ｂ’　）２を加え、ラテックス試薬のＦ（ａｂ’　）２
と反応する前に吸収することで対処している。（Ｍｉｔ
ｓｕｂｉｓｈｉ　Ｋａｓｅｉ　Ｒ＆　Ｄ　Ｒｅｖｉｅｗ
、　２，１０５　（１９８８あるいは、酢酸緩衝液など
で検体を前処理することにより、必要でない蛋白質を除
くことで、非特異反応を除く方法もある。

上記の方法で非特異反応の出現はかなり低減できるもの
の、まだ非特異反応を完全に抑えることは不可能である
し、粒子自体に起因する吸着は避けられない。また、非
特異反応を測定する方法も開発されているわけではない
。そこで、ＲＩＡやＥＩＡなと非特異反応が比較的少な
いといわれる方法で得た測定値と比べて値が解離するも
のを非特異反応と呼んでいるが現状である。

従って、前記特開昭５９−１２２９５０号公報などの蛍
光性微粒子を用いる免疫測定法を高感度検出法として実
用化するためには、これら非特異反応を抑制する方法ま
たは検出する手段を開発、併用することが重要な要件と
なる。

［課題を解決するだめの手段１ 本発明者らは、上記問題点を解決すべく鋭意検討した結
果、不溶性担体粒子を標識することにより高感度化しな
がら、かつ粒子の非特異的反応を検出できる新しい発光
免疫測定法を開発した。

即ち、本発明の要旨は、 （１）　（ａ）　（ｉ）蛍光またはリン光を発する第一
の色素および（ｉｉ）抗体または抗原を不溶性担体粒子
に担持してなる第一の色素標識粒子と（ｂ）　（ｉ）前
記第一の色素とは発光波長、励起波長または発光寿命の
異なる、蛍光またはリン光を発する第二の色素および（
ｉｉ）第一の粒子に担持された抗体または抗原が試料中
の抗原または抗体と特異的に結合する部位を含まない物
質を不溶性担体粒子に担持してなる第二の色素標識粒子
とを（Ｃ）　　被測定抗原または抗体を含む試料液と反
応させ、抗原抗体反応に伴う第一の色素標識粒子による
シグナルの変化および非特異反応に伴う第二の標識粒子
によるシグナル変化を測定することによって、抗原抗体
反応中の非特異反応を検出することを特徴とする免疫測
定法 に存する。

以下、本発明の詳細な説明をする。

本発明で用いる標識色素は、蛍光またはリン光を発する
色素である。本発明では２種の色素をそれぞれ不溶性担
体粒子に担持させ、第一の色素粒子を免疫測定用に、第
二の色素標識粒子を非特異反応または吸着の検出用に用
いるため、第一、第二の色素は共存する系で独立に測定
できることが必要である。従って、本発明で用いる第一
、第二の色素に求められる条件としては、 たとえば、 １）発光のピーク波長が互いに離れていること。

２）励起光の波長が互いに離れていること。

３）発光の寿命が互いに離れていること。

などが挙げられる。

１）の例としては、たとえば希土類キレート化合物で元
素とじ七ユーロピウム（Ｅｕ）とサマリウム（Ｓｍ）を
用いると２種の抗原または抗体を同時に測定できること
がＣ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３３．４
８　（１９８７）に示唆されているが、Ｅｕ（発光極大
６１５ｎｍ）とテルビウム（Ｔｂ）（発光極大５４５ｎ
ｍ　）の組み合わせの方が発光のピーク波長より離れて
いる（約７０ｎｍ）。希土類キレート化合物は発光スペ
クトルがシャープなため分離計測には適しているが、バ
ックグラウンドや互いの色素の共存の影響を補正するな
どして測定できる組み合せであれば、他の蛍光、リン光
性色素でも問題はない。通常、フルオレセインイソチオ
シアネート（発光極大５２０ｎｍ）、テトラメチルロー
ダミンイソチオシアネート（発光極大５７０ｎｍ）、フ
ィコビリプロティン（フィコシアニン：発光極大６５０
ｎｍ、フィコエリスリン二発光極大５８０ｎｍ　）など
の蛍光色素の組み合わせが使用できることが多い。

２）の場合も多くの発光性色素で、励起光の異なるもの
が知られているが、通常、励起光も発光と同様に幅広い
スペクトルを示すので励起の最大値から多少離れていて
も発光を観測する二とが可能なものが多い。従って、実
際には、１）と２）の組み合せ、つまり、発光のピーク
波長が互いに離れていて、かつ、励起光の波長も互いに
離れている色素の組み合わせによって、より正確な測定
を行うことができる。これらの組み合わせとしては、Ｅ
ｕとＴｂの組み合わせ等が挙げられる。

３）の例としては、フルオレセインやローダミンなどの
通常の蛍光色素（寿命数−数１０ｎｓｅｃ　）と希土類
キレート化合物（寿命数１０ｐｓｅｃ−散ｍ５ｅｃ　）
の組み合わせや、上託フルオレセインやローダミン等の
通常の短寿命の蛍光色素とエオシンなどのリン光色素の
組み合わせ、Ｅｕキレート化合物（寿命数１００ｐｓｅ
ｃ　）とＴｂキレート化合物（寿命数１０ｐｓｅｃ−数
ｍ５ｅｃ）の組み合わせなど考えられる。

色素標識をおこなう不溶性担体粒子としては反応させる
時に用いる液体媒体に実質的に不溶性で０．０１−１０
　ｐｍ、好ましくは０．０５−３　ｐｍの平均粒径を有
するものが用いられる。

相体粒子の材質は、ポリスチレン、スチレシーブタジエ
ン共重合体のような乳化重合により得られる有機高分子
のラテックス、あるいはシリカ、シリカ−アルミナのあ
ような無機酸化物、リポソームのような脂質重合物、赤
血球のような生体成分、ゼラチン、あるいは金コロイド
のような金属コロイド粒子等が用いられる。

不溶性担体粒子への標識色素の担持方法には、化学的に
結合させる方法、粒子を重合して作成する際に色素を加
えて粒子内部に閉じ込める方法、あらかじめ、タンパク
質やペプチドなどと色素を結合させておいてからそのタ
ンパク質、ペプチドを粒子に担持する方法がある。たと
えば、特開昭５４−１０１４３９号公報には、希土類キ
レートをＴＯＰＯ（トリー■−オクチルホスフィンオキ
シト）との協同抽出法を利用して有機高分子のラテック
スの内部に閉じ込める方法が述べられている。これに従
って作成した標識粒子は標識強度、安定性共に良好であ
った。

本発明の第一の標識担体粒子は、上記の第一の標識色素
と被測定抗原または抗体と同種または相対する抗原また
は抗体を担持している。第二の標識担体粒子には第一の
色素とは共存下で測定できる第二の色素と被測定抗原ま
たは抗体とは特異的に結合する部位を含まない物質を担
持している。

不溶性担体粒子に抗原または抗体あるいは被測定抗原ま
たは抗体とは特異性に結合する部位を含まない物質担持
させる（感作する）方法は、既に多くの方法が提案され
ている。例えば、担体に対し感作したい物質を物理的に
吸着させる方法、カンプノング剤により化学的に変性さ
せた後に化学結合させる方法、また、スペーサー分子を
はさんで結合させることもよく知られている。抗体を感
作した上に抗原を結合させて抗原感作粒子とすることも
できる。また重合による粒子作成時に抗原を混入して粒
子内に取り込む方法、他のタンパク質に化学結合法を用
いて結合させた後でそのタンパク質を物理的または化学
的に感作する方法などかある。

不溶性担体粒子に抗原または抗体あるいは被測定抗原ま
たは抗体とは特異的に反応する部位を含まない物質を感
作するのと同様に、固相に抗原、抗体を担持させる方法
もそれぞれの固相にあわせて、種々の方法が応用されて
いる。この場合も物理吸着による方法と化学結合による
方法がある。

抗体としては、通常ＩｇＧが用いられているが、ヘフシ
ン、パパインなどの消化酵素あるいはジチオスレイトー
ル、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いて、Ｆ　
（ａｂ’　）２、Ｆａｂ、　Ｆａｂ’などに低分子化し
たものを用いても良い。また、ＩｇＧだけでなくＩｇＭ
あるいはこれをＩｇＧと同様の処理により低分子化した
フラグメントを用いても良い。また、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体のいずれも適用できる。

モノクローナル抗体の適用については、Ｂ型肝炎ウィル
ス表面抗原のように、繰」返し構造を持つタンパク質に
対してはモノクローナル抗体は１種以上で使用できる。

また繰り返し構造がなくても認識エピトープの異なる２
種以上のモノクローナル抗体を組み合わせて使用すれば
適用できる。

一方、抗原としてはたとえばタンパク質、ポリペプチド
、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、遺伝子工学的に産
生された組換え蛋白質、薬物等様々のものが挙げられる
。

第二の標識粒子に感作されるものには、被測定抗原また
は抗体と特異的に反応する部位を含まない免疫グロブリ
ン画分、それらの誘導体または他の蛋白質、または担体
粒子の安定化のために粒子表面を覆う界面活性剤やポリ
マーなどがある。たとえば、第一の標識粒子に、被測定
抗原をウサギに免疫して得た抗血清がら精製したＦ　（
ａｂ’　）２を感作する場合は、第二の標識粒子には、
免疫していないウサギから精製したＦ　（ａｂ’　）２
を感作することが望ましい。あるいは、第一の標識粒子
に、遺伝子組み換え技術を用いて製造した抗原を感作す
る場合は第二の標識粒子には、培養液中に存在する他の
蛋白質を感作すると、抗原中に存在する不純物に由来す
る非特異反応を検出することが可能となる。

不溶性担体粒子に、標識色素と感作したい物質を担持す
る順序には特に制限はないが、標識色素を担持した後、
感作したい物質を担体するのが好ましい。

第一の標識粒子と第二の標識粒子の使用量には特に制限
はないが、一般に、反応液中で、０．０００１−１重量
％、好ましくは０．００１−０．１重量％のものが用い
られる。第一の標識粒子と第二の標識粒子の使用する比
にも特に制限はないが、第二の粒子には、第一の粒子の
非特異的反応を抑える働きも考えられるので、通常、第
一の粒子と等量またはそれ以上を用いることが好ましい
。使用量の比較は、第一と第二の担体粒子の粒径が異な
る場合は、表面積で換算することが通常行われる。

特異的免疫反応に伴う第一の色素標識粒子によるシグナ
ルの変化および非特異的免疫反応に伴う第二の色素標識
粒子によるシグナルの変化を測定するには公知の方法を
採用できる。例えば、反応チューブ、マイクロタイター
ウェル、ガラスビーズ、ラテックスやゼラチンなどの微
粒子、磁性体を含有したポリスチレンやセルロースなど
の微粒子、メンブレン、フィルターなどを固相として用
い、サンドインチ法、阻害法などにより、固相と被測定
抗原または抗体を介して結合した各色素標識粒子を測定
することによりシグナルの増加を計測する方法と、固相
と結合しなかった、残りの各色素標識粒子を測定するこ
とによりシグナルの減少を計測する場合がある。

マイクロタイターウェルを固相としたときの、サンドイ
ツチ法による抗原測定を操作例として以下に述べる。

被測定抗原に対する１次抗体を固定化しておいた固相（
マイクロタイターウェル）に被測定抗原を含む標準液ま
たは試料液と反応緩衝液を加え、一定時間インキュベー
トする。洗浄した後、被測定抗原に対する２次抗体（Ｆ
（ａｂ’）２）を感作した第一の色素標識粒子（例えば
Ｅｕキレート化合物含有粒子）と、免疫していない動物
から得たＦ　（ａｂ’　）２を感作した第二の色素標識
粒子（例えば、Ｔｂキレート化合物含有粒子）を混合し
、反応緩衝液で希釈した、抗原と反応した上記固相を加
え、一定時間インキュベートする。この段階で、固相と
結合しなかった、残りの各色素標識粒子（以下、上清と
する）のシグナルを（第一の標識のシグナルは励起光３
４５　ｎｍのときの６１６ｎｍの蛍光強度から、第二の
標識粒子のシグナルは励起光２９６　ｎｍのときの５４
６　ｎｍの蛍光強度から）それぞれ得る。この場合、時
間分解蛍光測定を行えば、さらに蛍光測定の特異性は向
上する。被測定抗原を介しておこる固相と第一の標識粒
子との特異的結合ならびに第一および第二の標識粒子と
の非特異的吸着により、上積中のシグナルの変化は蛍光
強度の減少として測定される。

上清を除去した後、洗浄し、被測定抗原を介して固相に
結合している第−及び第二の標識粒子の蛍光強度を上記
の上清の場合と同様に測定する。

被測定抗原を介した固相と第一の標識粒子との特異的結
合ならびに第一および第二の標識粒子との非特異的吸着
により、固相におけるシグナルの変化は蛍光強度の増加
として測定される。

測定する時は、そのまま測定しても良いし、ＳＤＳやＴ
ｗｅｅｎ　２０などの界面活性剤を用いて結合した標識
粒子を固相から離して液中に浮遊させた状態で測定する
こともできる。

上清測定の場合、第一の標識粒子の蛍光強度の減少量が
被測定抗原との特異的反応量と固相との非特異的反応量
の和をあられし、第二の標識粒子の蛍光強度の減少量が
固相との非特異的反応量をあられす。

固相結合量の測定の場合、第一の標識粒子の蛍光強度の
増加量が被測定抗原との結合による特異的反応量と固相
との非特異的反応量の和をあられし、第二の標識粒子の
蛍光強度の増加量が固相との非特異的反応量をあられす
。

シグナル変化の測定法としては、上記のように固相との
結合したものを測定する代わりに、抗原抗体反応により
凝集した色素標識粒子を濾過して未反応の粒子を分離し
て得られる凝集粒子のシグナル変化を測定してもよい。

固相に結合した標識粒子と、結合していない標識粒子と
を分離する際、通常は、上記のように洗浄を何度か繰り
返すことが行われるが、磁性体を含有した固相の場合は
磁力を用いれば、分離を比較的簡便に行うことができる
。また、フィルター等で濾過することにより簡便に分離
する方法も知られている。

磁性体を含有した固相を用いた場合の抗原測定を操作例
として以下に述べる。

被測定抗原にｔｌする１次抗体を固定化しておいた、磁
性体を含有した固相（以下、Ｍｇ固相とする。）、第一
の標識粒子および第二の標識粒子を混合懸濁後、被測定
抗原を含む標準液または試料液と反応緩衝液を加え、一
定時間インキュベートする。磁石を用いてＭｇ固相及び
Ｍｇを固相を含む反応凝集物を沈殿させ、上清サンプル
と沈殿サンプルに分離する。

上清サンプルからは、固相と反応しなかった、残りの各
色素標識粒子のシグナルが得られ、該シグナルの変化は
蛍光強度の減少として測定される。

沈殿サンプルからは、固相と反応した各色素標識粒子の
シグナルが得られ、該シグナルの変化は、蛍光強度の増
加として測定される。

その他、特願平１−３２９０９３号公報には、長寿命の
発光色素を担持した微粒子の免疫反応に従う凝集を発光
偏光度の変化として検出する方法が述べられている。こ
の方法に従えば、反応液を分離することもなく簡便に測
定することが可能である。

［実施例］ 以下、実施例をもとにして、より詳細な説明を行うが、
本発明はその要旨をこえない限り、実施例に測定される
ものではない。

［実施例月 希土類キレートのＥｕ　−ＴＴＡテノイルトリフルオロ
アセトン化合物１×１０　モルと、ＴＯＰＯ（前述）２
×１０モルをアセトン４０ｇに溶解した後、粒径０．２
２ｐｍのポリスチレンラテックス（Ｄｏｗ社）３ｇを水
４０ｍ１に懸濁させたものを混合し、エバポレーターに
よりアセトンを除去することにより、ラテックス粒子に
Ｅｕキレート化合物をＴＯＰＯと協同抽出しＥｕ標識粒
子を作製した。

同様に、希土類キレート化合物のＴｂ−Ｐ’Ｉムピバロ
イルトリフルオロアセトン化合物５×１０モルと、ＴＯ
ＰＯＩＩＸＩＯモルを粒径０．４９７ｐｍのポリスチレ
ンラテックス（Ｄｏｗ社）３ｇに含有させることにより
Ｔｂ標識粒子を作製した。

Ｅｕ標識ラテックスにウサギ抗ＨＢｓ　（Ｂ型肝炎ウィ
ルス表面）抗原Ｆ　（ａｂ’　）２を感作した後、ＢＳ
Ａで処理することにより粒子を安定化させた。

Ｔｂ標識ラテックスに正常ウサギＦ（ａｂ”）２を感作
した後、ＢＳＡで処理することにより粒子を安定化させ
た。

平均粒径１．５ｐｍの磁性体含有ポリスチレンラテック
ス（以下Ｍｇラテックスとする。ローヌプーラン社）に
ウサギ抗ＨＢｓ抗原Ｆ（ａｂ“）２を感作した後、ＢＳ
Ａで処理することにより粒子を安定化させた。

Ｅｕ標識ラテックス０．０２％、Ｔｂ標識ラテックス０
．２％、Ｍｇラテックス０．２％の混合懸濁液を作製し
ラテックス試薬とした。

抗原として、遺伝子組換え法で産生されたＨＢｓ抗原を
トリス緩衝液で希釈して０．１７．５．３５．７０．１
４０．２８０Ｕ／ｍｌの標準液を作製した。

抗原溶液６０μｍ、　ＢＳＡ含有トリス緩衝液４６０μ
ｌ、上記ラテックス試薬８０μｌを加えた後、撹拌し、
１０分間免疫反応を行わせた。

次に、磁石を用いてＭｇラテックス及びＭｇラテックス
を含む反応凝集物を沈殿させ、上清サンプルとする。残
りの沈殿は数回水で洗浄し、最後に０．１％ＳＤＳ溶液
に分散させ、沈殿サンプルとする。

日立蛍光分光光度系Ｆ　−４０１０を用いて、励起光３
４５ｎｍ、蛍光６１６ｎｍ　（Ｅｕ　）励起光２９６ｎ
ｍ、蛍光５４６ｎｍ　（Ｔｂ　）の蛍光を、上記上清、
沈殿の両サンプルについて測定した。結果を表１、図１
に示した。

抗原溶液中の抗原濃度が高くなるにつれて、Ｅｕの蛍光
強度は、上清サンプルでは小さく、沈殿サンプルでは大
きくなることがわかる。それに文士して、Ｔｂの蛍光強
度は、上記抗原溶液のような標準溶液では、非特異的な
凝集を生じることは少なく、しかも常にほぼ一定した小
さな値を示していることがわかる。

［実施例２１ 実施例１で用いたラテックス試薬（Ｅｕ標識、Ｔｂ標識
、Ｍｇラテックス混合懸濁液）を用いる。

試料溶液として、正常ヒト血清（ＥＩＡ法にてＨＢｓ抗
原陰性が確認されているもの）、非特異検体（ＬＰＩＡ
法にて非特異的凝集を示しＥＩＡ法にてＨＢｓ抗原陰性
が確認されているもの）、ＨＢｓ抗原陽性検体（ミドリ
十字社ＨＢｓ抗原。ＬＰＩＡ法にて陽性を確認した）を
使用した。

実施例１と同様の反応、及び分離操作を行い、上清、沈
殿の両サンプルを作製し、ＥｕとＴｂの蛍光濃度をそれ
ぞれ測定した。結果を、表２、図２に示した。

表２ ＨＢｓ抗原のカットオフ値をＩＯＵ／ｍｌとすると、実
施例１の結果から、Ｅｕの測定値が、上清では１３６．
９以下、沈殿では７．４０４以上がＨＢｓ抗原陽性とな
る。また、非特異反応のモニターであるＴｂの測定値は
、同様に実施例１の結果から、上清では４５．０以下、
沈殿では５．０以上が非特異反応が起こっていると考え
られる。

従って、Ｅｕの測定値からＨＢｓ抗原陽性となった時は
、Ｔｂの測定値を考慮することにより、真の陽性である
か、判定を保留するかを判断する。判定保留の場合、通
常は、確認用抗体で試料液中の抗原を吸収する操作によ
り陽性であるがどうが判定することが行われる。

以上の判定を本実施例の各種検体にあてはめてみると、
沈殿サンプルで、非特異検体のうちの１例でＨＢｓ抗原
陽性と判定されてしまったが、残りの検体では、陽性検
体の場合はＥｕの測定から抗原陽性、Ｔｂの測定から非
特異反応なしということがわかる。陰性検体の場合はＥ
ｕの測定値が陰性を示すか、あるいはＥｕの測定値が陽
性の領域に入った時はＴｂの測定値も非特異反応を示し
ている。従って、Ｅｕの測定から陰性と判定された時は
Ｔｂの測定値を併せて考慮することにより、真の陽性を
より正確に判定できる。（表３参照）

【図面の簡単な説明】

図１は、ＨＢｓ抗原濃度に対する蛍光強度の変化を示す
図であり、図中、○は上清サンプルのＥｕキレート化合
物の蛍光強度、・は沈殿サンプルのＥｕキレート化合物
の蛍光強度、△は上清サンプルのＴｂキレート化合物の
蛍光強度、ムは沈殿サンプルのＴｂキレート化合物の蛍
光強度を示す。 図２は、試料溶液として正常ヒト血清、非特異（ＨＢｓ
抗原陰性）検体およびＨＢｓ抗原陽性検体を使用した、
上清サンプルおよび沈殿サンプルの蛍光強度を示す図で
あり、○、・、△およびムは図１と同義を示す。 ［発明の効果］ 本発明の方法によれば、高感度な免疫測定が可能なだけ
でなく、粒子の非特異反応をも検出可能である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）（ｉ）蛍光またはリン光を発する第一の色
   素および（ｉｉ）抗体または抗原を不溶性担体粒子に担
   持してなる第一の色素標識粒子と （ｂ）（ｉ）前記第一の色素とは発光波長、励起波長ま
   たは発光寿命の異なる、蛍光またはリン光を発する第二
   の色素および（ｉｉ）第一の粒子に担持された抗体また
   は抗原が試料中の抗原または抗体と特異的に結合する部
   位を含まない物質を不溶性担体粒子に担持してなる第二
   の色素標識粒子とを （ｃ）被測定抗原または抗体を含む試料液と反応させ、
   抗原抗体反応に伴う第一の色素標識粒子によるシグナル
   の変化および非特異反応に伴う第二の色素標識粒子によ
   るシグナルの変化を測定することによって、 抗原抗体反応中の非特異反応を検出することを特徴とす
   る免疫測定法。