CN115343484B - 一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,本发明采用水溶性CdTe QDs为化学发光试剂,特定浓度、特定pH的KMnO4的PBS溶液作为激发剂,构建纳米粒子发光的CdTe QDs/KMnO4化学发光体系,基于半自动化测试方式实现TSH的超快速与高灵敏检测,达到单分子检测水平。
Description
技术领域
本发明涉及一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,属于化学发光免疫分析技术领域。
背景技术
在新型冠状病毒疫情不断侵袭的情况下,病毒的超快速、高灵敏检测已成大趋势。目前实用型新冠检测手段主要通过核酸扩增技术实现,耗时长且装置复杂。作为一种具有高灵敏度、高特异性、线性范围宽和仪器设备简单等优点体外诊断技术,化学发光免疫分析(CLIA)已在体外诊断领域取代传统的酶联免疫分析,正在商业化免疫分析领域获得广泛应用。商业化CLIA均采用分子型发光物作为标记物,在分析测定过程中仅能实施分子反应型化学发光,如,鲁米诺、吖啶酯和金刚烷等。由于分子型发光试剂只能参与一次化学发光反应,辐射信号弱,现阶段商业化CLIA尚不能实现对目标物的高灵敏与超快速测定。
量子点(QDs)是一类尺寸在1-20 nm之间、由IV、II-VI,IV-VI或III-V元素组成的纳米材料。量子点能够被激发光反复激发、产生强光致发光,自1998年以来一直是光致发光探针的明星材料(Science, 1998, 281, 2016),已在荧光型生化分析与单分子检测领域获得了广泛应用(Coord. Chem. Rev. 2014, 263, 86. )。量子点作为化学发光试剂与发光体的研究始于2004年(Nano Lett. 2004, 4, 693),并于近年来开始被用做化学发光免疫分析的标记物。然而受检测条件与实验技术等原因的限制,以量子点为发光试剂的CLIA的检测时间通常大于1小时,与个体化医疗中应有的“快速”的特性不符,检测灵敏度亦尚未达到高灵敏乃至单分子检测水平。
开发一种超快速与高灵敏化学发光免疫分析方法,同时不降低检测稳定性颇为重要。
发明内容
为了克服现有技术的不足,尤其是当前CLIA难以实现对目标物的高灵敏与超快速检测的局限性,本发明提供一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法。
本发明采用水溶性CdTe QDs为化学发光试剂,特定浓度、特定pH的 KMnO4的PBS溶液作为激发剂,构建纳米粒子发光的CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系,实施对目标物的超快速与高灵敏检测,达到了传统化学发光免疫分析难以企及的单分子检测水平,该检测方法检测时间特别短,检测时间小于等于6min,可以以超快的速度实现促甲状腺激素的检测,同时具有高灵敏性,检测范围宽,检测限低。
术语说明:
TSH:促甲状腺激素,英文名thyroid stimulating hormone,简称TSH。
一抗(TSH-Ab1):本发明一抗(Ab1)指生物素标记的促甲状腺激素抗原 (TSH) 的对应抗体,本发明对于上述抗原对应的单克隆抗体效果更好。
二抗(TSH-Ab2):本发明二抗指TSH抗原和一抗的对应二抗。
EDC:1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,英文名为1-(3-Dimethylaminopropyl)-ethylcarbodiimide hydrochloride,简称EDC。
NHS:N-羟基丁二酰亚胺,英文名为1-Hydroxypyrrolidine-2,5-dione,简称NHS。
MCE:β-巯基乙醇,又名2-巯基乙醇,英文名为β-Mercaptoethanol,简称MCE。
PBS:磷酸盐缓冲溶液的简称,主要成分包括K2HPO4、KH2PO4、KCl。
PBST:磷酸盐吐温缓冲溶液的简称,主要成分包括K2HPO4、KH2PO4、KCl、Tween-20。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,检测时间小于等于6min,包括步骤如下:
(1)免疫复合物的制备
1)纯化后的水溶性CdTe NCs复溶于PBST溶液中,得到CdTe NCs分散液,向分散液中加入含有EDC和NHS的溶液活化羧基10-15分钟,加入稀释后的MCE,室温下反应4-8分钟,反应后加入TSH二抗溶液,混匀,孵育1-4h,甘氨酸封闭,除去未连接的量子点和TSH二抗,得到CdTe QDs标记的TSH二抗,分散于PBST溶液中,得到CdTe QDs标记的TSH二抗溶液;
2)向链霉亲和素标记的磁珠溶液中加入生物素化TSH一抗溶液,震荡反应,清洗后复溶于PBST溶液,得到连接TSH一抗的磁珠溶液;
3)将CdTe QDs标记的TSH二抗溶液、连接TSH一抗的磁珠溶液与标准已知浓度的TSH抗原溶液混合反应,得到免疫复合物溶液;
(2)将免疫复合物溶液置于磁场中磁分离,加入KMnO4的PBS溶液作为激发液,KMnO4的浓度为1-3 mmol/L,使用NRM-CL-200半自动化学发光仪采集化学发光信号,绘制化学发光信号和抗原浓度的标准曲线;
(3)以待测目标TSH抗原替换标准已知浓度的TSH抗原溶液,按步骤(1)的方法构建免疫复合物,然后按步骤(2)的方法进行测试,得到目标电化学发光曲线;根据所得电化学发光曲线上最高光强和步标准曲线,得到待测样品溶液中的TSH抗原。
根据本发明优选的,步骤1)中,PBST溶液为1 mL pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液,CdTe NCs分散液的浓度为0.5-3 μmol/L。
根据本发明优选的,步骤1)中,含有EDC和NHS的溶液为20 μL 100 mg/mL EDC溶液与20 μL 100 mg/mL NHS溶液混合的混合液。
根据本发明优选的,步骤1)中,稀释后的MCE的浓度为1-2mol/L,稀释后的MCE的加入量为1-5μL。
根据本发明优选的,步骤1)中,TSH二抗溶液的浓度为5-15 μg/mL,最为优选的,TSH二抗溶液的浓度为10μg/mL;溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液。
根据本发明优选的,步骤1)中,TSH二抗溶液的加入量为40-70μL,最为优选的,TSH二抗溶液的加入量为50μL,所述孵育为37 ℃下反应2小时,利用TSH二抗上的氨基与量子点上活化的羧基偶联。
根据本发明优选的,步骤1)中,甘氨酸封闭为加入10 μL 1%的甘氨酸封闭羧基活化位点2-3小时,离心,使用pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液洗涤3次除去未连接的量子点和TSH二抗。
根据本发明优选的,步骤1)中,PBS缓冲溶液的配置方法如下:
称取0.1867 g K2HPO4、0.0259 g KH2PO4和0.0749 g KCl溶于100 mL去离子水中配制成pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液。
根据本发明优选的,步骤1)中,PBST溶液的配置方法如下:
向100 mL pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液中加入50 μL Tween-20,混匀后制得PBST溶液。
根据本发明优选的,步骤1)中,CdTe QDs标记的TSH二抗溶液浓度为0.5-3 μmol/L。
根据本发明优选的,步骤2)中,水溶性CdTe NCs为本领域现有技术。
根据本发明优选的,步骤2)中,链霉亲和素标记的磁珠溶液浓度为0.6-0.8 mg/mL,溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;生物素化TSH一抗溶液浓度为1-4 μg/mL,溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;链霉亲和素标记的磁珠溶液与生物素化TSH一抗溶液的体积比为(1-2):(1-2)。
根据本发明优选的,步骤2)中,震荡反应为37 ℃下震荡反应30 min,置于磁力架,清洗为使用pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液清洗5次,复溶于100 μL PBS溶液中,得到浓度为1-2 mg/mL的连接TSH一抗的磁珠溶液。
根据本发明优选的,步骤3)中,标准已知浓度的TSH抗原溶液溶剂为pH=7.4的10mmol/L PBS缓冲溶液;CdTe QDs标记的TSH二抗溶液、连接TSH一抗的磁珠溶液与标准已知浓度的TSH抗原溶液体积比为(2-4):(0.5-2):(1-3)。
根据本发明优选的,步骤3)中,具体的,5-15 μL 连接TSH一抗的磁珠溶液、15-25μL 的TSH抗原水溶液与130-150μL PBST缓冲溶液混匀,加入20-40μL CdTe QDs标记的TSH二抗溶液混匀,室温下震荡反应4-5分钟,得到免疫复合物溶液。
本发明在室温下反应5min内即可成功得到免疫复合物,反应时间短。
根据本发明优选的,生物素化TSH一抗、TSH二抗、TSH抗原为常规是市购产品,上海墨迪斯医疗技术有限公司有售;链霉亲和素标记的磁珠为常规是市购产品,赛默飞世尔科技(中国)有限公司有售。
根据本发明优选的,步骤(2)中,KMnO4的PBS溶液中KMnO4的浓度为1-2mmol/L,KMnO4的PBS溶液的加入量为20-40 μL,pH=7-7.4。
最为优选的,KMnO4的PBS溶液中KMnO4的浓度为1.5mmol/L,pH=7.4。
发明人在实验中意外发现,本发明KMnO4的浓度是超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的关键,浓度过大或过小均会导致发光时间延长,导致检测时间大于6min,甚至大于1小时,本发明KMnO4的浓度使得检测时间特别短,可以以极快的速度实现促甲状腺激素的检测。
根据本发明优选的,步骤(2)中,KMnO4的PBS溶液是按如下方法制得:
10 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液溶解0.0024 g KMnO4,得到浓度为1.5mmol/L的KMnO4的PBS溶液。
本发明检测的NRM-CL-200半自动化学发光仪由南京诺尔曼生物技术有限公司提供。
本发明的技术特点及优点:
1、通常化学发光免疫分析的反应时间长为1-3小时,本发明采用水溶性CdTe QDs为化学发光试剂,特定浓度、特定pH的 KMnO4的PBS溶液作为激发剂,构建纳米粒子发光的CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系,实施对目标物的超快速与高灵敏检测,达到了传统化学发光免疫分析难以企及的单分子检测水平,该检测方法检测时间特别短,本发明的免疫复合物反应时间在5min内,采集化学发光信号时间在50s内,两者时间不超过6min。
2、传统化学发光免疫分析的灵敏度难以达到单分子检测水平,本发明的化学发光免疫分析在0.0075 fg/mL-1fg/mL的浓度范围内表现出良好的线性关系,检出限为0.0075fg/mL,突破了自动化与半自动化化学发光免疫分析无法实施单分子检测的现状。
3、目前商业化化学发光免疫分析均采用的分子型发光试剂,该试剂发生反应后变为其他物质,无法持续化学发光,辐射信号弱;本发明采用纳米材料CdTe QDs作为发光试剂,特定浓度的 KMnO4的PBS溶液作为激发剂,持续发生化学发光反应,以实施发光信号放大的策略,提升检测灵敏度至单分子水平,并有效缩短检测时间。
4、本发明化学发光信号值测试均采用南京诺尔曼公司的NRM-CL-200半自动化学发光仪进行测试。所使用的CdTe QDs发光体化学发光强度强,发光时间短,发光时间为0.5秒内,属于闪光型化学发光。
附图说明
图1为实验例1中不同浓度的KMnO4对发光强度的影响图;横坐标为KMnO4浓度,纵坐标为化学发光强度。
图2为实验例2不同pH值的激发液对发光强度的影响图;横坐标为pH值,纵坐标为化学发光强度。
图3为实验例3中所制的CdTe QDs的化学发光光强曲线;横坐标为时间,纵坐标为化学发光强度。
图4为实验例3中所制的CdTe QDs的化学发光光谱曲线;横坐标为波长,纵坐标为化学发光强度。
图5为实验例4中所制的CdTe QDs-Ab2的化学发光光强曲线;横坐标为时间,纵坐标为化学发光强度。
图6为实验例5中TSH抗原检测的工作曲线;横坐标为TSH抗原浓度,纵坐标为化学发光强度。
图7为实验例6中TSH抗原浓度为1 fg/mL时的化学发光光强图;横坐标为时间,纵坐标为化学发光强度。
图8为实验例7中不同种类的激发液组成的化学发光体系的发光强度图;横坐标为时间,纵坐标为化学发光强度。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明,但不限于此。
实施例中生物素化TSH一抗、TSH二抗、TSH抗原为常规是市购产品,上海墨迪斯医疗技术有限公司有售;链霉亲和素标记的磁球为常规是市购产品,赛默飞世尔科技(中国)有限公司有售。
实施例中化学发光光强曲线有南京诺尔曼生物技术有限公司生产的NRM-CL-200半自动化学发光免疫分析仪采集获得。
实施例中水溶性CdTe NCs是按如下方法制得:
(1)取1.6 mL 0.1 mol/L 的CdCl2∙2H2O,加入去离子水稀释至50 mL,室温下搅拌;
(2)向步骤(1)中加入293.6 mg六偏磷酸钠;
(3)向步骤(2)中加入36.4 μL 巯基丙酸;
(4)向步骤(3)中加入1 M 氢氧化钠,调节pH至8.0;
(5)向步骤(4)中加入5.3 mg亚碲酸钠,100 ℃下回流10 min;
(6)向步骤(5)中加入2.4 mL水合肼,100 ℃下继续回流24 h。
实施例中PBS缓冲溶液的制备:称取0.1867 g K2HPO4、0.0259 g KH2PO4和0.0749g KCl溶于100 mL去离子水中配制成pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;
PBST缓冲溶液的制备:向配制的pH=7.4的100 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液中加入50 μL Tween-20,混匀后得到pH=7.4的10 mmol/L PBST缓冲溶液。
实施例1
超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,检测时间小于等于6 min,包括步骤如下:
(1)免疫复合物的制备
1)将1 mL CdTe原液纯化后复溶于1 mL pH 7.4 的10 mmol/L PBST溶液中,加入20 μL 100 mg/mL EDC溶液与20 μL 100 mg/mL NHS溶液混合的混合液,活化羧基10-15分钟;加入1.5 μL 浓度为1.45mol/L 的MCE稀释液,混匀,室温下反应5分钟;加入50 μL 10μg/mL的TSH二抗溶液,混匀37 ℃下反应2小时,利用TSH二抗上的氨基与量子点上的羧基偶联;加入10 μL 1%的甘氨酸封闭羧基活化位点2-3小时,离心,使用PBST溶液洗涤3次以除去多余的TSH二抗,重新分散于1 mL PBST,得到浓度为1μmol/L CdTe QDs标记的TSH二抗溶液;
2)取200 μL 0.75 mg/mL 链霉亲和素标记的磁珠溶液,加入250 μL 2 μg/mL生物素化TSH一抗溶液,37 ℃下震荡反应30 min,置于磁力架,使用pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液清洗5次,复溶于100 μL PBS溶液中,得到浓度为1 mg/mL的连接TSH一抗的磁珠溶液;
3)取10 μL 连接TSH一抗的磁珠溶液置于96孔板中,加入20 μL TSH抗原溶液,加入140 μL PBST缓冲溶液,混匀,加入30 μL CdTe QDs标记的TSH二抗溶液,混匀,室温下震荡5分钟;得到免疫复合物溶液;
(2)将免疫复合物溶液置于磁场中磁分离,加入KMnO4的PBS溶液作为激发液,KMnO4的PBS溶液中KMnO4的浓度为1.5mmol/L,pH=7.4,使用NRM-CL-200半自动化学发光仪采集化学发光信号,绘制化学发光信号和抗原浓度的标准曲线;
(3)以待测目标TSH抗原替换标准已知浓度的TSH抗原溶液,按步骤(1)的方法构建免疫复合物,然后按步骤(2)的方法进行测试,得到目标电化学发光曲线;根据所得电化学发光曲线上最高光强和步标准曲线,得到待测样品溶液中的TSH抗原。
实施例2
同实施例1所述超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,不同之处在于:
步骤(2)中,KMnO4的PBS溶液,pH=7.2。
实施例3
同实施例1所述超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,不同之处在于:
步骤(2)中,KMnO4的PBS溶液中KMnO4的浓度为1.8mmol/L。
实施例4
同实施例1所述超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,不同之处在于:
步骤(2)中,KMnO4的PBS溶液中KMnO4的浓度为2.0mmol/L。
实验例1
称取不同含量的KMnO4,溶于pH= 7.4,10 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液,超声溶解、混匀,得到0.5mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L不同浓度KMnO4的PBS溶液,作为激发液;
纯化后的水溶性CdTe NCs复溶于1 mL pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液中,得到浓度为1μmol/L的CdTe NCs分散液;
分别取200μL不同浓度KMnO4的PBS溶液,与100μL浓度为1μmol/L的CdTe NCs分散液混匀,得到CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系。
使用NRM-CL-200半自动化学发光仪采集化学发光信号,不同浓度KMnO4的PBS溶液与CdTe NCs分散液组成的CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系发光强度如图1所示。
由图1可知,0.5mM~15mM的激发液均能产生一定强度的化学发光信号,随KMnO4浓度的增加,化学发光信号逐渐增强,1.5 mM的KMnO4的PBS溶液,作为激发液,化学发光信号最强,但是KMnO4的浓度超过2mM,化学发光信号逐渐降低,可见KMnO4浓度浓度过大或过小均会使化学发光信号降低。
实验例2
称取KMnO4,溶于不同pH,10 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液,超声溶解、混匀,得到不同pH,KMnO4浓度为1.5 mM 的KMnO4的PBS溶液,作为激发液;
纯化后的水溶性CdTe NCs复溶于1 mL pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液中,得到浓度为1μmol/L的CdTe NCs分散液;
分别取200μL不同pH,KMnO4浓度为1.5 mM 的KMnO4的PBS溶液,与100μL浓度为1μmol/L的CdTe NCs分散液混匀,得到CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系。
使用NRM-CL-200半自动化学发光仪采集化学发光信号,不同pH的PBS溶液与CdTeNCs分散液组成的CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系发光强度如图2所示。
由图2可知,pH=7-7.4的KMnO4的PBS溶液化学发光信号强,尤其是pH=7.4,化学发光信号强,可见,激发液pH=7.4效果最好,小于7,大于7.4均使化学发光信号降低。
实验例3
取200μL pH= 7.4, KMnO4浓度为1.5 mM的KMnO4的PBS溶液,与100μL浓度为1μmol/L的CdTe NCs分散液混匀,得到CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系,置于化学发光反应杯中,使用NRM-CL-200 半自动化学发光免疫分析仪采集化学发光光强曲线及化学发光光谱曲线;
CdTe QDs/ KMnO4化学发光体系的化学发光光强曲线,如图3所示,化学发光光谱曲线,如图4所示。
由图3可知,本发明的激发液注入到反应杯瞬间即可与CdTe QDs反应产生化学发光。发光时间为0.5秒内,属于闪光型化学发光体系。由图4可知,本发明的CdTe QDs产生化学发光辐射波段位于700 nm左右。
实验例4
取实施例1步骤1)得到的浓度为1μmol/L CdTe QDs标记的TSH二抗溶液100 μL,置于化学发光反应杯中,使用NRM-CL-200 半自动化学发光免疫分析仪采集注入激发液后的化学发光光强曲线。
CdTe QDs标记的TSH二抗的化学发光光谱曲线,如图5所示。
由图5可知,CdTe QDs标记的TSH二抗产生化学发光辐射波段相比于CdTe QDs产生化学发光辐射波段发生红移,位于720 nm左右,说明CdTe QDs标记TSH二抗标记成功。
实验例5
实施例1步骤3)中,配制不同浓度的TSH抗原溶液,分别为0.0075 fg/mL、0.01 fg/mL、0.025 fg/mL、0.1 fg/mL、0.5 fg/mL、1 fg/mL,形成免疫复合物溶液;将免疫复合物溶液置于磁场中磁分离,20 μL不同浓度免疫复合物溶液加入30 μL pH= 7.4, KMnO4浓度为1.5 mM的KMnO4的PBS溶液,作为激发液,转移至化学发光反应杯中,采集化学发光光谱曲线及化学发光信号,将所得不同TSH抗原浓度的信号值绘制成工作曲线。
不同浓度的TSH抗原溶液的化学发光光谱曲线及工作曲线如图6所示;由图6可知,本发明的化学发光免疫分析检测TSH的方法的灵敏度可达0.0075 fg/mL,检测范围宽。
实验例6特异性检测
同实施例1所述的检测方法,不同之处在于:
将TSH抗原替换为空白、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)、甲胎蛋白抗原(AFP)、糖类抗原(CA125)及癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)、甲胎蛋白抗原(AFP)、糖类抗原(CA125)与TSH抗原的混合物;
不同抗原的的电化学发光响应如图7所示。由图7所示,本发明的检测方法为对TSH抗原选择性良好,并且其他抗原蛋白不对TSH抗原产生干扰,表明本发明的检测方法对TSH抗原检测特异性高。
实验例7
配制不同种类激发液:
称取2.4mgKMnO4,溶于pH= 7.4,10 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液,超声溶解、混匀,得到1mmol/L的 KMnO4的PBS溶液,作为激发液1;
称取3.263mg K3[Fe(CN)6],溶于pH= 7.4,10 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液,超声溶解、混匀,得到1mmol/L的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液,作为激发液2;
称取2.282mg (NH4)2S2O8,溶于pH= 7.4,10 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液,超声溶解、混匀,得到1 mmol/L的(NH4)2S2O8的PBS溶液,作为激发液3;
称取109.644mg Ce(NH4)2(NO3),溶于pH= 6.6,10 mL 10 mmol/L CPBS缓冲溶液,超声溶解、混匀,得到20 mmol/L的 Ce(NH4)2(NO3)的PBS溶液,作为激发液4;
3mol/L的H2O2溶液作为激发液5;
分别取上述不同种类的激发液(激发液1-5)200μL与100μL浓度为1μmol/L的CdTeNCs分散液混匀,分别置于化学发光反应杯中,使用NRM-CL-200半自动化学发光仪采集化学发光信号,不同激发液分别与CdTe NCs分散液组成的化学发光体系,不同种类的激发液最优条件下的发光强度如图8所示。由图8所示,KMnO4的PBS溶液化学发光信号最强。
Claims (7)
1.一种超快速与高灵敏检测促甲状腺激素的化学发光免疫分析方法,检测时间小于等于6min,包括步骤如下:
(1)免疫复合物的制备
1)纯化后的水溶性CdTe NCs复溶于PBST溶液中,得到CdTe NCs分散液,向分散液中加入含有EDC和NHS的溶液活化羧基10-15分钟,加入稀释后的MCE,室温下反应4-8分钟,反应后加入TSH二抗溶液,混匀,孵育1-4h,甘氨酸封闭,除去未连接的量子点和TSH二抗,得到CdTe QDs标记的TSH二抗,分散于PBST溶液中,得到CdTe QDs标记的TSH二抗溶液;
2)向链霉亲和素标记的磁珠溶液中加入生物素化TSH一抗溶液,震荡反应,清洗后复溶于PBST溶液,得到连接TSH一抗的磁珠溶液;
3)将CdTe QDs标记的TSH二抗溶液、连接TSH一抗的磁珠溶液与标准已知浓度的TSH抗原溶液混合反应,得到免疫复合物溶液;
(2)将免疫复合物溶液置于磁场中磁分离,加入KMnO4的PBS溶液作为激发液,KMnO4的浓度为1.5mmol/L,KMnO4的PBS溶液的加入量为20-40 μL,pH=7.4,使用NRM-CL-200半自动化学发光仪采集化学发光信号,绘制化学发光信号和抗原浓度的标准曲线;
KMnO4的PBS溶液是按如下方法制得:
10 mL 10 mmol/L PBS缓冲溶液溶解0.0024 g KMnO4,得到浓度为1.5mmol/L的KMnO4的PBS溶液;
(3)以待测目标TSH抗原替换标准已知浓度的TSH抗原溶液,按步骤(1)的方法构建免疫复合物,然后按步骤(2)的方法进行测试,得到目标电化学发光曲线;根据所得电化学发光曲线上最高光强和步标准曲线,得到待测样品溶液中的TSH抗原;
PBS缓冲溶液的配置方法如下:
称取0.1867 g K2HPO4、0.0259 g KH2PO4和0.0749 g KCl溶于100 mL去离子水中配制成pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;
步骤1)中,PBST溶液的配置方法如下:
向100 mL pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液中加入50 μL Tween-20,混匀后制得PBST溶液。
2.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析方法,其特征在于,步骤1)中,PBST溶液为1mL pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液,CdTe NCs分散液的浓度为0.5-3 μmol/L;
含有EDC和NHS的溶液为20 μL 100 mg/mL EDC溶液与20 μL 100 mg/mL NHS溶液混合的混合液;
稀释后的MCE的浓度为1-2mol/L,稀释后的MCE的加入量为1-5μL;
TSH二抗溶液的浓度为5-15 μg/mL,溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;
TSH二抗溶液的加入量为40-70μL,所述孵育为37 ℃下反应2小时,利用TSH二抗上的氨基与量子点上活化的羧基偶联;
甘氨酸封闭为加入10 μL 1%的甘氨酸封闭羧基活化位点2-3小时,离心,使用pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液洗涤3次除去未连接的量子点和TSH二抗。
3.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析方法,其特征在于,步骤1)中,CdTe QDs标记的TSH二抗溶液浓度为0.5-3 μmol/L。
4.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析方法,其特征在于,步骤2)中,链霉亲和素标记的磁珠溶液浓度为0.6-0.8 mg/mL,溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;生物素化TSH一抗溶液浓度为1-4 μg/mL,溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;链霉亲和素标记的磁珠溶液与生物素化TSH一抗溶液的体积比为(1-2):(1-2)。
5.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析方法,其特征在于,步骤2)中,震荡反应为37 ℃下震荡反应30 min,置于磁力架,清洗为使用pH= 7.4,浓度为10 mmol/L的PBST溶液清洗5次,复溶于100 μL PBS溶液中,得到浓度为1-2 mg/mL的连接TSH一抗的磁珠溶液。
6.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析方法,其特征在于,步骤3)中,标准已知浓度的TSH抗原溶液溶剂为pH=7.4的10 mmol/L PBS缓冲溶液;CdTe QDs标记的TSH二抗溶液、连接TSH一抗的磁珠溶液与标准已知浓度的TSH抗原溶液体积比为(2-4):(0.5-2):(1-3)。
7.根据权利要求1所述的化学发光免疫分析方法,其特征在于,步骤3)中,具体的,5-15μL 连接TSH一抗的磁珠溶液、15-25 μL 的TSH抗原水溶液与130-150μL PBST缓冲溶液混匀,加入20-40μL CdTe QDs标记的TSH二抗溶液混匀,室温下震荡反应4-5分钟,得到免疫复合物溶液。
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