CN110283190A - 荧光配合物及制备方法、荧光探针及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光配合物及制备方法，荧光探针及制备方法和应用。其中荧光配合物氨基化的三联吡啶四羧酸铕，其制备方法为将化合物1与N‑Boc‑丁炔‑4‑胺、CuI在惰性气氛下反应得到化合物2；将化合物2溶于CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中反应得到化合物3；将化合物3与EuCl3·6H2O反应得到氨基化的三联吡啶四羧酸铕；荧光探针由荧光配合物与三聚氯氰反应得到。荧光探针可以实现对蛋白质分子的标记，具有水溶性好、稳定性高、灵敏度高、简便快速等优势，可应用于时间分辨荧光生化分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种荧光配合物及制备方法、荧光探针及制备方法和应用。
背景技术
用具有强荧光的试剂或荧光生成试剂作为标记物进行的免疫分析称为荧光免疫分析法(FIA)。其中，基于稀土离子（包括Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）的荧光配合物由于具有非常特殊的荧光性质，如超长的荧光寿命（微秒级至毫秒级）、200纳米以上的Stocks位移以及尖锐的荧光发射谱带，而被广泛的作为荧光标记探针应用于时间分辨荧光生化分析技术领域。相比于一般的荧光分析技术，时间分辨荧光生化分析法如时间分辨荧光免疫分析法、时间分辨生物成像分析法等，已在临床医学检测、生命科学以及环境科学等领域得到了很多成功的应用。
在时间分辨荧光生化分析中，最关键的就是可以对如抗体、抗原、蛋白质及核酸等一些生物分子进行标记的稀土荧光配合物。理想的稀土荧光配合物应具有以下几个特征：（1）配合物分子与稀土离子之间的配位足够稳定；（2）稀土荧光配合物荧光较强（高量子产率和大摩尔吸光系数）；（3） 具有良好的水溶性；（4）荧光寿命长；（5）易于生物分子标记。到目前为止，可用于生物分子荧光标记的稀土配合物荧光探针主要包括三价铕离子与-二酮类配体的荧光配合物及三价铕及铽离子与三联吡啶四羧酸类配体的荧光配合物（文献1：I.Hemmilä,V.-M.Mukkala,Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.,2001,38,441；文献2：J.L.Yuan,G.L.Wang, Trends Anal.Chem.,2006,25,490）。三价铕离子与-二酮类配体的荧光配合物虽然发光效率更高，且具有氯磺酰基作为标记生物分子的活性基团，但是其水溶性较差的缺点一直限制着其实际应用的性能。
目前已有的基于三联吡啶四羧酸衍生物配体的稀土铕配合物用于生物分子的标记时，多数以异硫氰基或羧基作为标记过程的活性基团，研究表明，此类配合物不仅在生物标记方面具有很好的应用价值，其在功能性纳米稀土荧光材料的制备及复杂样品的时间分辨荧光生物成像方面也具有很好的应用前景（文献3：Mukkala, V. M., Helenius, M.,Hemmilä, I., Kankare, J., Takalo, H., Helv Chim Acta, 1993， 76(3), 1361-1378；文献4：Yuan, J., Tan, M., Wang, G., J Lumin, 2004, 106(2), 91-101.）。但是这两类方法各有其局限性：（1）三联吡啶四羧酸配体的异硫氰基衍生物虽然可以直接用于生物标记，但是其制备过程复杂，且使用到了有毒的二氯硫化碳；（2）以三联吡啶四羧酸结构中的一个羧酸，通过制备NHS活性脂中间体的方法使稀土配合物与生物分子偶联的方法虽然简便易行，但是这种偶联方法占用了配体中用于与稀土离子配位的羧基，会影响配合物的稳定性。
三聚氯氰具有三个反应活性不同的氯原子，在不同温度或酸碱度的条件这三个氯原子会逐步与胺发生反应。由于三聚氯氰中的一个氯原子被占用后，第二个氯原子在室温下仍具有很高的活性，这一性质使得三聚氯氰被广泛应用于有机合成或皮质类固醇、免疫球蛋白和氨基酸的标记反应中（文献5：Fierz‐David, H. E., Matter, M., J Soc DyersColour, 1937, 53(11), 424-436；文献6：Chayen, R., Gould, S., Harell, A., &Stead, C. V., Anal biochem, 1971, 39(2), 533-535；文献7：Blakeslee, D., Baines,M. G. J Immunol Methods, 1976, 13(3-4), 305-320.）。
需要寻求一种具有氨基的三联吡啶四羧基衍生物配体，通过三聚氯氰桥连，可以实现对蛋白质分子的标记的荧光配合物，并在此基础上建立时间分辨荧光免疫测定技术及时间分辨荧光生物成像测定技术中的应用方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种荧光配合物及其制备方法，荧光探针及其制备方法和应用，该荧光配合物为氨基化的三联吡啶四羧酸铕，荧光探针为氨基化的三联吡啶四羧酸铕通过三聚氯氰桥连获得的具有活性氯原子的衍生物，可以实现对蛋白质分子的标记，具有水溶性好、稳定性高、灵敏度高、简便快速等优势。其制备方法操作简便，操作温和。本申请的荧光探针可应用于时间分辨荧光免疫测定技术和时间分辨荧光生物成像测定技术，应用广泛。
为了实现上述目的，本发明提供了一种荧光配合物，所述荧光配合物为氨基化的三联吡啶四羧酸铕，所述氨基化的三联吡啶四羧酸铕具有以下式的结构式：
。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的荧光配合物的制备方法，包括以下步骤：
A1、将化合物1与N-Boc-丁炔-4-胺、CuI在惰性气氛下反应得到化合物2；
A2、将所述化合物2溶于CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中反应得到化合物3；
A3、将所述化合物3与EuCl3·6H2O反应得到NSTTA-Eu3+配合物，即为氨基化的三联吡啶四羧酸铕；
所述化合物1具有以下式的结构式：
所述化合物2具有以下式的结构式：
所述化合物3具有以下式的结构式：
。
上述的制备方法，优选的，所述A1具体为：将化合物1、N-Boc-丁炔-4-胺和CuI混合，在惰性气氛下，以80℃回流反应10h~16h得到化合物2。
上述的制备方法，优选的，所述化合物1、N-Boc-丁炔-4-胺和CuI的质量比为5∶1∶0.5。
上述的制备方法，优选的，所述S2中所述CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中CH2Cl2和CF3COOH 的体积比为0.9~1.1∶0.9~1.1。
上述的制备方法，优选的，S2中所述反应的温度为20~35℃，反应时间为12h~24h。
上述的制备方法，优选的，所述A3具体为：
A3-1、将化合物3与EuCl3·6H2O混合，调节pH为5.5~6.5，得到反应体系1；
A3-2、将所述反应体系1在20~35℃下搅拌1h以上；然后调节pH为8.5得到反应体系2；
A3-3、在所述反应体系2中加入有机溶剂沉淀，得到NSTTA-Eu3+配合物。进一步的，所述有机溶剂为丙酮、乙醇、乙腈或四氢呋喃。
上述的制备方法，优选的，所述化合物3与EuCl3·6H2O的质量比为1.5∶1。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种荧光探针，所述荧光探针由所述的荧光配合物与三聚氯氰反应得到。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种所述的荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
B1、将NSTTA-Eu3+配合物与三聚氯氰在pH为4.5~5.5的弱酸性缓冲溶液中反应得到反应体系3；
B2、在所述反应体系3中加入有机溶剂沉淀，得到CYC-NSTTA-Eu3+配合物，即为荧光探针。进一步的，所述有机溶剂为丙酮、乙醇、乙腈或四氢呋喃。
上述的制备方法，优选的，所述NSTTA-Eu3+配合物与三聚氯氰的质量比为1∶2~3。
基于一个总的技术构思 ，本发明还提供了一种所述的荧光探针在时间分辨荧光生化分析中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种荧光配合物：氨基化的三联吡啶四羧酸铕。该结构的配体，可以与铕离子形成稳定的强荧光性配合物，并且具有较好的水溶性，因而更具有广泛应用的潜力。可在4℃下与三聚氯氰偶联形成具有活性氯原子的衍生物，该衍生物可以在室温及弱碱性（pH=9.0）的硼酸缓冲溶液中以共价键合的形式与含有氨基的蛋白质（抗体、抗原、亲和素、链霉亲和素等）、氨基酸、肽、核酸等生物分子结合，当在溶液中加入三价铕或铽（氯化物）离子后，由于三价铕铽离子在溶液中可与结合在生物分子上的配位体形成稳定的强荧光性配合物，进而可得到铕或铽荧光配合物标记的生物分子，以用于各种时间分辨荧光生化测定。
2、本发明提供了一种荧光探针，水溶性好，水溶液中标记生物分子后仍具有强荧光和长荧光寿命。作为荧光探针，具有高的稳定性，能长期保存，可用于百微秒级的高灵敏度时间分辨荧光生化测定。
3、本发明提供了一种荧光配合物和荧光探针的制备方法，制备方法简单、条件温和。
4、本发明提供了一种生物标记探针的应用，相对于在荧光分子中引入异硫氰基和活性酯作为标记基团，本发明的生物标记探针标记生物分子，具有实验操作简便，快速高效、条件温和的特点。同时，相对于目前广泛使用的稳态（普通）荧光成像，时间分辨荧光成像可有效消除生物背景荧光和散射光的干扰，极大的提高荧光成像检测的灵敏度和准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中氨基化的三联吡啶四羧酸铕（Ⅲ）配合物及其实施例2中三聚氯氰活化产物的合成路线。
图2是本发明实施例3中NSTTA-Eu3+ （1×10-5mol/L）在pH值7.4的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光激发和发射光谱。
图3是本发明实施例3中（C3N3Cl）-NSTTA-Eu3+ （1×10-5mol/L）标记BSA在pH值7.4的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光激发和发射光谱。
图4是本发明实施例4中（C3N3Cl）-NSTTA-Eu3+标记链霉亲和素用于人AFP时间分辨荧光免疫测定的工作曲线。
图5是本发明实施例4中（C3N3Cl）-NSTTA-Eu3+标记链霉亲和素用于病原微生物Giardia lamblia的稳态荧光成像及时间分辨荧光成像测定结果。左：明场成像；中：稳态荧光成像；右：时间分辨荧光成像。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
本发明涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg 等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。
实施例1
一种本发明的荧光配合物：氨基化的三联吡啶四羧酸铕，具有以下式Ⅰ的结构式：
本实施例的氨基化的三联吡啶四羧酸铕由三价铕铽离子与氨基化的三联吡啶四羧酸衍生物发生配位反应得到。其合成路线如图1所示，具体合成方法为：
（1）化合物2（4’-[4-(2-叔丁基碳酸酰胺基-乙基)-1H-1,2,3-三氮唑基]-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸叔丁酯）的合成：
1.1、在100 mL圆底烧瓶中，将500 mg（0.63 mmol）化合物1（4’-叠氮基-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸叔丁酯）溶于20 ml 无水乙腈中 ，剧烈搅拌下，依次加入106mg（0.63 mmol） N-Boc-丁炔-4-胺和50 mg（0.26 mmol）. CuI反应液在氩气保护下，室温反应两个小时后，80℃回流反应过夜得到反应产物1。
1.2、待反应完全后，在反应产物1中加入25 mL含有10%的EDTA水溶液，室温搅拌1小时后过滤，取滤液。
1.3、将所得滤液用乙酸乙酯萃取（3×40 mL），收集有机相并用无水硫酸钠干燥后，滤除固体，减压蒸除溶剂得到粗产品。
1.4、将粗产品经真空干燥以后用乙酸乙酯作洗脱剂在中性氧化铝柱上分离提纯收集含有主产物的洗出液，蒸干溶剂并真空干燥后得310 mg淡红色固体，即为化合物2，产率51.4%。
将化合物2进行核磁共振：
1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ= 8.92 (s, 2H), 8.54 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 8.34(s, 1H), 7.88 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 7.74 (d, J = 5.0 Hz, 2H), 4.17 (s, 4H),3.63 – 3.58 (m, 2H), 3.56 (s, 8H), 3.06 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 1.48 (s, 36H)，1.45（s，9H）. ESI-MS (m/z）: 958.39 （100%，[M+H]+）。
由核磁共振的氢谱结果可知，得到的淡红色固体为化合物2：4’-[4-(2-叔丁基碳酸酰胺基-乙基)-1H-1,2,3-三氮唑基]-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺四乙酸叔丁酯。
（2）化合物3（4’-[4-(2-氨基-乙基)-1H-1,2,3-三氮唑基]-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6’-二甲胺四乙酸）的合成：
2.1、在100 mL圆底烧瓶中，将310 mg（0.32 mmol）化合物2溶于60 mL CH2Cl2−CF3COOH的混合溶剂（混合溶剂中CH2Cl2与CF3COOH的体积比为1︰1）中，室温搅拌反应12 h，蒸干溶剂得到反应产物2。
2.2、将反应产物2溶于5 mL的甲醇中，搅拌中慢慢加入50 mL乙醚，得到浅粉色沉淀。
2.3、将步骤2.2的浅粉色沉淀溶于20 mL干燥的乙腈中，回流60分钟，冷却至室温后，离心收集沉淀。
2.4、将步骤2.3中收集到的沉淀真空干燥后得100 mg深红色固体目标产物，即为化合物3，产率49%。
将化合物3进行核磁共振：
1H NMR (500 MHz, DMSO) δ= 9.13 (s, 1H), 8.86 (s, 2H), 8.59 (d, J = 10.0Hz, 2H), 8.07 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 10.0 Hz, 2H), 4.17 (s, 4H),3.58 (s, 8H), 3.27 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 3.12 (t, J = 10.0 Hz, 2H). ESI-MS(m/z）: 632.42（100%,[M-H]+）.
由核磁共振的氢谱结果可知，得到的深红色固体为化合物3：4’-[4-(2-氨基-乙基)-1H-1,2,3-三氮唑基]-2,2’:6’,2”-联三吡啶-6,6’-二甲胺四乙酸。
（3）配合物NSTTA-Eu3+的合成：
3.1、将13.8 mg（0.02 mmol）配体NSTTA（即步骤（2）中制备的化合物3）溶于2 mL去离子水中得到NSTTA水溶液，用饱和NaHCO3水溶液将上述NSTTA水溶液的pH值调至6.5。
3.2、在步骤3.1的NSTTA水溶液中加入含有9.2 mg（0.025 mmol） EuCl3·6H2O的200 L水溶液得到反应体系1，用饱和NaHCO3水溶液将上述反应体系1的pH值调至6.5。
3.3、将步骤3.2的反应体系1在室温下搅拌1.5小时，然后用1 M的氢氧化钠水溶液将反应液pH调至8.5，并继续搅拌10分钟得到反应体系2。
3.4、将步骤3.3中反应体系2中的固体物质滤除后，向所得滤液中加入50 mL丙酮，离心收集沉淀，所得沉淀用丙酮洗两遍后，经真空干燥得粉红色目标产物，即NSTTA-Eu3+配合物（氨基化的三联吡啶四羧酸铕）。
ESI-MS：784.25 (92%,[M+H]+)。
实施例2：
一种本发明的荧光分子探针：具有活性氯基团的氨基化的三联吡啶四羧酸铕（CYC-NSTTA-Eu3+）。
CYC-NSTTA-Eu3+的合成包括以下步骤：
（1）将实施例1的NSTTA-Eu3+配合物溶解于3 mL， pH=4.9的醋酸钠缓冲溶液（0.1 M），并逐滴加入含有36.8 mg三聚氯氰的1 mL丙酮溶液得到反应体系3，NSTTA-Eu3+配合物与三聚氯氰的质量比为1︰2.3。
（2）将反应体系3在室温下搅拌反应1小时，然后向反应体系3中加入50 mL丙酮，室温搅拌10分钟后，离心收集沉淀，并将所得沉淀用丙酮洗两次，真空干燥后得24.8 mg粉红色固体即为CYC-NSTTA-Eu3+。
此方法所得CYC-NSTTA-Eu3+配合物为CYC-NSTTA-Eu3+与醋酸钠的混合物，该混合物的组成经元素分析得近似组成为Na[CYC-NSTTA-Eu3+]•8(NaOAc)(H2O)，计算值（%）：C,35.95; H, 3.27; N, 10.48; 实测值（%）：C, 36.19; H, 3.42; N, 10.79。
实施例3：
一种本发明实施例2的CYC-NSTTA-Eu3+配合物在做为分子生物标记探针中的应用，其应用方法为：
（1）CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记牛血清白蛋白的制备：
将实施例1中的三聚氯氰活化的NSTTA-Eu3+配合物标记牛血清白蛋白，经过三聚氯氰活化的NSTTA配体可以与含有氨基的生物分子反应而共价键合在生物分子上，为了考察所合成的CYC-NSTTA-Eu3+配合物用于实际生物分子的标记情况及标记生物分子配合物的荧光性质，本实施例以牛血清蛋白（简称BSA）为模型生物分子，制备了NSTTA-Eu3+标记的BSA溶液，具体实验方法如下：
1.1、将10.0mg的BSA溶于1.0mL、pH值9.1的0.1mol/L的碳酸钠缓冲溶液后，搅拌下逐滴加入含有5.0×10-3mmolCYC-NSTTA-C3N3Cl2的pH值9.1的0.1mol/L的碳酸钠缓冲溶液中，室温搅拌5小时。
1.2、以0.05mol/L的碳酸氢铵溶液为洗脱剂，用SephadexG-50葡聚糖凝胶柱分离标记的BSA及未反应的配合物，将最先流出的高分子量溶液合并后即得到了CYC-NSTTA-Eu3+标记的BSA溶液。
为了估算标记BSA溶液中CYC-NSTTA-Eu3+对BSA的标记率（配合物与BSA的结合比），利用已知CYC-NSTTA-Eu3+配合物在340nm处的摩尔消光系数为2.05×104cm-1mol-1L，假定标记反应前后配位体的摩尔吸光系数不变，以此摩尔消光系数及分离后的配合物标记的BSA溶液的紫外吸收光谱测定结果，估算出CYC-NSTTA-Eu3+对BSA的标记率为21。该溶液在加入0.1%NaN3后4℃保存备用。
（2）CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的BSA（BSA-CYC-NSTTA-Eu3+）的荧光光谱与荧光性质测定：
用pH值7.4的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液将BSA-CYC-NSTTA-Eu3+溶液稀释到适当浓度后测定了溶液的稳态激发与发射光谱、荧光量子产率、及荧光寿命，所得结果如表1所示。
表1：CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的BSA的荧光光谱与荧光性质
| 荧光性质 | 最大吸收波长 | 最大发光波长 | ϕ（%） | τ（ms） |
| BSA-CYC-NSTTA-Eu<sup>3+</sup> | 340 | 607 | 27.3 | 0.78 |
从表1的结果可知：BSA-CYC-NSTTA-Eu3+显示典型的Eu3+发射光谱特点，其由500~710nm之间的几个离散的发射峰组成，对应于Eu3+的5D0→7FJ（J = 0-4）跃迁。并且最大激发和发射波长分别为340nm和607nm（5D0→7F2）。其发光量子产率高，荧光寿命长，表明我们制备的探针非常适合高灵敏度的时间分辨荧光生化分析。
图2为NSTTA-Eu3+ （1×10-5mol/L）溶液用pH值7.4的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液适当稀释后的时间分辨荧光激发与发射光谱，图3为本实施例中C3N3Cl）-NSTTA-Eu3+ （1×10-5mol/L）标记BSA在pH值7.4的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光激发和发射光谱。
测定条件为：延迟时间，0.2ms；记数窗口时间，0.4ms；循环时间，20ms；激发狭缝，10nm；发射狭缝，5nm；激发波长，340nm；发射波长，607nm。
从图2和图3的对比结果可知：将CYC-NSTTA-Eu3+配合物用于BSA标记之后，其激发与发射光谱保持了CYC-NSTTA-Eu3+配合物的特征光谱性质。
实施例4：
一种本发明的CYC-NSTTA-Eu3+配合物在时间分辨荧光生化分析中的应用，其应用方法为：
（1）CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的链霉亲和素的制备：
1.1、将0.4mg的链霉亲和素（简称SA）和0.4mg的BSA用pH值7.1的0.1mol/L磷酸缓冲溶液0.6mL溶解后，搅拌下加入0.1mL的1%戊二醛水溶液，4℃放置反应24小时得到反应产物3。
1.2、在步骤1.1的反应产物3中加入0.4 mg 的硼氢化钠，搅拌2小时，溶液在4℃下用3升含有0.9%氯化钠的水溶液透析两次（每次24小时）后，加入10 mg碳酸氢钠，再用1.0mol/L氢氧化钠调节溶液的pH 值为9.1得到反应产物4。
1.3、将步骤1.2的反应产物4在搅拌下慢慢滴加入0.5 mL含有1.0×10-3 mg CYC-NSTTA-Eu3+的pH 值为9.1的碳酸钠缓冲溶液，室温搅拌反应2小时后，溶液在4℃下用3升含有0.9%氯化钠的水溶液透析两次（每次24小时）除去未反应的标记物得到反应产物5。
1.4、将步骤1.3的反应产物5用含有0.2%BSA、0.9%NaCl和0.1%NaN3的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释50倍后即得到用于时间分辨荧光免疫分析的CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的链霉亲和素溶液，–20℃保存备用。
（2）CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的链霉亲和素溶液用于人甲胎蛋白(简称AFP)的时间分辨荧光免疫测定：
2.1、96微孔板的包被：在96微孔板的各孔中分别加入45μL含有10 μg/mL小鼠抗人AFP单克隆抗体的pH值9.6的0.1mol/L碳酸钠缓冲溶液，4℃下24小时包被后，用含有0.05%Tween 20的pH值7.4的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液（缓冲溶液1）洗两次，再用pH值7.4的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液（缓冲溶液2）洗1次，4℃下密封放置备用。
2.2、人AFP的时间分辨荧光免疫测定：
2.2.1、配制稀释液：稀释液为含5% BSA、0.9% NaCl、0.1% NaN3的0.05 mol/L 的Tris-HCl缓冲溶液，稀释液的pH值7.4。
2.2.2、制备梯度浓度的人AFP标准溶液：用步骤2.2.1的稀释液将人AFP标准溶液稀释成浓度分别为0.001 ng/mL、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL的人AFP标准溶液。
2.2.3、分别取不同浓度的人AFP标准溶液各45μL加入到步骤2.2.1包被后的96微孔板的各孔中，37℃下1小时温育反应后，用缓冲溶液1（缓冲溶液1为含有0.05% Tween 20的pH值7.4的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液）洗两次，再用缓冲溶液2（缓冲溶液2为pH值7.4的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液）洗一次。
2.3.4、将45μL的生物素标记抗人AFP多克隆抗体溶液加入到各孔中，37℃下1小时孵育反应后，用缓冲溶液1洗两次，再用缓冲溶液2洗一次。
2.3.5、将45μL的CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记链霉亲和素溶液加入到各孔中，37℃下1小时温育反应后，用缓冲溶液1洗4次。
2.3.6、进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为Perkin Elmer Victor 1420多标记计数仪，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；计数时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。
图4是（C3N3Cl）-NSTTA-Eu3+标记链霉亲和素用于人AFP时间分辨荧光免疫测定的工作曲线。用本底信号标准偏差的3倍计算得出本法测定人AFP的最低检测下限为0.1 ng/mL，工作曲线上限可达约100 ng/mL。
（3）CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的链霉亲和素用于病原微生物Giardia lamblia的稳态荧光成像及时间分辨荧光成像测定结果：
3.1、在1.5 mL塑料离心管中分别加入5μL的Giardia lamblia悬浮液（1.0×106细胞/mL）。
3.2、依次加入20μL的小鼠抗Giardia lamblia IgM单克隆抗体（约50μg/mL）、20μL的生物素标记兔抗鼠IgM多克隆抗体（约40μg/mL）及10μL的CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的链霉亲和素溶液，混合均匀后室温放置反应24小时。
3.3、离心（500转/分钟）收集Giardia lamblia，用50μL双蒸水重复离心洗涤3次后，取少量含有Giardia lamblia的溶液置于载波片上进行荧光显微成像测定。
稳态荧光成像与时间分辨荧光成像测定用仪器为实验室搭建的具有真彩稳态荧光成像及真彩时间分辨荧光成像功能的显微镜（文献8：L. Zhang, X. Zheng, W. Deng,Y. Lu, S. Lechevallier, Z. Ye, E. M. Goldys, J. M. Dawes, J. A. Piper and J.Yuan, Sci Rep, 2014, 4, 6597.）。稳态荧光成像测定条件为：激发滤光片波长，330-380nm；成像曝光时间，1.0 s。时间分辨荧光成像测定条件为：激发滤光片波长，330-380nm；迟延时间，33s ；计数时间，1.0ms；成像曝光时间，3.0 s。
图5是Giardia lamblia的明场成像、稳态荧光成像及时间分辨荧光成像测定结果。由图可见，经过CYC-NSTTA-Eu3+配合物标记的链霉亲和素免疫荧光染色的Giardia lamblia在时间分辨荧光成像图中显示出了明亮的三价铕配合物特异性红色荧光，该结果充分证明以CYC-NSTTA-Eu3+配合物为探针标记的链霉亲和素可用于病原微生物的时间分辨荧光成像测定。此外，与稳态荧光成像图相比，时间分辨荧光成像图中因不存在样品背景荧光的干扰，所得结果具有更高的清晰度与对比度。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种荧光配合物，其特征在于，所述荧光配合物为氨基化的三联吡啶四羧酸铕，所述氨基化的三联吡啶四羧酸铕具有以下式的结构式：
。
2.一种权利要求1所述的荧光配合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
A1、将化合物1与N-Boc-丁炔-4-胺、CuI在惰性气氛下反应得到化合物2；
A2、将所述化合物2溶于CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中反应得到化合物3；
A3、将所述化合物3与EuCl3·6H2O反应得到氨基化的三联吡啶四羧酸铕；
所述化合物1具有以下式的结构式：
所述化合物2具有以下式的结构式：
所述化合物3具有以下式的结构式：
。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述A1具体为：将化合物1、N-Boc-丁炔-4-胺和CuI混合，在惰性气氛下，以80℃回流反应10h~16h得到化合物2；
和/或，所述化合物1、N-Boc-丁炔-4-胺和CuI的质量比为5∶1∶0.5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述A2中，所述CH2Cl2和CF3COOH的混合溶剂中CH2Cl2和CF3COOH 的体积比为0.9~1.1∶0.9~1.1；
和/或，所述A2中所述反应的温度为20~35℃，反应时间为12h~24h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述A3具体为：
A3-1、将化合物3与EuCl3·6H2O混合，调节pH为5.5~6.5，得到反应体系1；
A3-2、将所述反应体系1在20~35℃下搅拌1h以上；然后调节pH为8.5，得到反应体系2；
A3-3、在所述反应体系2中加入有机溶剂沉淀，得到氨基化的三联吡啶四羧酸铕；
所述化合物3与EuCl3·6H2O的质量比为1.5∶1。
6.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针由权利要求1所述的荧光配合物与三聚氯氰反应得到。
7.一种权利要求6所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
B1、将氨基化的三联吡啶四羧酸铕与三聚氯氰在pH为4.5~5.5的弱酸性缓冲溶液中反应得到反应体系3；
B2、在所述反应体系3中加入有机溶剂沉淀，得到CYC-NSTTA-Eu3+配合物，即为荧光探针。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述氨基化的三联吡啶四羧酸铕与三聚氯氰的质量比为1∶2~3。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述B1中所述反应的温度为20℃~35℃，反应的时间为1h以上。
10.一种权利要求7所述的荧光探针在时间分辨荧光生化分析中的应用。
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