CN102391162A - 三种基于铕(III)与氯磺酰化四齿β-二酮配位体形成的荧光配合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及三种基于铕(III)与氯磺酰化四齿β-二酮配位体形成的荧光配合物及其应用。三价铕离子与三种氯磺酰化四齿β-二酮类配位体：1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯、1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯及1，2-二(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯所形成的荧光配合物。三种氯磺酰化四齿β-二酮类配位体结构式为：

三种探针在弱碱性缓冲溶液中与含有氨基的蛋白质、氨基酸、肽、核酸等生物分子共价键合而用于这些分子的荧光标记，用于时间分辨荧光免疫分析等生化测定。

Description

三种基于铕(III)与氯磺酰化四齿β-二酮配位体形成的荧光配合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种三种基于铕(III)与氯磺酰化四齿β-二酮配位体形成的荧光配合物及其应用，具体地说是三种可用于生物分子标记的三价铕离子与氯磺酰化四齿β-二酮的荧光配合物的制备及其在时间分辨荧光生化检测中的应用。

背景技术

稀土离子(包括Eu³⁺、Tb³⁺、Sm³⁺、Dy³⁺)荧光配合物具有非常特殊的荧光性质，如超长的荧光寿命，200纳米以上的Stokes位移及尖锐的荧光发射光谱，从而被作为生物分子的荧光标记探针而广泛地应用于时间分辨荧光生化分析技术领域。作为一种高灵敏度的生化分析技术，时间分辨荧光生化分析法如时间分辨荧光免疫分析法、时间分辨荧光核酸杂交分析法及时间分辨荧光生物成像分析法已在临床医学检测、生命科学及环境科学等领域得到了许多成功地的应用。

在时间分辨荧光生化分析技术中，最关键的步骤之一是在测定前需要对一些生物分子如抗体、抗原、蛋白质及核酸等用稀土荧光配合物探针进行标记。到目前为止，可用于生物分子荧光标记的稀土配合物荧光探针主要包括三价铕离子与β-二酮类配位体的荧光配合物及三价铕及铽离子与芳香胺类配位体的荧光配合物(文献1：I.

V.-M.Mukkala，Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，2001，38，441；文献2：J.L.Yuan，G.L.Wang，Trends Anal.Chem.，2006，25，490)。相对于三价稀土的芳香胺类配合物荧光标记探针来说，由于三价铕离子的β-二酮类配合物荧光标记探针具有发光效率更高，且合成比较简单及成本低廉的优点，这类探针的研制对于开拓时间分辨荧光生化分析技术的更广泛应用具有十分重要的实际意义。

基于上述原因，近年来几种氯磺酰基化的四齿β-二酮类配位体：包括4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯(简称BHHCT)(文献3：J.L.Yuan，K.Matsumoto，H.Kimura，Anal.Chem.，1998，70，596)，4，4’-二(1”，1”，1”，2”，2”-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯(简称BPPCT)(文献4：R.Connally，D.Veal，J.Piper，FEMS Microbiol.Ecol.，2002，41，239)，4，4’-bis(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基)氯磺酰基-邻二苯基苯(简称BTBCT)(文献5：F.B.Wu，C.Zhang，Anal.Biochem.，2002，311，57)，1，10-二(4”-氯磺酰基-1’，1”-联苯-4’-基)-4，4，5，5，6，6，7，7-八氟癸烷-1，3，8，10-四酮(简称BCDOT)(文献6：J.L.Yuan，K.Matsumoto，Anal.Sci.，1996，12，695)，1，10-二(8’-氯磺酰基-二苯并噻吩-2’-基)-4，4，5，5，6，6，7，7-八氟癸烷-1，3，8，10-四酮(简称BCOT)(文献7：J.L.Yuan，K.Matsumoto，J.Pharm.Biomed.Anal.，1997，15，1397)及1，10-二(5’-氯磺酰基-噻吩-2’-基)-4，4，5，5，6，6，7，7-八氟癸烷-1，3，8，10-四酮(简称BCTOT)(文献8：F.B.Wu，S.Q.Han，C.Zhang，Y.F.He，Anal.Chem.，2002，74，5882)，被先后研制了出来。这几种配位体不仅可与三价铕离子形成稳定的强荧光性配合物，其氯磺酰基还可与含有氨基的生物分子共价键合，进而对生物分子进行荧光标记，其中最具有代表性及应用价值，并且已经被商品化的是BHHCT。申请人近年来的研究工作还表明，三价铕离子的BHHCT配合物(简称BHHCT-Eu³⁺)不仅在生物标记方面具有很好的直接应用价值，其在功能性纳米稀土荧光材料的制备及复杂样品的时间分辨荧光生物成像测定方面也具有很好的应用价值(文献9：M.Q.Tan，Z.Q.Ye，G.L.Wang，J.L.Yuan，J.Mater.Chem.，2004，14，2896；文献10：J.Wu，Z.Q.Ye，G.L.Wang，D.Jin，J.L.Yuan，Y.F.Guan，J.Piper，J.Mater.Chem.，2009，19，1258)。

需要指出的是，虽然以BHHCT-Eu³⁺为代表的几种四齿β-二酮-铕(III)荧光配合物生物标记探针已经被研制了出来，但现有的稀土荧光配合物生物标记探针种类仍然十分有限，商品化的探针试剂价格昂贵，很大程度上制约了时间分辨荧光生化分析技术的发展与应用。另外，如何通过对四齿β-二酮配位体的结构优化与改良来研制具有更好荧光性能的四齿β-二酮-铕(III)荧光配合物生物标记探针也是十分必要的。

本发明在对配位体结构设计的基础上，合成出了三种新型氯磺酰化的四齿β-二酮-铕(III)荧光配合物生物标记探针，在利用探针对蛋白质分子进行标记的基础上，建立了该探针在时间分辨荧光免疫测定技术及时间分辨荧光生物成像测定技术中的应用方法。

发明内容

本发明的目的是提供三种新型的三价铕离子与氯磺酰化四齿β-二酮的荧光配合物生物标记探针，并将其用于蛋白质等生物分子的荧光标记及时间分辨荧光生化测定。

本发明的技术方案如下：

以三价铕离子与三种氯磺酰化四齿β-二酮类配位体所形成的荧光配合物为生物分子标记探针，其中所述三种氯磺酰化四齿β-二酮类配位体的结构为：

第一种：当R取C₃F₇：BHHBCB，BTBBCBO为1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯；

第二种：当R取C₂F₅：BPPBCB；BPPBCB为1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯；

第三种：当R取CF₃：BTBBCB；BTBBCB为1，2-二(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯。

所述结构的配位体，可在弱碱性(pH值＞8)的缓冲溶液中以共价键合的形式与含有氨基的蛋白质(抗体、抗原、亲和素、链霉亲和素等)、氨基酸、肽、核酸等生物分子结合，当在溶液中加入三价铕(氯化物、硝酸盐等)离子后，由于三价铕离子在溶液中可与结合在生物分子上的配位体形成稳定的强荧光性配合物，进而可得到铕(III)荧光配合物标记的生物分子，以用于各种时间分辨荧光生化测定。所述的三价铕荧光配合物生物标记探针试剂及含有其标记生物分子后的试剂盒。所述荧光测定除了常规的稳态荧光测定外，还包括时间分辨荧光测定及时间分辨荧光显微成像测定。

本发明的荧光探针具有如下优点：

1.合成步骤简单，原料易得，成本低。

2.比已报道的三价铕离子氯磺酰化四齿β-二酮荧光配合物生物标记探针具有更高的荧光发光量子产率，荧光发光更强。

3.作为荧光探针，具有高的稳定性，能长期保存使用。

4.生物分子的荧光标记方法操作简单。

5.水溶液中标记生物分子后仍具有强荧光和长荧光寿命，可用于百微秒级的高灵敏度时间分辨荧光生化测定。

附图说明

图1是三种四齿β-二酮配位体BHHBCB(R＝C₃F₇)、BPPBCB(R＝C₂F₅)及BTBBCB(R＝CF₃)的合成路线。

图2是BHHBCB-Eu³⁺(1×10^-6mol/L)标记BSA在pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光激发和发射光谱。

图3是BPPBCB-Eu³⁺(1×10^-6mol/L)标记BSA在pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光激发和发射光谱。

图4是BTBBCB-Eu³⁺(1×10^-6mol/L)标记BSA在pH值7.8的0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液中的时间分辨荧光激发和发射光谱。

图5是BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素用于人PSA时间分辨荧光免疫测定的工作曲线。

图6是BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素用于病原微生物鼠隐孢子虫的常规荧光成像及时间分辨荧光成像测定结果。上：明场成像；中：常规荧光成像；下：时间分辨荧光成像。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。本实施例仅用于对本发明进行说明，基于相同原理和类似原料的方法也属本发明的范围。

实施例1：三种氯磺酰化四齿β-二酮配位体BHHBCB、BPPBCB及BTBBCB的合成

三种氯磺酰化四齿β-二酮配位体的合成路线如图1所示，三种配位体的合成过程相似，只在1，2-二(氟代烷基-β-二酮基-对苄基)苯合成步骤所用氟代烷基羧酸乙酯的种类不同，具体实验过程如下。

(1)1，2-二(4’-乙酰基苄基)苯的合成。

将2.64g(10mmol)1，2-二(溴甲基)苯，5.91g(36mmol)4-乙酰基苯硼酸，6.90g(50mmol)碳酸钾加入含有60mL丙酮及20mL水的圆底烧瓶内，在冰水浴冷却下搅拌至大部分溶解，再加入70.90mg(0.4mmol)氯化钯，氩气保护下加热至50℃，搅拌12小时。反应结束后减压蒸除溶剂，生成物用氯仿萃取，经无水硫酸钠干燥后蒸干滤液得粗产品。粗产品用石油醚-乙酸乙酯(2∶1)过硅胶柱提纯，真空干燥，得目标产物1.58g，产率49.3％，¹HNMR(CDCl₃)测定结果：δ＝7.83(d，J＝8.0Hz，4H)，7.27-7.24(m，2H)，7.15-7.11(m，6H)，3.96(s，4H)，2.57(s，6H)。

(2)三种1，2-二(氟代烷基-β-二酮基-对苄基)苯的合成

将1.0g(2.92mmol)1，2-二(4’-乙酰基苄基)苯和8.75mmol的氟代烷基羧酸乙酯(2.04g七氟丁酸乙酯、或1.68g五氟丙酸乙酯、或1.25g三氟乙酸乙酯)溶于30mL的干燥乙醚中，加入0.47g(8.75mmol)甲醇钠，室温搅拌反应42小时。反应结束后加入20mL的15％硫酸水溶液，搅拌20分钟，蒸出乙醚，过滤收集沉淀，并用水充分洗涤。粗产物用无水乙醇重结晶后真空干燥，即得到目标产物1，2-二(氟代烷基-β-二酮基-对苄基)苯，三种产品的产率在50-60％左右。¹HNMR(氘代丙酮)测定结果：1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基-对苄基)苯：

(d，J＝8.0Hz，4H)，7.30-7.25(m，8H)，6.92(s，2H)，4.14(s，4H)；1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基-对苄基)苯：

(d，J＝8.0Hz，4H)，7.30-7.25(m，8H)，6.92(s，2H)，4.14(s，4H)；1，2-二(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基-对苄基)苯：

(d，J＝8.0Hz，4H)，7.30-7.24(m，8H)，6.84(s，2H)，4.14(s，4H)。

(3)三种氯磺酰化四齿β-二酮配位体BHHBCB、BPPBCB及BTBBCB的合成

在15mL圆底烧瓶中加入4mL的氯磺酸，搅拌下加入1.0g的1，2-二(氟代烷基-β-二酮基-对苄基)苯，室温搅拌反应5小时后，将反应液逐滴加入到200mL的冰水中，充分搅拌后过滤收集沉淀，并用冰水充分洗涤，真空干燥，即得到目标产物氯磺酰化的四齿β-二酮配位体。三种产品的产率在80-90％左右。¹HNMR(氘代丙酮)测定结果：BHHBCB：

7.66(d，J＝8.0Hz，1H)，7.38-7.33(m，4H)，6.92(s，2H)，4.41(s，2H)，4.36(s，2H)；BPPBCB：δ＝7.96-7.92(m，6H)，7.57(d，J＝8.0Hz，1H)，7.28-7.23(m，4H)，6.83(s，2H)，4.32(s，2H)，4.26(s，2H)；BTBBCB：7.67(d，J＝8.0Hz，1H)，7.38-7.33(m，4H)，6.85(s，2H)，4.41(s，2H)，4.35(s，2H)。元素分析测定结果：BHHBCB：按分子式C₃₂H₁₉C1F₁₄O₆S·2.5H₂O(BHHBCB·2.5H₂O)计算值(％)，C＝43.78，H＝2.16；实测值(％)，C＝43.53，H＝2.38；BPPBCB：按分子式C₃₀H₁₉C1F₁₀O₆S·H₂O(BPPBCB·H₂O)计算值(％)，C＝47.98，H＝2.80；实测值(％)，C＝47.54，H＝2.43；BTBBCB：按分子式C₂₈H₁₉ClF₆O₆S·H₂O(BTBBCB·H₂O)计算值(％)，C＝51.67，H＝3.23；实测值(％)，C＝51.46，H＝2.90。质谱测定结果：BHHBCB：分子离子峰m/z＝833.0(相对强度45％)；BPPBCB：分子离子峰m/z＝733.0(相对强度100％)；BTBBCB：分子离子峰m/z＝633.0(相对强度100％)。

实施例2：三种氯磺酰化四齿β-二酮配位体的铕(III)配合物标记牛血清白蛋白的制备

三种配位体含有的氯磺酰基可与含有氨基的生物分子反应生成磺酰胺共价键而标记在生物分子上，为了考察三种氯磺酰化四齿β-二酮配位体用于实际生物分子的标记情况及标记生物分子后三种配位体与铕(III)形成配合物的荧光性质，本实施例以牛血清白蛋白(简称BSA)为模型生物分子，分别制备了BHHBCB、BPPBCB及BTBBCB的三价铕配合物标记的BSA溶液，具体的实验方法如下。

将10.0mg的BSA溶于2.0mL、pH值9.3的0.05mol/L碳酸钠缓冲溶液后，搅拌下缓慢滴加入9.0×10^-3mmol的氯磺酰化四齿β-二酮配位体溶于0.4mL无水乙醇的溶液，室温搅拌2小时后，以0.05mol/L的NH₄HCO₃溶液为洗脱剂，用Sephadex G-50柱分离标记的BSA及未反应的配位体，将最先流出的高分子量溶液合并后即得到了氯磺酰化四齿β-二酮配位体标记的BSA溶液。为了估算标记BSA溶液中配位体对BSA的标记率(配位体与BSA的结合比)，将未经Sephadex G-50柱分离的标记BSA溶液用0.05mol/L的NH₄HCO₃溶液适当稀释后测定溶液的紫外吸收光谱，得到三种标记BSA溶液的最大吸收波长分别为328nm、326nm及324nm。利用溶液中配位体的已知浓度，并假定标记反应前后配位体的摩尔吸光系数不变，计算出标记BSA溶液中BHHBCB、BPPBCB及BTBBCB在328nm、326nm及324nm处的摩尔吸光系数分别为：3.08×10⁴cm^-1mol^-1L、2.65×10⁴cm^-1mol^-1L及1.60×10⁴cm^-1mol^-1L。以此摩尔吸光系数及分离后的配位体标记的BSA溶液的紫外光谱测定结果，估算出本实施例制备的BHHBCB标记BSA的标记率为34，BPPBCB标记BSA的标记率为18，BTBBCB标记BSA的标记率为17。

在上述得到的标记BSA溶液中加入配位体浓度1.5倍摩尔量的EuCl₃后，即得到了荧光强度达到最大并稳定的四齿β-二酮配位体的铕(III)配合物标记的BSA溶液，各溶液在加入0.1％NaN₃后4℃保存备用。

实施例3：三种铕(III)配合物标记BSA的荧光光谱与荧光性质测定

用pH值9.1的0.05mol/L硼酸缓冲溶液将三种铕(III)配合物标记BSA溶液稀释到适当浓度后测定了三种溶液的稳态荧光激发与发射光谱、荧光发光量子产率(φ)及荧光寿命(τ)，所得结果如表1所示。

表1.三种铕(III)配合物标记BSA溶液的荧光性质

图2、图3及图4分别给出了BHHBCB-Eu³⁺、BPPBCB-Eu³⁺及BTBBCB-Eu³⁺标记BSA溶液用pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液适当稀释后的时间分辨荧光激发与发射光谱，测定条件为：延迟时间，0.2ms；记数窗口时间，0.4ms；循环时间，20ms；激发狭缝，10nm；发射狭缝，5nm；激发波长，335nm；发射波长，608nm。可见采用时间分辨模式测得的荧光激发与发射光谱与稳态荧光激发与发射光谱在激发与发射波长上没有明显区别。

实施例4：BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素的制备

为确认新型铕(III)配合物标记探针在时间分辨荧光生化分析中的实际应用价值，本实施例选用BHHBCB-Eu³⁺为标记探针制备了BHHBCB-Eu³⁺标记的链霉亲和素，具体的实验方法如下。

将0.4mg的链霉亲和素(简称SA)和0.4mg的BSA用pH值7.1的0.1mol/L磷酸缓冲溶液0.6mL溶解后，搅拌下加入0.1mL的1％戊二醛水溶液，4℃放置反应24小时。加入0.4mg的硼氢化钠，搅拌2小时，溶液在4℃下用3升含有0.9％氯化钠的水溶液透析两次(每次24小时)后，加入10mg碳酸氢钠，再用1.0mol/L氢氧化钠调节溶液的pH值为9.1。上述溶液在搅拌下慢慢滴加入0.04mL含有1.0mg BHHBCB的二甲基亚砜溶液，4℃搅拌反应1小时后，溶液在4℃下用3升含有0.9％氯化钠的水溶液透析两次(每次24小时)除去未反应的标记物。透析后的溶液加入0.63mg EuCl₃·6H₂O，用含有0.2％BSA、0.9％NaCl和0.1％NaN₃的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释50倍后即得到用于时间分辨荧光免疫分析的BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素溶液，-20℃保存备用。

实施例5：BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素用于人前列腺特异抗原(简称PSA)的时间分辨荧光免疫测定

(1)96微孔板的包被

在96微孔板的各孔中分别加入45μL含有10μg/mmL小鼠抗人PSA单克隆抗体的pH值9.6的0.1mol/L碳酸钠缓冲溶液，4℃下24小时包被后，用含有0.05％Tween 20的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液1)洗两次，再用pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液(缓冲溶液2)洗1次，4℃下密封放置备用。

(2)人PSA的时间分辨荧光免疫测定

人PSA系列标准溶液用含有5％BSA-0.9％NaCl-0.1％NaN₃的pH值7.8的0.05mol/L Tris-HCl缓冲溶液稀释高浓度的人PSA标准溶液制得。分别取不同浓度的人PSA标准溶液各45μL加入到上述包被后的微孔板的各孔中，37℃下1小时温育反应后，用缓冲溶液1洗两次，再用缓冲溶液2洗一次。将45μL的生物素标记抗人PSA多克隆抗体溶液加入到各孔中，37℃下1小时温育反应后，用缓冲溶液1洗两次，再用缓冲溶液2洗一次。将45μL的BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素溶液加入到各孔中，37℃下1小时温育反应后，用缓冲溶液1洗4次，然后进行固相时间分辨荧光测定。测定用仪器为Perkin Elmer Victor 1420多标记计数仪，测定条件为：激发波长，340nm；检测波长，615nm；迟延时间，0.2ms；计数时间，0.4ms；循环时间，1.0ms。

图5是用上述方法测定人PSA的工作曲线，用本底信号标准偏差的3倍计算得出本法测定人PSA的最低检测下限为57pg/mL，工作曲线上限可达约25ng/mL。

实施例6：BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素用于病原微生物鼠隐孢子虫的稳态荧光成像及时间分辨荧光成像测定

在1.5mL塑料离心管中分别加入10μL的鼠隐孢子虫卵囊细胞悬浮液(2.5×10⁵细胞/mL)、8μL的小鼠抗鼠隐孢子虫IgM单克隆抗体(约50μg/mL)、8μL的生物素标记兔抗鼠IgM多克隆抗体(约44μg/mL)及8μL的BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素溶液，室温放置反应10小时后，离心(500转/分钟)收集鼠隐孢子虫卵囊细胞，用50μL水重复离心洗涤3次后，取少量含有卵囊细胞的溶液置于载波片上进行荧光显微成像测定。稳态荧光成像测定用仪器为日本尼康TE2000-E型倒置式荧光显微镜，测定条件为：激发滤光片波长，330-380nm；成像滤光片波长，＞420nm；成像曝光时间，5s。时间分辨荧光成像测定用仪器为本实验室研制的倒置式时间分辨荧光显微镜(文献11：B.Song，G.L.Wang，M.Q.Tan，J.L.Yuan.J.Am.Chem.Soc.，2006，128，13442)，测定条件为：激发滤光片波长，330-380nm；成像滤光片波长，＞420nm；迟延时间，0.1ms；计数时间，1.0ms；成像曝光时间，60s。

图6是鼠隐孢子虫卵囊细胞的明场成像、稳态荧光成像及时间分辨荧光成像测定结果，可见经过BHHBCB-Eu³⁺标记链霉亲和素免疫荧光染色的鼠隐孢子虫卵囊细胞在330-380nm激发光照射下均发出了明亮的三价铕配合物特异性红色荧光。该结果充分证明以BHHBCB-Eu³⁺配合物为探针标记的链霉亲和素可用于病原微生物的免疫染色及稳态荧光成像测定与时间分辨荧光成像测定。

Claims (3)

1.三种基于铕(III)与氯磺酰化四齿β-二酮配位体形成的荧光配合物，其特征在于：是以三价铕离子与三种氯磺酰化四齿β-二酮配位体所形成的荧光配合物，所述三种氯磺酰化四齿β-

二酮类配位体的结构为：

第一种：当R取C₃F₇：BHHBCB，BTBBCBO为1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”，3”，3”-七氟-4”，6”-己二酮-6”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯；

第二种：当R取C₂F₅：BPPBCB；BPPBCB为1，2-二(1”，1”，1”，2”，2”-五氟-3”，5”-戊二酮-5”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯；

第三种：当R取CF₃：BTBBCB；BTBBCB为1，2-二(1”，1”，1”-三氟-2”，4”-丁二酮-4”-基-对苄基)-4-氯磺酰基苯。

2.应用权利要求1所述的荧光配合物，其特征在于：在pH值＞8的弱碱性缓冲溶液中通过氯磺酰化四齿β-二酮配位体与含有氨基的生物分子的共价结合反应而对生物分子进行标记，标记生物分子经分离纯化后进一步与三价铕离子反应得到铕(III)荧光配合物标记的生物分子，进而用于各种荧光测定。

3.一种根据权利要求2所述的应用，其特征在于，三价铕荧光配合物的生物标记探针试剂或含有其标记生物分子后的试剂盒。

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