JPWO2006106867A1 - 遺伝子多型診断用装置 - Google Patents
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Abstract
Description
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び/又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン2対立遺伝子、又はパターン2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン2対立遺伝子又はパターン2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する(特許文献1参照。)。
比較的に少量のゲノムDNAを用いて数十万箇所に及ぶSNP部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムDNA及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンPCR法を用いる(特許文献3参照。)。
本発明はタイピング反応を短時間で測定するとともに、ベース値検出及びそのための蛍光色素を不要にする遺伝子多型診断用装置を提供することを目的とするものである。
タイピング反応としてインベーダ反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御部110はインベーダ反応のための温調部となる。
反応容器は反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部をさらに備えたものとすることができる。
制御部118を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部118にパーソナルコンピュータ(PC)122を接続してもよい。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはSNPである。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノムDNAなどである。
遺伝子増幅試薬の一例はPCR反応試薬である。
直接PCR法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のSNP部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ法やタックマンPCR法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンPCR試薬である。
PCR工程では血液などの生体サンプル2にPCR反応試薬4を添加するか、逆にPCR反応試薬4に生体サンプル2を添加する。
プライマーはPCR反応によるDNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
各レポータープローブはそれに対応したSNPの塩基に応じて2種類のものを用意すれば、そのSNPがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
また、蛍光強度の絶対値を求める必要がないので、蛍光強度のベース値を得るための蛍光色素が不要になり、コスト低下に寄与する。
アレル判定を行なう場合にも測定時間を短縮することができる。
平板状の基板10の同じ側に試薬収容部14及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体収容部16が凹部として形成されている。基板10の同じ側にはさらに、反応部18も形成されている。試薬収容部14と不揮発性液体収容部16はフィルム20で封止されており、試薬とミネラルオイルをノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム20を取り除いてノズルで吸入するか、又はそのフィルム20をノズルで貫通可能なものとしておいてノズルを貫通させてノズルで吸入する。そのようなフィルム20は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとPET(ポリエチレンテレフタレート)フィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないように融着や接着により貼りつけられている。
基板10の表面は、フィルム20上から、試薬収容部14、不揮発性液体収容部16及び反応部18を被う大きさの剥離可能なシール材22で被われている。
実施例では、不揮発性液体としてはミネラルオイルを使用し、以後、不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。
平板状の基板10の同じ側にサンプル注入部12、タイピング試薬収容部14、及びミネラルオイル収容部16が凹部として形成されている。基板10の同じ側にはさらに、複数のプローブ配置部18も形成されている。
図3A及び図3Bに示されるように、使用時にシール材22が剥がされる。タイピング試薬収容部14とミネラルオイル収容部16を封止しているフィルム20は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部12に外部でPCR反応によりDNAが増幅されたサンプル反応液24がピペット26などにより2〜20μL注入される。その後、この反応容器が検出装置に装着される。
各プローブ配置部18では反応液がプローブと反応して所定のSNPがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板10の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
この反応容器は核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入し、PCR反応によるDNAの増幅と、インベーダ反応によるSNP検出を共に行なうものである。ただし、核酸抽出操作を施している生体サンプルを注入してもよい。
増幅反応部32はPCR反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。
サンプル注入部12は、この実施例では核酸抽出操作を施していない生体サンプルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。
各プローブ配置部18も図2A及び図2Bの実施例と同じく、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部16からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。
基板10aも底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板10の厚さは1〜2mmである。
図7A及び図7Bに示されるように、使用時にシール材22が剥がされる。タイピング試薬収容部14、ミネラルオイル収容部16及び遺伝子増幅試薬収容部30を封止しているフィルム20は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部12にサンプル25がピペット26などにより0.5〜2μL注入される。図2A及び図2Bの実施例では、注入されるサンプルは外部でPCR反応によりDNAが増幅されたサンプル反応液であるが、この実施例で注入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が検出装置に装着される。
ノズル28により増幅反応部32から回収された反応終了後のPCR反応液38aはPCR終了液注入部31に移送されて注入される。
各プローブ配置部18では反応液がプローブと反応して所定のSNPがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板10の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
PCR反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献3の段落[0046]に記載されているような、プライマー、DNAポリメラーゼ及びTaqStart (CLONTECH Laboratories社製)を含む反応試薬を使用することができる。また、PCR反応試薬にはAmpDirect(島津製作所製)が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献3の表1に記載されているSNP ID1〜20、配列番号を1〜40などを使用することができる。
上側のヒートブロック62にはノズル28による液の移送や吸入、吐出の際に蓋が開くように開閉可能な窓が設けられている。
反応容器41として図2の実施例のように増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部は不要である。
ノズル28による液の移送や吸入、吐出を行なうために、分注部として送液アーム66が設けられており、送液アーム66はノズル28を備えている。ノズル28はその先端に使い捨て可能なチップ70が着脱可能に装着される。
反応容器41として図2の反応容器のように遺伝子増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、遺伝子増幅反応部の温度を制御する増幅部は必要ではなく、制御部118も増幅部の温度制御のための機能を備える必要がない。
本発明では図11に示されるような蛍光強度のタイムコースの所期の傾斜をもつ部分の単位時間当たりの蛍光強度値に基づいて測定を行なう。
4 PCR反応試薬
6 インベーダ試薬
8 プローブ配置部
10,10a 基板
12 サンプル注入部
14 タイピング試薬収容部
16 ミネラルオイル収容部
18 プローブ配置部
20 フィルム
22 シール材
28 ノズル
30 遺伝子増幅試薬収容部
31 PCR終了液注入部
32 増幅反応部
34a,34b 増幅反応部のポート
36a,36b ポートの開口
41 反応容器
60,62 ヒートブロック
64 検出器
66 送液アーム
70 チップ
Claims (4)
- 複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を少なくとも備えた遺伝子多型診断用反応容器を装着する反応容器装着部と、
移送して分注する分注部と、
前記プローブ配置部の温度をゲノムDNAとタイピング試薬との反応液が前記プローブと反応する温度に制御するタイピング反応温度制御部と、
前記各プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記分注部の分注動作、前記タイピング反応温度制御部の温度制御及び前記蛍光検出部の検出動作を少なくとも制御する制御部と、
を備えた反応容器処理装置において、
前記制御部は前記蛍光検出部から得られる蛍光検出値の単位時間当たりの蛍光強度値に基づいて遺伝子多型の有無の判定を行なうことを特徴とする遺伝子多型診断用装置。 - 前記プローブ配置部はそれぞれの多型部位に対してホモ接合体とヘテロ接合体とで異なる蛍光標識がなされたものであり、
前記制御部による測定結果を表示する表示部は前記2種類の標識蛍光の蛍光強度に基づいてアレル判定を行なうように表示するとともに、その表示の蛍光強度値として単位時間当たりの蛍光強度値を表示する請求項1に記載の遺伝子多型診断用装置。 - 前記反応容器は反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部をさらに備えたものである請求項1又は2に記載の遺伝子多型診断用装置。
- 前記反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、サンプルと前記遺伝子増幅試薬との混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備えたものであり、
該遺伝子多型診断用装置は前記増幅反応部の温度を前記サンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でDNAを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部をさらに備え、
前記制御部は前記増幅反応温度制御部の温度制御も行なう請求項1から3のいずれかに記載の遺伝子多型診断用装置。
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