CN101155917A - 基因多态性诊断用装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的优选方式使用至少具备分别对应各多个多态性位点发出荧光的探针的多个探针配置部的基因多态性诊断用反应容器。该装置的特征在于，控制部(118)基于从荧光检测部(64)得到的荧光检测值的每单位时间的荧光强度值(time－course(タイムコ一ス)的斜度)判定基因多态性的有无。

Description

基因多态性诊断用装置
技术领域
本发明涉及一种使用适于在现场进行各种自动分析例如基因分析的研究或临床的反应容器并用于检测以人为主以及动物或植物的基因组DNA的多态性、特别是SNP(单碱基多态性)的反应容器处理装置以及使用该基因多态性检测结果进行患病率的诊断、给药的种类与效果及副作用的关系的诊断等的装置。
背景技术
作为利用基因多态性来预测疾病的患病容易度等的方法或装置，提出了如下所述的方法或装置。
为了决定患者是否容易患上败血病及/或败血病是否快速进展，从患者身上采集核酸样品，检测该样品中的2型(pattern)等位基因或与2型等位基因连锁不平衡的标记基因，如果检测出2型等位基因或与2型等位基因连锁不平衡的标记基因，则判断为该患者容易患败血病(参照在专利文献1。)。
为了诊断人的flt-1基因中的1或1以上的单核苷多态性，通过决定人核酸的1或1以上的位置：1953、3453、3888(分别按照EMBL受理编号X51602中的位置)、519、786、1422、1429(分别按照EMBL受理编号D64016中的位置)、454(按照序列编号3)及696(按照序列编号5)的序列，参照flt-1基因中的多态性，决定此人的体质(参照专利文献2。)。
有关于鉴别SNP位点的碱基即分型的很多手法的报道。下述手法为其中具有代表性的手法。
为了使用较少量的基因组DNA，对涉及到数十万处的SNP位点，进行分型，使用基因组DNA及多对引物同时扩增至少包括一个单碱基多态性位点的碱基序列，使用扩增后的多个碱基序列，利用分型工序辨别该碱基序列中含有的单碱基多态性位点的碱基。作为该分型工序，使用侵入(invader)法或荧光定量PCR(Taqman PCR)法(参照专利文献3。)。
专利文献1：特表2002-533096号公报
专利文献2：特开2001-299366号公报
专利文献3：特开2002-300894号公报
专利文献4：专利第3452717号公报
发明内容
诊断基因多态性时的分型反应需要耗费时间。例如在利用荧光检测值的绝对值进行分型反应的情况下，如果持续测定直至出现与荧光的基础值的有意义差，需要30分钟～2小时。
另外，为了求得荧光检测值的绝对值必需荧光的基础值，但基础值由于光源的强度变动等主要原因而发生经时变化。所以，为了从标记荧光检测荧光强度的同时检测成为基础值的荧光强度，必需为与标记荧光不同的其他基础值检测用的荧光色素。该基础值检测用的荧光色素也与标记荧光同样昂贵，所以成本提高。
本发明的目的在于提供一种以短时间测定分型反应并同时不需要基础值检测及为此的荧光色素的基因多态性诊断用装置。
在本发明中，使用至少具备分别保持对应各多个多态性位点并发出荧光的探针的多个探针配置部的基因多态性诊断用反应容器。所以，本发明的基因多态性诊断用装置具备安装该反应容器的反应容器安装部，如图1所示，具备安装有移送并分注液体的分注部112；和将反应容器的探针配置部的温度控制在基因组DNA和分型试剂的反应液与所述探针发生反应的温度的分型反应温度控制部110；和向反应容器的各探针配置部照射激励光进而检测荧光的荧光检测部64；和至少控制分注部64的分注动作、分型反应温度控制部110的温度控制及荧光检测部64的检测动作的控制部118。控制部118基于从荧光检测部64得到的荧光检测值的每单位时间的荧光强度值(time-course(タイムコ一ス)的斜度)判定基因多态性的有无。
例如，在反应的初期阶段，也可以通过荧光检测值的每单位时间的荧光强度值是否超过某种阈值来判定是否存在基因多态性。
作为分型反应使用侵入反应的情况下，分型反应温度控制部110成为用于侵入反应的温调部。
在优选方式中，反应容器的探针配置部相对各多态性位点进行纯合子和杂合子不同的荧光标记，显示利用控制部118的测定结果的显示部基于2种标记荧光的荧光强度进行等位基因判定的显示，并同时显示每单位时间的荧光强度值作为该显示的荧光强度值。
反应容器进而具备储存比重低于反应液的不挥发性液体的不挥发性液体储存部。
在该基因多态性诊断用装置中进行样品的基因组DNA的扩增反应的情况下，反应容器进而具备储存含有分别夹持结合多个多态性位点的多个引物的基因扩增试剂的基因扩增试剂储存部，和对样品和所述基因扩增试剂的混合液进行基因扩增反应的扩增反应部，该基因多态性诊断用装置进而具备将扩增反应部的温度控制在用于使DNA在样品和基因扩增试剂的反应液内扩增的基因扩增的温度的扩增反应温度控制部120，控制部118也进行扩增反应温度控制部120的温度控制。
作为基因扩增反应使用PCR反应的情况下，扩增反应温度控制部120成为用于PCR反应的温度循环用的温调部。
为了从外部操作控制部118或显示检查结果，也可以使个人电脑(PC)122与控制部118连接。
在此，如果表示多态性位点与引物的关系，则是为了扩增一个多态性位点而必需夹持结合该多态性位点的一对引物。成为对象的生物体样品中存在多种多态性位点，所以在这些多态性位点存在于彼此分离的位置的情况下，必需多态性位点的种类的数目的2倍种引物。不过，2个多态性位点接近的情况下，分别夹持这些多态性位点结合引物扩增本身也可以在这2个多态性位点之间不结合引物，而只在2个多态性位点的序列的两侧结合引物扩增。因而，必要的引物种类不一定需要为多态性位点的种类的数目的2倍。本发明中的“分别夹持结合多个多态性位点的多个引物”不只包括一对引物夹持结合1个多态性位点的情况，也包括夹持结合2或2以上的多态性位点的情况，是指扩增多个多态性位点所必需的种类的引物。
多态性包括变异、缺失、重复、转移等。具有代表性的多态性是SNP。
生物体样品为血液、唾液、基因组DNA等。
基因扩增试剂的一例为PCR反应试剂。
SNP的分型中，在进入扩增工序的阶段必须调整基因组DNA，其中需要花费时间、人力和成本。如果只着眼于扩增DNA的PCR法，还提出了不用进行前处理而从血液等样品直接进行PCR反应的方法。于是，在扩增含有基因的样品中的目的基因的核酸合成法中，向基因扩增反应液中添加含有基因的样品中的基因包含体或含有基因的样品本身，添加后的该反应液的pH在为8.5～9.5(25℃)下，扩增含有基因的样品中的目的基因(参照专利文献4。)。
已经构建的分型系统，为了用PCR法扩增需要进行分型的多个SNP区域，虽然最初采集的DNA量很少即可，但在PCR法扩增之前，必需进行预先从生物体样品中提取DNA的前处理。为此该前处理需要花费时间和人力。
在将直接PCR法与分型方法结合起来时，对需要进行分型的多个SNP位点同时进行扩增的自动化系统尚未构建起来。
分型工序可以使用侵入法或荧光定量PCR法。这种情况下，分型试剂为侵入试剂或荧光定量PCR试剂。
图13是概要地表示将本发明的反应容器用作基因多态性诊断用试剂盒来检测基因多态性时的检测方法的图。在此，扩增工序使用PCR法、分型工序使用侵入法进行说明。
在PCR工序中，向血液等生物体样品2中添加PCR反应试剂4，或相反，向PCR反应试剂4中添加生物体样品2。
PCR反应试剂4被预先调整，含有用于需要测定的SNP位点的多个引物，向其中添加用于调节pH的pH缓冲液、4种脱氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)类、热稳定性合成酶、及MgCl2、KCl等盐类等必需的试剂。此外，还可以根据需要添加表面活性剂或蛋白等物质。有时在本发明中使用的扩增工序的PCR法是使目的多个SNP位点同时扩增的方法。生物体样品可以是实施了核酸提取操作的样品，也可以是没有实施核酸提取操作的样品。从没有实施核酸提取操作的生物体样品，直接利用PCR法，使含有这些SNP位点的多个基因组DNA扩增的情况下，使含有用于这些SNP位点的多个引物的基因扩增反应试剂作用于生物体样品，在与样品2混合时使其在25℃、pH8.5～9.5的条件下，发生PCR反应。
除了三(羟甲基)氨基甲烷与盐酸、硝酸、硫酸等无机酸的组合以外，pH缓冲液还可以使用各种pH缓冲液。在PCR反应试剂中，优选以10mM～100mM的浓度使用已调整pH的缓冲液。
引物是指作为起到利用PCR反应合成DNA的开始点作用的寡核苷酸。引物可以合成，也可以从生物界中分离。
合成酶是通过附加引物来合成DNA用的酶，也包括化学合成系。作为适当的合成酶，包括大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶(polymerase)I、大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶的Klenow片段(Klenow fragment)、T4DNA聚合物、TaqDNA聚合酶、T.litoralis DNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、Hot Start Taq聚合酶、KOD DNA聚合酶、EX TaqDNA聚合酶、逆转录酶等，但不被这些所限定。“热稳定性”是指即使在高温下、最好在65～95℃下也可以保持其活性的化合物的性质。
在PCR工序中，使生物体样品2与PCR反应试剂4的混合液，按照规定的温度循环进行PCR反应。PCR温度循环包括变性、引物附着(退火(annealing))及引物延伸的3个工序，通过反复进行该循环，使DNA扩增。作为各工序的一例，变性工序为94℃下1分钟，引物附着工序为55℃下1分钟，引物延伸为72℃下1分钟。生物体样品可以为实施了基因组提取操作的样品，但在此也可以使用没有实施基因组提取操作的样品。即使是没有实施基因组提取操作的生物体样品，也可以在PCR温度循环的高温下，DNA从血细胞或细胞游离出来，PCR反应所必需的试剂与DNA接触，反应进行。
PCR反应结束后，添加作为分型试剂的侵入试剂6。侵入试剂6中含有发出荧光的FRET探针及切割酶(cleavase：结构特异的DNA分解酶)。FRET探针是具有与基因组DNA完全没有关系的序列的荧光标记寡核苷酸，无论SNP的种类如何，序列大多共用。
接着，向多个探针配置部8中添加已添加侵入试剂6的反应液，使其反应。在各探针配置部8，分别对应各多个SNP位点保持侵入探针和报告(reporter)探针，反应液与侵入探针反应，只要存在对应该报告探针的SNP，就可以发出荧光。
在专利文献3的段落[0032]～[0034]中有关于侵入法的详细记载。
各报告探针只要根据与其对应的SNP碱基准备2种，就可以辨别出该SNP为纯合子还是杂合子。
在分型工序中使用的侵入法是通过使等位基因特异寡核苷酸与含有分型对象的SNP的DNA发生杂交(hybridyzation)，来分型SNP位点的方法，是使用如下所述物质的方法，即：含有分型对象的SNP的DNA，具有对含有分型对象的SNP的各等位基因特异的2种报告探针及1种侵入探针，和识别DNA结构并切断的具有特殊内切酶(endonuclease)活性的酶(参照专利文献3。)。
在本发明中，由于基于荧光检测值的每单位时间的荧光强度值进行测定，所以不需要等到反应终止，可以在反应的需要的阶段判断基因多态性的有无，所以测定时间可以缩短至数分～10分钟左右的短时间。
另外，不需要求荧光强度的绝对值，所以不需要用于得到荧光强度的基础值的荧光色素，有助于降低成本。
即使在进行等位基因判定的情况下，也可以缩短测定时间。
附图说明
图1是概要地显示本发明的模块图。
图2A是反应容器的第1实施例的主视图。
图2B是反应容器的第1实施例的俯视图。
图3A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的主视图。
图3B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的俯视图。
图4A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的主视图。
图4B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的俯视图。
图5A是反应容器的第2实施例的主视图。
图5B是反应容器的第2实施例的俯视图。
图5C是表示反应容器的第2实施例的在图5B的X-X线位置的放大截面图。
图6A是作为在同一实施例中的扩增反应部被注入反应液的状态下在图5B的Y-Y线位置的放大截面图表示的图。
图6B是作为在同一实施例中的扩增反应部被回收反应液的状态下在图5B的Y-Y线位置的放大截面图表示的图。
图7A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的主视图。
图7B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前半部分的俯视图。
图8A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的主视图。
图8B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后半部分的俯视图。
图9是表示将本发明的反应容器用作试剂盒，用于检测生物体样品的SNP的简易型反应容器处理装置的一个实施例的概要截面图。
图10是表示同一检测装置中的检测器的概要截面图。
图11是表示利用2种标记荧光的荧光检测强度的经时变化的图。
图12是表示用于进行等位基因判定的显示例的图。
图13是概要地表示本发明相关的SNP检测方法的流程图。
图中，2-样品，4-PCR反应试剂，6-侵入试剂，8-探针配置部，10、10a-基板，12-样品注入部，14-分型试剂储存部，16-矿物油储存部，18-探针配置部，20-薄膜，22-密封材料，28-喷嘴，30-基因扩增试剂储存部，31-PCR终止液注入部，32-扩增反应部，34a、34b-扩增反应部的喷口，36a、36b-喷口的开口，41-反应容器，60、62-加热模块，64-检测器，66-送液臂，70-尖端。
具体实施方式
图2A及图2B是反应容器的第1实施例，图2A为主视图，图2B为俯视图。
在平板状的基板10的同一侧，试剂储存部14及比重低于反应液的不挥发性液体储存部16形成为凹部。在基板10的同一侧，进而还形成反应部18。试剂储存部14和不挥发性液体储存部16被薄膜20密封，在用喷嘴吸入试剂和矿物油并移送至其他场所时，去除该薄膜20用喷嘴吸入，或者可以用喷嘴穿透该薄膜20时使喷嘴穿透该薄膜，用喷嘴吸入。这样的薄膜20例如为铝箔、铝与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)薄膜等树脂薄膜的层叠膜等，为了不容易剥落，利用熔融或粘接贴附。
从薄膜20上，用大小为覆盖试剂储存部14、不挥发性液体储存部16及反应部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10的表面。
作为比重低于反应液的不挥发性液体，可以使用矿物油(石油)、植物油、动物油、硅油及二苯醚等。矿物油是从凡士林蒸馏得到的液体的烃混合物，也被称为流动石蜡、流动凡士林、白油等，也包括低比重的汽油。作为动物油，可以使用鳕鱼肝油、狭鳞庸鲽油、鲱油、罗非鱼(Orangeroughy)油或鲨鱼肝油等。另外，作为植物油，可以使用卡诺拉(canola)油、杏仁油、绵子油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、豆油等。
在实施例中，将矿物油用作不挥发性液体，以后将不挥发性液体储存部称为矿物油储存部。
作为该反应容器的具体用途的一例，为注入利用PCR反应扩增DNA的样品反应液并利用侵入反应检测SNP的基因多态性诊断用试剂盒。参照图2A及图2B，详细说明该基因多态性诊断用试剂盒的实施例。
在平板状的基板10的同一侧，样品注入部12、分型试剂储存部14及矿物油储存部16形成为凹部。在基板10的同一侧，进而还形成多个探针配置部18。
样品注入部12是注入利用PCR反应扩增DNA的生物体样品反应液的部位，以在使用前的状态下尚未注入样品的空的状态提供。分型试剂储存部14储存10～300μL对应多个多态性位点配制的分型试剂，矿物油储存部16储存20～300μL用于防止反应液的蒸发的矿物油，这些分型试剂储存部14和矿物油储存部16被喷嘴可以穿透的薄膜20密封。
各探针配置部18分别保持对应各多个多态性位点并发出荧光的探针，成为可以在从矿物油储存部16分注矿物油时保持该矿物油的凹部。各探针配置部18的凹部的尺寸例如为直径100μm～2mm、深50μm～1.5mm的圆形。
从薄膜20上，用大小为覆盖样品注入部12、分型试剂储存部14、矿物油储存部16及探针配置部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10的表面。该密封材料22也可以为铝箔、铝与树脂的层叠膜等，但贴附强度比薄膜20弱，所以利用粘合剂等贴附成可以剥离的程度。
为了从底面侧测定荧光，用低自荧光性(很少从其自身产生荧光的性质)而且光透过性的树脂例如聚碳酸酯等原材料形成基板10。基板10的厚度为0.3～4mm，优选为1～2mm。从低自荧光性的观点出发，优选基板10的厚度薄。
下面显示该实施例的反应容器的使用方法。
如图3A及图3B所示，使用时剥下密封材料22。密封分型试剂储存部14和矿物油储存部16的薄膜20不被剥下而残留不变。
利用吸量管(pipet)26等向样品注入部12注入2～20μL已利用PCR反应扩增DNA的样品反应液24。然后，将该反应容器安装于检测装置。
在检测装置中，如图4A及图4B所示，喷嘴28穿透薄膜20插入分型试剂储存部14吸入分型试剂，分型试剂被该喷嘴28移送至样品注入部12。通过在样品注入部12反复进行喷嘴28的吸入和喷出，使样品反应液与分型试剂混合。
然后，各0.5～4μL样品反应液与分型试剂的反应液被喷嘴28分注到各探针配置部18。从矿物油储存部16利用喷嘴28向各探针配置部18分别分注0.5～10μL矿物油。矿物油向探针配置部18的分注也可以在反应液向探针配置部18分注之前。在各探针配置部18，各分注0.5～10μL矿物油，该矿物油覆盖反应液的表面，防止伴随着检测装置的分型反应温度控制部的加热而分型反应时间中的反应液的蒸发。
在各探针配置部18，反应液只要有与探针反应的规定的SNP，就会从该探针发出荧光。通过从基板10的背面侧照射激励光来检测出荧光。
图5A、图5B及图5C是反应容器的第2实施例。图5A是主视图，图5B是俯视图，图5C是在图5B的X-X线位置的放大截面图。
该反应容器将没有实施核酸提取操作的生物体样品作为样品注入，同时进行利用PCR反应的DNA的扩增和利用侵入反应的SNP检测。其中，也可以注入未实施核酸提取操作的生物体样品。
与图2A及图2B的实施例同样，在平板状的基板10a的同一侧，形成样品注入部12、分型试剂储存部14、矿物油储存部16及多个探针配置部18。在该反应容器中，进而在基板10a的同一侧形成基因扩增试剂储存部30、PCR终止液注入部31及扩增反应部32。
基因扩增试剂储存部30也在基板10a形成为凹部，储存含有分别夹持结合多个多态性位点的多个引物的基因扩增试剂。基因扩增试剂储存部30与分型试剂储存部14及矿物油储存部16一起用可以被喷嘴穿透的薄膜20密封。在基因扩增试剂储存部30中储存2～300LPCR反应试剂。与图2A及图2B的实施例同样，在分型试剂储存部14储存10～300μL分型试剂，矿物油储存部16中储存20～300μL的矿物油。
PCR终止液注入部31是用于混合在扩增反应部32终止PCR反应的反应液与分型试剂的部位，在基板10a形成为凹部，以使用前的状态为空的状态提供。
扩增反应部32是对PCR反应试剂和样品的混合液进行基因扩增反应的部位。
图6A及图6B表示放大扩增反应部32的部分截面。图6A及图6B是在图5B的Y-Y线位置的截面图。如图6A及图6B所示，扩增反应部32的液体分注用喷口34a、34b具有对应喷嘴28的顶端形状的形状的开口36a、36b，为了可以与喷嘴28的顶端贴紧而用PDMS(聚二甲基硅氧烷)或硅酮橡胶等弹性原材料构成。
扩增反应部32为了使热传导系数很好而该部分的基板10a的下面侧如图6A及图6B所示，壁厚变薄。该部分的壁厚例如为0.2～0.3mm。
样品注入部12在该实施例中被注入没有实施核酸提取操作的生物体样品，但以使用前的状态尚未注入样品的空的状态提供。
与图2A及图2B的实施例相同，分型试剂储存部14储存对应多个多态性位点配制的分型试剂，矿物油储存部16储存用于防止反应液的蒸发的矿物油。
各探针配置部18也与图2A及图2B的实施例相同，分别保持对应各多个多态性位点发出荧光的探针，成为在从矿物油储存部16分注矿物油时可以保持该矿物油的凹部。
从薄膜20上，用大小为覆盖样品注入部12、PCR终止液注入部31、分型试剂储存部14、矿物油储存部16、基因扩增试剂储存部30、扩增反应部32及探针配置部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10a的表面。薄膜20与密封材料22的材质及其贴附方法与图2A及图2B的实施例相同。
为了从底面侧测定荧光，也用低自荧光性而且光透过性的树脂例如聚碳酸酯等原材料形成基板10a。基板10的厚度为1～2mm。
下面显示该实施例的反应容器的使用方法。
如图7A及图7B所示，使用时剥下密封材料22。密封分型试剂储存部14、矿物油储存部16及基因扩增试剂储存部30的薄膜20不被剥下而残留不变。
利用吸量管26等向样品注入部12注入0.5～2μL样品25。在图2A及图2B的实施例中，注入的样品为在外部利用PCR反应扩增DNA的样品反应液，但在该实施例中注入的样品为没有实施核酸提取操作的生物体样品例如血液。样品也可以为实施了核酸提取操作的生物体样品。注入样品之后，将该反应容器安装于检测装置。
在检测装置中，如图8A及图8B所示，喷嘴28穿透薄膜20插入基因扩增试剂储存部30吸入PCR反应试剂，2～20μLPCR反应试剂被该喷嘴28移送至样品注入部12。通过在样品注入部12反复进行喷嘴28的吸入和喷出，使样品反应液与PCR反应试剂混合，成为PCR反应液。
接着，如图6A所示，该PCR反应液被喷嘴28分注到扩增反应部32。即，喷嘴28插入扩增反应部32的一方的喷口34a，注入该PCR反应液38，接着，为了防止在扩增反应部32的反应中PCR反应液38蒸发，利用喷嘴38向喷口34a、34b注入矿物油40，用矿物油40覆盖在喷口34a、34b的PCR反应液38的表面。
PCR反应终止后，利用喷嘴28回收PCR反应液，但此时为了容易回收，如图6B所示，从扩增反应部32的一方喷口34a注入矿物油40。反应终止后的PCR反应液38a被压向另一方喷口34b。因此，插入该喷嘴28，PCR反应液38a被吸入到喷嘴28。喷口34a、34b形成为其开口36a、36b的形状与喷嘴28的形状一致，而且用弹性原材料形成，所以喷嘴28与喷口34a、34b贴紧，防止液体漏出，容易进行PCR反应液的注入和回收的操作。
利用喷嘴28，从扩增反应部32回收的反应终止后的PCR反应液38a被移送至PCR终止液注入部31。
接着，喷嘴28穿透薄膜20插入分型试剂储存部14，吸入分型试剂，分型试剂被该喷嘴28移送至并被注入PCR终止液注入部31。在PCR终止液注入部31，通过反复进行利用喷嘴28的吸入和喷出，混合PCR反应液和分型试剂。
然后，各0.5～4μL的PCR反应液与分型试剂的反应液被喷嘴28分注到各探针配置部18。从矿物油储存部16利用喷嘴28向各探针配置部18分注各0.5～10μL矿物油。矿物油向探针配置部18的分注也可以在反应液向探针配置部18分注之前。在各探针配置部18，矿物油覆盖反应液的表面，防止伴随着检测装置的分型反应温度控制部的加热而分型反应时间中的反应液的蒸发。
在各探针配置部18，反应液只要有与探针反应的规定的SNP，就会从该探针发出荧光。通过从基板10的背面侧照射激励光来检测出荧光。
以下显示各反应试剂的组成，详细说明本发明，但本发明的技术范围不限于这些实施例。
PCR反应试剂为已知的试剂，例如可以使用如专利文献3的段落[0046]中记载的含有引物、DNA聚合酶及TaqStart(CLONTECH Laboratories公司制)的反应试剂。另外，也可以在PCR反应试剂中混入AmpDirect(岛津制作所制)。引物例如可以使用在专利文献3的表1中记载的SNPID1～20、序列编号1～40等。
作为分型试剂使用侵入试剂。作为该侵入试剂，使用侵入检测试剂盒(invader assay kit)(Third Wave Technology公司制)。例如，将信号缓冲液(signal buffer)、FRET探针、结构特异DNA分解酶及等位基因特异探针配制成如专利文献3的段落[0046]中记载的浓度。
图9是表示将本发明的反应容器用作试剂盒，用于检测生物体样品的SNP的简易型反应容器处理装置的一个实施例的图。在装置内上下配置一对加热模块60和62，构成反应容器安装部，在下侧加热模块60上平行地并列设置5张向本发明的反应容器41中注入样品的反应容器。这些加热模块60、62可以向箭头所示的Y方向移动。
在上侧加热模块62设置在利用喷嘴28移送或吸入、喷出液体时可以开闭地打开盖的窗。
下侧的加热模块60具备将扩增反应部32的温度控制成规定的温度循环的扩增反应温度控制部和将探针配置部18的温度控制成使DNA和探针反应的温度的分型反应温度控制部。扩增反应温度控制部的温度例如被设定成在94℃、55℃及72℃的3个阶段依次变化，重复进行该循环。分型反应温度控制部的温度例如被设定成63℃。
作为反应容器41使用如图2的实施例的不具备扩增反应部的反应容器的情况下，不需要控制扩增反应部的温度的扩增反应温度控制部。
另外，在加热模块60的下部设置进行荧光检测的检测器64，检测器64向图的箭头X方向移动，检测来自探针配置部18的荧光。为了检测荧光而在加热模块60设置开口。利用反应容器安装部的探针配置部18的Y方向移动和检测器64的X方向移动，进行在各探针的荧光检测。
为了进行利用喷嘴28的移送或吸入、喷出液体，作为分注部设置送液臂66，送液臂66具备喷嘴28。喷嘴28在其顶端装卸自如地安装一次性尖端70。
为了控制加热模块60、62、荧光检测部64及送液臂66的动作，在它们的附近配置控制部118。控制部118具备CPU，保持用于动作的程序。控制部118控制利用加热模块60、62实现的分型反应部110或扩增部120的温度控制、荧光检测部64的检测动作及分注部112的送液臂66的分注动作。
在作为反应容器41使用图2的反应容器之类的不具备基因扩增反应部的反应容器的情况下，不需要控制基因扩增反应部的温度的扩增部，扩增部18也不需要具备用于控制扩增部的温度的功能。
图10是具体地表示检测器64的图。检测器64具备发出例如473nm的激光的激光二极管(laser diode)(LD)或发光二极管(LED)92作为激励光源，具备使该激光聚光、照射于反应容器41的探针配置部的底面的一对透镜94、96。透镜94使来自激光二极管92的激光聚光成为平行光，透镜96是使变为平行的激光会聚、照射于反应容器41的底面的物镜。物镜96还起到使从反应容器41产生的荧光聚光的透镜的作用。在一对透镜94、96之间设有分色镜(dichroic mirror)98，分色镜98的波长特性被设定为使激励光透过、使荧光反射。在分色镜98的反射光(荧光)的光程上进一步设置分色镜100。分色镜100的波长特性被设定为反射例如525nm的光、透过例如605nm的光。在利用分色镜100的反射光的光程上配置有检测525nm的荧光的透镜102和光检测器104，在利用分色镜100的透过光的光程上配置有检测605nm的荧光的透镜106和光检测器108。通过利用此两个检测器104、108检测2种荧光，检验对应固定于各探针配置部位置的侵入探针的SNP的有无，和该SNP为纯合子还是杂合子。作为标记荧光体，可以使用例如FAM、ROX、VIC、TAMRA、RedmondRed等。
图11是表示荧光标记反应容器的探针配置部的探针，利用具有SNP的DNA的侵入反应而标记荧光进行显色的过程(time-course)的图。对作为荧光色素用FAM标记的探针和用VIC标记的探针进行测定。根据标记荧光色素不同而不同，不过可见荧光强度在缓慢增加的状态。
以往，基于成为基础的荧光强度值与侵入反应终止时刻的倾向强度值之间的差进行SNP的有无的判定。
在本发明中，基于如图11所示的具有荧光强度的time-course的需要的斜度的部分的每单位时间的荧光强度值进行测定。
图12是表示用于判定等位基因的显示例的图。在反应容器的探针配置部中，相对各SNP，分别用例如FAM荧光标记正常型的纯合子、用例如VIC荧光标记变异型的纯合子。图12的横轴为利用VIC的荧光强度的每单位时间的荧光强度值，纵轴为利用FAM的荧光强度的每单位时间的荧光强度值。
目前，在例如用A表示某样品的测定值之类的主要检测出FAM的荧光的情况下，在该样品中存在SNP，可以判定该SNP为正常型的纯合子。另外，在例如用B表示该样品的测定值之类的主要检测出VIC的荧光的情况下，在该样品中存在SNP，可以判定该SNP为变异型的纯合子。另外，在例如用C表示某样品的测定值之类的均检测出FAM的荧光和VIC的荧光的情况下，在该样品中存在SNP，可以判定该SNP为杂合子。
图10的检测器64构成为在利用光源的激励光下激发，测定2波长的荧光，但为了测定2波长的荧光而可以用不同的激发波长激发，作为检测器64也可以构成为使用2个光源。
产业上的可利用性
本发明除了各种化学反应的测定以外，例如可以在基因分析的研究或临床领域用于各种自动分析，例如可以用于检测以人为主以及动物或植物的基因组DNA的多态性、特别是SNP(单碱基多态性)，进而可以用于使用该结果进行患病率的诊断、给药的种类与效果及副作用的关系的诊断等，此外还可以用于动物或植物的品种判定、传染病诊断(感染菌的型判定)等。

Claims (4)

1.一种基因多态性诊断用装置，其具备：
反应容器安装部，其安装有至少具备分别保持与各多个多态性位点对应并发出荧光的探针的多个探针配置部的基因多态性诊断用反应容器；和
移送并分注的分注部；和
分型反应温度控制部，其将所述探针配置部的温度控制于基因组DNA和分型试剂的反应液与所述探针发生反应的温度；和
荧光检测部，其向所述各探针配置部照射激励光进而检测荧光；和
控制部，其至少控制所述分注部的分注动作、所述分型反应温度控制部的温度控制及所述荧光检测部的检测动作，
所述基因多态性诊断用装置的特征在于，所述控制部基于从所述荧光检测部得到的荧光检测值的每单位时间的荧光强度值判定基因多态性的有无。
2.根据权利要求1所述的基因多态性诊断用装置，其中，
所述探针配置部相对各多态性位点以纯合子和杂合子形成不同的荧光标记，且
对基于所述控制部的测定结果进行显示的显示部以基于所述两种标记荧光的荧光强度进行等位基因判定的方式显示，并同时显示每单位时间的荧光强度值作为该显示的荧光强度值。
3.根据权利要求1或2所述的基因多态性诊断用装置，其中，
所述反应容器还具备储存比重比反应液低的不挥发性液体的不挥发性液体储存部。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的基因多态性诊断用装置，其中，
所述反应容器还具备：
基因扩增试剂储存部，其储存含有分别夹持结合多个多态性位点的多个引物的基因扩增试剂；和
扩增反应部，其对样品和所述基因扩增试剂的混合液进行基因扩增反应，且
该基因多态性诊断用装置还具备将所述扩增反应部的温度控制在用于使DNA在所述样品和基因扩增试剂的反应液中扩增的基因扩增的温度的扩增反应温度控制部，
所述控制部也进行所述扩增反应温度控制部的温度控制。
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