JP4580981B2 - 遺伝子多型診断用装置 - Google Patents
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Description
本発明は場において各種自動解析、例えば遺伝子解析の研究や臨床を行なうのに適する反応容器を用いて人間を初めとする動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出するための反応容器処理装置、並びにその遺伝子多型検出結果を用いて病気罹患率の診断、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係の診断などを行なう装置に関するものである。
遺伝子多型を利用して病気の罹りやすさなどを予測する方法又は装置として、下記のようなものが提案されている。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び／又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン２対立遺伝子、又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン２対立遺伝子又はパターン２対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する（特許文献１参照。）。
ヒトのｆｌｔ−１遺伝子中の１又はそれ以上の単一ヌクレオチド多型性の診断のために、ヒトの核酸の１又はそれ以上の位置：１９５３、３４５３、３８８８（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｘ５１６０２中の位置に従う）、５１９、７８６、１４２２、１４２９（各々ＥＭＢＬ受理番号Ｄ６４０１６中の位置に従う）、４５４（配列番号３に従う）及び６９６（配列番号５に従う）の配列を決定し、ｆｌｔ−１遺伝子中の多型性を参照することにより、そのヒトの体質を決定する（特許文献２参照。）。
ＳＮＰ部位の塩基を判別する、いわゆるタイピングについては多くの手法が報告されている。そのうちの代表的なものは次の方法である。
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。
特表２００２−５３３０９６号公報
特開２００１−２９９３６６号公報
特開２００２−３００８９４号公報
特許第３４５２７１７号公報
比較的に少量のゲノムＤＮＡを用いて数十万箇所に及ぶＳＮＰ部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムＤＮＡ及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンＰＣＲ法を用いる（特許文献３参照。）。
遺伝子多型を診断する際のタイピング反応には時間がかかる。例えば、タイピング反応を蛍光検出値の絶対値により行なう場合、蛍光のベース値との有意差がでるまで測定を続けると３０分から２時間を要することがある。
また蛍光検出値の絶対値を求めるには蛍光のベース値を求める必要があるが、ベース値は光源の強度変動などの要因で経時変化をする。そのため、標識蛍光からの蛍光強度検出とともにベース値となる蛍光強度を検出ために標識蛍光とは別のベース値検出用の蛍光色素が必要となる。そのベース値検出用の蛍光色素も標識蛍光と同様に高価であるため、コスト高を招くおそれがある。
本発明はタイピング反応を短時間で測定するとともに、ベース値検出及びそのための蛍光色素を不要にする遺伝子多型診断用装置を提供することを目的とするものである。
本発明はタイピング反応を短時間で測定するとともに、ベース値検出及びそのための蛍光色素を不要にする遺伝子多型診断用装置を提供することを目的とするものである。
本発明では複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を少なくとも備えた遺伝子多型診断用反応容器を用いる。そのために、本発明の遺伝子多型診断用装置はその反応容器を装着する反応容器装着部を備え、図１に示されるように、液を移送して分注する分注部１１２と、反応容器のプローブ配置部の温度をゲノムＤＮＡとタイピング試薬との反応液が前記プローブと反応する温度に制御するタイピング反応温度制御部１１０と、反応容器の各プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部６４と、分注部６４の分注動作、タイピング反応温度制御部１１０の温度制御及び蛍光検出部６４の検出動作を少なくとも制御する制御部１１８とを備えており、制御部１１８は蛍光検出部６４から得られる蛍光検出値の単位時間当たりの蛍光強度値（タイムコースの傾斜）に基づいて遺伝子多型の有無の判定を行なうことを特徴とするものである。
例えば、反応の初期段階においても蛍光検出値の単位時間当たりの蛍光強度値がある閾値を越えたかどうかにより、遺伝子多型があるか否かを判定する。
タイピング反応としてインベーダ反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御部１１０はインベーダ反応のための温調部となる。
タイピング反応としてインベーダ反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御部１１０はインベーダ反応のための温調部となる。
好ましい形態では、反応容器のプローブ配置部はそれぞれの多型部位に対してホモ接合体とヘテロ接合体とで異なる蛍光標識がなされたものであり、制御部１１８による測定結果を表示する表示部は２種類の標識蛍光の蛍光強度に基づいてアレル判定を行なうように表示するとともに、その表示の蛍光強度値として単位時間当たりの蛍光強度値を表示する。
反応容器は反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部をさらに備えたものとすることができる。
反応容器は反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部をさらに備えたものとすることができる。
この遺伝子多型診断用装置でサンプルのゲノムＤＮＡの増幅反応まで行なう場合には、反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、サンプルと前記遺伝子増幅試薬との混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備えたものとし、この遺伝子多型診断用装置は増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部１２０をさらに備えたものとし、制御部１１８は増幅反応温度制御部１２０の温度制御も行なうものとすることができる。
遺伝子増幅反応としてＰＣＲ反応を使用する場合は、増幅反応温度制御部１２０はＰＣＲ反応のための温度サイクル用の温調部となる。
制御部１１８を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部１１８にパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１２２を接続してもよい。
制御部１１８を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部１１８にパーソナルコンピュータ（ＰＣ）１２２を接続してもよい。
ここで、多型部位とプライマーの関係を示すと、１つの多型部位を増幅するためにはその多型部位をはさんで結合する一対のプライマーが必要になる。対象となる生体サンプルには複数種類の多型部位が存在するので、それらの多型部位が互いに離れた位置に存在する場合には多型部位の種類の数の２倍の種類のプライマーが必要になる。しかし、２つの多型部位が接近している場合には、それらの多型部位それぞれをはさんでプライマーを結合させて増幅することも、またそれらの２つの多型部位の間にはプライマーを結合させず、２つの多型部位の配列の両側にのみプライマーを結合させて増幅することもできる。したがって、必要なプライマーの種類は必ずしも多型部位の種類の数の２倍になるわけではない。本発明における「複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマー」とは一対のプライマーが１つの多型部位をはさんで結合する場合だけでなく、２又はそれ以上の多型部位をはさんで結合する場合も含めて、複数の多型部位を増幅するのに必要な種類のプライマーという意味で使用している。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはＳＮＰである。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノムＤＮＡなどである。
遺伝子増幅試薬の一例はＰＣＲ反応試薬である。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはＳＮＰである。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノムＤＮＡなどである。
遺伝子増幅試薬の一例はＰＣＲ反応試薬である。
ＳＮＰのタイピングには増幅工程に入る段階でゲノムＤＮＡの調整が必須であり、そこに手間とコストがかかる。ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法だけに着目すれば、前処理なしで血液などのサンプルから直接ＰＣＲ反応を行なわせる方法も提案されている。そこでは、遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、遺伝子を含むサンプル中の遺伝子包含体もしくは遺伝子を含むサンプルそのものを遺伝子増幅反応液に添加して、添加後の該反応液のｐＨが８.５−９.５（２５℃）で遺伝子を含むサンプル中の目的とする遺伝子を増幅する（特許文献４参照。）。
既に構築されているタイピングシステムは、タイピングしようとする複数のＳＮＰ領域をＰＣＲ法で増幅するために、最初に採取するＤＮＡ量は少なくてすむが、ＰＣＲ法で増幅する前に予め生体サンプルからＤＮＡを抽出しておくという前処理が必要である。そのためにその前処理に時間と手間がかかる。
直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ法やタックマンＰＣＲ法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。
直接ＰＣＲ法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のＳＮＰ部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ法やタックマンＰＣＲ法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンＰＣＲ試薬である。
図１３は本発明の反応容器を遺伝子多型診断用試薬キットとして使用して遺伝子多型を検出する際の検出方法を概略的に示したものである。ここでは、増幅工程にはＰＣＲ法、タイピング工程にはインベーダ法を使用するものとして説明する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。
ＰＣＲ工程では血液などの生体サンプル２にＰＣＲ反応試薬４を添加するか、逆にＰＣＲ反応試薬４に生体サンプル２を添加する。
ＰＣＲ反応試薬４は予め調整されたものであり、測定しようとするＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含み、それにｐＨを調整するためのｐＨ緩衝液、４種類のデオキシリボヌクレオチド類、熱安定性合成酵素、及びＭｇＣｌ2、ＫＣｌ等の塩類などの必要な試薬が添加されている。その他に、界面活性剤や蛋白などの物質を必要に応じて添加することができる。本発明で用いることのある増幅工程のＰＣＲ法は、目的とする複数のＳＮＰ部位を同時に増幅させるものである。生体サンプルは核酸抽出操作を施しているものであってもよく、核酸抽出操作を施していないものであってもよい。核酸抽出操作を施していない生体サンプルから直接ＰＣＲ法によりそれらのＳＮＰ部位を含む複数のゲノムＤＮＡを増幅させる場合には、それらのＳＮＰ部位のための複数のプライマーを含む遺伝子増幅反応試薬を生体サンプルに作用させ、サンプル２と混合したときに２５℃でのｐＨが８.５−９.５となる条件下でＰＣＲ反応を起こさせる。
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せのほか、種々のｐＨ緩衝液を使用することができる。ｐＨ調整された緩衝液は、ＰＣＲ反応試薬の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用するのが好ましい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
プライマーはＰＣＲ反応によるＤＮＡ合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
合成酵素はプライマー付加によるＤＮＡ合成用の酵素であり、化学合成系も含む。適切な合成酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．litoralis ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、Hot Start Taq ポリメラーゼ、KOD ＤＮＡポリメラーゼ、EX TaqＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などがあるが、これらに限定されるものではない。「熱安定性」は、高温下、好ましくは６５−９５℃でもその活性を保持する化合物の性質を意味する。
ＰＣＲ工程では、生体サンプル２とＰＣＲ反応試薬４との混合液を所定の温度サイクルに従ってＰＣＲ反応を行なわせる。ＰＣＲ温度サイクルは、変性、プライマー付着（アニーリング）及びプライマー伸長の３工程を含み、そのサイクルを繰り返すことによりＤＮＡを増幅させる。各工程の一例は、変性工程が９４℃で１分間、プライマー付着工程が５５℃で１分間、プライマー伸長が７２℃で１分間である。生体サンプルはゲノム抽出操作を施したものであってもよいが、ここではゲノム抽出操作を施していないものを使用する。ゲノム抽出操作を施していない生体サンプルであっても、ＰＣＲ温度サイクルの高温下でＤＮＡが血球や細胞から遊離し、ＰＣＲ反応に必要な試薬がＤＮＡに接触して反応が進む。
ＰＣＲ反応終了後、タイピング試薬としてインベーダ試薬６が添加される。インベーダ試薬６には蛍光を発するフレット（FRET）プローブ及びクリベース（Cleavase：構造特異的ＤＮＡ分解酵素）が含まれている。フレットプローブはゲノムＤＮＡと全く無関係な配列をもつ蛍光標識オリゴであり、ＳＮＰの種類によらず配列は共通であることが多い。
次に、インベーダ試薬６が添加された反応液を複数のプローブ配置部８に添加して反応をさせる。各プローブ配置部８には、複数のＳＮＰ部位のそれぞれに対応してインベーダプローブとレポータープローブが個別に保持されており、反応液がインベーダプローブと反応し、そのレポータープローブに対応するＳＮＰが存在すれば蛍光を発する。
インベーダ法については、特許文献３の段落［0032］から［0034］に詳しく記載されている。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものを用意すれば、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
各レポータープローブはそれに対応したＳＮＰの塩基に応じて２種類のものを用意すれば、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
タイピング工程で使用するインベーダ法は、アレル特異的オリゴとタイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡとをハイブリダイゼーションすることによりＳＮＰ部位をタイピングする方法であり、タイピング対象のＳＮＰを含むＤＮＡと、タイピング対象のＳＮＰのそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダプローブと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素とを用いる方法である（特許文献３参照。）。
本発明では、蛍光検出値の単位時間当たりの蛍光強度値に基づいて測定を行なうようにしたので、反応が完了するまで待つ必要がなく、反応の所期の段階で遺伝子多型の有無を判断することができるので、測定時間を例えば数分〜１０分程度というような短時間に短縮することができる。
また、蛍光強度の絶対値を求める必要がないので、蛍光強度のベース値を得るための蛍光色素が不要になり、コスト低下に寄与する。
アレル判定を行なう場合にも測定時間を短縮することができる。
また、蛍光強度の絶対値を求める必要がないので、蛍光強度のベース値を得るための蛍光色素が不要になり、コスト低下に寄与する。
アレル判定を行なう場合にも測定時間を短縮することができる。
図２Ａ及び図２Ｂは反応容器の参考例である。図２Ａは正面図、図２Ｂは平面図である。
平板状の基板１０の同じ側に試薬収容部１４及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体収容部１６が凹部として形成されている。基板１０の同じ側にはさらに、反応部１８も形成されている。試薬収容部１４と不揮発性液体収容部１６はフィルム２０で封止されており、試薬とミネラルオイルをノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム２０を取り除いてノズルで吸入するか、又はそのフィルム２０をノズルで貫通可能なものとしておいてノズルを貫通させてノズルで吸入する。そのようなフィルム２０は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないように融着や接着により貼りつけられている。
基板１０の表面は、フィルム２０上から、試薬収容部１４、不揮発性液体収容部１６及び反応部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。
平板状の基板１０の同じ側に試薬収容部１４及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体収容部１６が凹部として形成されている。基板１０の同じ側にはさらに、反応部１８も形成されている。試薬収容部１４と不揮発性液体収容部１６はフィルム２０で封止されており、試薬とミネラルオイルをノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム２０を取り除いてノズルで吸入するか、又はそのフィルム２０をノズルで貫通可能なものとしておいてノズルを貫通させてノズルで吸入する。そのようなフィルム２０は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）フィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないように融着や接着により貼りつけられている。
基板１０の表面は、フィルム２０上から、試薬収容部１４、不揮発性液体収容部１６及び反応部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。
反応液よりも比重の低い不揮発性液体としては、ミネラルオイル（鉱油）、植物油、動物油、シリコーンオイル又はジフェニルエーテルなどを用いることができる。ミネラルオイルはペトロラタムから蒸留により得られる液体の炭化水素混合物であり、流動パラフィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物油としてはタラの肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油又はサメの肝油などを用いることができる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油などを用いることができる。
不揮発性液体としてはミネラルオイルを使用し、以後、不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。
不揮発性液体としてはミネラルオイルを使用し、以後、不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。
この反応容器の具体的な用途の一例は、ＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させたサンプル反応液を注入し、インベーダ反応によりＳＮＰを検出する遺伝子多型診断用試薬キットとなったものである。図２Ａ及び図２Ｂを参照して、その遺伝子多型診断用試薬キットとしての参考例を詳細に説明する。
平板状の基板１０の同じ側にサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、及びミネラルオイル収容部１６が凹部として形成されている。基板１０の同じ側にはさらに、複数のプローブ配置部１８も形成されている。
平板状の基板１０の同じ側にサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、及びミネラルオイル収容部１６が凹部として形成されている。基板１０の同じ側にはさらに、複数のプローブ配置部１８も形成されている。
サンプル注入部１２はＰＣＲ反応によりＤＮＡを増幅させた生体サンプル反応液が注入されるものであるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。タイピング試薬収容部１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を１０〜３００μＬ収容しており、ミネラルオイル収容部１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを２０〜３００μＬ収容しており、これらのタイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６はノズルで貫通可能なフィルム２０で封止されている。
各プローブ配置部１８は複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。各プローブ配置部１８の凹部の大きさは、例えば直径が１００μｍ〜２ｍｍ、深さが５０μｍ〜１.５ｍｍの円形である。
基板１０の表面は、フィルム２０上から、サンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。このシール材２２もアルミニウム箔、アルミニウムと樹脂との積層膜などであるが、貼りつけ強度はフィルム２０よりは弱く、粘着剤などにより剥離可能な程度に貼りつけられている。
基板１０は底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性（それ自身からの蛍光発生が少ない性質のこと）で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板１０の厚さは０.３〜４ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍである。低自蛍光性の観点から基板１０の厚さは薄い方が好ましい。
この参考例の反応容器の使用方法を示す。
図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部１２に外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液２４がピペット２６などにより２〜２０μＬ注入される。その後、この反応容器が検出装置に装着される。
図３Ａ及び図３Ｂに示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４とミネラルオイル収容部１６を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部１２に外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液２４がピペット２６などにより２〜２０μＬ注入される。その後、この反応容器が検出装置に装着される。
検出装置において、図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、ノズル２８がフィルム２０を貫通してタイピング試薬収容部１４に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はそのノズル２８によりサンプル注入部１２に移送される。サンプル注入部１２ではノズル２８による吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とタイピング試薬が混合される。
その後、サンプル反応液とタイピング試薬との反応液がノズル２８により各プローブ配置部１８へ０.５〜４μＬずつ分注される。各プローブ配置部１８にはノズル２８によりミネラルオイル収容部１６からミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注される。プローブ配置部１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１８への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部１８ではミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注されて、そのミネラルオイルが反応液の表面を被い、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
図５Ａ、図５Ｂ及び図５Ｃは反応容器の一実施例である。図５Ａは正面図、図５Ｂは平面図、図５Ｃは図５ＢのＸ−Ｘ線位置での拡大断面図である。
この反応容器は核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入し、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅と、インベーダ反応によるＳＮＰ検出を共に行なうものである。ただし、核酸抽出操作を施している生体サンプルを注入してもよい。
この反応容器は核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入し、ＰＣＲ反応によるＤＮＡの増幅と、インベーダ反応によるＳＮＰ検出を共に行なうものである。ただし、核酸抽出操作を施している生体サンプルを注入してもよい。
平板状の基板１０ａの同じ側に、図２Ａ及び図２Ｂの参考例と同じサンプル注入部１２、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６、及び複数のプローブ配置部１８が形成されている。この反応容器では、さらに遺伝子増幅試薬収容部３０、ＰＣＲ終了液注入部３１、及び増幅反応部３２が基板１０ａの同じ側に形成されている。
遺伝子増幅試薬収容部３０も基板１０ａに凹部として形成され、複数の多型部位それぞれを挟んで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容している。遺伝子増幅試薬収容部３０はタイピング試薬収容部１４及びミネラルオイル収容部１６とともに、ノズルで貫通可能なフィルム２０で封止されている。遺伝子増幅試薬収容部３０にはＰＣＲ反応試薬が２〜３００μＬ収容されている。タイピング試薬収容部１４には図２Ａ及び図２Ｂの参考例と同様に、タイピング試薬が１０〜３００μＬ収容されており、ミネラルオイル収容部１６には２０〜３００μＬのミネラルオイルが収容されている。
ＰＣＲ終了液注入部３１は増幅反応部３２でＰＣＲ反応を終了した反応液とタイピング試薬とを混合するためのもので、基板１０ａに凹部として形成され、使用前の状態では空の状態で提供される。
増幅反応部３２はＰＣＲ反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。
増幅反応部３２はＰＣＲ反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。
増幅反応部３２の部分の断面を拡大して図６Ａ及び図６Ｂに示す。図６Ａ及び図６Ｂは図５ＢのＹ−Ｙ線位置での断面図である。図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、増幅反応部３２の液分注用ポート３４ａ，３４ｂはノズル２８の先端形状に対応した形状の開口３６ａ，３６ｂをもち、ノズル２８の先端に密着できるようにＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）やシリコーンゴムなどの弾性素材で構成されている。
増幅反応部３２は熱伝導率をよくするためにその部分の基板１０ａの下面側が、図５Ｃ、図６Ａ及び図６Ｂに示されるように肉厚が薄くなっている。その部分の肉厚は、例えば０．２〜０．３ｍｍである。
サンプル注入部１２は、この実施例では核酸抽出操作を施していない生体サンプルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。
サンプル注入部１２は、この実施例では核酸抽出操作を施していない生体サンプルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。
図２Ａ及び図２Ｂの参考例と同じく、タイピング試薬収容部１４は複数の多型部位に対応して調製されたタイピング試薬を収容しており、ミネラルオイル収容部１６は反応液の蒸発を防ぐためのミネラルオイルを収容している。
各プローブ配置部１８も図２Ａ及び図２Ｂの参考例と同じく、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。
各プローブ配置部１８も図２Ａ及び図２Ｂの参考例と同じく、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部１６からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。
基板１０ａの表面は、フィルム２０上から、サンプル注入部１２、ＰＣＲ終了液注入部３１、タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６、遺伝子増幅試薬収容部３０、増幅反応部３２及びプローブ配置部１８を被う大きさの剥離可能なシール材２２で被われている。フィルム２０とシール材２２の材質及びその貼りつけ方法は図２Ａ及び図２Ｂの参考例と同じである。
基板１０ａも底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板１０の厚さは１〜２ｍｍである。
基板１０ａも底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板１０の厚さは１〜２ｍｍである。
この実施例の反応容器の使用方法を示す。
図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及び遺伝子増幅試薬収容部３０を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部１２にサンプル２５がピペット２６などにより０.５〜２μＬ注入される。図２Ａ及び図２Ｂの参考例では、注入されるサンプルは外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液であるが、この実施例で注入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が検出装置に装着される。
図７Ａ及び図７Ｂに示されるように、使用時にシール材２２が剥がされる。タイピング試薬収容部１４、ミネラルオイル収容部１６及び遺伝子増幅試薬収容部３０を封止しているフィルム２０は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部１２にサンプル２５がピペット２６などにより０.５〜２μＬ注入される。図２Ａ及び図２Ｂの参考例では、注入されるサンプルは外部でＰＣＲ反応によりＤＮＡが増幅されたサンプル反応液であるが、この実施例で注入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が検出装置に装着される。
検出装置において、図８Ａ及び図８Ｂに示されるように、ノズル２８がフィルム２０を貫通して遺伝子増幅試薬収容部３０に挿入されてＰＣＲ反応試薬が吸入され、ＰＣＲ反応試薬はそのノズル２８によりサンプル注入部１２に２〜２０μＬ移送される。サンプル注入部１２ではノズル２８による吸入と吐出が繰り返されることにより、サンプル反応液とＰＣＲ反応試薬が混合されてＰＣＲ反応液となる。
次に、図６Ａに示されるように、そのＰＣＲ反応液がノズル２８により増幅反応部３２へ注入される。すなわち、ノズル２８が増幅反応部３２の一方のポート３４ａに挿入されてそのＰＣＲ反応液３８が注入され、続いて増幅反応部３２での反応中にＰＣＲ反応液３８が蒸発するのを防ぐために、ポート３４ａ，３４ｂにノズル２８によりミネラルオイル４０が注入されてポート３４ａ，３４ｂでのＰＣＲ反応液３８の表面がミネラルオイル４０で被われる。
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ反応液がノズル２８により回収されるが、このとき回収を容易にするために、図６Ｂに示されるように、増幅反応部３２の一方のポート３４ａからミネラルオイル４０が注入される。反応終了後のＰＣＲ反応液３８ａは他方のポート３４ｂに押しやられる。そこで、そのノズル２８が挿入され、ＰＣＲ反応液３８ａがノズル２８に吸入される。ポート３４ａ，３４ｂはその開口３６ａ，３６ｂの形状がノズル２８の形状に合わせて形成され、かつ弾性素材で形成されているので、ノズル２８がポート３４ａ，３４ｂに密着して液漏れを防ぎ、ＰＣＲ反応液の注入と回収の操作が容易である。
ノズル２８により増幅反応部３２から回収された反応終了後のＰＣＲ反応液３８ａはＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。
ノズル２８により増幅反応部３２から回収された反応終了後のＰＣＲ反応液３８ａはＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。
次に、ノズル２８がフィルム２０を貫通してタイピング試薬収容部１４に挿入されてタイピング試薬が吸入され、タイピング試薬はそのノズル２８によりＰＣＲ終了液注入部３１に移送されて注入される。ＰＣＲ終了液注入部３１ではノズル２８による吸入と吐出が繰り返されることにより、ＰＣＲ反応液とタイピング試薬が混合される。
その後、ＰＣＲ反応液とタイピング試薬との反応液がノズル２８により各プローブ配置部１８へ０.５〜４μＬずつ分注される。各プローブ配置部１８にはノズル２８によりミネラルオイル収容部１６からミネラルオイルが０.５〜１０μＬずつ分注される。プローブ配置部１８へのミネラルオイルの分注は、プローブ配置部１８への反応液の分注前であってもよい。各プローブ配置部１８ではミネラルオイルが反応液の表面を被い、検出装置のタイピング反応温度制御部での加熱を伴なうタイピング反応時間中の反応液の蒸発を防止する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
各プローブ配置部１８では反応液がプローブと反応して所定のＳＮＰがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板１０の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
以下、各反応試薬の組成を示して、本発明を詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。
ＰＣＲ反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献３の段落［００４６］に記載されているような、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及びTaqStart （CLONTECH Laboratories社製）を含む反応試薬を使用することができる。また、ＰＣＲ反応試薬にはAmpDirect（島津製作所製）が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献３の表１に記載されているＳＮＰ ＩＤ１〜２０、配列番号を１〜４０などを使用することができる。
タイピング試薬としてインベーダ試薬を使用する。そのインベーダ試薬としては、インベーダーアッセイキット（Third Wave Technology社製）を使用する。例えば、シグナルバッファー、フレットプローブ、構造特異的ＤＮＡ分解酵素及びアレル特異的プローブを特許文献３の段落［００４６］に記載されているような濃度に調製されたものである。
図９は本発明の反応容器を試薬キットとして用い、生体サンプルのＳＮＰを検出するための簡易型反応容器処理装置の一実施例を示したものである。装置内に上下に一対のヒートブロック６０と６２が配置されて反応容器装着部を構成しており、本発明の反応容器４１にサンプルが注入されたものが５枚平行に下側ヒートブロック６０上に並べて設置される。これらのヒートブロック６０，６２は、矢印で示されるＹ方向に移動することができる。
上側のヒートブロック６２にはノズル２８による液の移送や吸入、吐出の際に蓋が開くように開閉可能な窓が設けられている。
上側のヒートブロック６２にはノズル２８による液の移送や吸入、吐出の際に蓋が開くように開閉可能な窓が設けられている。
下側のヒートブロック６０は増幅反応部３２の温度を所定の温度サイクルになるように制御する増幅反応温度制御部と、プローブ配置部１８の温度をＤＮＡとプローブとを反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部とを備えている。増幅反応温度制御部の温度は、例えば９４℃、５５℃及び７２℃の３段階にその順に変化させられ、そのサイクルが繰り返されるように設定されている。タイピング反応温度制御部の温度は、例えば６３℃に設定されている。
反応容器４１として図２の参考例のように増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部は不要である。
反応容器４１として図２の参考例のように増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部は不要である。
またヒータブロック６０の下部には蛍光検出を行なう検出器６４が配置されており、検出器６４は図の矢印Ｘ方向に移動してブローブ配置部１８からの蛍光を検出する。ヒータブロック６０には蛍光検出のために開口が設けられている。反応容器装着部によるプローブ配置部１８のＹ方向移動と、検出器６４のＸ方向移動により各ブローブでの蛍光検出を行なう。
ノズル２８による液の移送や吸入、吐出を行なうために、分注部として送液アーム６６が設けられており、送液アーム６６はノズル２８を備えている。ノズル２８はその先端に使い捨て可能なチップ７０が着脱可能に装着される。
ノズル２８による液の移送や吸入、吐出を行なうために、分注部として送液アーム６６が設けられており、送液アーム６６はノズル２８を備えている。ノズル２８はその先端に使い捨て可能なチップ７０が着脱可能に装着される。
ヒートブロック６０，６２、蛍光検出部６４及び送液アーム６６の動作を制御するために、それらの近くに制御部１１８が配置されている。制御部１１８はＣＰＵを備えて、動作のためのプログラムを保持している。制御部１１８はヒートブロック６０，６２により実現されるタイピング反応部１１０や増幅部１２０の温度制御、蛍光検出部６４の検出動作、及び分注部１１２の送液アーム６６の分注動作を制御する。
反応容器４１として図２の反応容器のように遺伝子増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、遺伝子増幅反応部の温度を制御する増幅部は必要ではなく、制御部１１８も増幅部の温度制御のための機能を備える必要がない。
反応容器４１として図２の反応容器のように遺伝子増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、遺伝子増幅反応部の温度を制御する増幅部は必要ではなく、制御部１１８も増幅部の温度制御のための機能を備える必要がない。
図１０は検出器６４を詳細に示したものである。検出器６４は励起光源として例えば４７３ｎｍのレーザ光を発するレーザダイオード（ＬＤ）や発光ダイオード（ＬＥＤ）９２を備え、そのレーザ光を反応容器４１のプローブ配置部の底面に集光して照射する一対のレンズ９４，９６を備えている。レンズ９４はレーザダイオード９２からのレーザ光を集光して平行光にするものであり、レンズ９６は平行にされたレーザ光を反応容器４１の底面に収束させて照射する対物レンズである。対物レンズ９６はまた、反応容器４１から発生する蛍光を集光するレンズとしても作用する。一対のレンズ９４，９６の間にはダイクロイックミラー９８が設けられており、ダイクロイックミラー９８は励起光を透過させ、蛍光を反射させるように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー９８の反射光（蛍光）の光路上にはさらにダイクロイックミラー１００が配置されている。ダイクロイックミラー１００は例えば５２５ｎｍの光を反射し、例えば６０５ｎｍの光を透過するように波長特性が設定されている。ダイクロイックミラー１００による反射光の光路上には５２５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０２と光検出器１０４が配置され、ダイクロイックミラー１００による透過光の光路上には６０５ｎｍの蛍光を検出するようにレンズ１０６と光検出器１０８が配置されている。この２つの検出器１０４，１０８による２種類の蛍光検出により、各プローブ配置位置に固定されたインベーダプローブに対応したＳＮＰの有無と、そのＳＮＰがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかが検知される。標識蛍光体としては、例えばＦＡＭ、ＲＯＸ、ＶＩＣ、ＴＡＭＲＡ、Redmond Redなどを使用することができる。
図１１に、反応容器のプローブ配置部のプローブを蛍光標識し、ＳＮＰをもつＤＮＡのインベーダ反応により標識蛍光が発色していく過程（タイムコース）を示したものである。蛍光色素としてＦＡＭで標識したものとＶＩＣで標識したものについて測定を行なった。標識蛍光色素により違いがあるが、蛍光強度が徐々に増加していく様子がわかる。
従来はＳＮＰの有無の判定をベースとなる蛍光強度値とインベーダ反応が完了した時点の傾向強度値との差に基づいて行なっていた。
本発明では図１１に示されるような蛍光強度のタイムコースの所期の傾斜をもつ部分の単位時間当たりの蛍光強度値に基づいて測定を行なう。
本発明では図１１に示されるような蛍光強度のタイムコースの所期の傾斜をもつ部分の単位時間当たりの蛍光強度値に基づいて測定を行なう。
図１２はアレル判定を行なうための表示例を示したものである。反応容器のプローブ配置部では、それぞれのＳＮＰに対して正常型のホモ接合体を例えばＦＡＭ、変異型のホモ接合体を例えばＶＩＣでそれぞれ蛍光標識したものとする。図１２の横軸はＶＩＣによる蛍光強度の単位時間当たりの蛍光強度値、縦軸はＦＡＭによる蛍光強度の単位時間当たりの蛍光強度値である。
いま、例えばあるサンプルの測定値がＡで示されるように主としてＦＡＭによる蛍光が検出された場合には、そのサンプルにはＳＮＰが存在し、そのＳＮＰが正常型のホモ接合体であると判定することができる。また、例えばそのサンプルの測定値がＢで示されるように主としてＶＩＣによる蛍光が検出された場合には、そのサンプルにはＳＮＰが存在し、そのＳＮＰが変異型のホモ接合体であると判定することができる。また、例えばそのサンプルの測定値がＣで示されるようにＦＡＭによる蛍光とＶＩＣによる蛍光とがともに検出された場合には、そのサンプルにはＳＮＰが存在し、そのＳＮＰがヘテロ接合体であると判定することができる。
図１０の検出器６４は１光源による励起光で励起し、２波長の蛍光を測定するように構成されているが、検出器６４としては２波長の蛍光測定のために異なる励起波長で励起できるように２光源を使用するように構成してもよい。
本発明は種々の化学反応の測定のほか、例えば遺伝子解析の研究や臨床分野において、種々の自動分析に利用することができ、例えば、人間を初めとして、動物や植物のゲノムＤＮＡの多型、特にＳＮＰ（一塩基多型）を検出することができ、さらにその結果を用いて病気罹患率の診断や、投与薬剤の種類と効果及び副作用との関係などの診断のほか、動物や植物の品種判定、感染症診断（感染菌の型判定）などを行なうのにも利用することができる。
２ サンプル
４ ＰＣＲ反応試薬
６ インベーダ試薬
８ プローブ配置部
１０，１０ａ 基板
１２ サンプル注入部
１４ タイピング試薬収容部
１６ ミネラルオイル収容部
１８ プローブ配置部
２０ フィルム
２２ シール材
２８ ノズル
３０ 遺伝子増幅試薬収容部
３１ ＰＣＲ終了液注入部
３２ 増幅反応部
３４ａ，３４ｂ 増幅反応部のポート
３６ａ，３６ｂ ポートの開口
４１ 反応容器
６０，６２ ヒートブロック
６４ 検出器
６６ 送液アーム
７０ チップ
４ ＰＣＲ反応試薬
６ インベーダ試薬
８ プローブ配置部
１０，１０ａ 基板
１２ サンプル注入部
１４ タイピング試薬収容部
１６ ミネラルオイル収容部
１８ プローブ配置部
２０ フィルム
２２ シール材
２８ ノズル
３０ 遺伝子増幅試薬収容部
３１ ＰＣＲ終了液注入部
３２ 増幅反応部
３４ａ，３４ｂ 増幅反応部のポート
３６ａ，３６ｂ ポートの開口
４１ 反応容器
６０，６２ ヒートブロック
６４ 検出器
６６ 送液アーム
７０ チップ
Claims (3)
- 複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を少なくとも備えた遺伝子多型診断用反応容器を装着する反応容器装着部と、
移送して分注する分注部と、
前記プローブ配置部の温度をゲノムＤＮＡとタイピング試薬との反応液が前記プローブと反応する温度に制御するタイピング反応温度制御部と、
前記各プローブ配置部に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記分注部の分注動作、前記タイピング反応温度制御部の温度制御及び前記蛍光検出部の検出動作を少なくとも制御する制御部と、
を備えた反応容器処理装置において、
前記反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、サンプルと前記遺伝子増幅試薬との混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備えたものであり、
該遺伝子多型診断用装置は前記増幅反応部の温度を前記サンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でＤＮＡを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部をさらに備え、
前記制御部は前記増幅反応温度制御部の温度制御を行ない、前記蛍光検出部から得られる蛍光検出値の単位時間当たりの蛍光強度値に基づいて遺伝子多型の有無の判定を行なうことを特徴とする遺伝子多型診断用装置。 - 前記プローブ配置部はそれぞれの多型部位に対してホモ接合体とヘテロ接合体とで異なる蛍光標識がなされたものであり、
前記制御部による測定結果を表示する表示部は前記２種類の標識蛍光の蛍光強度に基づいてアレル判定を行なうように表示するとともに、その表示の蛍光強度値として単位時間当たりの蛍光強度値を表示する請求項１に記載の遺伝子多型診断用装置。 - 前記反応容器は反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部をさらに備えたものである請求項１又は２に記載の遺伝子多型診断用装置。
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