JP4697781B2 - 反応容器処理装置 - Google Patents
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患者が敗血症に罹りやすいか否か及び/又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン2対立遺伝子、又はパターン2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン2対立遺伝子又はパターン2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する(特許文献1参照。)。
比較的に少量のゲノムDNAを用いて数十万箇所に及ぶSNP部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムDNA及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ(登録商標)法又はタックマン(登録商標)PCR法を用いる(特許文献3参照。)。
その反応容器は、複数の反応領域を含む反応部を少なくとも備え、それらが平板状基板に形成されたものである。その反応部には分注部のノズルにより反応液が分注され、反応を起こさせるために所定の温度に維持される。
しかしながら、反応容器装着部、分注部及び反応温度制御部が独立して構成されている場合には、反応容器処理装置全体として構造が複雑化し、また大型化し、高価にもなる。
そこで、本発明は上記のような反応容器を自動的に処理する反応容器処理装置を簡略化し、小型で安価に実現できるようにすることを目的とするものである。
タイピング反応としてインベーダ(登録商標)反応を使用する場合は、タイピング反応温度制御部110はインベーダ(登録商標)反応のための温調部となる。
光学的検出部64は反応領域に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部とすることができる。
また、反応容器内で遺伝子増幅反応も行なわせる場合には反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、その遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部も反応部が形成されている平板状基板に一体として備えたものとすることができる。その場合、この反応容器処理装置はその増幅反応部の温度をサンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でDNAを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部120をさらに備え、制御部118は増幅反応温度制御部120の温度制御も行なうものとなる。
制御部118を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部118にパーソナルコンピュータ(PC)122を接続してもよい。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはSNPである。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノムDNAなどである。
遺伝子増幅試薬の一例はPCR反応試薬である。
タイピング工程はインベーダ(登録商標)法やタックマン(登録商標)PCR法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ(登録商標)試薬又はタックマン(登録商標)PCR試薬である。
PCR工程では血液などの生体サンプル2にPCR反応試薬4を添加するか、逆にPCR反応試薬4に生体サンプル2を添加する。
プライマーはPCR反応によるDNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
各レポータープローブはそれに対応したSNPの塩基に応じて2種類のものを用意すれば、そのSNPがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
また、温度調節部材に設ける開口は反応領域に対応する位置にのみであるため、精度よく温調することができる。
平板状の基板10の同じ側に試薬収容部14及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部16が凹部として形成されている。
反応液よりも比重の低い不揮発性液体としては、ミネラルオイル(鉱油)、植物油、動物油、シリコーンオイル又はジフェニルエーテルなどを用いることができる。ミネラルオイルはペトロラタムから蒸留により得られる液体の炭化水素混合物であり、流動パラフィン、流動ペトロラタム、ホワイト油などとも呼ばれ、低比重の軽油も含む。動物油としてはタラの肝油、オヒョウ油、ニシン油、オレンジラフィー油又はサメの肝油などを用いることができる。また、植物油としてはカノーラ油、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油、ゴマ油、大豆油などを用いることができる。
試薬収容部14とミネラルオイル収容部16はフィルム20で封止されており、試薬とミネラルオイルをノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム20を取り除いてノズルで吸入するか、又はそのフィルム20をノズルで貫通可能なものとしておいてノズルを貫通させてノズルで吸入する。そのようなフィルム20は、例えばアルミニウム箔、アルミニウムとPET(ポリエチレンテレフタレート)フィルムなどの樹脂フィルムとの積層膜などであり、容易に剥がれないように融着や接着により貼りつけられている。
基板10の表面は、フィルム20上から、試薬収容部14、ミネラルオイル収容部16及び反応部18を被う大きさの剥離可能なシール材22で被われている。
平板状の基板10の同じ側にサンプル注入部12、タイピング試薬収容部14、及びミネラルオイル収容部16が凹部として形成されている。基板10の同じ側にはさらに、複数のプローブ配置部18も形成されている。
図3に示されるように、使用時にシール材22が剥がされる。タイピング試薬収容部14とミネラルオイル収容部16を封止しているフィルム20は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部12に外部でPCR反応によりDNAが増幅されたサンプル反応液24がピペット26などにより2〜20μL注入される。その後、この反応容器が検出装置に装着される。
各プローブ配置部18では反応液がプローブと反応して所定のSNPがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板10の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
この反応容器は核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入し、PCR反応によるDNAの増幅と、インベーダ(登録商標)反応によるSNP検出を共に行なうものである。ただし、核酸抽出操作を施している生体サンプルを注入してもよい。
増幅反応部32はPCR反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。
サンプル注入部12は、この実施例では核酸抽出操作を施していない生体サンプルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。
各プローブ配置部18も図2の実施例と同じく、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部16からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。
基板10aも底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板10の厚さは1〜2mmである。
図7に示されるように、使用時にシール材22が剥がされる。タイピング試薬収容部14、ミネラルオイル収容部16及び遺伝子増幅試薬収容部30を封止しているフィルム20は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部12にサンプル25がピペット26などにより注入される。図2の実施例では、注入されるサンプルは外部でPCR反応によりDNAが増幅されたサンプル反応液であるが、この実施例で注入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。その後、この反応容器が検出装置に装着される。
ノズル28により増幅反応部32から回収された反応終了後のPCR反応液38aはPCR終了液注入部31に移送されて注入される。
各プローブ配置部18では反応液がプローブと反応して所定のSNPがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板10の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
PCR反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献3の段落[0046]に記載されているような、プライマー、DNAポリメラーゼ及びTaqStart (CLONTECH Laboratories社製)を含む反応試薬を使用することができる。また、PCR反応試薬にはAmpDirect(島津製作所製)が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献3の表1に記載されているSNP ID1〜20、配列番号を1〜40などを使用することができる。
装置内に温度調節部材として上下に一対のヒートブロック60と62が配置されて反応容器装着部を構成しており、本発明の反応容器41にサンプルが注入されたものが5枚平行に下側ヒートブロック60上に並べて設置される。これらのヒートブロック60,62は、矢印で示されるY方向に移動することができる。
ガイドピン142bと当接する反応容器41の当接面には、反応容器41が所定の位置にきたときにガイドピン142bと当接する位置にV型の切欠き41aが設けられている。
分注部のノズル28は、図11に示されるように、カバー154の開口156とヒートブロック62の開口150を介してプローブ配置部に反応液を分注する。
反応容器41として図2の反応容器のように遺伝子増幅反応部を備えていないものを使用する場合には、遺伝子増幅反応部の温度を制御する増幅反応温度制御部は必要ではなく、制御部118も増幅反応温度制御部の温度制御のための機能を備える必要がない。
4 PCR反応試薬
6 インベーダ(登録商標)試薬
8 プローブ配置部
10,10a 基板
12 サンプル注入部
14 タイピング試薬収容部
16 ミネラルオイル収容部
18 プローブ配置部
20 フィルム
22 シール材
28 ノズル
30 遺伝子増幅試薬収容部
31 PCR終了液注入部
32 遺伝子増幅反応部
41 反応容器
60,62 ヒートブロック
64 蛍光検出部
66 送液アーム
70 チップ
110 タイピング反応温度制御部
112 分注部112
116 チップ位置センサ部
118 制御部
142 ガイド機構
142a ガイド機構の溝
142b ガイドピン
150,152 ヒートブロックの開口
Claims (6)
- 複数の反応領域を含む反応部を少なくとも備え、それらが平板状基板に形成された反応容器を装着する反応容器装着部と、
吸引及び吐出のためのノズルを備えて前記反応容器の液の移送を行なう分注部と、
前記反応部の温度を所定の温度に制御する反応温度制御部と、
前記分注部の分注動作及び前記反応温度制御部の温度制御を行なう制御部とを少なくとも備えた反応容器処理装置であって、
前記反応温度制御部は前記反応容器装着部に装着された反応容器の前記反応部の上部に温度制御用の温度調節部材を備え、その温度調節部材には前記反応領域に対応する位置にのみ開口をもち、前記分注部のノズルはそれらの開口を介して前記反応領域に反応液を分注することを特徴とする反応容器処理装置。 - 前記反応部における反応領域は複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持したプローブ配置部であり、
前記反応温度制御部は前記プローブ配置部の温度をサンプルとタイピング試薬との反応液を前記プローブと反応させる温度に制御するタイピング反応温度制御部である請求項1に記載の反応容器処理装置。 - 前記反応領域に光を照射して反応を光学的に検出する光学的検出部をさらに備え、
前記反応温度制御部は前記反応容器装着部に装着された反応容器の前記反応部の下部にも温度制御用の温度調節部材を備え、その温度調節部材には前記反応領域に対応する位置にのみ開口をもち、前記光学的検出部はそれらの開口を介して前記反応領域の反応を検出するものであり、
前記制御部は前記光学的検出部の検出動作の制御も行なうものである請求項1又は2に記載の反応容器処理装置。 - 前記光学的検出部は前記反応領域に励起光を照射して蛍光を検出する蛍光検出部である請求項3に記載の反応容器処理装置。
- 前記反応容器はタイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部、及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部も前記平板状基板に一体として備えたものである請求項2又は4に記載の反応容器処理装置。
- 前記反応容器は複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部と、前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部も前記平板状基板に一体として備えたものであり、
該反応容器処理装置は前記増幅反応部の温度を前記サンプルと遺伝子増幅試薬との反応液内でDNAを増幅させる遺伝子増幅のための温度に制御する増幅反応温度制御部をさらに備え、
前記制御部は前記増幅反応温度制御部の温度制御も行なう請求項2,4又は5に記載の反応容器処理装置。
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