WO2013168765A1 - 反応検出方法 - Google Patents

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WO2013168765A1
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oxygen
oxygen transfer
transfer layer
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直美 浅野
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シャープ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the concentration of a target substance in a sample using a chemical reaction such as an enzyme reaction.
  • Measurement of the concentration of a target substance contained in a sample such as a biological fluid is an analytical technique widely used in the medical and biochemical fields.
  • a sample such as a biological fluid
  • measurement of glucose concentration in blood and urine is applied as an effective screening test in the diagnosis of diseases such as hypoglycemia and diabetes.
  • a method using detection of a chemical reaction with respect to the target substance is generally used.
  • chemical reaction detection methods there is a method of observing a sample after the reaction of all target substances is completed and detecting a chemical reaction with respect to the target substance based on this.
  • this method there is a case where the waiting time until the reaction of all the target substances in the sample is completed becomes long and is not efficient.
  • Patent Document 1 a technique used for quantitatively detecting the reaction of the target substance, for example, a colorimetric method described in Patent Document 1 can be cited.
  • a colorimetric method described in Patent Document 1 for example, in salivary sugar measurement, a reduced coenzyme or hydrogen peroxide produced using glucose oxidase-peroxidase is colored to another redox substance, and a microplate reader or spectrophotometer is used. Describes how to make measurements.
  • Patent Document 2 a sample containing a hydrogen peroxide assay reagent and an analyte is mixed into a small droplet, and an assay is performed in the small droplet to detect a signal (such as a color change). ) Is described. It is also described that the droplet can be surrounded by a filler fluid that is immiscible with the droplet, such as silicone oil.
  • Japanese Patent Publication Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-219309 (published on August 5, 2004)”
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a reaction detection method capable of increasing the chemical reaction rate with respect to a target substance in a sample.
  • a reaction detection method is a reaction detection method for detecting a chemical reaction with respect to a target substance in a sample, and a step of forming a reaction layer that causes the chemical reaction; Forming an oxygen transmission layer having oxygen permeability higher than that of the reaction layer and transmitting oxygen in the atmosphere consumed in the chemical reaction to the reaction layer between the reaction layer and the atmosphere; It is characterized by including.
  • the reaction layer since the oxygen transmission layer having an oxygen permeability higher than that of the reaction layer is provided between the reaction layer and the atmosphere, the reaction layer allows oxygen consumed in the chemical reaction from the atmosphere. Capturing is faster than capturing directly.
  • the chemical reaction rate with respect to the target substance in the sample in the reaction layer can be increased.
  • the oxygen transfer layer is formed using a substance having a specific gravity lower than that of the reaction layer.
  • the oxygen transfer layer is automatically formed in the upper layer in the vertical upward direction of the reaction layer due to the difference in specific gravity between them. . Therefore, no special treatment is required, and an oxygen transfer layer can be formed between the reaction layer and the atmosphere in the container.
  • the oxygen transfer layer is formed using a substance that is immiscible with the reaction layer.
  • the oxygen transfer layer can be maintained as an independent layer without mixing with the reaction layer, the effect of promoting the chemical reaction by the oxygen transfer layer is not attenuated by elapse of time or stirring, for example.
  • the oxygen transfer layer is formed using silicon oil.
  • the oxygen transfer layer has a light transmission property and a chemically stable property.
  • oxygen transfer layer suitable for optical measurement of the reaction layer. Further, since the oxygen transfer layer can be prevented from being denatured due to the passage of time or stirring, it can be applied to various experimental systems without requiring special management.
  • the thickness of the oxygen transmission layer is preferably 2 mm or less.
  • the oxygen transmission layer made of silicon oil has the above thickness, oxygen can be efficiently transmitted to the reaction layer, so that the chemical reaction rate can be reliably increased.
  • the chemical reaction may be an enzyme reaction
  • the target substance may be an enzyme or a substrate.
  • an enzyme reaction against a predetermined enzyme or substrate in the sample is detected.
  • the detection of this enzyme reaction is a technique generally used in various biological analyses. Therefore, the reaction detection method of the present invention can be used for various biological analyses.
  • the target substance may be glucose
  • the reaction detection method of the present invention can be used in the detection of a chemical reaction with respect to glucose which is the subject of the biological analysis.
  • reaction detection method according to the present invention may include a step of coloring the reaction layer in association with the chemical reaction.
  • the color of the reaction layer changes with a chemical reaction.
  • the integrated amount of the target substance that has completed the chemical reaction can be obtained at an arbitrary time.
  • the chemical reaction to the target substance can be detected by using an optical measurement method.
  • the reaction detection method according to the present invention is a reaction detection method for detecting a chemical reaction with respect to a target substance in a sample as described above, and includes a step of forming a reaction layer that causes the chemical reaction, and the reaction layer. Forming an oxygen transfer layer having a high oxygen permeability and transmitting oxygen in the atmosphere consumed in the chemical reaction to the reaction layer between the reaction layer and the atmosphere. This is a characteristic reaction detection method.
  • the chemical reaction rate with respect to the target substance in the sample can be increased.
  • FIG. 1 It is a schematic sectional drawing which shows a mode that the atmospheric layer, the oxygen transmission layer, and the reaction layer were formed by the method which concerns on one Embodiment of this invention. It is a figure which shows an example of the introduction procedure of each liquid in the method which concerns on one Embodiment of this invention, (a) is a figure which shows the state with which the reaction liquid was introduce
  • (D) is a figure which shows the state which the color of the said reaction layer changed by the effect
  • a reaction layer is formed by mixing a sample containing a target material and a reaction solution containing at least a substance that reacts with the target material. Oxygen consumed in the chemical reaction in the reaction layer is sequentially taken into the reaction layer from the atmosphere. In this situation, an oxygen transfer layer for efficiently supplying oxygen from the atmosphere to the reaction layer is formed between the reaction layer and the atmosphere.
  • glucose is a target substance and glucose in a sample is enzymatically reacted with glucose oxidase (GOD) in a reaction solution
  • GOD glucose oxidase
  • the target substance of the present invention is not limited to these examples. It may be bilirubin, neutral fat, cholesterol, lactate dehydrogenase (LDH), creatinine, and the like, and any substance detected through a reaction that consumes oxygen can be the target substance.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the reaction solution used in the present embodiment contains a color former that reacts with the product of the enzyme reaction and develops a color.
  • the enzyme reaction is detected, and the glucose concentration in the sample is determined.
  • the measurement method is not limited to an optical method, and may be an electrical measurement method, for example.
  • FIG. 2 shows a reaction layer in which the oxygen transfer layer 2 is provided between the reaction layer 3 and the atmosphere layer (atmosphere) 1 (see FIG. 1), and the color changes with the enzyme reaction (chemical reaction) in this embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram showing a procedure for introducing each liquid when measuring 3.
  • the reaction layer 3 can take oxygen molecules (oxygen) 4 (see FIG. 1) from the atmosphere layer 1 into the reaction system.
  • the container 10 may be a microplate, for example, and is preferably open to the atmosphere. When the atmosphere is open, the atmosphere layer 1 is not necessarily formed inside the container 10.
  • FIG. 2A is a diagram showing a state in which the reaction liquid 31 is introduced into the container 10.
  • the reaction liquid 31 is a liquid containing at least a substance that reacts with glucose 5 as a target substance contained in the sample 32, and includes GOD6 (see FIG. 1) in the present embodiment.
  • GOD6 is an enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing glucose 5 to produce gluconic acid and hydrogen peroxide. Oxygen is consumed during the enzymatic reaction.
  • the reaction liquid 31 contains the substance which produces
  • it is an enzyme reaction which produces glucose 5 and GOD6.
  • an enzyme for coloring the reaction layer 3 and a coloring agent are included.
  • the reaction solution 31 contains peroxidase (POD) as an enzyme and 4-aminoantipyrine (4-AA) and TOOS as color formers.
  • POD is an enzyme that catalyzes a reaction in which 4-AA and TOOS are oxidatively condensed to form a multimer having an absorption wavelength peak at 555 nm.
  • hydrogen peroxide which is one of the products of the enzymatic reaction between glucose 5 and GOD 6, is consumed. That is, when hydrogen peroxide is generated along with the enzyme reaction between glucose 5 and GOD 6, the multimer is generated by consuming this hydrogen peroxide, and the color of the reaction layer 3 changes.
  • the reaction solution 31 is a solution obtained by diluting each of the above substances with PBS (phosphate buffered saline).
  • FIG. 2B is a diagram showing a process of forming the reaction layer 3 by further introducing the sample 32 after FIG. 2A. That is, the reaction layer 3 is formed by introducing the reaction solution 31 and the sample 32 into the container 10.
  • the sample 32 is a PBS solution containing glucose 5 as a target substance.
  • Glucose 5 is a substrate that causes an enzymatic reaction upon contact with GOD6.
  • the reaction layer 3 that is a layer that causes an enzyme reaction with respect to the glucose 5 is formed. At this stage, the reaction layer 3 may be stirred to promote contact between glucose 5 and GOD 6.
  • the reaction layer 3 is preferably maintained at a different temperature depending on the target material.
  • the target material is glucose 5
  • the reaction layer 3 is preferably maintained at 37 ° C. Thereby, the enzyme reaction rate can be further increased.
  • FIG. 2C is a diagram showing a process of forming the oxygen transfer layer 2 by introducing silicon oil 21 from above the reaction layer 3 formed in FIG.
  • the oxygen transfer layer 2 separate from the reaction layer 3 is formed. Further, since the specific gravity of the silicon oil 21 is lighter than that of the reaction solution 31 and the sample 32, the oxygen transfer layer 2 is formed in an upper layer (vertically upward) than the reaction layer 3. As a result, the oxygen transfer layer 2 can be formed between the reaction layer 3 and the atmospheric layer 1 without requiring any special treatment. Note that liquid paraffin may be used in place of the silicon oil 21 as a substance forming the oxygen transfer layer 2.
  • FIG. 2 (d) is a diagram showing a state in which the color of the reaction layer 3 has changed due to the coloring of the color former accompanying the enzyme reaction of glucose 5.
  • the reaction layer 3 in this state is introduced into, for example, the microplate reader together with the container 10, and the enzymatic reaction between glucose 5 and GOD6 in the reaction layer 3 is detected by optically measuring the reaction layer 3 in this state. Can do. Then, by detecting the enzyme reaction between glucose 5 and GOD6, the concentration of glucose 5 can be measured.
  • FIG. 2 (d) shows a step of coloring the reaction layer 3 along with the enzyme reaction, and the enzyme reaction in the reaction layer 3 is detected by detecting the coloration.
  • the reaction detection method is not limited to optical measurement by coloring the reaction layer 3, but may be fluorescence detection or optical measurement using chemiluminescence. Alternatively, it may be current measurement when an oxidation-reduction potential is applied to the reaction layer 3 or electrical measurement based on impedance measurement of the reaction layer 3.
  • FIG. 3 (a) is a view showing a state in which the silicon oil 21 has been introduced into the container 10 in advance and the oxygen transfer layer 2 has already been formed.
  • the reaction liquid 31 when the reaction liquid 31 is introduced from above the oxygen transfer layer 2 to the container 10 in such a state, the reaction liquid 31 has a higher specific gravity than the silicon oil 21. It accumulates in the lower layer of the oxygen transfer layer 2.
  • the sample 32 when the sample 32 is introduced into the container 10 from above the oxygen transfer layer 2, the sample 32 also has a higher specific gravity than the silicon oil 21. And mixed with the reaction solution 31 to form the reaction layer 3. At this stage, the reaction layer 3 may be gently stirred so as not to disturb the layer structure with the oxygen transfer layer 2 in order to promote contact between the enzyme and the substrate.
  • each layer in the container 10 is in the order of the reaction layer 3 and the oxygen transfer layer 2 in FIG. 2, and in the order of the oxygen transfer layer 2 and the reaction layer 3 in FIG. Is formed.
  • the silicon oil 21 forming the oxygen transfer layer 2 is immiscible with the reaction solution 31 and the sample 32 forming the reaction layer 3 and has a specific gravity lighter than these.
  • the oxygen transfer layer 2 can be formed between the reaction layer 3 and the atmospheric layer 1 in either of FIG. 2 and FIG. That is, the three kinds of liquids (reaction liquid 31, sample 32, and silicon oil 21) are introduced into the container 10 in an arbitrary order to form the oxygen transfer layer 2 between the reaction layer 3 and the atmospheric layer 1. Can do.
  • the reaction detection method according to the present embodiment includes a step of coloring the reaction layer 3 in accordance with the enzyme reaction between glucose 5 and GOD 6. Therefore, the enzyme reaction between glucose 5 and GOD 6 can be detected by a method of optically measuring the color change of the reaction layer 3, that is, an optical measurement method.
  • FIG. 1 is a view showing the oxygen transfer layer 2 according to the present embodiment together with the atmospheric layer 1 and the reaction layer 3, and is a schematic view showing the inside of the container 10 in FIG. 2 (c).
  • a reaction layer 3 As shown in FIG. 1, in the container 10, a reaction layer 3, an oxygen transfer layer 2, and an atmosphere 1 are formed in this order from the bottom of the container 10.
  • the atmosphere layer 1 is a gas layer containing oxygen, nitrogen, and other molecules.
  • the oxygen molecules 4 are substances in the atmospheric layer 1 that are consumed by the enzyme reaction in the reaction layer 3. That is, the atmosphere layer 1 is a gas layer containing at least oxygen molecules 4.
  • the oxygen transfer layer 2 is a layer for supplying oxygen molecules 4 in the atmospheric layer 1 to the reaction layer 3, and the oxygen transmission rate in the oxygen transfer layer 2 is higher than the oxygen transmission rate in the reaction unit 3. .
  • silicon oil 21 is used as a suitable material for forming such an oxygen transfer layer 3.
  • the oxygen permeability is a quantity based on the solubility and diffusion rate of oxygen in a certain substance, and is an index indicating the ease of oxygen passage of the substance. Since the oxygen transfer layer 2 has an oxygen permeability higher than that of the reaction layer 3, the oxygen transfer layer 2 can take in oxygen molecules 4 from the atmosphere layer 1 more efficiently than the reaction layer 3 directly takes in from the atmosphere layer 1 (FIG. Middle curved arrow). Furthermore, oxygen molecules 4 dissolved in the oxygen transfer layer 2 can be supplied to the reaction layer 3 with high efficiency (linear arrows in the figure).
  • the reaction layer 3 is a layer in which the reaction solution 31 and the sample 32 are mixed. In the reaction layer 3, as described above, an enzyme reaction occurs between GOD 6 contained in the reaction solution 31 and glucose 5 contained in the sample 32.
  • the oxygen molecules 4 are dissolved in the reaction layer 3, and the dissolved oxygen molecules 4 are consumed in the reaction layer 3 in the initial stage of the enzyme reaction. However, with the progress of the enzyme reaction, oxygen molecules 4 originally dissolved in the reaction layer 3 are consumed, and eventually the oxygen molecules 4 necessary for the progress of the enzyme reaction become insufficient.
  • reaction layer 3 since the reaction layer 3 is formed adjacent to the oxygen transfer layer 2, it can take in oxygen molecules 4 dissolved in the oxygen transfer layer 2, rather than taking in oxygen molecules 4 directly from the atmospheric layer 1. Enzymatic reaction can be generated with high efficiency. Therefore, the enzyme reaction rate in the reaction layer 3 can be increased. In addition, the shortage of oxygen molecules 4 accompanying the progress of the enzyme reaction as described above can be compensated.
  • the movement (dissolution) of the oxygen molecules 4 from the gas to the liquid occurs when the oxygen molecules 4 collide with the liquid surface and some of the collided oxygen molecules 4 are taken into the liquid.
  • the rate at which the collided oxygen molecules 4 are taken into the liquid depends on the solubility of oxygen in the liquid. For this reason, in the oxygen transfer layer 2 and the reaction layer 3 in which the collision frequency of the oxygen molecules 4 to the liquid surface is the same, the proportion of the collision of the oxygen molecules 4 in the liquid is oxygen with high oxygen solubility.
  • the transmission layer 2 is higher than the reaction layer 3.
  • the movement of the oxygen molecules 4 at the interface between the liquid and the liquid also depends on the solubility of oxygen in the liquid in which the oxygen molecules 4 collide, as described above.
  • the collision frequency of the oxygen molecules 4 at the interface is overwhelmingly higher between the liquid and the liquid than between the gas and the liquid (movement of the oxygen molecules 4 from the gas to the liquid).
  • the oxygen molecule 4 has a high mobility as a free molecule in a gas, whereas the mobility decreases in a liquid due to the action of intermolecular force.
  • the transmission speed of the oxygen molecules 4 is higher between the oxygen transmission layer 2 and the reaction layer 3 that are both liquid than when generated between the atmospheric layer 1 that is a gas and the reaction layer 3 that is a liquid. .
  • the oxygen transfer layer 2 increases the moving speed of the oxygen molecules 4 between the gas and the liquid, which is the rate-determining step of the incorporation of the oxygen molecules 4 into the reaction layer 3.
  • the movement of the oxygen molecules 4 from the oxygen transfer layer 2 to the reaction layer 3 is performed smoothly because the probability of the movement of the oxygen molecules 4 is higher between the liquid and the liquid than between the gas and the liquid.
  • the oxygen transfer layer 2 can take in the oxygen molecules 4 from the atmosphere layer 1 with high efficiency and supply the oxygen molecules 4 thus taken into the reaction layer 3 with high efficiency.
  • the oxygen uptake rate of the reaction layer 3, which is the rate-determining step of the enzyme reaction increases through the oxygen transfer layer 2.
  • the reaction solution 31 was GOD6 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (6 U / mL), POD (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ( 2 U / mL), 4-AA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (2 mM), and TOOS (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.) (8 mM) were used.
  • GOD6 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • POD manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 4-AA manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • TOOS manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd.
  • the sample 32 a glucose solution (12 mg / dL) containing glucose 5 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a target material was used.
  • the solvent was PBS, and the total amount of the reaction solution 31 and the sample 32 was adjusted to 100 ml. All concentrations in parent
  • FIG. 4 (a) is a diagram showing a procedure for introducing each liquid in an enzyme reaction detection experiment under a condition without the oxygen transfer layer 2 (hereinafter referred to as condition A) according to a comparative example of the present embodiment.
  • the reaction solution 31 containing GOD6, POD, 4-AA, and TOOS is introduced into the container 10 (Sa1).
  • a sample 32 (glucose solution) containing glucose 5 as a target material is introduced (Sa2).
  • the reaction layer 3 is formed by mixing the reaction solution 31 and the sample 32 in the container 10. And the light absorbency of the reaction layer 3 in which the color changed with the enzyme reaction of glucose 5 and GOD6 after predetermined time progress is measured (Sa3).
  • FIG. 4 (b) is a diagram showing a procedure for introducing each liquid in an enzyme reaction detection experiment under the condition with the oxygen transfer layer 2 (hereinafter referred to as condition B) according to the present embodiment. Since the steps Sb1 and Sb3 are the same as Sa1 and Sa3 in the condition A, the description thereof is omitted.
  • Condition B is different from the comparative example shown in FIG. 4A in that a step (Sb1-2) of introducing the silicon oil 21 from above the reaction solution 31 is provided after introducing the reaction solution 31 in Sb1.
  • the oxygen transfer layer 2 is formed by the introduced silicon oil 21, and the inside of the container 10 is in the same state as in FIG.
  • the sample 32 is introduced in the same manner as Sa2 in FIG. 4A (Sb2).
  • the reaction layer 3 is formed by mixing with the reaction solution 31. The principle of movement of the inside of the container 10 and the sample 32 at this time is the same as that in FIG.
  • the reaction layer 3 may be stirred between Sa2 (Sb2) and Sa3 (Sb3).
  • Sb2 Sa2
  • Sb3 Sa3
  • Fig. 5 shows the experimental results under conditions A and B.
  • the horizontal axis of the graph is the elapsed time after the reaction solution 31 and the sample 32 are mixed, and the vertical axis is the absorbance when the reaction layer 3 is irradiated with irradiation light of 560 nm.
  • the plots indicated by circles in the figure are data obtained under condition A (without oxygen transfer layer 2), and the plots indicated by triangles are obtained under condition B (with oxygen transfer layer 2). Data.
  • the oxygen transfer layer 2 made of silicon oil 21 has a function of promoting an enzyme reaction that oxidizes glucose 5. That is, by forming the oxygen transfer layer 2 by the reaction detection method according to the present embodiment, the speed of the enzyme reaction can be increased.
  • oxygen molecules 4 are supplied in an amount corresponding to the thickness of the oxygen transfer layer 2. .
  • the thickness of the oxygen transfer layer 2 increases, the diffusion distance of the oxygen molecules 4 becomes longer, and the oxygen molecules 4 may not be efficiently transferred from the atmosphere layer 1 to the reaction layer 3. Considering this point, further experiments were performed to verify an appropriate thickness of the oxygen transfer layer 2.
  • the horizontal axis of the graph is the thickness of the oxygen transfer layer 2 made of silicon oil 21, and the vertical axis is the amount of change in the absorbance of the reaction layer 3 compared to before the reaction at 2 minutes after the start of the reaction.
  • the broken line in the figure indicates the numerical value of the absorbance obtained by the same procedure as the condition A shown in FIG.
  • the oxygen transfer effect from the atmospheric layer 1 to the reaction layer 3 is impaired when the thickness of the oxygen transfer layer 2 is increased beyond a certain level.
  • the thickness of the oxygen transfer layer 2 is preferably greater than 0 mm and 8 mm or less, thereby realizing a further high oxygen transfer effect. Therefore, it can be said that it is preferably greater than 0 mm and not more than about 2 mm.
  • Patent Document 2 an example in which silicon oil is used as the filler fluid is described.
  • the document does not mention the function of transmitting oxygen of silicon oil.
  • Patent Document 2 discloses a configuration in which droplets are isolated from the atmosphere using silicon oil, but the experimental results shown in FIG. 6 also indicate that this configuration does not function as an oxygen transfer layer. .
  • the silicon oil 21 is interposed between the reaction layer 3 that generates an enzyme reaction that oxidizes glucose 5 using GOD 6 as a catalyst and the atmospheric layer 1 that includes oxygen molecules 4.
  • the enzyme reaction in the reaction layer 3 is detected by forming the oxygen transfer layer 2 made of The oxygen transfer layer 2 has a higher oxygen permeability than the reaction layer 3.
  • the oxygen transfer layer 2 can efficiently supply the oxygen molecules 4 in the atmosphere layer 1 to the reaction layer 3 and promote the enzyme reaction in the reaction layer 3. That is, according to the reaction detection method of the present embodiment, the formation of the oxygen transfer layer 2 can increase the speed of the entire enzyme reaction in the reaction layer 3.
  • the oxygen transfer layer 2 increases the amount of dissolved oxygen in the reaction layer 3 in a pseudo manner, so that the data range for obtaining the initial rate is widened. be able to.
  • the detection accuracy may be lowered. Concentration estimation accuracy can be improved.
  • the silicon oil 21 is immiscible with the reaction layer 3 and has a specific gravity lighter than that of the reaction layer 3, the liquid constituting the reaction layer 3 and the silicon oil 21 are introduced into the container 10 in any order.
  • the oxygen transfer layer 2 can be easily formed between the atmospheric layer 1 and the reaction layer 3.
  • various biological analyzes such as testing of biological dysfunction or virus infection based on measurement of the concentration of a predetermined enzyme or substrate in a sample can be performed.
  • glucose 5 as a target substance, for example, blood sugar and urine sugar can be analyzed, so that medical diagnosis relating to various diseases such as hypoglycemia and diabetes can be performed.
  • the present invention can be suitably used for analysis of biological samples in the medical field and biochemical field.
  • Atmosphere layer 2
  • Oxygen transfer layer 3
  • Reaction layer 4
  • Oxygen molecule (oxygen) 5
  • Glucose target substance, substrate
  • GOD target substance, enzyme

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Abstract

試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させる。 試料（３２）中のグルコース（５）に対する化学反応を検出する反応検出方法は、当該化学反応を生じさせる反応層（３）を形成する工程と、反応層（３）よりも高い酸素透過率を有し、反応層（３）と大気（１）との間に、当該化学反応において消費される大気（１）中の酸素（４）を反応層（３）に伝達する酸素伝達層（２）を形成する工程と、を含む。

Description

反応検出方法
　本発明は、酵素反応等の化学反応を利用した、試料中のターゲット物質の濃度の測定方法に関する。
　生体液等の試料中に含まれるターゲット物質の濃度測定は、医療や生化学の分野において広く用いられる分析手法である。例えば、医療分野では、血液や尿中のグルコースの濃度測定は、低血糖症や糖尿病等の疾患の診断において有効なスクリーニング検査として適用されている。
　現在広く用いられている、試料中のターゲット物質の濃度を求める手段としては、当該ターゲット物質に対する化学反応の検出を利用した方法が一般的である。そのような化学反応検出方法の１つとして、ターゲット物質全ての反応が完了した後の試料を観測し、これに基づいてターゲット物質に対する化学反応を検出する方法が挙げられる。しかしながら、この方法では、試料中のターゲット物質全ての反応が完了するまでの待ち時間が長くなり、効率的でない場合がある。
　このような不都合を伴わない別の方法としては、反応の初速度を測定し、これに基づいてターゲット物質に対する化学反応を検出する方法がある。この方法では、ターゲット物質が反応を開始してからの所定の期間後の試料を観測し、その時点における該ターゲット物質の総反応量を求める。この方法は、例えば酵素反応のように、反応速度から基質濃度を高い精度で推定することができる場合において有効であり、全ターゲット物質の反応が完了するまで待つ必要がないという点において有用である。
　また、ターゲット物質の反応を定量的に検出するために用いられる手法としては、例えば特許文献１の比色定量法が挙げられる。例えば、特許文献１には、唾液糖測定において、グルコースオキシダーゼ－ペルオキシダーゼを用いて生成される還元型補酵素もしくは過酸化水素を他の酸化還元物質に呈色させて、マイクロプレートリーダーまたは分光光度計で測定を行う方法が記載されている。
　なお、特許文献２には、過酸化水素アッセイ試薬および被分析物を含む試料を小滴の中へと混合し、当該小滴の中でアッセイを実施して検出可能な信号（色の変化など）を得る構成が記載されている。また、上記小滴は、シリコンオイル等の、該小滴と非混和性のフィラー流体によって囲まれ得ることが記載されている。
日本国公開特許公報「特開２００４－２１９３０９号公報（２００４年８月５日公開）」 日本国公表特許公報「特表２０１０－５１９９３５号公報（２０１０年６月１０日公開）」
　しかしながら、特許文献１に記載の技術では、検体を含む混合物中の溶存量を超える酸素を消費する酵素反応を検出しようとする場合、外部から系に酸素を取り込む必要がある。このように大気から直接酸素を系に取り込む場合の酸素取り込み速度は遅いため、酵素反応全体の律速段階となる。結果として、試料中のターゲット物質全てが反応を完了するまでに長い時間を要する虞がある。
　また、特許文献２に記載の技術は、試料を小滴の中へと混合するものであることから、そもそもの溶存酸素量が少ない上に、大気から試料までの距離が大きく、実質的に密封系であるため、外部から酸素を取り込むことができない。このため、試料中の被分析物全てを反応させることができない虞がある。
　本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させることが可能な反応検出方法を提供することにある。
　上記の課題を解決するために、本発明に係る反応検出方法は、試料中のターゲット物質に対する化学反応を検出する反応検出方法であって、上記化学反応を生じさせる反応層を形成する工程と、上記反応層よりも高い酸素透過率を有し、上記反応層と大気との間に、上記化学反応において消費される大気中の酸素を上記反応層に伝達する酸素伝達層を形成する工程と、を含むことを特徴としている。
　上記構成によれば、反応層よりも高い酸素透過率を有する酸素伝達層が反応層と大気との間に設けられていることにより、反応層は、化学反応において消費される酸素を、大気から直接取り込むよりも速く取り込むことができる。
　これにより、化学反応の律速段階となる反応層の酸素取り込み速度が、酸素伝達層を介することで上昇する。
　従って、本発明の反応検出方法によれば、反応層における試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させることができる。
　さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層を、上記反応層よりも比重が軽い物質を用いて形成することが好ましい。
　上記構成によれば、反応層および酸素伝達層を形成する物質がそれぞれ容器に導入されると、両者の比重差によって、酸素伝達層は反応層の鉛直上方向における上層に自動的に形成される。そのため、特別な処理を必要とせず、容器中で反応層と大気との間に酸素伝達層を形成することができる。
　さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層を、上記反応層と非混和性の物質を用いて形成することが好ましい。
　上記構成によれば、酸素伝達層を、反応層と混合することなく、独立の層として維持できるので、酸素伝達層による化学反応を促進する効果が、例えば時間の経過または攪拌によって減衰しない。
　従って、酸素伝達層による化学反応を促進する効果を安定して得ることができる。
　さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層を、シリコンオイルを用いて形成することが好ましい。
　上記構成によれば、酸素伝達層は、光透過性を有し、かつ化学的に安定な性質を有する。
　これにより、反応層の光学的測定に適した酸素伝達層を形成できる。また、時間の経過または攪拌による酸素伝達層の変性を抑制できるため、特別な管理を必要とせず、様々な実験系に適用することができる。
　さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層の厚みは、２ｍｍ以下であることが好ましい。
　上記構成によれば、シリコンオイルからなる酸素伝達層が上記の厚みを有することにより、効率よく反応層に酸素を伝達することができるため、確実に化学反応速度を上昇させることができる。
　さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記化学反応は酵素反応であり、上記ターゲット物質は酵素または基質であってもよい。
　上記構成によれば、試料中の所定の酵素または基質に対する酵素反応が検出される。この酵素反応の検出は、様々な生体分析において一般に用いられる手法である。そのため、本発明の反応検出方法を様々な生体分析に利用することができる。
　さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記ターゲット物質はグルコースであってもよい。
　上記構成によれば、上記生体分析の対象となるグルコースに対する化学反応の検出において、本発明の反応検出方法を利用することができる。
　さらに、本発明に係る反応検出方法は、上記化学反応に伴って上記反応層を着色する工程を含んでいてもよい。
　上記構成によれば、反応層は、化学反応に伴って色が変化する。
　これにより、色が変化した反応層に光を照射し、反応層における該光の吸収量を測定することによって、任意の時点において、化学反応が完了したターゲット物質の積算量を求めることができる。
　従って、光学的測定法を用いて、ターゲット物質に対する化学反応を検出することができる。
　本発明に係る反応検出方法は、以上のように、試料中のターゲット物質に対する化学反応を検出する反応検出方法であって、上記化学反応を生じさせる反応層を形成する工程と、上記反応層よりも高い酸素透過率を有し、上記反応層と大気との間に、上記化学反応において消費される大気中の酸素を上記反応層に伝達する酸素伝達層を形成する工程と、を含むことを特徴とした反応検出方法である。
　上記構成により、試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させることができる。
本発明の一実施形態に係る方法によって大気層、酸素伝達層および反応層が形成された様子を示す概略断面図である。 本発明の一実施形態に係る方法における各液体の導入手順の一例を示す図であり、（ａ）は、容器に反応液が導入された状態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の状態にさらに試料を導入し、反応層を形成する工程を示す図であり、（ｃ）は、（ｂ）の状態にさらにシリコンオイルを導入し、酸素伝達層を形成する工程を示す図であり、（ｄ）は、酵素反応に伴う発色剤の働きにより、上記反応層の色が変化した状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係る方法における各液体の導入手順の別の例を示す図であり、（ａ）は、容器中にあらかじめ酸素伝達層が形成されている状態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の状態にさらに反応液を導入する工程を示す図であり、（ｃ）は、（ｂ）の状態にさらに試料を導入し、反応層を形成する工程を示す図であり、（ｄ）は、反応液に含まれる発色剤によって、反応層の色が変化した状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係る酸素伝達層の効果を検証するための比較実験を行うための各液体の導入手順を示す図であり、（ａ）は、酸素伝達層を設けない条件（条件Ａ）での導入手順を示す図であり、（ｂ）は、酸素伝達層を設ける条件（条件Ｂ）での導入手順を示す図である。 図４に示す比較実験の結果として、反応開始からの時間経過に伴う反応層の吸光度の変化を示す図であり、条件Ａと条件Ｂとで得られた結果を並べて示したものである。 シリコンオイルからなる酸素伝達層の厚みと、反応開始後２分の時点における反応層の吸光度の変化量との対応関係を示す図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図１～６に基づいて説明する。なお、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。また、説明の便宜上、各図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、適宜その説明を省略する。また、各図面に記載した構成の形状や、長さ、大きさおよび幅などの寸法は、実際の形状や寸法を反映させたものではなく、図面の明瞭化と簡略化のために適宜に変更している。
　まず、本実施形態の概要を記載する。本実施形態では、ターゲット物質を含む試料と、該ターゲット物質と反応する物質を少なくとも含む反応液とを混合することで反応層が形成される。この反応層における化学反応において消費される酸素は、大気中より反応層に順次取り込まれる。この状況において、酸素を大気中から反応層に効率的に供給するための酸素伝達層を、反応層と大気との間に形成する。
　より具体的には、本実施形態では、グルコースをターゲット物質とし、試料中のグルコースを、反応液中のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）と酵素反応させる例について説明する。なお、ＧＯＤをターゲット物質としてもよい。本発明のターゲット物質はこれらに限定されることなく、例えばコハク酸、尿酸、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、γグルタミルトランスペプチダーゼ（γＧＴＰ）、ビリルビン、中性脂肪、コレステロール、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチニン等であってもよく、酸素を消費する反応を介して検出されるあらゆる物質がターゲット物質となり得る。
　さらに、本実施形態で用いる反応液は、上記酵素反応の生成物と反応して呈色する発色剤を含んでおり、該発色剤によって色が変化した反応層を光学的に測定することで、酵素反応を検出し、試料中のグルコースの濃度を求める。測定方法は光学的手法に限定されず、例えば電気的測定手法であってもよい。
　〔１．酸素伝達層２の形成手順について〕
　本発明の一実施形態に係る酸素伝達層２の形成手順の概要について、図２および図３を参照して説明する。
　図２は、本実施形態における、反応層３と大気層（大気）１（図１参照）との間に、酸素伝達層２を設け、酵素反応（化学反応）に伴い色が変化した反応層３を測定するときの各液体の導入手順を示す図である。
　なお、図２および図３では、容器１０に大気層１、反応層２および酸素伝達層３が形成される様子について説明する。容器１０に大気層１が形成されていることにより、反応層３は、大気層１から酸素分子（酸素）４（図１参照）を反応系に取り込むことができる。
　また、容器１０は、例えばマイクロプレートであってもよく、大気開放されていることが好ましい。大気開放されている場合には、容器１０の内部に大気層１が形成されている必要は必ずしもない。
　図２（ａ）は、容器１０に反応液３１が導入された状態を示す図である。反応液３１は、試料３２中に含まれるターゲット物質であるグルコース５と反応する物質を少なくとも含む液体であり、本実施形態では、ＧＯＤ６（図１参照）を含む。ＧＯＤ６は、グルコース５を酸化して、グルコン酸と過酸化水素とを生成する反応を触媒する酵素である。この酵素反応の過程で酸素が消費される。
　また、反応液３１は、ＧＯＤ６以外に、該反応を直接または間接に検出するための指標を生成する物質を含んでいることが好ましく、本実施形態では、グルコース５とＧＯＤ６とが生じる酵素反応に応じて呈色し、反応層３を着色するための酵素および発色剤（ともに不図示）を含む。
　具体的には、反応液３１は、酵素としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を、発色剤として４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）とＴＯＯＳとを含む。ＰＯＤは、４－ＡＡとＴＯＯＳとを酸化縮合し、５５５ｎｍに吸収波長のピークを有する多量体を生成する反応を触媒する酵素である。ＰＯＤが触媒する上記の反応において、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応の生成物の１つである過酸化水素が消費される。すなわち、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応に伴い過酸化水素が発生すると、この過酸化水素を消費して上記多量体が生成され、反応層３の色が変化する。
　このため、例えば、反応層３に５５５ｎｍ付近の波長を有する光を照射し、該光の吸収量を測定することにより、任意の観測時点において反応が完了したグルコース５の積算量を求めることができる。なお、本実施形態において、反応液３１は、上記の各物質をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈した溶液である。
　図２（ｂ）は、図２（ａ）の後に、試料３２をさらに導入し、反応層３を形成する工程を示す図である。すなわち、反応液３１および試料３２を容器１０に導入することにより、反応層３が形成される。
　本実施形態では、試料３２は、ターゲット物質としてのグルコース５を含むＰＢＳ溶液である。グルコース５は、ＧＯＤ６と接触することにより酵素反応を生じる基質である。反応液３１と試料３２とが混合されることで、グルコース５に対して酵素反応を生じさせる層である反応層３が形成される。この段階で、グルコース５とＧＯＤ６との接触を促進するために反応層３を攪拌してもよい。
　また、反応層３は、ターゲット物質に応じて異なる温度に維持されることが好ましく、ターゲット物質がグルコース５である場合、反応層３は３７℃に維持されることが好ましい。これにより、酵素反応速度をさらに上昇させることができる。
　図２（ｃ）は、図２（ｂ）で形成された反応層３の上からシリコンオイル２１を導入し、酸素伝達層２を形成する工程を示す図である。
　シリコンオイル２１は、ＰＢＳを溶媒とする反応液３１および試料３２と非混和性であるため、反応層３と別個の酸素伝達層２を形成する。さらに、シリコンオイル２１は、反応液３１および試料３２より比重が軽いため、酸素伝達層２は反応層３よりも上層に（鉛直上方向に）形成される。結果として、特別な処理を必要とせずに、反応層３と大気層１との間に酸素伝達層２を形成することができる。なお、酸素伝達層２を形成する物質として、シリコンオイル２１に代えて流動パラフィンを用いてもよい。
　図２（ｄ）は、グルコース５の酵素反応に伴う発色剤の呈色により、反応層３の色が変化した状態を示す図である。この状態の反応層３を、例えば容器１０ごとマイクロプレートリーダーに導入し、この状態の反応層３を光学的に測定することで、反応層３におけるグルコース５とＧＯＤ６との酵素反応を検出することができる。そして、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応が検出されることにより、グルコース５の濃度を測定することが可能となる。
　すなわち、図２（ｄ）は、上記酵素反応に伴って上記反応層３を着色する工程を示すものであり、その着色を検出することによって、反応層３における上記酵素反応が検出される。しかし、その反応検出方法は、反応層３の着色による光学的測定に限らず、蛍光検出、または、化学発光を利用した光学的測定であってもよい。あるいは、反応層３に酸化還元電位を与えた場合の電流測定、または、反応層３のインピーダンス測定に基づく電気的測定であってもよい。
　（酸素伝達層２の形成手順の別例）
　なお、シリコンオイル２１は、必ずしも反応液３１および試料３２の後に導入されなくともよい。本実施形態に係る酸素伝達層２の形成手順の別の例を、図３を参照して説明する。
　図３（ａ）は、容器１０中にあらかじめシリコンオイル２１が導入されており、これによって酸素伝達層２が既に形成されている状態を示す図である。
　このような状態の容器１０に対し、図３（ｂ）に示すように、反応液３１が酸素伝達層２の上から導入されると、反応液３１はシリコンオイル２１よりも比重が重いため、酸素伝達層２の下層に溜まる。
　続いて、図３（ｃ）に示すように、試料３２が酸素伝達層２の上から容器１０に導入されると、試料３２もまたシリコンオイル２１より比重が重いため、酸素伝達層２の下層に移動し、反応液３１と混合されて反応層３を形成する。この段階で、酵素と基質との接触を促進するために、反応層３を、酸素伝達層２との層構造を乱さないよう静かに攪拌してもよい。
　そして、所定の時間が経過すると、反応層３での酵素反応が進行し、図３（ｄ）に示すように、反応液３１に含まれる発色剤によって、反応層３の色が変化する。以降の測定については、図２に示す例と同様である。
　以上のように、本実施形態に係る反応検出方法では、容器１０中には、図２では反応層３および酸素伝達層２の順に、図３では酸素伝達層２および反応層３の順に、各層が形成される。上記のように、酸素伝達層２を形成するシリコンオイル２１は、反応層３を形成する反応液３１および試料３２と非混和性であり、且つこれらよりも軽い比重を有する。
　それゆえ、図２および図３のいずれであっても、反応層３と大気層１との間に酸素伝達層２を形成することができる。すなわち、上記３種の液体（反応液３１、試料３２およびシリコンオイル２１）を任意の順序で容器１０に導入して、反応層３と大気層１との間に酸素伝達層２を形成することができる。
　さらに、図２および図３に示すように、本実施形態に係る反応検出方法は、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応に伴って反応層３を着色する工程を含む。それゆえ、反応層３の色の変化を光学的に測定する方法、すなわち光学的測定手法によって、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応を検出することができる。
　〔２．酸素伝達層の構造について〕
　図１は、本実施形態に係る酸素伝達層２を、大気層１と反応層３とともに示す図であり、図２（ｃ）における容器１０の内部を示す概略図である。図１に示すように、容器１０中には、容器１０の底部から順に、反応層３、酸素伝達層２および大気１がこの順に形成されている。
　大気層１は、酸素や窒素、およびその他の分子を含む気体の層である。本実施形態では、酸素分子４は、反応層３における酵素反応で消費される大気層１中の物質である。すなわち、大気層１は、少なくとも酸素分子４を含む気体の層である。
　酸素伝達層２は、大気層１中の酸素分子４を、反応層３へと供給するための層であり、当該酸素伝達層２における酸素透過率は、反応部３における酸素透過率よりも高い。このような酸素伝達層３を形成する好適な物質として、本実施形態では、シリコンオイル２１が用いられている。
　酸素透過率は、ある物質における酸素の溶解度と拡散速度とに基づいた数量であり、当該物質の酸素の通しやすさを示す指標である。酸素伝達層２は、反応層３よりも高い酸素透過率を有することにより、反応層３が大気層１から直接取り込むよりも高効率に、大気層１から酸素分子４を取り込むことができる（図中の曲線矢印）。さらに、反応層３に、酸素伝達層２中に溶存する酸素分子４を高効率に供給することができる（図中の直線矢印）。
　反応層３は、反応液３１と試料３２とを混合した層である。反応層３では、上述のように、反応液３１に含まれるＧＯＤ６と、試料３２に含まれるグルコース５とによる酵素反応が生じる。
　反応層３には酸素分子４が溶存しており、上記酵素反応の初期段階においては、反応層３に上記溶存する酸素分子４が消費される。しかしながら、上記酵素反応の進行に伴い、元々反応層３に溶存していた酸素分子４が消費され、やがては上記酵素反応の進行に必要な酸素分子４が不足することとなる。
　ここで、反応層３は、酸素伝達層２と隣接して形成されているので、酸素伝達層２に溶存する酸素分子４を取り込むことができ、大気層１から直接酸素分子４を取り込むよりも高効率に酵素反応を生じさせることができる。それゆえ、反応層３における酵素反応速度を上昇させることができる。また、上記のような酵素反応の進行に伴う酸素分子４の不足を補うことができる。
　以下に、酸素伝達層２を介して、酸素分子４が大気層１から反応層３へ取り込まれる機構について具体的に説明する。
　通常、気体から液体への酸素分子４の移動（溶解）は、酸素分子４が液面に衝突し、該衝突した酸素分子４のうち一部が液体中に取り込まれることで生じる。このとき、衝突した酸素分子４が液体中に取り込まれる割合は、当該液体における酸素の溶解度に依存する。このため、酸素分子４の液面への衝突頻度が同程度である酸素伝達層２と反応層３とでは、該衝突した酸素分子４が液体中に取り込まれる割合は、酸素の溶解度が高い酸素伝達層２の方が、反応層３よりも高くなる。
　一方、液体と液体との界面における酸素分子４の移動も、上記と同様に、酸素分子４が衝突した液体における酸素の溶解度に依存する。ここで、酸素分子４の界面への衝突頻度は、液体－液体間の方が、気体－液体間（気体から液体への酸素分子４の移動）と比較して圧倒的に高い。これは、酸素分子４は、気体中では自由分子として高い運動性を有するのに対し、液体中では分子間力の作用により運動性が低下するためである。従って、酸素分子４の伝達速度は、共に液体である酸素伝達層２と反応層３との間では、気体である大気層１と液体である反応層３との間で生じる場合よりも上昇する。
　上記機構によれば、酸素伝達層２は、酸素分子４の反応層３への取り込みの律速段階となる酸素分子４の気体－液体間の移動速度を上昇させる。さらに、気体－液体間よりも液体－液体間の方が、酸素分子４の移動が生じる確率が高いことにより、酸素伝達層２から反応層３への酸素分子４の移動はスムーズに行われる。
　従って、酸素伝達層２は、大気層１から酸素分子４を高効率に取り込むとともに、該取り込んだ酸素分子４を反応層３へと高効率に供給することができる。換言すれば、酵素反応の律速段階となる反応層３の酸素取り込み速度が、酸素伝達層２を介することで上昇する。
　〔３．比較実験：酸素伝達層の反応促進効果の検証〕
　本実施形態に係る反応検出方法において形成される酸素伝達層２の酵素反応の促進効果を検証するため、容器１０中に酸素伝達層２を設けた場合と設けない場合とで、酵素反応の速度を比較する実験を行った。
　本実験では、容器１０として、９６ｗｅｌｌのマイクロプレートを用い、反応液３１としては、ＧＯＤ６（和光純薬工業（株）製）（６Ｕ／ｍＬ）、ＰＯＤ（和光純薬工業（株）製）（２Ｕ／ｍＬ）、４－ＡＡ（和光純薬工業（株）製）（２ｍＭ）、およびＴＯＯＳ（同仁化学（株）製）（８ｍＭ）を含む溶液を用いた。試料３２としては、ターゲット物質としてグルコース５（和光純薬工業（株）製）を含むグルコース溶液（１２ｍｇ／ｄＬ）を用いた。いずれも溶媒はＰＢＳであり、反応液３１および試料３２の合計量が１００ｍｌとなるように調整した。なお、括弧内の濃度は全て終濃度である。酸素伝達層２として使用したシリコンオイル２１は５０ｕＬである。
　本実験の手順について、図４を参照して説明を行う。
　図４（ａ）は、本実施形態の比較例に係る、酸素伝達層２なしの条件（以下、条件Ａとする）での酵素反応検出実験における各液体の導入手順を示す図である。
　まず、ＧＯＤ６、ＰＯＤ、４－ＡＡ、およびＴＯＯＳを含む反応液３１を容器１０に導入する（Ｓａ１）。続いて、ターゲット物質であるグルコース５を含む試料３２（グルコース溶液）を導入する（Ｓａ２）。反応液３１と試料３２とが容器１０中で混合されることにより、反応層３が形成される。そして、所定の時間経過後にグルコース５とＧＯＤ６との酵素反応に伴って色が変化した反応層３の吸光度を測定する（Ｓａ３）。
　図４（ｂ）は、本実施形態に係る、酸素伝達層２ありの条件（以下、条件Ｂとする）での酵素反応検出実験における各液体の導入手順を示す図である。Ｓｂ１およびＳｂ３の工程は条件ＡのＳａ１およびＳａ３と同様であるため説明を省略する。
　条件Ｂでは、Ｓｂ１で反応液３１を導入した後に、反応液３１の上からシリコンオイル２１を導入する工程（Ｓｂ１－２）が設けられている点で、図４（ａ）に示す比較例とは異なる。この導入されたシリコンオイル２１によって酸素伝達層２が形成され、容器１０の内部は図３（ｂ）と同様の状態となる。続いて、図４（ａ）のＳａ２と同様に試料３２が導入される（Ｓｂ２）が、試料３２はシリコンオイル２１よりも比重が重いため、酸素伝達層２の下層へ移動し、既に導入されている反応液３１と混合されて反応層３を形成する。このときの容器１０の内部および試料３２の移動原理については、図３（ｃ）と同様である。
　なお、条件Ａおよび条件Ｂにおいて、Ｓａ２（Ｓｂ２）とＳａ３（Ｓｂ３）との間において、反応層３を攪拌してもよい。ただし、図４（ｂ）の場合には、酸素伝達層２と反応層３との層構造を乱さない程度に、静かに攪拌する必要がある。
　条件Ａおよび条件Ｂの実験結果を図５に示す。グラフの横軸は反応液３１と試料３２とが混合されてからの経過時間であり、縦軸は反応層３に５６０ｎｍの照射光を照射した場合の吸光度である。さらに、図中の丸で示したプロットは、条件Ａ（酸素伝達層２なし）にて得られたデータであり、三角で示したプロットは、条件Ｂ（酸素伝達層２あり）にて得られたデータである。
　酵素反応が開始してから３分程度で、両条件間で吸光度に差異が現れていることが分かる。また、吸光度が２に達するまでに要する時間が、条件Ｂでは条件Ａの約半分に抑えられていることが分かる。すなわち、酸素伝達層２がない場合、酵素反応系に十分な酸素が供給されず、これによって酵素反応の進捗が阻害されていることが分かる。それ以降も、少なくとも反応開始後１０分の時点において条件Ａでの吸光度は条件Ｂに追い付いておらず、条件Ｂにおける酸素伝達層２が酵素反応速度を上昇させる効果（酵素伝達層２による酵素反応促進効果）が継続していることが分かる。
　以上の結果から、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２が、グルコース５を酸化する酵素反応を促進する機能を有することが示された。すなわち、本実施形態に係る反応検出方法によって酸素伝達層２が形成されることにより、酵素反応の速度を上昇させることができる。
　ここで、酸素伝達層２には、反応開始時には反応層３よりも多くの酸素が溶存しているため、酸素伝達層２の厚みに応じた溶存量だけ酸素分子４が供給されると考えられる。しかしながら、酸素伝達層２の厚みの増大に伴い、酸素分子４の拡散距離が長くなり、大気層１から反応層３への酸素分子４の伝達が効率的に行われなくなる虞がある。この点を考慮し、酸素伝達層２の適切な厚みを検証するために、さらなる実験を行った。
　〔４．酸素伝達層２の厚みの影響〕
　本実験は、反応液３１と試料３２の量、および導入手順に関しては、上記の比較実験における条件Ｂと同様の条件で実施した。但し、本実験では、図４（ｂ）のＳｂ１－２の工程において導入するシリコンオイル２１の量を０～３００ｕＬの範囲で段階的に変化させた条件設定を行い、各条件で反応層３の吸光度を測定した。
　本実験の結果を図６に示す。グラフの横軸はシリコンオイル２１からなる酸素伝達層２の厚みであり、縦軸は反応開始後２分の時点における、反応前と比較した反応層３の吸光度の変化量である。図中の破線はシリコンオイル２１の量が０ｕＬ、すなわち図４（ａ）に示した条件Ａと同様の手順で得られた吸光度の数値を示している。
　図６のグラフより、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２の厚みが０ｍｍより厚く約２ｍｍ以下であるときに反応層３の吸光度の変化が最も大きい、すなわち酵素反応が最も促進されていることが分かる。一方、上記厚みが約４ｍｍを超えると酵素反応の促進効果が低減し、８ｍｍでは酸素伝達層２を設けていない条件Ａと同程度の結果となった。
　以上の結果から、酸素伝達層２は一定以上厚みを増すと大気層１から反応層３への酸素伝達効果を損なうことが分かる。また、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２によって高い酸素伝達効果を実現するには、酸素伝達層２の厚みは、０ｍｍより大きく８ｍｍ以下であることが好ましく、更なる高い酸素伝達効果を実現するためには、０ｍｍより大きく約２ｍｍ以下であることが好ましいと言える。
　ここで、特許文献２では、フィラー流体としてシリコンオイルを用いる例が記載されているが、当該文献においては、シリコンオイルの酸素を伝達する機能について言及されていない。さらに、特許文献２ではシリコンオイルによって小滴を大気より隔絶して操作する構成が示されているが、図６に示す実験結果からも、この構成が酸素伝達層として機能するものではないと言える。
　〔５．まとめ〕
　上記のように、本実施形態に係る反応検出方法では、ＧＯＤ６を触媒としてグルコース５を酸化する酵素反応を生じさせる反応層３と、酸素分子４を含む大気層１との間に、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２を形成することにより、反応層３における酵素反応を検出している。また、この酸素伝達層２は、反応層３よりも高い酸素透過率を有している。
　これにより、酸素伝達層２は、大気層１中の酸素分子４を反応層３に効率的に供給し、反応層３における酵素反応を促進させることができる。すなわち、本実施形態の反応検出方法によれば、酸素伝達層２の形成により、反応層３における酵素反応全体の速度を上昇させることができる。
　このため、ターゲット物質が全て反応した後の反応層３の観測データから試料３２中のターゲット物質の濃度を求める場合において、ターゲット物質が全て反応し終えるまでに要する時間を短縮化することができる。
　一方、酵素反応の初速度からターゲット物質の濃度を推定する場合においては、酸素伝達層２によって、反応層３における溶存酸素量が擬似的に増えるため、初速度を求めるためのデータ範囲を広く取ることができる。これによって、試料中の溶存酸素を利用可能な期間における微少な変化に依存するために検出の精度が低くなる虞のある特許文献１および特許文献２と比較して、初速度からのターゲット物質の濃度の推定精度を向上させることができる。
　さらに、シリコンオイル２１は反応層３と非混和性であり、且つ反応層３よりも比重が軽いことにより、反応層３を構成する液体とシリコンオイル２１とを任意の順序で容器１０に導入し、大気層１と反応層３との間に酸素伝達層２を容易に形成させることができる。
　また、酵素反応を生じる基質または酵素をターゲット物質とすることにより、例えば試料中の所定の酵素または基質の濃度測定に基づいた生体機能障害またはウイルス感染の検査等、様々な生体分析が可能となる。特に、グルコース５をターゲット物質とすることで、例えば血糖や尿糖の分析が可能となるため、低血糖症や糖尿病等の種々の疾患に関する医療診断を行うことができる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明は、医療分野や生化学分野における生体試料の分析に好適に利用することができる。
　１　大気層（大気）
　２　酸素伝達層
　３　反応層
　４　酸素分子（酸素）
　５　グルコース（ターゲット物質、基質）
　６　ＧＯＤ（ターゲット物質、酵素）
２１　シリコンオイル
３２　試料

Claims (8)

  1. 　試料中のターゲット物質に対する化学反応を検出する反応検出方法であって、
    　上記化学反応を生じさせる反応層を形成する工程と、
    　上記反応層よりも高い酸素透過率を有し、上記反応層と大気との間に、上記化学反応において消費される大気中の酸素を上記反応層に伝達する酸素伝達層を形成する工程と、を含むことを特徴とする反応検出方法。
  2. 　上記酸素伝達層を、上記反応層よりも比重が軽い物質を用いて形成することを特徴とする請求項１に記載の反応検出方法。
  3. 　上記酸素伝達層を、上記反応層と非混和性の物質を用いて形成することを特徴とする請求項１または２に記載の反応検出方法。
  4. 　上記酸素伝達層を、シリコンオイルを用いて形成することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の反応検出方法。
  5. 　上記酸素伝達層の厚みは、２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項４に記載の反応検出方法。
  6. 　上記化学反応は酵素反応であり、
    　上記ターゲット物質は酵素または基質であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の反応検出方法。
  7. 　上記ターゲット物質はグルコースであることを特徴とする請求項６に記載の反応検出方法。
  8. 　上記化学反応に伴って上記反応層を着色する工程を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の反応検出方法。
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