JP2013236559A - 反応検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させる。
【解決手段】試料３２中のグルコース５に対する化学反応を検出する反応検出方法は、当該化学反応を生じさせる反応層３を形成する工程と、反応層３よりも高い酸素透過率を有し、反応層３と大気１との間に、当該化学反応において消費される大気１中の酸素４を反応層３に伝達する酸素伝達層２を形成する工程と、を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、酵素反応等の化学反応を利用した、試料中のターゲット物質の濃度の測定方法に関する。

生体液等の試料中に含まれるターゲット物質の濃度測定は、医療や生化学の分野において広く用いられる分析手法である。例えば、医療分野では、血液や尿中のグルコースの濃度測定は、低血糖症や糖尿病等の疾患の診断において有効なスクリーニング検査として適用されている。

現在広く用いられている、試料中のターゲット物質の濃度を求める手段としては、当該ターゲット物質に対する化学反応の検出を利用した方法が一般的である。そのような化学反応検出方法の１つとして、ターゲット物質全ての反応が完了した後の試料を観測し、これに基づいてターゲット物質に対する化学反応を検出する方法が挙げられる。しかしながら、この方法では、試料中のターゲット物質全ての反応が完了するまでの待ち時間が長くなり、効率的でない場合がある。

このような不都合を伴わない別の方法としては、反応の初速度を測定し、これに基づいてターゲット物質に対する化学反応を検出する方法がある。この方法では、ターゲット物質が反応を開始してからの所定の期間後の試料を観測し、その時点における該ターゲット物質の総反応量を求める。この方法は、例えば酵素反応のように、反応速度から基質濃度を高い精度で推定することができる場合において有効であり、全ターゲット物質の反応が完了するまで待つ必要がないという点において有用である。

また、ターゲット物質の反応を定量的に検出するために用いられる手法としては、例えば特許文献１の比色定量法が挙げられる。例えば、特許文献１には、唾液糖測定において、グルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼを用いて生成される還元型補酵素もしくは過酸化水素を他の酸化還元物質に呈色させて、マイクロプレートリーダーまたは分光光度計で測定を行う方法が記載されている。

なお、特許文献２には、過酸化水素アッセイ試薬および被分析物を含む試料を小滴の中へと混合し、当該小滴の中でアッセイを実施して検出可能な信号（色の変化など）を得る構成が記載されている。また、上記小滴は、シリコンオイル等の、該小滴と非混和性のフィラー流体によって囲まれ得ることが記載されている。

特開２００４−２１９３０９号公報（２００４年８月５日公開） 特表２０１０−５１９９３５号公報（２０１０年６月１０日公開）

しかしながら、特許文献１に記載の技術では、検体を含む混合物中の溶存量を超える酸素を消費する酵素反応を検出しようとする場合、外部から系に酸素を取り込む必要がある。このように大気から直接酸素を系に取り込む場合の酸素取り込み速度は遅いため、酵素反応全体の律速段階となる。結果として、試料中のターゲット物質全てが反応を完了するまでに長い時間を要する虞がある。

また、特許文献２に記載の技術は、試料を小滴の中へと混合するものであることから、そもそもの溶存酸素量が少ない上に、大気から試料までの距離が大きく、実質的に密封系であるため、外部から酸素を取り込むことができない。このため、試料中の被分析物全てを反応させることができない虞がある。

本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させることが可能な反応検出方法を提供することにある。

上記の課題を解決するために、本発明に係る反応検出方法は、試料中のターゲット物質に対する化学反応を検出する反応検出方法であって、上記化学反応を生じさせる反応層を形成する工程と、上記反応層よりも高い酸素透過率を有し、上記反応層と大気との間に、上記化学反応において消費される大気中の酸素を上記反応層に伝達する酸素伝達層を形成する工程と、を含むことを特徴としている。

上記構成によれば、反応層よりも高い酸素透過率を有する酸素伝達層が反応層と大気との間に設けられていることにより、反応層は、化学反応において消費される酸素を、大気から直接取り込むよりも速く取り込むことができる。

これにより、化学反応の律速段階となる反応層の酸素取り込み速度が、酸素伝達層を介することで上昇する。

従って、本発明の反応検出方法によれば、反応層における試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させることができる。

さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層を、上記反応層よりも比重が軽い物質を用いて形成することが好ましい。

上記構成によれば、反応層および酸素伝達層を形成する物質がそれぞれ容器に導入されると、両者の比重差によって、酸素伝達層は反応層の鉛直上方向における上層に自動的に形成される。そのため、特別な処理を必要とせず、容器中で反応層と大気との間に酸素伝達層を形成することができる。

さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層を、上記反応層と非混和性の物質を用いて形成することが好ましい。

上記構成によれば、酸素伝達層を、反応層と混合することなく、独立の層として維持できるので、酸素伝達層による化学反応を促進する効果が、例えば時間の経過または攪拌によって減衰しない。

従って、酸素伝達層による化学反応を促進する効果を安定して得ることができる。

さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層を、シリコンオイルを用いて形成することが好ましい。

上記構成によれば、酸素伝達層は、光透過性を有し、かつ化学的に安定な性質を有する。

これにより、反応層の光学的測定に適した酸素伝達層を形成できる。また、時間の経過または攪拌による酸素伝達層の変性を抑制できるため、特別な管理を必要とせず、様々な実験系に適用することができる。

さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記酸素伝達層の厚みは、２ｍｍ以下であることが好ましい。

上記構成によれば、シリコンオイルからなる酸素伝達層が上記の厚みを有することにより、効率よく反応層に酸素を伝達することができるため、確実に化学反応速度を上昇させることができる。

さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記化学反応は酵素反応であり、上記ターゲット物質は酵素または基質であってもよい。

上記構成によれば、試料中の所定の酵素または基質に対する酵素反応が検出される。この酵素反応の検出は、様々な生体分析において一般に用いられる手法である。そのため、本発明の反応検出方法を様々な生体分析に利用することができる。

さらに、本発明に係る反応検出方法において、上記ターゲット物質はグルコースであってもよい。

上記構成によれば、上記生体分析の対象となるグルコースに対する化学反応の検出において、本発明の反応検出方法を利用することができる。

さらに、本発明に係る反応検出方法は、上記化学反応に伴って上記反応層を着色する工程を含んでいてもよい。

上記構成によれば、反応層は、化学反応に伴って色が変化する。

これにより、色が変化した反応層に光を照射し、反応層における該光の吸収量を測定することによって、任意の時点において、化学反応が完了したターゲット物質の積算量を求めることができる。

従って、光学的測定法を用いて、ターゲット物質に対する化学反応を検出することができる。

本発明に係る反応検出方法は、以上のように、試料中のターゲット物質に対する化学反応を検出する反応検出方法であって、上記化学反応を生じさせる反応層を形成する工程と、上記反応層よりも高い酸素透過率を有し、上記反応層と大気との間に、上記化学反応において消費される大気中の酸素を上記反応層に伝達する酸素伝達層を形成する工程と、を含むことを特徴とした反応検出方法である。

上記構成により、試料中のターゲット物質に対する化学反応速度を上昇させることができる。

本発明の一実施形態に係る方法によって大気層、酸素伝達層および反応層が形成された様子を示す概略断面図である。 本発明の一実施形態に係る方法における各液体の導入手順の一例を示す図であり、（ａ）は、容器に反応液が導入された状態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の状態にさらに試料を導入し、反応層を形成する工程を示す図であり、（ｃ）は、（ｂ）の状態にさらにシリコンオイルを導入し、酸素伝達層を形成する工程を示す図であり、（ｄ）は、酵素反応に伴う発色剤の働きにより、上記反応層の色が変化した状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係る方法における各液体の導入手順の別の例を示す図であり、（ａ）は、容器中にあらかじめ酸素伝達層が形成されている状態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）の状態にさらに反応液を導入する工程を示す図であり、（ｃ）は、（ｂ）の状態にさらに試料を導入し、反応層を形成する工程を示す図であり、（ｄ）は、反応液に含まれる発色剤によって、反応層の色が変化した状態を示す図である。 本発明の一実施形態に係る酸素伝達層の効果を検証するための比較実験を行うための各液体の導入手順を示す図であり、（ａ）は、酸素伝達層を設けない条件（条件Ａ）での導入手順を示す図であり、（ｂ）は、酸素伝達層を設ける条件（条件Ｂ）での導入手順を示す図である。 図４に示す比較実験の結果として、反応開始からの時間経過に伴う反応層の吸光度の変化を示す図であり、条件Ａと条件Ｂとで得られた結果を並べて示したものである。 シリコンオイルからなる酸素伝達層の厚みと、反応開始後２分の時点における反応層の吸光度の変化量との対応関係を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、図１〜６に基づいて説明する。なお、本発明は、以下の記載に限定されるものではない。また、説明の便宜上、各図面に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、適宜その説明を省略する。また、各図面に記載した構成の形状や、長さ、大きさおよび幅などの寸法は、実際の形状や寸法を反映させたものではなく、図面の明瞭化と簡略化のために適宜に変更している。

まず、本実施形態の概要を記載する。本実施形態では、ターゲット物質を含む試料と、該ターゲット物質と反応する物質を少なくとも含む反応液とを混合することで反応層が形成される。この反応層における化学反応において消費される酸素は、大気中より反応層に順次取り込まれる。この状況において、酸素を大気中から反応層に効率的に供給するための酸素伝達層を、反応層と大気との間に形成する。

より具体的には、本実施形態では、グルコースをターゲット物質とし、試料中のグルコースを、反応液中のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）と酵素反応させる例について説明する。なお、ＧＯＤをターゲット物質としてもよい。本発明のターゲット物質はこれらに限定されることなく、例えばコハク酸、尿酸、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、γグルタミルトランスペプチダーゼ（γＧＴＰ）、ビリルビン、中性脂肪、コレステロール、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチニン等であってもよく、酸素を消費する反応を介して検出されるあらゆる物質がターゲット物質となり得る。

さらに、本実施形態で用いる反応液は、上記酵素反応の生成物と反応して呈色する発色剤を含んでおり、該発色剤によって色が変化した反応層を光学的に測定することで、酵素反応を検出し、試料中のグルコースの濃度を求める。測定方法は光学的手法に限定されず、例えば電気的測定手法であってもよい。

〔１．酸素伝達層２の形成手順について〕
本発明の一実施形態に係る酸素伝達層２の形成手順の概要について、図２および図３を参照して説明する。

図２は、本実施形態における、反応層３と大気層（大気）１（図１参照）との間に、酸素伝達層２を設け、酵素反応（化学反応）に伴い色が変化した反応層３を測定するときの各液体の導入手順を示す図である。

なお、図２および図３では、容器１０に大気層１、反応層２および酸素伝達層３が形成される様子について説明する。容器１０に大気層１が形成されていることにより、反応層３は、大気層１から酸素分子（酸素）４（図１参照）を反応系に取り込むことができる。

また、容器１０は、例えばマイクロプレートであってもよく、大気開放されていることが好ましい。大気開放されている場合には、容器１０の内部に大気層１が形成されている必要は必ずしもない。

図２（ａ）は、容器１０に反応液３１が導入された状態を示す図である。反応液３１は、試料３２中に含まれるターゲット物質であるグルコース５と反応する物質を少なくとも含む液体であり、本実施形態では、ＧＯＤ６（図１参照）を含む。ＧＯＤ６は、グルコース５を酸化して、グルコン酸と過酸化水素とを生成する反応を触媒する酵素である。この酵素反応の過程で酸素が消費される。

また、反応液３１は、ＧＯＤ６以外に、該反応を直接または間接に検出するための指標を生成する物質を含んでいることが好ましく、本実施形態では、グルコース５とＧＯＤ６とが生じる酵素反応に応じて呈色し、反応層３を着色するための酵素および発色剤（ともに不図示）を含む。

具体的には、反応液３１は、酵素としてペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を、発色剤として４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）とＴＯＯＳとを含む。ＰＯＤは、４−ＡＡとＴＯＯＳとを酸化縮合し、５５５ｎｍに吸収波長のピークを有する多量体を生成する反応を触媒する酵素である。ＰＯＤが触媒する上記の反応において、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応の生成物の１つである過酸化水素が消費される。すなわち、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応に伴い過酸化水素が発生すると、この過酸化水素を消費して上記多量体が生成され、反応層３の色が変化する。

このため、例えば、反応層３に５５５ｎｍ付近の波長を有する光を照射し、該光の吸収量を測定することにより、任意の観測時点において反応が完了したグルコース５の積算量を求めることができる。なお、本実施形態において、反応液３１は、上記の各物質をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈した溶液である。

図２（ｂ）は、図２（ａ）の後に、試料３２をさらに導入し、反応層３を形成する工程を示す図である。すなわち、反応液３１および試料３２を容器１０に導入することにより、反応層３が形成される。

本実施形態では、試料３２は、ターゲット物質としてのグルコース５を含むＰＢＳ溶液である。グルコース５は、ＧＯＤ６と接触することにより酵素反応を生じる基質である。反応液３１と試料３２とが混合されることで、グルコース５に対して酵素反応を生じさせる層である反応層３が形成される。この段階で、グルコース５とＧＯＤ６との接触を促進するために反応層３を攪拌してもよい。

また、反応層３は、ターゲット物質に応じて異なる温度に維持されることが好ましく、ターゲット物質がグルコース５である場合、反応層３は３７℃に維持されることが好ましい。これにより、酵素反応速度をさらに上昇させることができる。

図２（ｃ）は、図２（ｂ）で形成された反応層３の上からシリコンオイル２１を導入し、酸素伝達層２を形成する工程を示す図である。

シリコンオイル２１は、ＰＢＳを溶媒とする反応液３１および試料３２と非混和性であるため、反応層３と別個の酸素伝達層２を形成する。さらに、シリコンオイル２１は、反応液３１および試料３２より比重が軽いため、酸素伝達層２は反応層３よりも上層に（鉛直上方向に）形成される。結果として、特別な処理を必要とせずに、反応層３と大気層１との間に酸素伝達層２を形成することができる。なお、酸素伝達層２を形成する物質として、シリコンオイル２１に代えて流動パラフィンを用いてもよい。

図２（ｄ）は、グルコース５の酵素反応に伴う発色剤の呈色により、反応層３の色が変化した状態を示す図である。この状態の反応層３を、例えば容器１０ごとマイクロプレートリーダーに導入し、この状態の反応層３を光学的に測定することで、反応層３におけるグルコース５とＧＯＤ６との酵素反応を検出することができる。そして、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応が検出されることにより、グルコース５の濃度を測定することが可能となる。

すなわち、図２（ｄ）は、上記酵素反応に伴って上記反応層３を着色する工程を示すものであり、その着色を検出することによって、反応層３における上記酵素反応が検出される。しかし、その反応検出方法は、反応層３の着色による光学的測定に限らず、蛍光検出、または、化学発光を利用した光学的測定であってもよい。あるいは、反応層３に酸化還元電位を与えた場合の電流測定、または、反応層３のインピーダンス測定に基づく電気的測定であってもよい。

（酸素伝達層２の形成手順の別例）
なお、シリコンオイル２１は、必ずしも反応液３１および試料３２の後に導入されなくともよい。本実施形態に係る酸素伝達層２の形成手順の別の例を、図３を参照して説明する。

図３（ａ）は、容器１０中にあらかじめシリコンオイル２１が導入されており、これによって酸素伝達層２が既に形成されている状態を示す図である。

このような状態の容器１０に対し、図３（ｂ）に示すように、反応液３１が酸素伝達層２の上から導入されると、反応液３１はシリコンオイル２１よりも比重が重いため、酸素伝達層２の下層に溜まる。

続いて、図３（ｃ）に示すように、試料３２が酸素伝達層２の上から容器１０に導入されると、試料３２もまたシリコンオイル２１より比重が重いため、酸素伝達層２の下層に移動し、反応液３１と混合されて反応層３を形成する。この段階で、酵素と基質との接触を促進するために、反応層３を、酸素伝達層２との層構造を乱さないよう静かに攪拌してもよい。

そして、所定の時間が経過すると、反応層３での酵素反応が進行し、図３（ｄ）に示すように、反応液３１に含まれる発色剤によって、反応層３の色が変化する。以降の測定については、図２に示す例と同様である。

以上のように、本実施形態に係る反応検出方法では、容器１０中には、図２では反応層３および酸素伝達層２の順に、図３では酸素伝達層２および反応層３の順に、各層が形成される。上記のように、酸素伝達層２を形成するシリコンオイル２１は、反応層３を形成する反応液３１および試料３２と非混和性であり、且つこれらよりも軽い比重を有する。

それゆえ、図２および図３のいずれであっても、反応層３と大気層１との間に酸素伝達層２を形成することができる。すなわち、上記３種の液体（反応液３１、試料３２およびシリコンオイル２１）を任意の順序で容器１０に導入して、反応層３と大気層１との間に酸素伝達層２を形成することができる。

さらに、図２および図３に示すように、本実施形態に係る反応検出方法は、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応に伴って反応層３を着色する工程を含む。それゆえ、反応層３の色の変化を光学的に測定する方法、すなわち光学的測定手法によって、グルコース５とＧＯＤ６との酵素反応を検出することができる。

〔２．酸素伝達層の構造について〕
図１は、本実施形態に係る酸素伝達層２を、大気層１と反応層３とともに示す図であり、図２（ｃ）における容器１０の内部を示す概略図である。図１に示すように、容器１０中には、容器１０の底部から順に、反応層３、酸素伝達層２および大気１がこの順に形成されている。

大気層１は、酸素や窒素、およびその他の分子を含む気体の層である。本実施形態では、酸素分子４は、反応層３における酵素反応で消費される大気層１中の物質である。すなわち、大気層１は、少なくとも酸素分子４を含む気体の層である。

酸素伝達層２は、大気層１中の酸素分子４を、反応層３へと供給するための層であり、当該酸素伝達層２における酸素透過率は、反応部３における酸素透過率よりも高い。このような酸素伝達層３を形成する好適な物質として、本実施形態では、シリコンオイル２１が用いられている。

酸素透過率は、ある物質における酸素の溶解度と拡散速度とに基づいた数量であり、当該物質の酸素の通しやすさを示す指標である。酸素伝達層２は、反応層３よりも高い酸素透過率を有することにより、反応層３が大気層１から直接取り込むよりも高効率に、大気層１から酸素分子４を取り込むことができる（図中の曲線矢印）。さらに、反応層３に、酸素伝達層２中に溶存する酸素分子４を高効率に供給することができる（図中の直線矢印）。

反応層３は、反応液３１と試料３２とを混合した層である。反応層３では、上述のように、反応液３１に含まれるＧＯＤ６と、試料３２に含まれるグルコース５とによる酵素反応が生じる。

反応層３には酸素分子４が溶存しており、上記酵素反応の初期段階においては、反応層３に上記溶存する酸素分子４が消費される。しかしながら、上記酵素反応の進行に伴い、元々反応層３に溶存していた酸素分子４が消費され、やがては上記酵素反応の進行に必要な酸素分子４が不足することとなる。

ここで、反応層３は、酸素伝達層２と隣接して形成されているので、酸素伝達層２に溶存する酸素分子４を取り込むことができ、大気層１から直接酸素分子４を取り込むよりも高効率に酵素反応を生じさせることができる。それゆえ、反応層３における酵素反応速度を上昇させることができる。また、上記のような酵素反応の進行に伴う酸素分子４の不足を補うことができる。

以下に、酸素伝達層２を介して、酸素分子４が大気層１から反応層３へ取り込まれる機構について具体的に説明する。

通常、気体から液体への酸素分子４の移動（溶解）は、酸素分子４が液面に衝突し、該衝突した酸素分子４のうち一部が液体中に取り込まれることで生じる。このとき、衝突した酸素分子４が液体中に取り込まれる割合は、当該液体における酸素の溶解度に依存する。このため、酸素分子４の液面への衝突頻度が同程度である酸素伝達層２と反応層３とでは、該衝突した酸素分子４が液体中に取り込まれる割合は、酸素の溶解度が高い酸素伝達層２の方が、反応層３よりも高くなる。

一方、液体と液体との界面における酸素分子４の移動も、上記と同様に、酸素分子４が衝突した液体における酸素の溶解度に依存する。ここで、酸素分子４の界面への衝突頻度は、液体−液体間の方が、気体−液体間（気体から液体への酸素分子４の移動）と比較して圧倒的に高い。これは、酸素分子４は、気体中では自由分子として高い運動性を有するのに対し、液体中では分子間力の作用により運動性が低下するためである。従って、酸素分子４の伝達速度は、共に液体である酸素伝達層２と反応層３との間では、気体である大気層１と液体である反応層３との間で生じる場合よりも上昇する。

上記機構によれば、酸素伝達層２は、酸素分子４の反応層３への取り込みの律速段階となる酸素分子４の気体−液体間の移動速度を上昇させる。さらに、気体−液体間よりも液体−液体間の方が、酸素分子４の移動が生じる確率が高いことにより、酸素伝達層２から反応層３への酸素分子４の移動はスムーズに行われる。

従って、酸素伝達層２は、大気層１から酸素分子４を高効率に取り込むとともに、該取り込んだ酸素分子４を反応層３へと高効率に供給することができる。換言すれば、酵素反応の律速段階となる反応層３の酸素取り込み速度が、酸素伝達層２を介することで上昇する。

〔３．比較実験：酸素伝達層の反応促進効果の検証〕
本実施形態に係る反応検出方法において形成される酸素伝達層２の酵素反応の促進効果を検証するため、容器１０中に酸素伝達層２を設けた場合と設けない場合とで、酵素反応の速度を比較する実験を行った。

本実験では、容器１０として、９６ｗｅｌｌのマイクロプレートを用い、反応液３１としては、ＧＯＤ６（和光純薬工業（株）製）（６Ｕ／ｍＬ）、ＰＯＤ（和光純薬工業（株）製）（２Ｕ／ｍＬ）、４−ＡＡ（和光純薬工業（株）製）（２ｍＭ）、およびＴＯＯＳ（同仁化学（株）製）（８ｍＭ）を含む溶液を用いた。試料３２としては、ターゲット物質としてグルコース５（和光純薬工業（株）製）を含むグルコース溶液（１２ｍｇ／ｄＬ）を用いた。いずれも溶媒はＰＢＳであり、反応液３１および試料３２の合計量が１００ｍｌとなるように調整した。なお、括弧内の濃度は全て終濃度である。酸素伝達層２として使用したシリコンオイル２１は５０ｕＬである。

本実験の手順について、図４を参照して説明を行う。

図４（ａ）は、本実施形態の比較例に係る、酸素伝達層２なしの条件（以下、条件Ａとする）での酵素反応検出実験における各液体の導入手順を示す図である。

まず、ＧＯＤ６、ＰＯＤ、４−ＡＡ、およびＴＯＯＳを含む反応液３１を容器１０に導入する（Ｓａ１）。続いて、ターゲット物質であるグルコース５を含む試料３２（グルコース溶液）を導入する（Ｓａ２）。反応液３１と試料３２とが容器１０中で混合されることにより、反応層３が形成される。そして、所定の時間経過後にグルコース５とＧＯＤ６との酵素反応に伴って色が変化した反応層３の吸光度を測定する（Ｓａ３）。

図４（ｂ）は、本実施形態に係る、酸素伝達層２ありの条件（以下、条件Ｂとする）での酵素反応検出実験における各液体の導入手順を示す図である。Ｓｂ１およびＳｂ３の工程は条件ＡのＳａ１およびＳａ３と同様であるため説明を省略する。

条件Ｂでは、Ｓｂ１で反応液３１を導入した後に、反応液３１の上からシリコンオイル２１を導入する工程（Ｓｂ１−２）が設けられている点で、図４（ａ）に示す比較例とは異なる。この導入されたシリコンオイル２１によって酸素伝達層２が形成され、容器１０の内部は図３（ｂ）と同様の状態となる。続いて、図４（ａ）のＳａ２と同様に試料３２が導入される（Ｓｂ２）が、試料３２はシリコンオイル２１よりも比重が重いため、酸素伝達層２の下層へ移動し、既に導入されている反応液３１と混合されて反応層３を形成する。このときの容器１０の内部および試料３２の移動原理については、図３（ｃ）と同様である。

なお、条件Ａおよび条件Ｂにおいて、Ｓａ２（Ｓｂ２）とＳａ３（Ｓｂ３）との間において、反応層３を攪拌してもよい。ただし、図４（ｂ）の場合には、酸素伝達層２と反応層３との層構造を乱さない程度に、静かに攪拌する必要がある。

条件Ａおよび条件Ｂの実験結果を図５に示す。グラフの横軸は反応液３１と試料３２とが混合されてからの経過時間であり、縦軸は反応層３に５６０ｎｍの照射光を照射した場合の吸光度である。さらに、図中の丸で示したプロットは、条件Ａ（酸素伝達層２なし）にて得られたデータであり、三角で示したプロットは、条件Ｂ（酸素伝達層２あり）にて得られたデータである。

酵素反応が開始してから３分程度で、両条件間で吸光度に差異が現れていることが分かる。また、吸光度が２に達するまでに要する時間が、条件Ｂでは条件Ａの約半分に抑えられていることが分かる。すなわち、酸素伝達層２がない場合、酵素反応系に十分な酸素が供給されず、これによって酵素反応の進捗が阻害されていることが分かる。それ以降も、少なくとも反応開始後１０分の時点において条件Ａでの吸光度は条件Ｂに追い付いておらず、条件Ｂにおける酸素伝達層２が酵素反応速度を上昇させる効果（酵素伝達層２による酵素反応促進効果）が継続していることが分かる。

以上の結果から、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２が、グルコース５を酸化する酵素反応を促進する機能を有することが示された。すなわち、本実施形態に係る反応検出方法によって酸素伝達層２が形成されることにより、酵素反応の速度を上昇させることができる。

ここで、酸素伝達層２には、反応開始時には反応層３よりも多くの酸素が溶存しているため、酸素伝達層２の厚みに応じた溶存量だけ酸素分子４が供給されると考えられる。しかしながら、酸素伝達層２の厚みの増大に伴い、酸素分子４の拡散距離が長くなり、大気層１から反応層３への酸素分子４の伝達が効率的に行われなくなる虞がある。この点を考慮し、酸素伝達層２の適切な厚みを検証するために、さらなる実験を行った。

〔４．酸素伝達層２の厚みの影響〕
本実験は、反応液３１と試料３２の量、および導入手順に関しては、上記の比較実験における条件Ｂと同様の条件で実施した。但し、本実験では、図４（ｂ）のＳｂ１−２の工程において導入するシリコンオイル２１の量を０〜３００ｕＬの範囲で段階的に変化させた条件設定を行い、各条件で反応層３の吸光度を測定した。

本実験の結果を図６に示す。グラフの横軸はシリコンオイル２１からなる酸素伝達層２の厚みであり、縦軸は反応開始後２分の時点における、反応前と比較した反応層３の吸光度の変化量である。図中の破線はシリコンオイル２１の量が０ｕＬ、すなわち図４（ａ）に示した条件Ａと同様の手順で得られた吸光度の数値を示している。

図６のグラフより、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２の厚みが０ｍｍより厚く約２ｍｍ以下であるときに反応層３の吸光度の変化が最も大きい、すなわち酵素反応が最も促進されていることが分かる。一方、上記厚みが約４ｍｍを超えると酵素反応の促進効果が低減し、８ｍｍでは酸素伝達層２を設けていない条件Ａと同程度の結果となった。

以上の結果から、酸素伝達層２は一定以上厚みを増すと大気層１から反応層３への酸素伝達効果を損なうことが分かる。また、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２によって高い酸素伝達効果を実現するには、酸素伝達層２の厚みは、０ｍｍより大きく８ｍｍ以下であることが好ましく、更なる高い酸素伝達効果を実現するためには、０ｍｍより大きく約２ｍｍ以下であることが好ましいと言える。

ここで、特許文献２では、フィラー流体としてシリコンオイルを用いる例が記載されているが、当該文献においては、シリコンオイルの酸素を伝達する機能について言及されていない。さらに、特許文献２ではシリコンオイルによって小滴を大気より隔絶して操作する構成が示されているが、図６に示す実験結果からも、この構成が酸素伝達層として機能するものではないと言える。

〔５．まとめ〕
上記のように、本実施形態に係る反応検出方法では、ＧＯＤ６を触媒としてグルコース５を酸化する酵素反応を生じさせる反応層３と、酸素分子４を含む大気層１との間に、シリコンオイル２１からなる酸素伝達層２を形成することにより、反応層３における酵素反応を検出している。また、この酸素伝達層２は、反応層３よりも高い酸素透過率を有している。

これにより、酸素伝達層２は、大気層１中の酸素分子４を反応層３に効率的に供給し、反応層３における酵素反応を促進させることができる。すなわち、本実施形態の反応検出方法によれば、酸素伝達層２の形成により、反応層３における酵素反応全体の速度を上昇させることができる。

このため、ターゲット物質が全て反応した後の反応層３の観測データから試料３２中のターゲット物質の濃度を求める場合において、ターゲット物質が全て反応し終えるまでに要する時間を短縮化することができる。

一方、酵素反応の初速度からターゲット物質の濃度を推定する場合においては、酸素伝達層２によって、反応層３における溶存酸素量が擬似的に増えるため、初速度を求めるためのデータ範囲を広く取ることができる。これによって、試料中の溶存酸素を利用可能な期間における微少な変化に依存するために検出の精度が低くなる虞のある特許文献１および特許文献２と比較して、初速度からのターゲット物質の濃度の推定精度を向上させることができる。

さらに、シリコンオイル２１は反応層３と非混和性であり、且つ反応層３よりも比重が軽いことにより、反応層３を構成する液体とシリコンオイル２１とを任意の順序で容器１０に導入し、大気層１と反応層３との間に酸素伝達層２を容易に形成させることができる。

また、酵素反応を生じる基質または酵素をターゲット物質とすることにより、例えば試料中の所定の酵素または基質の濃度測定に基づいた生体機能障害またはウイルス感染の検査等、様々な生体分析が可能となる。特に、グルコース５をターゲット物質とすることで、例えば血糖や尿糖の分析が可能となるため、低血糖症や糖尿病等の種々の疾患に関する医療診断を行うことができる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明は、医療分野や生化学分野における生体試料の分析に好適に利用することができる。

１ 大気層（大気）
２ 酸素伝達層
３ 反応層
４ 酸素分子（酸素）
５ グルコース（ターゲット物質、基質）
６ ＧＯＤ（ターゲット物質、酵素）
２１ シリコンオイル
３２ 試料

Claims (8)

1. 試料中のターゲット物質に対する化学反応を検出する反応検出方法であって、
   上記化学反応を生じさせる反応層を形成する工程と、
   上記反応層よりも高い酸素透過率を有し、上記反応層と大気との間に、上記化学反応において消費される大気中の酸素を上記反応層に伝達する酸素伝達層を形成する工程と、を含むことを特徴とする反応検出方法。
2. 上記酸素伝達層を、上記反応層よりも比重が軽い物質を用いて形成することを特徴とする請求項１に記載の反応検出方法。
3. 上記酸素伝達層を、上記反応層と非混和性の物質を用いて形成することを特徴とする請求項１または２に記載の反応検出方法。
4. 上記酸素伝達層を、シリコンオイルを用いて形成することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の反応検出方法。
5. 上記酸素伝達層の厚みは、２ｍｍ以下であることを特徴とする請求項４に記載の反応検出方法。
6. 上記化学反応は酵素反応であり、
   上記ターゲット物質は酵素または基質であることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の反応検出方法。
7. 上記ターゲット物質はグルコースであることを特徴とする請求項６に記載の反応検出方法。
8. 上記化学反応に伴って上記反応層を着色する工程を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか１項に記載の反応検出方法。

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