WO2005064012A2 - Verfahren zum validieren und/oder kalibrieren eines systems zur durchführung von hybridisierungsexperimenten, mikroarray und kit hierfür - Google Patents

Verfahren zum validieren und/oder kalibrieren eines systems zur durchführung von hybridisierungsexperimenten, mikroarray und kit hierfür Download PDF

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WO2005064012A2
WO2005064012A2 PCT/EP2004/014414 EP2004014414W WO2005064012A2 WO 2005064012 A2 WO2005064012 A2 WO 2005064012A2 EP 2004014414 W EP2004014414 W EP 2004014414W WO 2005064012 A2 WO2005064012 A2 WO 2005064012A2
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microarray
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hybrids
molecules
measuring point
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Wolfgang Mann
Oliver Krispin
Petra HOFFMÜLLER
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Alopex Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00693—Means for quality control

Definitions

  • the invention relates to a microarray, a kit and a method for validating and / or calibrating a system for carrying out hybridization experiments.
  • the invention relates to a DNA microarray, a corresponding kit and a corresponding method.
  • DNA microarrays The basic structure of DNA microarrays is evident, for example, from EP 476 014 B1, EP 619 321 B1, EP 386 229 B1 and EP 373 203 B1.
  • Capture probes are fixed to a substrate. Each capture probe has a specific sequence. From a sample mixture in which there are complementary strands of nucleic acids, individual strands of nucleic acids are extracted according to the key-lock principle by hybridizing with the complementary capture probes.
  • a system for carrying out hybridization experiments comprises a device, reagents (buffer, wash solution) and certain process steps (application of the sample, hybridization, washing).
  • DE 100 50 943 A1 describes a corresponding hybridization chamber in which a cyclic movement of the sample material on the array can be carried out by means of two adjacent vessels that communicate with the hybridization chamber.
  • EP 1 132 485 A2 describes a further hybridization device with a hybridization chamber.
  • This hybridization chamber has a transparent cover.
  • a device is provided with which the individual spots on the array are scanned through the transparent cover during the hybridization process.
  • a temperature control device is provided which is designed such that the array can be temperature-controlled at different temperatures. The temperature is varied during a measurement run and the array is scanned at different temperature values. This is intended to capture all spots under ideal conditions.
  • a further hybridization device emerges from EP 1 148 119 A1, in which the hybridization is to be influenced by means of an electric field.
  • hybridization chamber is part of a circuit in which a pump is arranged.
  • the sample material can be circulated continuously in this circuit so that the
  • Hybridization experiments are carried out with a constant flow of the sample material along the surface of the array.
  • the sample strands should be exactly complementary to the probes and have an exact setting of the physical conditions (temperature, salt, etc.). Correct in this context means that only exactly complementary strands are bound and that the reaction is in equilibrium. This is the only way to quantify analytically correctly, because the same number of Associate and dissociate partners. There is therefore a dynamic balance here. This means that the melting temperature Tm of the respective hybrid is set.
  • Such physical and chemical boundary conditions can on the one hand be device-specific features, such as the geometry of the hybridization chamber, or process-specific features, such as the temperature control on the array, possible agitation of the sample material, how the sample material is applied or how the array is rinsed, washed or dried.
  • the results may also depend on the buffer, salt used and the way in which the sample material and other reagents have been pipetted.
  • the signals can depend on further physical parameters, for example the flow rate (cf. US 2003/0162283) or the applied electrical field (cf. EP 1 148 119 A1). It is therefore practically impossible to compare experiments carried out with different devices or with different settings of the physical and chemical parameters, even if the same type of microarray should be used.
  • US Pat. No. 6,490,533 B2 discloses a scanner for sampling hybridization signals, the signals being normalized.
  • the normalization compensates for different amplitudes of excitation signals due to different optical properties of the scanning optics and the scanning electronics at different wavelengths.
  • WO 00/52625 describes a further normalization of data using software.
  • the invention is therefore based on the object of providing means which permit a validation or calibration of a system for carrying out hybridization experiments carried out by means of microarrays.
  • the object is achieved by a method with the feature of claim 1 or 2, by a microarray with the features of claim 3 and by a kit with the features of claim 17.
  • Advantageous embodiments of the invention are specified in the respective subclaims.
  • a microarray is used for validating and / or calibrating a system for carrying out microarray experiments, comprising: at least one first measuring point with probe molecules (PM) located therein, which are complementary to target molecules and which can form hybrids with the target molecules which have a melting temperature T m ( PM ),
  • At least one second measuring point with probe molecules (MM1) located therein which are incompletely complementary to the target molecules and which can form false hybrids with the target molecules, which have a melting temperature T m (MM i).
  • the method according to the invention further comprises the steps:
  • the parameter value at the maximum difference between the signal intensities of the first and second measuring points being the parameter value at which the system is approximately in equilibrium with regard to the hybrids in the first measuring point, and to which System is calibrated.
  • hybridization experiments are thus carried out under certain reaction conditions (device used, hybridization protocol used, etc.) in which target molecules are brought into connection with the probe molecules on the microarray which form hybrids or faulty hybrids. From the amount of hybrids and faulty hybrids formed in each case and their relationship to one another, it can be concluded whether the reaction conditions are suitable to meet the desired requirements for a hybridization experiment. If so, the reaction conditions are (or the system, device, method) validated. Comparing the results of different hybridization experiments that were carried out under different reaction conditions, one can select those reaction conditions in which the desired requirements are best met or at least meet a minimum standard.
  • the method according to the invention enables the calibration of a system under real test conditions.
  • the object is further achieved by a method for validating a system for performing microarray experiments with the following steps:
  • the validation being successful if the difference between the signal intensities of the first and second measuring points corresponds to a predetermined validation value.
  • the method according to the invention enables the validation of a system under real test conditions. It also enables different systems to be compared with one another.
  • microarray according to the invention for validating and / or calibrating a system for performing microarray experiments comprises:
  • PM PM measuring point with probe molecules located therein which are complementary to target molecules and which can form hybrids with the target molecules which have a melting temperature T m (PM).
  • MM1 An MM measuring point with probe molecules (MM1) located therein that are incompletely complementary to the target molecules and that with the target molecules
  • T m melting temperature
  • the microarray having a plurality of PM measuring points with different melting temperatures and corresponding MM measuring points and the different ones Cover melting temperatures of at least 15 ° C.
  • the microarray according to the invention also has: at least one second MM measuring point assigned to a specific PM measuring point with probe molecules (MM2) located therein which are incompletely complementary to the target molecules which can form false hybrids with the target molecules which form distinguish the probe molecules of the other MM measuring point corresponding to the PM measuring point and which have a melting temperature T m (MM2)
  • a further advantageous embodiment of a microarray according to the invention is characterized in that the probe molecules are formed from: DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, proteins, antigens / antibodies, peptides, steroid hormones or others biologically relevant analytes
  • a further advantageous embodiment of a microarray according to the invention is characterized in that the probe molecules are formed from oligonucleotides produced ex situ.
  • Such probe molecules can easily be provided in pure form, which is why the homogeneity of measuring points can be easily guaranteed. Their use therefore leads to high quality microarrays in an economical manner.
  • thermo difference .DELTA.T is between the melting temperature Tm (PM) of hybrids and the melting temperature T m (MM1) and / or Tm (MM2) of incorrect hybrids at least 0.5 ° C.
  • Such a microarray enables a particularly precise and convenient calibration or validation of a system for performing microarray experiments.
  • Further advantageous embodiments of a microarray according to the invention are characterized in that the temperature difference ⁇ T between the melting temperature Tm (PM) of hybrids and the melting temperature T m (MM1) and / or T m (MM2) of faulty hybrids between 0.1 ° C and 5 ° C.
  • a preferred embodiment of the microarray according to the invention is characterized in that each measurement point on the array occurs several times.
  • microarray enables local differences in hybridization reactions to be recognized as a function of the reaction conditions when calibrating or validating a system.
  • a configuration is also advantageous in which the PM measuring point is in the immediate vicinity of the MM measuring point (MM1) or the further MM measuring point (MM2).
  • a microarray of several PM measuring points preferably more than 2 or 3 PM measuring points, enables calibration methods or validation methods to be carried out at a comparatively large temperature range.
  • Such a microarray is advantageously further characterized in that the difference in the melting temperatures of hybrids of the target molecules with complementary probe points of different PM measuring points is at least 1 ° C. to 10 ° C.
  • Such a microarray is also advantageously characterized in that the different melting temperatures of the different PM measuring points unite Cover the range from at least 20 ° C to 60 ° C.
  • kits for validating and / or calibrating systems for carrying out microarray experiments comprising: a microarray according to the invention, and
  • the probe molecules (PM, MM) and the target molecules are formed from: DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, proteins, antigens / Antibodies, peptides, steroid hormones or other biologically relevant analytes
  • a further embodiment of the kit according to the invention is characterized in that the temperature difference ⁇ T between the melting temperature Tm (PM) of hybrids and the melting temperature Tm (MM) of faulty hybrids is at least 0.5 K.
  • FIG. 1 schematically shows three possible states of a hybridization equilibrium between probe molecules and target molecules, and signal intensities resulting therefrom,
  • FIG. 2A shows a schematic representation of the structure of probe molecules of a microarray according to the invention
  • FIG. 2B shows a schematic representation of the structure of further probe molecules of a microarray according to the invention
  • FIG. 3 shows a table listing the probe molecules of a microarray according to the invention
  • FIG. 4A shows a schematic representation of the structure of a target molecule according to the present invention
  • FIG. 4B shows a schematic representation of the structure of further target molecules according to the invention
  • FIG. 5 shows a table in which different target molecules according to the invention are listed
  • FIG. 6 shows a schematic representation of the signal intensities in the measuring points of a plurality of microarrays according to the invention after carrying out a method according to the invention
  • FIGS. 7A to 7D each have tables which relate to one of the microarrays shown in FIG. 6 at different temperatures
  • FIG. 8 shows a hybridization protocol
  • Figure 9 is a table listing the probe molecules of a microarray according to the invention and the corresponding different target molecules.
  • Microarrays have a substrate 1, on which probe molecules 2 are arranged, which can form a hybrid with target molecules 3.
  • the probe molecules 2 on the substrate 1 are grouped into measuring points, which are also referred to as spots.
  • PM first measuring point or PM measuring point with probe molecules
  • Tm melting temperature
  • MM1; mm mismatch
  • False hybrids are hybrids that are formed from a probe molecule and a target molecule that are not exactly complementary. If the probe molecules and the target molecules are formed from oligonucleotides or other sequences, the faulty hybrids typically have one or two defects. However, the target molecules and the probe molecules do not have to be a sequence. For example, they can also be formed from antigens and corresponding antibodies, which can also form a hybrid according to the key-lock principle. In this case, faulty hybrids are formed by probe molecules that do not exactly match the target molecules, but whose deviation is so small that hybridization is also possible when the melting temperature Tm (PM) is reduced.
  • Tm melting temperature
  • a faulty hybrid can therefore also be defined by its melting temperature T m (MM), which is at least 0.5 ° C lower than the melting temperature T m (PM) of the hybrid of complementary target molecule and probe molecule.
  • the melting temperature T m (MM) is preferably less than 1 ° C., 2 ° C., 3 ° C., 4 ° C., 5 ° C. or 10 ° C. than the melting temperature T m (PM).
  • Tm the amount of hybrids corresponds to the amount of free probe molecules. This fact is indicated by reaction arrows of the same length. If the experiment is interrupted at this point, a signal intensity la is obtained in the probe point in which the probe molecules 2 are located.
  • the hybridization reaction proceeds faster than the dissociation reaction, and at least theoretically, this should result in more hybrids than single molecules, which should lead to a higher signal intensity purple in the corresponding measurement point. This does not always have to be the case, since target molecules can be withdrawn from the reaction mixture due to incorrect hybridizations with other probes.
  • this temperature T 3 is closer to the melting temperature T m (MM) of the faulty hybrids than T 2 or Ti, and then higher signal intensities are obtained for the faulty hybrids than in the other two experiments.
  • the signal intensity of the hybrid signal does not increase to the same extent as the signal intensity of the faulty hybrid signal, especially since the formation of faulty hybrids removes target molecules from the reaction mixture which are then no longer available for hybrid formation. As a result, the distance between these two signal intensities decreases.
  • the difference between the signal intensities of measuring points which have hybrids and of measuring points which have faulty hybrids is therefore greatest at a temperature Ti which corresponds to the melting temperature T m of the hybrids.
  • the respective hybridization experiment is carried out at a temperature which is approximately the melting temperature T m of the conceivable hybrids between the probe molecules present on the microarray and the matching target molecules. Only if physical and chemical parameters are observed that allow the establishment of a chemical equilibrium at which the dissociation rate is at least approximately the association rate, is the amount of detectable incorrect hybridizations small compared to the amount of detectable hybridizations, and only then can make reliable qualitative and, if necessary, quantitative statements or statements about the proportions of target molecules in a biological sample.
  • the calculated melting temperatures of different probe molecules (or their hybrids with target molecules) on a microarray are generally as identical as possible or are at least in a very narrow temperature range.
  • This temperature is generally calculated using prior art methods as outlined above. These calculations are based on idealized conditions and it is not possible to carry out these calculations so precisely that all influences that can affect the respective hybridization experiment are included in the calculation. This includes a large number of parameters, for example the pressure prevailing in a hybridization chamber, the geometry of the hybridization used. chamber, the manner in which a reaction mixture is applied, the composition of the reaction mixture (concentration of target molecules, buffer contained therein, pH value, etc.), the reaction time, etc.
  • the microarray according to the invention makes it possible to carry out a calibration process in which the microarray is associated with target molecules which are complementary to the probe molecules in the first measuring point of the microarray, and a specific parameter which is to be calibrated is used in the hybridization experiments is calibrated.
  • the parameter value at the maximum difference between the signal intensities of the first and second measuring points is, for the reasons mentioned above, the parameter value at which the system is approximately in equilibrium with regard to the hybrids in the first measuring point, that is to say at which the system reaches a state which corresponds approximately to that of the reaction equation I in FIG. 1.
  • the temperature at which a microarray experiment is carried out depends on the probes arranged on the respective microarray and the resultant optimal optimal hybridization temperature for such a microarray, it is of particular advantage if one can use a microarray according to the invention which has several sets of measuring points, each with at least a first measuring point with complementary probe molecules (PM) and a second measuring point with the Target molecules have incompletely complementary probe molecules (MM), the hybrids of the target molecules with the complementary probe points (PM) of the different sets each having a different melting temperature, and wherein for each set separate probe and target molecules are provided, which are selected in such a way that incorrect hybridizations or cross-hybridizations between target molecules of one set and probe molecules of another set are almost impossible.
  • MM incompletely complementary probe molecules
  • the difference in melting temperatures of hybrids of the target molecules with complementary probes of different sets is at least one degree Celsius, and with the aid of these sets a range between 20 ° C and 60 ° C is covered, the user can use such a microarray to systems for performing hybridization experiments that run at any operating temperature between 20 ° C and 50 ° C.
  • the manufacturer of a hybridization device in which the hybridization reaction is to run fully automatically can use parameters such as the type of agitation of the hybridization chamber, the applied layer thickness of the sample material, the reaction time, etc. for every conceivable operating temperature between 20 ° C and 60 ° C using the microarray optimize and store in a device memory that is connected to a controller that controls the device taking into account the data contained in the memory.
  • the end user then only has to enter the hybridization temperature desired by him, and the device can use the controller to automatically set the parameters which are most favorable for the hybridization temperature selected in each case.
  • hybridization devices can also be recalibrated, for example by the manufacturer, or else checked or recalibrated by the user himself.
  • a system is validated by connecting the microarray to target molecules at about the melting temperature of the hybrids and carrying out the hybridization according to a predetermined protocol (see FIG. 8) and then determining whether the difference between the signal intensities of the first measuring points with hybrids and of the second or third measuring points with faulty hybrids corresponds to or exceeds a predetermined value. This value is to be specified for each device type by the manufacturer of the device. If a system fulfills this condition, it is validated correctly. Otherwise the device does not meet the requirements.
  • Different systems that is to say devices and / or methods for hybridizing, can be compared with one another on the basis of the values determined.
  • the validation can be carried out separately with the aid of a microarray according to the invention with different sets of probe molecules at different for each melting temperature for which a set is provided on the microarray.
  • Calibration and validation can be repeated at different points on a microarray at the same time.
  • the first, second and possibly third measuring points of a set of probe molecules can be repeatedly applied to a microarray at different locations.
  • a microarray can thus be completely covered by measuring points of one or more sets that are repeated at regular intervals.
  • inhomogeneities can be easily detected by means of such a microarray: at the points where the temperature of the microarray T m comes closest, the detected signal intensities of the respective measuring points of a set have the highest values and at other points lower values.
  • those parameters can be determined in which the differences between the values determined in this way of otherwise identical sentences are reduced to a minimum.
  • the invention is explained in more detail below in the context of an exemplary embodiment.
  • oligonucleotides are used as probe molecules and target molecules. However, this is in no way to be understood as limiting.
  • probes and target molecules such as DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, proteins, antigens / antibodies, peptides, stereoid hormones or other biologically relevant analytes.
  • Measuring points are applied at regular intervals on an epoxy-coated glass slide (75x25 mm Schott nexterion slide E), in which oligonucleotides with a total length of 26 or 30 nucleotides and with an amino link at the 5 'end are provided.
  • the oligonucleotide sequences each contain one
  • the relevant sequence for the hybridization is a 16 or 20mer.
  • the hybridization-relevant sequence is composed of 4 or 5 blocks of four nucleotides each. Two of the four blocks determine the GC content of the oligonucleotide and thus essentially its melting temperature T m , the remaining blocks have a GC content of 50%.
  • FIGS. 2A, 2B A schematic illustration of such probes is shown in FIGS. 2A, 2B.
  • 2A shows the schematic structure of a probe called GC 67, the melting temperature of which is 67 ° C.
  • 2B shows the schematic structure of two further probes GC 58 and GC 48, each of which has a melting temperature of 58 ° C. or 48 ° C.
  • probes on the microarray which differ from the probes by one nucleotide (mismatch 1, MM1) or by two nucleotides (mismatch2, MM2).
  • FIGS. 2A, 2B the respective four-nucleotide block in which such a nucleotide was exchanged is shown schematically with the designations MM1, MM2.
  • the exact sequences of the probes provided on the chip as well as their designation can be seen from the table in FIG. 3.
  • the nucleotide exchange takes place in the four-nucleotide block, which defines the GC content of the respective microarray probe.
  • the GC content of the microarray probe molecule is not changed by the nucleotide exchange, the GC content of the mismatch probe molecules corresponds to the GC content of the associated perfectmatch Probe molecules.
  • the spotted chipset also contains a negative control (GC 37).
  • Target molecules are synthesized for the probe molecules, which are perfectly complementary to the probe molecules GC 67, GC 58 and GC 48 and which are each labeled with Cy3 at the 5 'end. It is 16 or 20mers (Fig. 4a, Fig. 4b).
  • the target nucleic acids have the properties shown in the table in FIG. 5.
  • the respective probe molecules are spotted in a concentration of 40 ⁇ mol on a spot diameter of about 120 ⁇ m on the above-mentioned glass slide from Schott.
  • Four identical microarrays are produced, which have measurement points in eight columns and three rows.
  • Negative control probes (GC 37) are spotted in the first two columns of each microarray, perfectmatch probe molecules PM are spotted in columns 3 and 4, and mismatch probe molecules MM1 in which a nucleotide has been exchanged are spotted in columns 5 and 6 , and in columns 7 and 8 mismatch probe molecules MM2 in which two nucleotides were exchanged were spotted.
  • the respective probe molecules PM, MM1 and MM2 are spotted with the melting temperature 67 ° C, in the second row those with the melting temperature 58 ° C, in column 3 those with the melting temperature 48 ° C.
  • This microarray thus has measuring points that cover a temperature range between 48 ° C and 67 ° C and thus of 19 ° C. 6 shows four such microarrays arranged one below the other.
  • a first microarray is mixed with a reaction mixture which contains all three of the 5'-Cy3 labeled oligonucleotides GC 67, GC 58 and GC 48 in a concentration of one nanomole per liter, at a hybridization temperature of 67 ° C. with the aid of an array booster Advalytix GmbH, Brunnthal, carried out with a mixing setting on the array booster of 26 dbm.
  • the signal intensities resulting from this experiment correspond to the signal intensities of the microarray surface shown first in FIG. 6.
  • a second microarray hybridization experiment at a hybridization temperature of 58 ° C. a result is obtained under otherwise identical conditions as it is schematically corresponds to the microarray shown in second place from above in FIG.
  • FIGS. 7A to 7D give the respectively measured signal intensities in the microarrays shown in FIG. 6 in the experiments carried out at 67 ° C. (FIG. 7A), 58 ° C. (FIG. 7B), 48 ° C (Fig. 7C), 38 ° C (Fig. 7D).
  • the result of the first hybridization experiment at 67 ° C. can be seen in FIG. 6 above.
  • the corresponding intensity values (detection of Cy3) are listed from FIG. 7A.
  • the mean value of the signal intensity at the measuring points that the GC 67 probe has is 28,507.25 units.
  • the signal intensity in the measuring point which has the GC 67 MM1 probe is only 1/100 of it, the signal intensity in the measuring points which contain the GC 67 MM2 probe molecules is even lower, it is less than a 1/300 of that in the Measuring point with the GC 67 probes. If the same experiment is carried out at a temperature of 58 ° C, the signal intensities determined at these measuring points are less far apart.
  • the signal intensity in the measurement point GC 67 MM2 is approximately 1/160 of the signal intensity determined in the measurement point GC 67, and the value determined in the measurement point GC 67 MM1 is approximately 1/7 of the value determined in the probe point GC 67 , Finally, at 48 ° C and 38 ° C, the factor shrinks to values between 1, 28 and 1, 88. At 58 ° C the factor formed from the signal intensities of the perfectmatch probes and the signal intensities of the respective mismatch probes is greatest for the GC 58 probes, whereas it decreases at the other temperatures for these probes.
  • the sequences of a second exemplary embodiment of the probes provided on the chip and of the corresponding target molecules are shown in FIG. 9.
  • the microarray of the second embodiment is basically the same as the microarray of the first embodiment, and differs from the first embodiment only in the other probe sequences.
  • This execution Example includes four PM test points for the melting temperatures 61 ° C, 53 ° C, 43 ° C and 33 ° C as well as corresponding MM 1 test points and MM2 test points.
  • a probe point is also provided for a negative control.
  • This microarray thus has measuring points that cover a temperature range between 33 ° C and 61 ° C and thus of 28 ° C.
  • the maximum temperature difference between two PM test points with neighboring melting temperatures is 10 ° C. This temperature difference should at least not be greater than 15 ° C. It can also be expedient to limit the maximum temperature difference between two PM test points with adjacent melting temperatures to less than 10 ° C., in particular to 8 ° C. or 5 ° C.
  • Cy-3 is used as a fluorescent marker in order to be able to determine the relative amount of hybrids formed in measuring points.
  • marking systems known to the person skilled in the art can also be used, for example different fluorescent dyes, or markings based on detection mechanisms other than fluorescence.
  • microarrays according to the invention can also have protein materials or other materials as probe molecules instead of nucleic acid material, depending on what type of microarray is to be examined with the system to be validated or calibrated.
  • the method according to the invention can be summarized as follows: a) Using a microarray with at least one first measuring point with probe molecules (PM) located therein, which are complementary to target molecules and which can form hybrids with the target molecules which have a melting temperature T m (PM) , - At least one second measuring point with probe molecules (MM1) located therein, which are incompletely complementary to the target molecules and which can form false hybrids with the target molecules, which have a melting temperature T m (MM1), b) Use of target molecules which form probe molecules (PM) are complementary in one or more first measuring points of the microarray, and c) performing a hybridization experiment with the microarray and the target molecules when a certain parameter is varied, d) determining the signal intensities as a function of the change in the parameter, the parameter value at the maximum difference between the signal intensities of the first and second measuring points being the parameter value at which the system approximately approximates the hybrids in the first measuring point is in balance and to which the system is calibrated.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Kalibrieren und/oder Validieren eines Systems zum Durchführen eines Mikroarray-Experimentes und ein Mikroarray und ein Kit hierfür. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst folgende Schritte: a) Bereitstellen eines Mikroarrays mit - zumindest einem ersten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM), die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride aus-bilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(PM) aufweisen. - zumindest einem zweiten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(MM1) aufweisen, b) Bereitstellen von Zielmolekülen die zu Sondenmolekülen (PM) in einem oder meh-reren ersten Messpunkten des Mikroarrays komplementär sind, und c) Durchführen eines Hybridisierungsexperimentes mit dem Mikroarray und den Ziel-molekülen bei Variierung eines bestimmten Parameters, d) Feststellen der Signalintensitäten in Abhängigkeit der Veränderung des Parame-ters, wobei der Parameterwert bei dem maximalen Unterschied zwischen den Sig-nalintensitäten der ersten und zweiten Messpunkte der Parameterwert ist, bei dem das System bezüglich der Hybride in dem ersten Messpunkt annähernd im Gleichgewicht ist, und auf den das System kalibriert wird.

Description

Verfahren zum Validieren und/oder Kalibrieren eines Systems zur Durchfüh- rung von Hybridisierungsexperimenten, Mikroarray und Kit hierfür
Die Erfindung betrifft ein Mikroarray, ein Kit und ein Verfahren zum Validieren und/oder Kalibrieren eines Systems zur Durchführung von Hybridisierungsexperimenten. Insbesondere betrifft die Erfindung ein DNA-Mikroarray, ein entsprechendes Kit und ein entsprechendes Verfahren.
Der grundsätzliche Aufbau von DNA-Mikroarrays geht zum Beispiel aus der EP 476 014 B1 , EP 619 321 B1 , EP 386 229 B1 und EP 373 203 B1 hervor.
Hierbei sind Fängersonden an einem Substrat fixiert. Jede Fängersonde weist eine bestimmte Sequenz auf. Aus einem Probengemisch, in dem sich komplementäre Stränge von Nukleinsäuren befinden, werden nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip einzelne Stränge von Nukleinsäuren herausgefangen, in dem sie mit den komplementären Fängersonden hybridisieren.
Ein System zur Durchführung von Hybridisierungsexperimenten umfasst eine Vorrichtung, Reagenzien (Puffer, Waschlösung) und bestimmte Verfahrensschritte (Ap- plizieren der Probe, Hybridisieren, Waschen).
Zur Durchführung von Hybridisierungsexperimenten gibt es eine Vielzahl unterschiedlicher Vorrichtungen, die in der Regel eine temperierbare Hybridisierungskam- mer aufweisen, in der das Mikroarray angeordnet wird und mit der Probe und weiteren Reagenzien benetzt wird.
So geht aus der DE 100 50 943 A1 eine entsprechende Hybridisierungskammer her- vor, in welcher mittels zweier benachbart angeordneter Gefäße, die mit der Hybridisierungskammer kommunizieren, eine zyklische Bewegung des Probenmaterials auf dem Array ausgeführt werden kann.
Die EP 1 132 485 A2 beschreibt eine weitere Hybridisierungsvorrichtung mit einer Hybridisierungskammer. Diese Hybridisierungskammer besitzt eine transparente Abdeckung. Es ist eine Vorrichtung vorgesehen, mit der während des Hybridisierungs- vorganges durch die transparente Abdeckung hindurch die einzelnen Spots auf dem Array abgetastet werden. Es ist eine Temperiereinrichtung vorgesehen, die derart ausgebildet ist, dass das Array auf unterschiedliche Temperaturen temperierbar ist. Während eines Messlaufes wird die Temperatur variiert und das Array bei unterschiedlichen Temperaturwerten abgetastet. Hierdurch sollen alle Spots zu idealen Bedingungen erfasst werden.
Aus der EP 1 148 119 A1 geht eine weitere Hybridisierungsvorrichtung hervor, bei welcher die Hybridisierung mittels eines elektrischen Feldes beeinflusst werden soll.
In der US 2003/0162283 A1 ist eine weitere Vorrichtung zum Hybridisieren beschrieben, bei der eine Hybridisierungskammer vorgesehen ist. Die Hybridisierungskammer ist Bestandteil eines Kreislaufes, in dem eine Pumpe angeordnet ist. In diesem Kreislauf kann das Probenmaterial kontinuierlich umgewälzt werden, so dass die
Hybridisierungsexperimente bei einem stetigen Durchfluss des Probenmaterials entlang der Oberfläche des Arrays ausgeführt werden.
Um qualitativ und quantitativ korrekte Ergebnisse zu erhalten, sollten die Proben- stränge exakt komplementär zu den Sonden sein und eine genaue Einstellung der physikalischen Bedingungen (Temperatur, Salz, etc.) aufweisen. Korrekt in diesem Zusammenhang bedeutet, dass möglichst nur exakt komplementäre Stränge gebunden werden und dass sich die Reaktion im Gleichgewicht befindet. Denn nur dann kann analytisch korrekt quantifiziert werden, weil je Zeiteinheit ebenso viele Reakti- onspartner assoziieren wie dissoziieren. Hier liegt somit ein dynamisches Gleichgewicht vor. Das heißt, dass die Schmelztemperatur Tm des jeweiligen Hybrides eingestellt ist.
Bei einem komplexen Mikroarray ist es kaum möglich, jede einzelne Hybridisierungs- reaktion (in jedem Messpunkt bzw. Spot) im Gleichgewicht zu messen, da sich die Sequenzen und damit ihre Schmelztemperaturen Tm stets leicht unterscheiden. Die Vorhersage der Schmelztemperatur ist möglich, wobei die experimentelle Bestimmung durch die Unzulänglichkeit der Vorhersage, Sequenzspezifitäten oder thermo- dynamische Randbedingungen von der Vorhersage abweicht. Verfügbare Software zur Vorhersage von Schmelztemperaturen von DNA-Sequenzen für Mikroarrays sind z. B. Rouillard, JM. et al. (Nucleic Acids Research 2003, 31 : 3057-3062): OligoAr- ray2.0: design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamic approach; Nielsen, HB. et al. (Nucleic Acids Research 2003, 31 : 3491 -3496); Li, F. & GD Stormo (Bioinformatics 2001 , 17: 1067-1076).
Besonders bei der automatisierten Abarbeitung, die die Probenapplikation, Hybridi- sierungsschritte und Waschprozeduren umfasst, stellt sich oftmals das Problem, dass Abweichungen im Ergebnis der Signalintensitäten sowohl biologischen Ur- sprung in der Probe haben können, als auch darauf beruhen können, dass die physikalischen und chemischen Randbedingungen nicht korrekt eingehalten worden sind. Dies hat zur Folge, dass die Auswertung entsprechender Signale mit einer erheblichen Unsicherheit behaftet ist. Derartige physikalische und chemische Randbedingungen können zum einen vorrichtungsspezifische Merkmale, wie die Geometrie der Hybridisierungskammer, oder verfahrensspezifische Merkmale sein, wie die Temperaturführung am Array, eventuelles Agitieren des Probenmaterials, wie das Probenmaterial appliziert wird oder wie das Array gespült, gewaschen oder getrocknet wird. Die Ergebnisse können auch von dem verwendeten Puffer, Salz und der Art und Weise wie das Probenmaterial und sonstige Reagenzien pipettiert worden sind, ab- hängen. Des weiteren können die Signale in Abhängigkeit von der verwendeten Vorrichtung von weiteren physikalischen Parametern abhängen, z.B. der Durchflussgeschwindigkeit (vgl. US 2003/0162283) oder des angelegten elektrischen Feldes (vgl. EP 1 148 119 A1). Es ist somit praktisch nicht möglich, Experimente, die mit unterschiedlichen Vorrichtungen oder mit unterschiedlicher Einstellung der physikalischen und chemischen Parameter ausgeführt worden sind, zu vergleichen, selbst wenn der gleiche Typ von Mikroarray verwendet werden sollte.
Es besteht daher ein erheblicher Bedarf, ein entsprechendes System zur Durchführung von Hybridisierungsexperimenten zu validieren bzw. zu kalibrieren, damit die erhaltenen Signale vergleichbar sind und Abweichungen im Ergebnis einen sicheren Rückschluss auf die biologische Probe zulassen.
Aus
- SASIK, R. u.a.: Statistical analysis of high-density oligonucleotide arrays: a multipli- cative noise model. Bioinformatics (2002) 18 (12) 1633-40,
- der WO 00/22173 A1 , - HELD, G.A. u.a.: Modeling of DNA microarray data by using physical properties of hybrid ization. Proc. Natl. Acad. Sei. USA (24.06.2003) 100 (13) 7575-80, und
- URAKAWA, H. u.a.: Optimization of single-base-pair mismatch discrimination in oligonucleotide microarrays. Appln. Environ. Microbiol. (Mai 2003) 69 (5) 2848-56 gehen Mikroarrays hervor, die Sonden, die mit einem bestimmten Zielmolekül perfekt hybridisieren, und weitere Sonden aufweisen, die mit dem bestimmten Zielmolekül nicht perfekt hybridisieren.
Aus der US 6,490,533 B2 geht ein Scanner zum Abtasten von Hybridisierungssigna- len hervor, wobei die Signale normalisiert werden. Mit der Normalisierung werden unterschiedliche Amplituden von Anregungssignalen aufgrund unterschiedlicher optischer Eigenschaften der Abtastoptik und der Abtastelektronik bei unterschiedlichen Wellenlängen kompensiert.
Die WO 00/52625 beschreibt eine weitere Normalisierung von Daten mittels Soft- wäre.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, Mittel zur Verfügung zu stellen, die ein Validieren oder Kalibrieren eines Systems zur Durchführung von mittels Mikroarrays ausgeführten Hybridisierungsexperimenten erlauben. Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit dem Merkmal des Anspruchs 1 bzw. 2 durch ein Mikroarray mit den Merkmalen des Anspruchs 3 und durch ein Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 17 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen angegeben.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Mikroarray zum Validieren und/oder Kalibrieren eines Systems zum Durchführen von Mikroarray-Experimenten verwendet, aufweisend: - zumindest einen ersten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM), die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(PM) aufweisen,
- zumindest einen zweiten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(MMi) aufweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst ferner die Schritte:
- Durchführen eines Hybridisierungsexperimentes mit dem Mikroarray und den Ziel- molekülen bei Variierung eines bestimmten Parameters,
- Feststellen der Signalintensitäten in Abhängigkeit der Veränderung des Parameters, wobei der Parameterwert bei dem maximalen Unterschied zwischen den Signalintensitäten der ersten und zweiten Messpunkte der Parameterwert ist, bei dem das System bezüglich der Hybride in dem ersten Messpunkt annähernd im Gleichgewicht ist, und auf den das System kalibriert wird.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden somit Hybridisierungsexperimente unter bestimmten Reaktionsbedingungen (verwendete Vorrichtung, verwendetes Hybridi- sierungsprotokoll, etc.), bei dem Zielmoleküle mit den Sondenmolekülen auf dem Mikroarray in Verbindung gebracht werden, die mit diesen Hybride oder Fehlhybride ausbilden, durchgeführt. Aus der Menge der jeweils gebildeten Hybride und Fehlhybride und deren Verhältnis zueinander lässt sich darauf schließen, ob die Reaktionsbedingungen dazu geeignet sind, die gewünschten Anforderungen an ein Hybridisie- rungsexperiment zu erfüllen. Wenn das der Fall ist, sind die Reaktionsbedingungen (oder das System, die Vorrichtung, das Verfahren) validiert. Vergleicht man die Ergebnisse von verschiedenen Hybridisierungsexperimenten, die bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchgeführt wurden, untereinander, kann man diejenigen Reaktionsbedingungen auswählen, bei denen die gewünschten Anforderungen am besten erfüllt sind oder zumindest einen Mindeststandard erfüllen. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Kalibrierung eines Systems unter realen Versuchsbedingungen.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zum Validieren eines Systems zum Durchführen von Mikroarray-Experimenten mit folgenden Schritten:
- Bereitstellen des oben genannten Mikroarrays,
- Bereitstellen von Zielmolekülen, die zu den Sondenmolekülen (PM) in einem oder mehreren ersten Messpunkten des Mikroarrays komplementär sind, und
- Durchführen eines Hybridisierungsexperimentes mit dem Mikroarray und den Ziel- molekülen bei Standardparametern bei Verwendung des zu validierenden Systems,
- Feststellen der Signalintensitäten, wobei die Validierung erfolgreich ist, wenn der Unterschied zwischen den Signalintensitäten der ersten und zweiten Messpunkte einem vorbestimmten Validierungswert entspricht.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Validierung eines Systems unter realen Versuchsbedingungen. Es ermöglicht darüber hinaus auch den Vergleich verschiedener Systeme untereinander.
Das erfindungsgemäße Mikroarray zum Validieren und/oder Kalibrieren eines Sys- tems zum Durchführen von Mikroarray-Experimenten, umfasst:
- einen PM-Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM), die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(PM) aufweisen.
- einen MM-Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1), die unvoll- ständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen
Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(MM1) aufweisen, wobei das Mikroarray mehrere PM-Messpunkte mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen und dazu korrespondierende MM-Messpunkte aufweist und die unterschiedlichen Schmelztemperaturen mindestens einen Bereich von 15°C abdecken.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung weist das erfindungsgemäße Mikroarray außerdem auf: Zumindest einen zweiten einem bestimmten PM-Messpunkt zugeordneten MM- Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM2), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind, die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die sich von den Sondenmolekülen des anderen zum PM-Messpunkt korrespondierenden MM-Messpunktes unterscheiden und die eine Schmelztempe- ratur Tm(MM2) aufweisen
Weitere vorteilhafte Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Mikroarrays sind dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle ausgebildet sind aus: DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, Proteinen, Antige- nen/Antikörper, Peptide, Stereoidhormone oder andere biologisch relevante Analyten
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung eines erfindungsgemäßen Mikroarrays ist dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle ausgebildet sind aus ex-situ hergestellten Oligonukleotiden.
Solche Sondenmoleküle können gut in Reinform bereitgestellt werden, weshalb die Homogenität von Messpunkten gut gewährleistet werden kann. Ihre Verwendung führt daher auf ökonomische Weise zu qualitativ hochwertigen Mikroarrays.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen eines erfindungsgemäßen Mikroarrays sind dadurch gekennzeichnet, dass der Temperaturunterschied ΔT zwischen der Schmelztemperatur Tm(PM) von Hybriden und der Schmelztemperatur Tm(MM1) und/oder Tm(MM2) von Fehlhybriden zumindest 0,5°C beträgt.
Ein solches Mikroarray ermöglicht eine besonders genaue und komfortable Kalibrierung oder Validierung eines Systems zum Durchführen von Mikroarray- Experimenten. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen eines erfindungsgemäßen Mikroarrays sind dadurch gekennzeichnet, dass der Temperaturunterschied ΔT zwischen der Schmelztemperatur Tm(PM) von Hybriden und der Schmelztemperatur Tm(MM1) und/oder Tm(MM2) von Fehlhybriden zwischen 0,1 °C und 5°C beträgt.
Eine bevorzugte Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Mikroarrays ist dadurch gekennzeichnet, dass jeder Messpunkt auf dem Array mehrfach vorkommt.
Ein solches Mikroarray ermöglicht es, lokal Unterschiede von Hybridisierungsreaktio- nen in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen bei der Kalibrierung oder Validierung eines Systems zu erkennen.
Vorteilhaft ist ferner eine Ausgestaltung, bei der der PM-Messpunkt in unmittelbarer Nachbarschaft zum MM-Messpunkt (MM1) beziehungsweise zu dem weiteren MM- Messpunkt (MM2) ist.
Durch die unmittelbare Nachbarschaft der Sonden werden unterschiedliche Reaktionsbedingungen, die an unterschiedlichen Stellen eines Arrays gegebenenfalls auftreten können, beispielsweise bedingt durch unterschiedliche Schichtdicken an den verschiedenen Enden des Mikroarrays, oder bedingt durch andere Unwägbarkeiten, auf ein Minimum reduziert.
Ein Mikroarray mehreren PM-Messpunkten, vorzugsweise mehr als 2 oder 3 PM- Messpunkte, ermöglicht die Durchführung von Kalibrierverfahren oder Validierverfah- ren bei einem vergleichsweise großen Temperaturumfang.
Vorteilhafterweise ist ein solches Mikroarray ferner dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied der Schmelztemperaturen von Hybriden der Zielmoleküle mit dazu komplementären Sondenpunkten unterschiedlicher PM-Messpunkte zumindest 1°C bis 10°C beträgt.
Vorteilhafterweise ist ein solches Mikroarray ferner dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Schmelztemperaturen der unterschiedlichen PM-Messpunkte einen Bereich von mindestens 20°C bis 60°C abdecken.
Die Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Kit zum Validieren und/oder Kalibrieren von Systemen zum Durchführen von Mikroarray-Experimenten, umfassend: - ein erfindungsgemäßes Mikroarray, und
- zumindest Zielmoleküle, die zu den Sondenmolekülen (PM) auf dem Mikroarray komplementär sind.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist dadurch gekenn- zeichnet, dass die Sondenmoleküle (PM, MM) und die Zielmoleküle ausgebildet sind aus: DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, Proteinen, Antigenen/Antikörper, Peptide, Stereoidhormone oder andere biologisch relevante Analyten
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist dadurch gekennzeichnet, dass der Temperaturunterschied ΔT zwischen der Schmelztemperatur Tm(PM) von Hybriden und der Schmelztemperatur Tm(MM) von Fehlhybriden zumindest 0,5 K beträgt.
Im folgenden wird die Erfindung beispielhaft anhand der Zeichnungen näher erläutert.
Die Zeichnungen zeigen in
Figur 1 jeweils schematisch drei mögliche Zustände eines Hybridisie- rungsgleichgewichtes zwischen Sondenmolekülen und Zielmolekülen, sowie daraus resultierende Signalintensitäten,
Figur 2A eine schematische Darstellung des Aufbaus von Sondenmolekülen eines erfindungsgemäßen Mikroarrays,
Figur 2B eine schematische Darstellung des Aufbaus von weiteren Sondenmolekülen eines erfindungsgemäßen Mikroarrays, Figur 3 eine Tabelle, die die Sondenmoleküle eines erfindungsgemäßen Mikroarrays auflistet,
Figur 4A eine schematische Darstellung des Aufbaus eines Zielmoleküls nach der vorliegenden Erfindung,
Figur 4B eine schematische Darstellung des Aufbaus weiterer Zielmoleküle nach der Erfindung,
Figur 5 eine Tabelle, in der unterschiedliche Zielmoleküle nach der Erfindung aufgelistet sind,
Figur 6 eine schematische Darstellung der Signalintensitäten in den Messpunkten einer Mehrzahl von erfindungsgemäßen Mikroarrays nach Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
Figuren 7A bis 7D jeweils Tabellen, die sich auf jeweils auf einen der in der Figur 6 dargestellten Mikroarrays bei unterschiedlichen Temperaturen bezieht,
Figur 8 ein Hybridisierungsprotokoll, und
Figur 9 eine Tabelle, die die Sondenmoleküle eines erfindungsgemäßen Mikroarrays und die korrespondierenden unterschiedlichen Zielmoleküle auflistet.
Mikroarrays weisen ein Substrat 1 auf, an dem Sondenmoleküle 2 angeordnet sind, die mit Zielmolekülen 3 ein Hybrid bilden können. In der Regel sind die Sondenmoleküle 2 auf dem Substrat 1 in Messpunkten gruppiert, die auch als Spots bezeichnet werden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Mikroarray verwendet, das zumindest einen ersten Messpunkt bzw. PM-Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM; PM = perfect match) auf, die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm (PM) aufweisen, und zumindest einen zweiten Messpunkt bzw. MM-Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1 ; mm = mismatch), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm (MM 1) aufweisen.
Fehlhybride sind Hybride, die aus einem Sondenmolekül und einem Zielmolekül ausgebildet sind, die nicht exakt komplementär sind. Sind die Sondenmoleküle und die Zielmoleküle aus Oligonucleotiden oder anderen Sequenzen ausgebildet, so weisen die Fehlhybride typischerweise eine oder zwei Fehlstellen auf. Die Zielmoleküle und die Sondenmoleküle müssen jedoch keine Sequenz sein. So können sie zum Beispiel auch aus Antigenen und korrespondierenden Antikörpern ausgebildet sein, die auch nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip ein Hybrid bilden können. Fehlhybride werden in diesem Fall durch Sondenmoleküle ausgebildet, die nicht exakt zu den Zielmolekülen passen, jedoch deren Abweichung so gering ist, dass bei einer Absen- kung der Schmelztemperatur Tm(PM) auch eine Hybridisierung möglich ist. Daher kann ein Fehlhybrid auch über seine Schmelztemperatur Tm(MM) definiert sein, die mindestens 0,5 °C kleiner als die Schmelztemperatur Tm(PM) des Hybrides aus komplementären Zielmolekül und Sondenmolekül ist. Vorzugsweise ist die Schmelztemperatur Tm (MM) kleiner als 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C bzw. 10 °C als die Schmelz- temperatur Tm (PM).
Bringt man die Oberfläche eines erfindungsgemäßen Mikroarrays unter typischen Hybridisierungsbedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, mit Zielmolekülen in Verbindung und wählt man als Hybridisierungstemperatur die Schmelztemperaturen (Ti = Tm), so stellt sich ein heterogenes Gleichgewicht zwischen den am Substrat 1 angeordneten Sondenmolekülen PM 2 (feste Phase) und den freien Zielmolekülen 3 auf der einen Seite und den sich aus den Sondenmolekülen 2 und den Zielmolekülen 3 bildenden Hybriden 4 mit der Schmelztemperatur Tm ein (Fig. 1 oben). Bei Tm entspricht die Menge der Hybride der Menge freier Sondenmoleküle. Dieser Umstand wird durch gleich lange Reaktionspfeile angedeutet. Unterbricht man das Experiment an dieser Stelle, so erhält man in dem Sondenpunkt, in dem sich die Sondenmoleküle 2 befinden, eine Signalintensität la. Führt man dasselbe Experiment bei einer Temperatur T2 durch, die größer als die Schmelztemperatur ist (T2> Tm), so ist die Hybridisierungsgeschwindigkeit kleiner als die Dissoziationsgeschwindigkeit, und es liegen mehr vereinzelte Zielmoleküle 3 und Sondenmoleküle 2 vor als Hybride 4 vor (Figur 1 Mitte, angedeutet durch unter- schiedlich lange Reaktionspfeile). Unterbricht man das Experiment an dieser Stelle und wertet man das Mikroarray aus, so detektiert man in einem Messpunkt weniger Hybride und erhält daher eine Signalintensität lla, die kleiner ist als die im ersten Experiment gemessene Signalintensität la.
Führt man das Experiment bei einer Temperatur T3 durch, die kleiner als die
Schmelztemperatur ist, (T3 < Tm), so verläuft die Hybridisierungsreaktion schneller als die Dissoziationsreaktion, und zumindest theoretisch müsste daraus resultieren, dass mehr Hybride vorliegen, als Einzelmoleküle, was zu einer höheren Signalintensität lila in dem entsprechenden Messpunkt führen sollte. Dies muss nicht immer der Fall sein, da Zielmoleküle durch Fehlhybridisierungen mit anderen Sonden dem Reaktionsgemisch entzogen sein können.
Die Schmelztemperatur Tm(PM) von Hybriden zwischen einem Zielmolekül und einem Sondenmolekül, das komplementär zu dem Zielmolekül ist, ist grundsätzlich höher als die Schmelztemperatur Tm(MM) eines Fehlhybrides zwischen einem Zielmolekül und einem unvollständig komplementären Sondenmolekül. Wenn Ti = Tm(PM) ist, gilt darum zugleich Ti > Tm(MM), woraus für Hybride eine normale Signalintensität la resultiert und für Fehlhybride eine geringe Intensität lla, wie in Figur 1 schematisch dargestellt.
Führt man das Experiment bei einer Temperatur T2 > Tm(PM) durch, so folgt daraus, dass man sowohl für die Hybride als auch für die Fehlhybride jeweils schwache Signalintensitäten erhält, woraus wiederum folgt, dass sie sich weniger stark voneinander unterscheiden als die Signalintensitäten bei Tm(PM).
Führt man das Experiment bei einer Temperatur T3 < Tm(PM) durch, so liegt diese Temperatur T3 näher an der Schmelztemperatur Tm(MM) der Fehlhybride als T2 oder Ti, und man erhält dann für die Fehlhybride höhere Signalintensitäten als bei den anderen beiden Experimenten. Gegenüber einem Experiment mit der Temperatur Ti nimmt die Signalintensität des Signals der Hybride aber nicht in dem Maße zu, wie die Signalintensität des Signals der Fehlhybride, zumal die Bildung von Fehlhybriden Zielmoleküle aus dem Reaktionsgemisch entfernt, die dann für eine Hybridbildung nicht mehr zur Verfügung stehen. Dadurch nimmt der Abstand zwischen diesen bei- den Signalintensitäten ab.
Der Unterschied zwischen den Signalintensitäten von Messpunkten, die Hybride aufweisen, und von Messpunkten, die Fehlhybride aufweisen, ist darum bei einer Temperatur Ti, die der Schmelztemperatur Tm der Hybride entspricht, am größten.
Aus den oben in der Beschreibungseinleitung genannten Gründen ist es für die Reproduzierbarkeit und die Aussagekraft von Mikroarray-Hybridisierungsexperimenten wünschenswert, dass das jeweilige Hybridisierungsexperiment bei einer Temperatur durchgeführt wird, die annähernd der Schmelztemperatur Tm der denkbaren Hybride zwischen den auf den Mikroarray vorhandenen Sondenmolekülen und den dazu passenden Zielmolekülen entspricht. Nur dann, wenn physikalische und chemische Parameter eingehalten werden, die die Einstellung eines chemischen Gleichgewichtes ermöglicht, bei dem die Dissoziationsgeschwindigkeit zumindest annähernd der Assoziationsgeschwindigkeit entspricht, ist die Menge detektierbarer Fehlhybridisierun- gen gering im Vergleich zu der Menge detektierbarer Hybridisierungen, und nur dann lassen sich zuvelrässige qualitative und gegebenenfalls quantitative Aussagen oder solche über die Mengenverhältnisse von Zielmolekülen in einer biologischen Probe machen.
Die berechneten Schmelztemperaturen von unterschiedlichen Sondenmolekülen (bzw. deren Hybriden mit Zielmolekülen) auf einem Mikroarray sind aus diesem Grund im allgemeinen möglichst identisch oder liegen zumindest in einem sehr engen Temperaturbereich. Diese Temperatur wird im allgemeinen mit Verfahren nach dem Stand der Technik berechnet, wie es oben ausgeführt wurde. Diese Berechnun- gen gehen von idealisierten Bedingungen aus und es ist nicht möglich, diese Berechnungen so genau durchzuführen, dass alle Einflüsse, die auf das jeweilige Hybridisierungsexperiment wirken können, in die Berechnung mit einfließen. Dazu gehören eine Vielzahl von Parametern, beispielsweise der in einer Hybridisierungskammer vorherrschende Druck, die Geometrie der verwendeten Hybridisie- rungskammer, die Art und Weise der Auftragung eines Reaktionsgemisches, die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches (Konzentration an Zielmolekülen, darin enthaltene Puffer, ph-Wert, etc.), die Reaktionsdauer, usw.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Mikroarrays lässt sich nun genau ermitteln, bei welchen physikalischen und/oder chemischen Parametern das Gleichgewicht am ehesten dem gewünschten Gleichgewicht entspricht, also demjenigen, bei dem Assoziation und Dissoziation mit gleicher Geschwindigkeit vonstatten gehen.
Selbst wenn man immer dasselbe Gerät verwendet, können sich auf Grund der Abnutzung desselben von Experiment zu Experiment erhebliche Unterschiede ergeben, beispielsweise auf Grund von Abnutzungserscheinungen, beispielsweise bei einem Peltierelement, das nach einer gewissen Betriebsdauer an Leistung verliert, und darum nach dieser Betriebsdauer ein anderes Temperaturintervall bereitstellt, als zu Be- ginn seiner Lebensdauer. Aus diesem Grund ist es erforderlich, Systeme zum Hybridisieren entsprechend zu kalibrieren.
Das erfindungsgemäße Mikroarray ermöglicht es, ein Verfahren zum Kalibrieren durchzuführen, bei dem das Mikroarray mit Zielmolekülen, die zu den Sondenmole- külen im ersten Messpunkt des Mikroarrays komplementär sind, in Verbindung gebracht werden und ein bestimmter Parameter, der kalibriert werden soll, bei den Hybridisierungsexperimenten kalibriert wird.
Anschließend stellt man die jeweiligen Signalintensitäten in den Messpunkten mit Hybriden (erste Messpunkte) und in den Messpunkten mit Fehlhybriden (zweite
Messpunkte) in Abhängigkeit der Veränderung des Parameters fest. Der Parameterwert bei dem maximalen Unterschied zwischen den Signalintensitäten der ersten und zweiten Messpunkte ist aus den oben genannten Gründen der Parameterwert, bei dem das System bezüglich der Hybride in dem ersten Messpunkt annähernd im Gleichgewicht ist, das heißt bei dem das System einen Zustand erreicht, der annähernd demjenigen der Reaktionsgleichung I in Figur 1 entspricht.
Da die Temperatur, bei der ein Mikroarrayexperiment durchgeführt wird, abhängig ist von den auf dem jeweiligen Mikroarray angeordneten Sonden und der daraus resul- tierenden optimalen Hybridisierungstemperatur für ein solches Mikroarray, ist es von besonderem Vorteil, wenn man ein erfindungsgemäßes Mikroarray verwenden kann, das mehrere Sätze von Messpunkten aufweist, die jeweils zumindest einen ersten Messpunkt mit zu Zielmolekülen komplementären Sondenmolekülen (PM) und einen zweiten Messpunkt mit zu den Zielmolekülen unvollständig komplementären Sondenmolekülen (MM) aufweisen, wobei die Hybride der Zielmoleküle mit den komplementären Sondenpunkten (PM) der unterschiedlichen Sätze jeweils eine andere Schmelztemperatur aufweisen, und wobei für jeden Satz separate Sonden- und Zielmoleküle vorgesehen sind, die so ausgewählt sind, dass Fehlhybridisierungen oder Kreuzhybridisierungen zwischen Zielmolekülen eines Satzes und Sondenmolekülen eines anderen Satzes nahezu ausgeschlossen sind.
Wenn der Unterschied der Schmelztemperaturen von Hybriden der Zielmoleküle mit dazu komplementären Sonden unterschiedlicher Sätze zumindest ein Grad Celsius beträgt, und mit Hilfe dieser Sätze ein Bereich zwischen 20°C und 60°C abgedeckt wird, so kann der Anwender ein derartiges Mikroarray verwenden, um Systeme zum Durchführen von Hybridisierungsexperimenten zu kalibrieren, die bei einer beliebigen Betriebstemperatur zwischen 20°C und 50°C ablaufen.
Beispielsweise kann der Hersteller einer Hybridisiervorrichtung, in der die Hybridisie- rungsreaktion vollautomatisch ablaufen soll, für jede denkbare Betriebstemperatur zwischen 20°C und 60°C Parameter wie die Agitationsart der Hybridisierungskammer, die aufgetragene Schichtdicke des Probenmaterials, die Reaktionsdauer usw. mit Hilfe des Mikroarrays optimieren und in einem Gerätespeicher speichern, der mit einer Steuerung verbunden ist, die die Vorrichtung unter Berücksichtigung der im Speicher enthaltenen Daten steuert. Der Endnutzer muss dann nur die von ihm gewünschte Hybridisierungstemperatur eingeben, und die Vorrichtung kann mit Hilfe der Steuerung die für die jeweils gewählte Hybridisierungstemperatur günstigsten Parameter automatisch einstellen.
Mit Hilfe erfindungsgemäßer Mikroarrays lassen sich Hybridisierungsvorrichtungen auch nachkalibrieren, beispielsweise durch den Hersteller, oder aber durch den Anwender selbst prüfen oder nachkalibrieren. Validiert wird ein System, indem man das Mikroarray etwa bei der Schmelztemperatur der Hybride mit Zielmolekülen in Verbindung bringt und die Hybridisierung nach einem vorbestimmten Protokoll (siehe Fig. 8) ausführt und anschließend feststellt, ob der Unterschied zwischen den Signalintensitäten der ersten Messpunkte mit Hybriden und der zweiten bzw. dritten Messpunkte mit Fehlhybriden einem vorbestimmten Wert entspricht oder diesen übertrifft. Dieser Wert ist für jeden Gerätetyp vom Hersteller des Gerätes festzulegen. Wenn ein System diese Bedingung erfüllt, so ist es korrekt validiert. Ansonsten entspricht das Gerät nicht den Anforderungen. Anhand der ermittelten Werte lassen sich verschiedene Systeme, also Vorrichtungen und/oder Verfahren zum Hybridisieren untereinander vergleichen.
Die Validierung lässt sich mit Hilfe eines erfindungsgemässen Mikroarrays mit unterschiedlichen Sätzen von Sondenmolekülen bei verschiedenen für jede Schmelztemperatur, für die ein Satz auf dem Mikroarray vorgesehen ist, separat durchführen.
Kalibrierung und Validierung lassen sich an unterschiedlichen Stellen eines Mikroarrays gleichzeitig wiederholen. So kann man die ersten, zweiten und gegebenenfalls dritten Messpunkte eines Satzes von Sondenmolekülen auf einem Mikroarray an unterschiedlichen Stellen wiederholt auftragen. So kann ein Mikroarray vollständig von Messpunkten eines oder mehrerer Sätze bedeckt sein, die sich in regelmässigen Abständen wiederholen.
Führt mit einem solchen Chip Hybridisierungsexperimente mit entsprechenden Zielsequenzen durch, lässt sich ermitteln ob physikalische und/oder chemische Para- meter lokale Unterschiede auf dem Mikroarray verursachen, und falls ja, bei welchen Parametern derartige Unterschiede auf ein Minimum reduziert sind.
Beispielsweise lassen sich Inhomogenitäten mittels eines derartigen Mikroarrays leicht nachweisen: an den Stellen, an denen die Temperierung des Mikroarrays Tm am nächsten kommt, weisen die erfassten Signalintensitäten der jeweiligen Messpunkte eines Satzes die höchsten Werte auf, und an anderen Stellen niedrigere Werte. Durch Variation der Parameter lassen sich diejenigen Parameter ermitteln, bei denen die Unterschiede zwischen den so ermittelten Werten ansonsten identischer Sätze auf ein Minimum reduziert sind. lm folgenden wird die Erfindung im Rahmen eines Ausführungsbeispieles näher erläutert. In diesem Ausführungsbeispiel werden Oligonukleotide als Sondenmoleküle und Zielmoleküle verwendet. Dies ist jedoch keineswegs beschränkend zu verstehen. Die Erfindung ist gleichermaßen durchführbar mit anderen Arten von Sonden und Zielmolekülen, wie beispielsweise DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, Proteinen, Antigenen/Antikörper, Peptide, Stereoidhormone oder andere biologisch relevante Analyten.
Ausführunqsbeispiel 1
Auf einem epoxybeschichteten Glasobjektträger (75x25 mm Schott nexterion slide E) werden in regelmäßigen Abständen Messpunkte aufgetragen, in denen Oligonukleotide mit einer Gesamtlänge von 26 bzw. 30 Nukleotiden und mit einem Aminolink am 5' Ende vorgesehen sind. Die Oligonukleotidsequenzen enthalten jeweils einen
Spacer von insgesamt 10 Tymidinen. Die für die Hybridisierung jeweils relevante Sequenz ist ein 16 bzw. 20mer. Die hybridisierungsrelevante Sequenz ist dabei aus 4 bzw. 5 Blöcken zu je vier Nukleotiden aufgebaut. Zwei der vier Blöcke legen den GC- Gehalt des Oligonukleotides und damit im wesentlichen dessen Schmelztemperatur Tm fest, die restlichen Blöcke haben einen GC-Gehalt von 50%. Eine schematische Darstellung derartiger Sonden sind in Figuren 2A, 2B wieder gegeben. Fig. 2A zeigt den schematischen Aufbau einer als GC 67 bezeichneten Sonde, deren Schmelztemperatur bei 67°C liegt. Die Fig. 2B zeigt den schematischen Aufbau zweier weiterer Sonden GC 58 und GC 48, die jeweils eine Schmelztemperatur von 58°C bzw. 48°C aufweisen. Zu jeder dieser drei Sonden existieren auf dem Mikroarray Sonden, die sich um ein Nukleotid (mismatch 1 , MM1) bzw. um zwei Nukleotide (mismatch2, MM2) von den Sonden unterscheiden. In Figuren 2A, 2B ist der jeweilige Vierer- Nukleotid block, in dem ein solches Nukleotid ausgetauscht wurde, schematisch mit den Bezeichnungen MM1 , MM2 dargestellt. Die exakten Sequenzen der auf dem Chip vorgesehenen Sonden sowie deren Bezeichnung ergibt sich aus der Tabelle in Fig. 3. Der Nukleotidaustausch erfolgt in dem Vierer-Nukleotidblock, der den GC- Gehalt der jeweiligen Mikroarraysonde festlegt. Durch den Nukleotidaustausch wird der GC-Gehalt des Mikroarraysondenmoleküls nicht geändert, der GC-Gehalt der mismatch-Sondenmoleküle entspricht dem GC-Gehalt der zugehörigen perfectmatch- Sondenmoleküle. Zusätzlich enthält das gespottete Chipset eine Negativkontrolle (GC 37).
Zu den Sondenmolekülen werden Zielmoleküle synthetisiert, die perfekt komple- mentär zu den Sondenmolekülen GC 67, GC 58 und GC 48 sind und die am 5'-Ende jeweils Cy3 markiert sind. Es handelt sich um 16 bzw. 20mere (Fig. 4a, Fig. 4b). Die Zielnukleinsäuren haben die in der Tabelle der Fig. 5 wiedergegebenen Eigenschaften.
Auf dem oben genannten Glasslide der Firma Schott werden die jeweiligen Sondenmoleküle in einer Konzentration von 40 μmol bei einem Spotdurchmesser von etwa 120 μm aufgespottet. Es werden vier identische Mikroarrays hergestellt, die Messpunkte in acht Spalten und drei Reihen aufweisen. In den ersten beiden Spalten eines jeden Mikroarrays sind dabei Negativkontrollsonden (GC 37) aufgespottet, in den Spalten 3 und 4 sind jeweils perfectmatch-Sondenmoleküle PM aufgespottet, in den Spalten 5 und 6 jeweils mismatch-Sondenmoleküle MM1, bei denen ein Nukleotid ausgetauscht wurde aufgespottet, und in den Spalten 7 und 8 mismatch-Sondenmoleküle MM2, bei denen zwei Nukleotide ausgetauscht wurden aufgespottet. In der ersten Reihe sind die jeweiligen Sondenmoleküle PM, MM1 und MM2 mit der Schmelztemperatur 67°C aufgespottet, in der zweiten Reihe diejenigen mit der Schmelztemperatur 58°C, in der Spalte 3 diejenigen mit der Schmelztemperatur 48°C. Dieses Mikroarray weist somit Messpunkte auf, die einen Temperaturbereich zwischen 48°C und 67°C und somit von 19°C abdecken. In Fig. 6 sieht man vier derartige Mikroarrays untereinander angeordnet.
Ein erstes Mikroarray wird mit einem Reaktionsgemisch versetzt, das alle drei der 5'- Cy3 markierten Oligonukleotide GC 67, GC 58 und GC 48 in einer Konzentration von jeweils einem Nanomol pro Liter enthält, bei einer Hybridisierungstemperatur von 67°C mit Hilfe eines Arrayboosters der Firma Advalytix GmbH, Brunnthal, bei einer Durchmischungseinstellung am Arraybooster von 26 dbm durchgeführt. Die aus diesem Experiment resultierenden Signalintensitäten entsprechen den Signalintensitäten der in der Fig. 6 an erster Stelle dargestellten Mikroarrayoberfläche. In einem zweiten Mikroarray-Hybridisierungsexperiment bei einer Hybridisierungstemperatur von 58°C wird unter ansonsten gleichen Bedingungen ein Ergebnis erhalten, wie es schematisch in Fig. 6 dem an zweiter Stelle von oben gezeigten Mikroarray entspricht. An dritter Stelle schematisch dargestellt ist das Ergebnis eines entsprechenden Experimentes bei 48°C, und an vierter Stelle eines entsprechenden Experimentes bei 38°C. Die Tabellen der Fig. 7A bis 7D geben die jeweils gemessenen Signal- intensitäten in den in der Fig. 6 dargestellten Mikroarrays bei den Experimenten, die bei 67°C (Fig. 7A), 58°C (Fig. 7B), 48°C (Fig. 7C), 38°C (Fig. 7D) durchgeführt wurden.
In der Fig. 6 oben erkennt man das Ergebnis des ersten Hybridisierungsexperimen- tes bei 67°C. Aus der Fig. 7A sind die entsprechenden Intensitätswerte (Detektion von Cy3) aufgelistet. Bei einer Schmelztemperatur von 67°C trägt der Mittelwert der Signalintensität in den Messpunkten, die die Sonde GC 67 aufweisen, 28.507,25 Einheiten. Die Signalintensität in dem Messpunkt, der die Sonde GC 67 MM1 aufweist, beträgt lediglich 1/100 davon, die Signalintensität in den Messpunkten, die die Sondenmoleküle GC 67 MM2 enthalten, ist noch geringer, sie beträgt weniger als ein 1/300 des in dem Messpunkt mit den Sonden GC 67 ermittelten Mittelwertes. Führt man dasselbe Experiment bei einer Temperatur von 58°C durch, so liegen die in diesen Messpunkten ermittelten Signalintensitäten weniger weit auseinander. Bei 58°C beträgt die Signalintensität in dem Messpunkt GC 67 MM2 etwa ein 1/160 der in dem Messpunkt GC 67 ermittelten Signalintensität, und der in dem Messpunkt GC 67 MM1 ermittelte Wert beträgt etwa 1/7 des in dem Sondenpunkt GC 67 ermittelten Wertes. Bei 48°C und bei 38°C schließlich schrumpft der Faktor auf Werte zwischen 1 ,28 und 1 ,88. Bei 58°C ist der aus den Signalintensitäten der perfectmatch-Sonden und den Signalintensitäten der jeweiligen mismatch-Sonden gebildete Faktor für die GC 58-Sonden am größten, wohingegen er bei den anderen Temperaturen für diese Sonden abnimmt. Die gleiche Aussage lässt sich für die GC 48-Sonden machen, bei denen der ermittelte Signalintensitätsunterschied bei einem Hybridisierungsexperiment, das bei 48°C durchgeführt wurde, am größten ist. Deutlich erkennbar ist dies in Fig. 6, wenn man die jeweiligen Reihen der Sonden auf den jeweiligen Mikroarrays miteinander vergleicht. Der Signalintensitätsunterschied der GC 67-Sonden ist bei dem bei 67°C durchgeführten Hybridisierungsexperiment am größten, wie sich an dem ganz oben in der Fig. 6 dargestellten Mikroarray im Vergleich zu den übrigen drei Mikroarrays erkennen lässt. Weniger deutlich, aber doch erkennbar, ergibt sich dasselbe Bild für die Sonde GC 58, bei denen der Signalintensitätsunterschied bei dem 58°C-Hybridisiereungsexperiment erkennbar am stärksten ist. Dasselbe gilt für die GC 48-Sonden, die die größten Unterschiede bei den Signalintensitäten auf dem dritten Chip von oben aufweisen, der aus einem Hybridisierungsexperiment resultiert, das bei 48°C durchgeführt wurde.
Im Kontrollexperiment schließlich sind Unterschiede im Hybridisierungsverhalten zwischen den Sonden GC 67, GC 67 MM1 , GC 67 MM2 einerseits und den Sonden GC 58, GC 58 MM1 , GC 58 MM2 andererseits kaum auszumachen. Dies unterstreicht auf plakative Weise, dass ein Mikroarrayexperiment, das bei physikalischen Para- metern durchgeführt wird, die nicht zur Einstellung eines Gleichgewichtes führen, das einem Gleichgewicht bei Tm entspricht, kaum Aussagekraft hat.
Die Fig. 6 gibt damit das Ergebnis eines erfindungsgemäßen Kalibrierungsverfahrens wieder, bei dem die Temperatur des Systems während der Hybridisierung (Hybridi- sierungstemperatur) variiert wurde. Hat man beispielsweise bei einer Vorrichtung, die ein Peltierelement aufweist, die elektronische Steuerung dieses Peltierelementes so kalibriert, dass es für Mikroarrays, deren Sonden eine Schmelztemperatur von 67°C aufweist, optimale Ergebnisse liefert, so kann man anschließend das Kalibrierungsexperiment wiederholen und dabei einen anderen Parameter als die Temperatur va- riieren, beispielsweise die Durchmischungseinstellung am verwendeten Arraybooster im vorliegenden Experiment oder aber den auf das System wirkenden Druck, die Schichtdicke des aufgetragenen Reaktionsgemisches, die Art und Weise der Auftragung des Reaktionsgemisches, die Targetkonzentration, die Pufferkonzentration und die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches, sowie beliebige weitere Parameter, die das Hybridisierungsexperiment und die Einstellung eines Hybridisierungsgleich- gewichtes beeinflussen können.
Ausführunqsbeispiel 2
Die Sequenzen eines zweiten Ausführungsbeispieles der auf dem Chip vorgesehenen Sonden sowie der entsprechenden Zielmoleküle sind in Fig. 9 gezeigt. Das Mikroarray des zweiten Ausführungsbeispiels ist grundsätzlich genauso ausgebildet wie das Mikroarray des ersten Ausführungsbeispiels, und unterscheidet sich vom ersten Ausführungsbeispiel nur durch die anderen Sondensequenzen. Dieses Ausführungs- beispiel umfasst vier PM-Testpunkte für die Schmelztemperaturen 61 °C, 53°C, 43°C und 33°C sowie korrespondierende MM 1 -Testpunkte und MM2-Testp unkte. Weiterhin ist ein Sondenpunkt für eine Negativ-Kontrolle vorgesehen. Dieses Mikroarray weist somit Messpunkte auf, die einen Temperaturbereich zwischen 33°C und 61 °C und somit von 28°C abdecken. Der maximale Temperaturunterschied zwischen zwei PM-Testpunkten mit benachbarten Schmelztemperaturen beträgt hier 10°C. Dieser Temperaturunterschied sollte zumindest nicht größer als 15°C sein. Es kann auch zweckmäßig sein den maximalen Temperaturunterschied zwischen zwei PM- Testpunkten mit benachbarten Schmelztemperaturen auf weniger als 10°C, insbe- sondere auf 8°C bzw. 5°C zu beschränken.
In den Ausführungsbeispielen werden Cy-3 als Fluoreszenzmarker verwendet, um die relative Menge von in Messpunkten gebildeten Hybriden ermitteln zu können. Es können aber auch andere Markierungssysteme verwendet werden, die dem Fach- mann bekannt sind, etwa andere Fluoreszenzfarbstoffe, oder auf anderen Detekti- onsmechanismen als der Fluoreszenz beruhende Markierungen.
Ebenso können erfindungsgemäße Mikroarrays anstelle von Nukleinsäurematerial auch Proteinmaterialien oder andere Materialien als Sondenmoleküle aufweisen, je nachdem, was für eine Art von Mikroarray mit dem zu validierenden oder zu kalibrierenden System untersucht werden soll.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann folgendermaßen zusammengefasst werden: a) Verwenden eines Mikroarrays mit - zumindest einem ersten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM), die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(PM) aufweisen. - zumindest einem zweiten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(MM1) aufweisen, b) Verwenden von Zielmolekülen die zu Sondenmolekülen (PM) in einem oder mehreren ersten Messpunkten des Mikroarrays komplementär sind, und c) Durchführen eines Hybridisierungsexperimentes mit dem Mikroarray und den Ziel- molekülen bei Variierung eines bestimmten Parameters, d) Feststellen der Signalintensitäten in Abhängigkeit der Veränderung des Parameters, wobei der Parameterwert bei dem maximalen Unterschied zwischen den Signalintensitäten der ersten und zweiten Messpunkte der Parameterwert ist, bei dem das System bezüglich der Hybride in dem ersten Messpunkt annähernd im Gleichgewicht ist, und auf den das System kalibriert wird.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Kalibrieren eines Systems zum Durchführen von Mikroarray- Experimenten mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen eines Mikroarrays mit
- zumindest einem ersten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM), die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(PM) aufweisen.
- zumindest einem zweiten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(MM1) aufweisen, b) Bereitstellen von Zielmolekülen die zu Sondenmolekülen (PM) in einem oder mehreren ersten Messpunkten des Mikroarrays komplementär sind, und c) Durchführen eines Hybridisierungsexperimentes mit dem Mikroarray und den Zielmolekülen bei Variierung eines bestimmten Parameters, d) Feststellen der Signalintensitäten in Abhängigkeit der Veränderung des Pa- rameters, wobei der Parameterwert bei dem maximalen Unterschied zwischen den Signalintensitaten der ersten und zweiten Messpunkte der Parameterwert ist, bei dem das System bezüglich der Hybride in dem ersten Messpunkt annähernd im Gleichgewicht ist, und auf den das System kalibriert wird.
2. Verfahren zum Validieren eines Systems zum Durchführen von Mikroarray- Experimenten mit folgenden Schritten: a) Bereitstellen eines Mikroarrays mit
- zumindest einem ersten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM), die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(PM) aufweisen.
- zumindest einem zweiten Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekulen Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(MM1) aufweisen, b) Bereitstellen von Zielmolekülen, die zu den Sondenmolekülen (PM) in einem oder mehreren ersten Messpunkten des Mikroarrays komplementär sind, und c) Durchführen eines Hybridisierungsexperimentes mit dem Mikroarray und den Zielmolekülen bei Standardparametern bei Verwendung des zu validierenden Systems, d) Feststellen der Signalintensitäten, wobei die Validierung erfolgreich ist, wenn der Unterschied zwischen den Signalintensitäten der ersten und zweiten Messpunkte einem vorbestimmten Validierungswert entspricht.
3. Mikroarray zum Validieren und/oder Kalibrieren eines Systems zum Durchführen von Mikroarray-Experimenten, aufweisend:
- einen PM-Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (PM), die komplementär zu Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Hybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(PM) aufweisen. - einen MM-Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM1), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind und die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die eine Schmelztemperatur Tm(MM1) aufweisen, wobei das Mikroarray mehrere PM-Messpunkte mit unterschiedlichen Schmelztempe- raturen und dazu korrespondierende MM-Messpunkte aufweist, und die unterschiedlichen Schmelztemperaturen mindestens einen Bereich von 15°C abdecken.
4. Mikroarray nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass zu einem PM-Messpunkt zumindest ein zweiter MM-Messpunkt mit darin befindlichen Sondenmolekülen (MM2), die unvollständig komplementär zu den Zielmolekülen sind, die mit den Zielmolekülen Fehlhybride ausbilden können, die sich von den Sondenmolekülen des anderen zum PM-Messpunkt korres- pondierenden MM-Messpunktes unterscheiden und die eine Schmelztemperatur Tm(MM2) aufweisen.
5. Mikroarray nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle ausgebildet sind aus: DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, Proteinen, Antigenen/Antikörper, Peptide, Stereoidhormone oder andere biologisch relevante Analyten
6. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle aus ex-situ hergestellten Oligonukleotiden ausgebildet sind.
7. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle aus in-situ hergestellten Oligonukleotiden ausgebildet sind.
8. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Temperaturunterschied ΔT zwischen der Schmelztemperatur Tm(PM) von Hybriden und der Schmelztemperatur Tm(MM1) und/oder Tm(MM2) von
Fehlhybriden zumindest 0,5°C beträgt.
9. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Temperaturunterschied ΔT zwischen der Schmelztemperatur Tm(PM) von Hybriden und der Schmelztemperatur Tm(MM1) und/oder Tm(MM2) von Fehlhybriden zwischen 0, 1 °C und 5°C beträgt.
10. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass jeder Messpunkt auf dem Array mehrfach vorkommt.
11. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der PM-Messpunkt in unmittelbarer Nachbarschaft zu dem bzw. einem der korrespondierenden MM-Messpunkte ist.
12. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass die Hybride der Zielmolekülen mit den komplementären PM-Messpunkten jeweils eine andere Schmelztemperatur aufweisen, die sich ausreichend so voneinander unterscheiden, dass Fehl- oder Kreuzhybridisierungen zwischen unterschiedlichen PM-Messpunkten nahezu ausgeschlossen sind.
13. Mikroarray nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied der Schmelztemperaturen von Hybriden der Zielmoleküle mit dazu komplementären PM-Messpunkten zumindest 1°C bis 10°C beträgt.
14. Mikroarray nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Schmelztemperaturen der unterschiedlichen PM- Messpunkte einen Bereich von mindestens 20°C, 25°C, 30°C, 40°C, 50°C bzw. 60°C abdecken.
15. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zu einem jeden PM-Messpunkt ein korrespondierender MM-Messpunkt mit exakt einer Fehlstelle in den Sonden bzgl. der Zielmoleküle vorgesehen ist.
16. Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zu einem jeden PM-Messpunkt ein korrespondierender MM-Messpunkt mit exakt zwei Fehlstellen in den Sonden bzgl. der Zielmoleküle vorgesehen ist.
17. Kit zum Validieren und/oder Kalibrieren von Systemen zum Durchführen von Mikroarray-Experimenten, umfassend:
- ein Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 - 16, und - zumindest Zielmoleküle, die zu den Sondenmolekülen (PM) auf dem Mikroarray komplementär sind.
18. Kit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Sondenmoleküle (PM, MM) und die Zielmoleküle ausgebildet sind aus: DNA, RNA, mRNA, cDNA, PNA, tRNA, mRNA, LNA, aRNA, PNA, Proteinen, Antigenen/Antikörper, Peptide, Stereoidhormone oder andere biologisch relevante Analyten
19. Kit nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Temperaturunterschied ΔT zwischen der Schmelztemperatur Tm(PM) von Hybriden und der Schmelztemperatur Tm(MM) von Fehlhybriden zumindest 0,5 K beträgt.
20. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikroarray nach einem der Ansprüche 3 bis 16 verwendet wird.
21. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kit nach einem der Ansprüche 17 bis 19 verwendet wird.
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