DE69822614T2

DE69822614T2 - Dna kapillare

Info

Publication number: DE69822614T2
Application number: DE69822614T
Authority: DE
Inventors: Akira Hachioji-shi SUYAMA
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: JP3938982B2; JPH1175812A; WO1999011754A1; DK0969083T3; DE69822614D1; EP0969083B1; EP0969083A4; EP0969083A1

Description

GEBIET DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Nachweisen einer Ziel-DNA, einer Ziel-mRNA usw. mittels einer DNA-Sonde.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Seit einigen Jahren wird weltweit an einem Projekt zur Totalsequenzierung des menschlichen Genoms (Human Genome Project) gearbeitet, d. h. an einem Versuch, die Basensequenz aller menschlichen Gene zu analysieren. Die Analyse des menschlichen Genoms einschließlich der Bestimmung der Basensequenz ist eine sehr komplexe und aufwendige Arbeit. Das Human Genome Project soll jedoch zu Beginn des 21. Jahrhunderts abgeschlossen sein. Die Entwicklung vieler neuartiger Techniken ebenso wie die Verbesserung und Automatisierung der Analyseausrüstung trägt erheblich zur Förderung des Human Genome Projects bei. Die DNA-Chip-Technik ist eine der neu entwickelten Analysetechniken.
Ein DNA-Chip ist ein Chip, der durch punktförmiges Auftragen vieler Arten von DNA-Sonden an vorgegebenen Stellen auf einem Substrat, z. B. einem Silicium-Wafer, anhand der auf dem Gebiet der Halbleitervorrichtungen angewendeten Lithographietechnik hergestellt wird. Die DNA-Sonde wird auf einem Oligonucleotid ausgebildet, das eine vorgegebene Sequenz der 4 Basen aufweist, aus denen die DNA besteht, d. h. Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T). Die Sequenz ist zu der Basensequenz der Ziel-DNA oder -mRNA komplementär. Wenn beispielsweise die Sequenz AGCTT (5' → 3') als DNA-Sonde verwendet wird, wird eine DNA mit der Basensequenz AAGCT, die komplementär zur oben genannten Sequenz AGCTT ist, mit der DNA-Sonde hybridisiert, so daß sie selektiv festgehalten wird. Übrigens handelt es sich bei der eigentlichen Baueinheit der DNA-Sonde um ein Nucleotid mit dem oben genannten Basenabschnitt (Basenabschnitt + Desoxyriboseabschnitt + Phosphorsäureab schnitt). Um die Beschreibung zu vereinfachen, wird das Nucleotid in der folgenden Beschreibung jedoch nur durch die Base dargestellt.
Ein Verfahren zur Immobilisieren einer DNA-Sonde auf einem Substrat wird beispielsweise in „Science 251: 767–773", Februar 1991, erklärt. Bei diesem Verfahren wird eine DNA-Sonde mittels einer photochemischen Reaktion auf einem flachen Substrat ausgebildet. Wir wollen mit Bezug auf 1 kurz beschreiben, wie man eine DNA-Sonde mit einer Länge von 4 Basen anhand dieses Verfahrens auf einem Siliciumsubstrat bildet.
Im ersten Schritt wird auf einem Siliciumsubstrat S durch eine Behandlung mit Silan eine Aminogruppe gebildet, anschließend läßt man Lichtschutzgruppen X sich an jede Aminogruppe koppeln. Dann wird eine gewünschte Stelle anhand einer ersten Maske M₁ selektiv mit Ultraviolettlicht bestrahlt. Als Ergebnis wird die Schutzgruppe X an der gewünschten Stelle entfernt, so daß die Aminogruppe freiliegt, wie in 1A gezeigt. Dann läßt man eine beliebige DNA-Base (hier durch K dargestellt), die von einer photolabilen Schutzgruppe begleitet wird, mit der freigelegten Aminogruppe reagieren, wie in 1B dargestellt. Infolgedessen werden ein Abschnitt, in dem die Base K, die von der, photolabilen Schutzgruppe X begleitet wird, an die Aminogruppe gekoppelt ist, und ein anderer Abschnitt, in dem die photolabile Schutzgruppe X allein an die Aminogruppe gekoppelt ist, auf dem Substrat ausgebildet, wie in 1C dargestellt. Weiter wird der Abschnitt, in dem die photolabile Schutzgruppe X allein an die Aminogruppe gekoppelt ist, durch eine zweite Maske M₂ selektiv belichtet, um die photolabile Schutzgruppe X im belichteten Abschnitt selektiv zu entfernen. Dann wird eine beliebige DNA-Base (hier durch L dargestellt), die von der photolabilen Schutzgruppe X begleitet wird, an die freigelegten Aminogruppe gekoppelt, wie in 1D dargestellt. Infolgedessen werden die Basen K und L, die von der photolabilen Schutzgruppe X begleitet werden, auf der Substratoberfläche mit einer (nicht gezeigten) dazwischen liegenden Aminogruppe immobilisiert, wie in 1E dargestellt. Weiter werden ähnliche Schritte mittels einer beliebigen DNA-Base (hier durch M dargestellt) und einer weiteren beliebigen DNA-Base (hier durch N dargestellt) durchgeführt. Als Ergebnis wird eine DNA-Sonde mit einer Länge von 2 Basen auf der Substratoberfläche immobilisiert. Außerdem werden ähnliche Schritte wiederholt durchgeführt, um die Basen in dreidimensionaler Richtung zu stapeln, um DNA-Sonden zu formen, die jeweils eine Länge von vier Basen aufweisen, wobei diese DNA-Sonden unterschiedliche Basensequenzen aufweisen, abhängig von den Verarbeitungseinheiten, wie in 1F dargestellt. Um eine Basensequenz mit einer Länge von beispielsweise 8 Basen zu bilden, werden eine Photolithographie mittels 32 Masken und eine Photoreaktion 32 mal wiederholt, um DNA-Sonden zu bilden, die alle gewünschten Basensequenzen aufweisen. Theoretisch ist es möglich, anhand der oben beschriebenen Technik effektive DNA-Sonden zu formen, die jeweils eine beliebige Basenlänge und eine beliebige Basensequenz auf einem einzigen Substrat aufweisen.
Ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips ist in der internationalen Offenlegungsschrift WO 93/096668 (japanische Übersetzungsversion Nr. 7-506561) offenbart. In diesem Verfahren wird eine DNA-Sonde auf einem Siliciumsubstrat immobilisiert, auf dem sich eine anhand eines Strömungstyp-Kanalblocks ausgebildete Aminogruppe befindet. Der Strömungstyp-Kanalblock, der in diesem Verfahren verwendet wird, ist eine Musterplatte mit einer Mehrzahl von feinen Kanälen. Wenn eine Musterplatte verwendet wird, kann die DNA-Sonde entlang jedes dieser Kanäle immobilisiert werden. In diesem Fall unterscheidet sich die Basensequenz der DNA-Sonde abhängig vom Kanal. Die Basensequenz ist über die gesamte Länge eines einzelnen Kanals jedoch die gleiche. Bei dieser bevorzugten Anwendungsart des Standes der Technik wird zuerst eine Aminogruppe auf einem Substrat befestigt, gefolgt von der Kombination des Substrats mit einem Block, der eine Mehrzahl von Kanälen aufweist, die parallel angeordnet sind. Dann läßt man eine Prozeßlösung, die eine Base enthält, die eine Baugruppe der gewählten DNA-Sonde darstellt, durch einen vorgegebenen Kanal strömen, um die erste Base auf der angezielten DNA-Sonde zu immobilisieren. Dann werden das Substrat und der Kanalblock relativ zueinander um einen vorgegebenen Winkel, z. B. 90°, verdreht, gefolgt von einer erneuten Kombination des Substrats und des Kanalblocks und dem anschließenden Immobilisieren einer Base, die der zweiten Basensequenz entspricht, entlang des Kanals. Durch aufeinanderfolgendes Wiederholen der oben genannten Schritte kann eine DNA-Sonde mit der gewünschten Basensequenz erzeugt werden. Auch kann eine große Zahl der oben genannten DNA-Chips in einem einzigen Arbeitsgang hergestellt werden, wenn man das oben beschriebene Verfahren mit einer photochemischen Reaktion kombiniert. Es sei auch darauf hingewiesen, daß anhand des DNA-Chips, der auf die oben genannte Weise in Kombination mit dem oben beschriebenen Kanalblock hergestellt wurde, ein Screening durchgeführt werden kann.
Um einen herkömmlichen DNA-Chip herzustellen, ist es notwendig, beim Immobilisieren der Sonde Wechselwirkungen einer großen Zahl von Reagenzien auf einem flachen Substrat zu bewirken. Wenn der DNA-Chip für eine Messung verwendet wird, ist es außerdem nötig, ein flüssiges Material viele Male auf die Oberfläche des flachen DNA-Chips aufzutragen, um Reaktionen mit einer Probe zu bewirken und um die Oberfläche des DNA-Chips zu waschen. Um ein flaches Substrat (oder einen DNA-Chip) auf diese Weise zu behandeln, muß das Substrat (oder der DNA-Chip) in eine Reagenslösung getaucht werden, mit der ein Behälter gefüllt wurde. Alternativ dazu muß ein Strömungskanal auf der Oberfläche des DNA-Chips ausgebildet werden, und zwar unter Verwendung eines zusätzlichen Werkzeugs, beispielsweise des oben erwähnten Kanalblocks, gefolgt von einer Behandlung mit der Flüssigkeit. Das Tauchverfahren bringt jedoch das Problem mit sich, daß jede An von Verfahrensflüssigkeit im Immobilisierungsschritt und im Probenmessungsschritt im Überschuß verwendet werden muß. Andererseits wird in dem Verfahren, das sich eines Strömungskanals bedient, nur eine begrenzte Region auf der Oberfläche des DNA-Chips, auf dem eine DNA-Sonde immobilisiert ist, verwendet, was dazu führt, daß der ausgebildete DNA-Chip nur unzureichend genutzt wird. Weiter ist der DNA-Chip ein offenes System, in dem die von Sonden gebildete Oberfläche der Umgebung ausgesetzt ist, was den Nachteil mit sich bringt, daß die Oberfläche für eine Verschmutzung anfällig ist, und daß der DNA-Chip nicht komfortabel gehandhabt werden kann.
Die herkömmliche DNA-Chip-Technik bringt außer den genannten Problemen noch ein weiteres Problem mit sich. Insbesondere ist die herkömmliche DNA-Chip- Technik zwar wirksam, um das Sequenzieren einer DNA mit unbekannter Basensequenz durchzuführen, eignet sich aber nicht für die Musterentwicklungsanalyse von mRNA, die in Zukunft von Bedeutung sein wird. Wir wollen dieses spezielle Problem im folgenden beschreiben.
Für die neuere Genforschung ist die Nutzung der erhaltenen DNA-Informationen, die anhand einer Sequenzierung erhalten wurden, angesichts der „Post Genom"-Ära wichtiger als das Sequenzieren an sich. Beispielsweise wird die Analyse des mRNA-Expressionsmusters stark vorangetrieben, um das Genexpressionsprofil zu erforschen. Die mRNA-Expression bezüglich eines bestimmten Gens zeigt je nach Organ unterschiedliche Expressionsniveaus. Selbst in der gleichen Zellinie unterscheiden sich die Expressionsniveaus abhängig von Phasenfaktoren, insbesondere Krankheitsfaktoren usw. Die Analyse des Unterschieds der mRNA-Expressionsniveaus in einem Individuum, z. B. die Analyse der Expressionsmuster, kann auf verschiedenen technischen Gebieten eingesetzt werden, beispielsweise bei der Gendiagnose, der Gentherapie, der Entwicklung von Arzneistoffen und für Ackerbau und Viehzucht, und somit ist mit weiteren Fortschritten zu rechnen.
Im allgemeinen ist für die Analyse des mRNA-Expressionsmusters eine quantitative Analyse der mRNA bezüglich eines Zielgens erforderlich. Für die quantitative Analyse wird ein Verfahren angewendet, in dem man die zu vermessende mRNA oder ihre cDNA, die durch eine reverse Transkription der mRNA erhalten wird, mit einer DNA-Sonde reagieren läßt, die eine Basensequenz aufweist, die komplementär dazu ist, so daß beide hybridisieren und somit ein Nachweis möglich ist. Bei solchen Untersuchungen werden eine Mehrzahl von Expressionsniveaus gemessen. Daher wird eine Mehrzahl von DNA-Sonden verwendet, die der Zahl dieser Ziel-mRNA-Moleküle entspricht. Es sei auch darauf hingewiesen, daß die Basensequenz der gemessenen mRNA oder cDNA bis zu einem gewissen Grad bereits bekannt ist, wodurch es im Hinblick auf die Genauigkeit und Effizienz der Messung möglich ist, eine relativ lange DNA-Sonde mit etwa 20 bis 60 Basen, vorzugsweise 40 Basen, zu verwenden. Tatsächlich werden solch relativ lange DNA-Sonden verwendet. Um eine Sonde mit einer solchen Länge anhand der herkömmlichen DNA-Chip-Technik herzustellen, ist ein gewaltiger Arbeitsaufwand notwendig, da 80 bis 240 Masken hergestellt werden müssen und 80 bis 240 mal eine Basensynthese durch Lithographie und Photoreaktion durchgeführt werden muß. Um die Meßgenauigkeit zu verbessern, ist es außerdem notwendig, die Länge der DNA-Sonde anzugleichen. Im Fall der Anwendung eines herkömmlichen Verfahrens ist es angesichts des Syntheseergebnisses in jeder Stufe praktisch unmöglich, eine DNA-Sonde mit einer angeglichenen Basenlänge direkt auf einem Substrat zu synthetisieren.
Andererseits nimmt man an, daß etwa 20 000 bis 30 000 Genarten von den etwa 100 000 Genen, die in einer einzigen Zelle vorhanden sind, mRNA exprimieren. Da der Anteil von zellspezifischen Genen, die für die Erforschung der Expressionsmuster wichtig sind, auf einige Prozent (etwa 1 bis 3%) geschätzt wird, nimmt man an, daß einige hundert bis tausend mRNAs oder ihrer cDNAs in der Lage sind, das Zielobjekt zu liefern, das zu messen ist. Gemäß der oben beschriebenen herkömmlichen DNA-Chip-Technik können auf einem einzigen Substrat 4⁸ Arten, d. h. 65 536 Sondenarten mit jeweils einer Länge von 8 Basen, gebildet werden. Da man jedoch annimmt, daß maximal etwa 20 000 bis 30 000 mRNA-Arten, eigentlich nicht mehr als 1/10 davon, in der Lage sind, ein Zielobjekt zu liefern, ist es in der Praxis nicht notwendig, diese gewaltige Anzahl an Sondenarten auszubilden.
Weiter gleichen sich die Hybridisierungsbedingungen zwischen einer DNA-Sonde und dem Zielobjekt eines mRNA-Segments (oder ihres cDNA-Segments) nicht völlig und erfordern stringente Reaktionsbedingungen. Darüber hinaus ist es angesichts des Dynamikbereichs der Meßvorrichtung unmöglich, in einem einzigen Ablauf eine Testprobe zu bearbeiten, die eine gewaltige Zahl an verschiedenartigen Ziel-mRNA- (oder Ziel-cDNA-) Stücken aufweist, die sich in ihrer Konzentration stark unterscheiden, um eine Ziel-mRNA nachzuweisen. Auch wenn eine große Zahl von DNA-Sondenarten unter den gleichen Meßbedingungen erzeugt wird, erbringt daher nur ein sehr geringer Anteil der DNA-Sonden ein brauchbares Ergebnis. Angesichts dieser Situation muß eine riesige Zahl von DNA-Sonden auf dem gleichen Substrat gebildet werden.
Weiter muß in der oben beschriebenen herkömmlichen DNA-Chip-Technik die Photoreaktionssynthese für die Bildung der DNA-Sonde wiederholt werden, mit dem Ergebnis, daß nach wie vor das Problem besteht, daß die DNA-Sonde durch Ultraviolettlicht verschlechtert wird. Daraus folgt, daß die herkömmliche DNA-Chip-Technik sich für die Herstellung einer DNA-Sonde mit einer Länge von 20 oder mehr Basen nicht eignet.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein erstes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer DNA-Sondenvorrichtung, die gegen Verunreinigungen beständig ist, die leicht zu handhaben ist und die eine ausgezeichnete Effizienz zeigt.
Ein zweites Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer DNA-Sondenvorrichtung, die das Immobilisieren der DNA-Sonde ermöglicht, ohne einen Überschuß an den verschiedenen Prozeßflüssigkeiten zu erfordern, und die außerdem einen vergrößerten Anwendungsbereich hat.
Ein drittes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer DNA-Sondenvorrichtung, die den gleichzeitigen Nachweis einer Mehrzahl von Ziel-DNAs usw. ermöglicht.
Ein viertes Ziel der vorliegenden Erfindung ist außerdem die Bereitstellung einer DNA-Kapillare, die einen Fluidkanal, der mindestens teilweise von einer lichtdurchlässigen Wand begrenzt wird, eine Mehrzahl von unabhängigen Sondenregionen, die an der Innenwand des Fluidkanals ausgebildet sind, und DNA-Sonden aufweist, die auf den Sondenregionen immobilisiert sind, wobei die DNA-Sonden sich untereinander abhängig von den Sondenregionen, auf denen die DNA-Sonden immobilisiert sind, unterscheiden.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung sollte der Fluidkanal vorzugsweise eine Hohlkapillare sein, deren Endabschnitt offen bleiben. Stärker bevorzugt sollte der Fluidkanal eine zylindrische Kapillare sein. Wenn der Fluidkanal die Form eines Zylinders hat, bei dem nur der Endabschnitt offen ist, bildet die DNA-Kapillare ein geschlossenes System, wodurch es möglich ist, eine DNA-Kapillare bereitzustellen, die sehr beständig gegen Verunreinigungen ist und die leicht zu handhaben ist.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden eine Mehrzahl von Fluidkanälen zusammenhängend angeordnet, um die Immobilisierungsbehandlung der DNA-Sonde und die Bearbeitbarkeit der Testprobe zu verbessern. Insbesondere dann, wenn alle oder die meisten Fluidkanäle so kombiniert werden, daß sie in der Nähe von mindestens einem Endabschnitt des Fluidkanals miteinander in Verbindung stehen, können die verschiedenen Prozeßlösungen durch den kombinierten Abschnitt gemeinsam in die vielen Fluidkanäle eingetragen oder aus diesen ausgetragen werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es erwünscht, die vielen Sondenregionen innerhalb eines einzigen Fluidkanals in Form von ringförmigen, voneinander getrennten Regionen entlang des Fluidkanals anzuordnen. Diese besondere Anordnung erlaubt eine Effizienzsteigerung, da eine Mehrzahl von verschiedenen DNA-Sonden gleichzeitig eine Nachweisfunktion ausführen können, indem man einfach die zu behandelnde Flüssigkeit, die eine Testprobe enthält, oder ein Gas für Trocknungszwecke nur einmal durch einen einzigen Fluidkanal strömen läßt. Außerdem ist es in der DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung erwünscht, daß die verschiedenen DNA-Sonden in ringförmigen Regionen über die gesamte Umfangsregion an der Innenseite der Kapillare beabstandet voneinander angeordnet sind. Diese besondere Konstruktion ermöglicht eine Vergrößerung der nutzbaren Fläche im Vergleich zum herkömmlichen DNA-Chip, der eine ebene Fläche verwendet. Infolgedessen kann die Zielsubstanz auch dann wirksam festgehalten werden, wenn nur eine geringe Menge der Testprobe verwendet wird.
In der DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung kann der Fluidkanal durch Aufbringen eines Ätzmittels auf ein Glas- oder Siliciumsubstrat gebildet werden. Das Ätzverfahren ist bevorzugt, da eine große Zahl von Kapillaren anhand eines einzigen Verfahrensschritts gebildet werden können. Darüber hinaus können eine große Zahl an DNA-Sonden anhand einer photochemischen Reaktion in einer großen Zahl von Kapillaren immobilisiert werden.
Ebenfalls zu beachten ist, daß es in der vorliegenden Erfindung wünschenswert ist, eine DNA-Sonde zu verwenden, die zuvor mit einer vorgegebenen Basensequenz und -länge synthetisiert wurde. In diesem Fall ist es möglich, eine DNA-Sonde bereitzustellen, die sich für die Analyse eines mRNA-Expressionsmusters eignet, um das vierte Ziel der vorliegenden Erfindung zu erreichen. Genauer gesagt kann, da die Sonde durch das einmalige Anwenden einer photochemischen Reaktion immobilisiert werden kann, eine DNA-Sonde mit mindestens 20 Basen stabil immobilisiert werden. Daraus folgt, daß es möglich ist, eine Nachweisvorrichtung bereitzustellen, die sich für die Erforschung des mRNA-Expressionsmusters eignet, obwohl die Erzeugung solch einer Nachweisvorrichtung anhand der herkömmlichen DNA-Chip-Technik nicht möglich war.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1A bis 1F zeigen schematisch ein herkömmliches Verfahren zur Immobilisierung von DNA-Sonden.
2 zeigt eine DNA-Kapillare gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt schematisch ein Verfahren zur Immobilisierung von DNA-Sonden an der Innenwand der Kapillare.
4A und 4B zeigen gemeinsam eine DNA-Kapillare mit integrierten Kanälen gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei 4A eine Schrägansicht ist und 4B eine Draufsicht ist.
5A bis 5H sind Querschnittsdarstellungen, die gemeinsam zeigen, wie anhand einer Halbleiter-Bearbeitungstechnik eine Rinne bzw. Nut für eine DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung ausgebildet wird.
BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
2 zeig eine DNA-Kapillare gemäß einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Wie in der Figur dargestellt, werden DNA-Sonden 1a, 1b, 1c usw. unterschiedlicher Art in ringförmigen Sondenregionen immobilisiert, die getrennt voneinander an der Innenwand 5 einer zylindrischen Kapillare 4 angeordnet sind, die einen offenen Eintrags- bzw. Injektionsendabschnitt 2a und einen offenen Austragsendtragsabschnitt 2b aufweist, und die aus lichtdurchlässigem Material hergestellt ist. Es ist möglich, eine Kapillare 4 mit einem Innendurchmesser von etwa 0,1 mm bis etwa 5 mm zu verwenden. Der Innendurchmesser der Kapillare 4 sollte jedoch vorzugsweise etwa 0,5 mm bis 1 mm betragen, damit die Kapillare 4 leicht zu handhaben ist. Die Länge des Fluidkanals der Kapillare 4 sollte vorzugsweise etwa 5 mm bis etwa 100 mm betragen. Es reicht aus, den Innendurchmesser und die Länge des Fluidkanals der Kapillare 4 abhängig von der Menge der zu messenden Probe und der Fließfähigkeit der Flüssigkeit zu bestimmen.
Die Sonde, die innerhalb der Kapillare 4 immobilisiert ist, besteht aus einer gewünschten Basensequenz, die zuvor synthetisiert wurde, und sollte vorzugsweise aus mindestens 20 Basen, vorzugsweise 20 bis 60 Basen, insbesondere etwa 40 Basen (z. B. 35 bis 45 Basen) bestehen. Die Gesamtzahl der Sondenarten, die auf einer einzigen Kapillare immobilisiert wird, die von Objekt zu Objekt unterschiedlich ist, hängt von der Zahl der zu messenden mRNA-Moleküle oder der aus den mRNA-Molkülen konvertierten cDNA-Moleküle in einer einzigen Probe ab. Die Zahl der zu messenden Objekte, die in einer einzigen Probe enthalten sind, liegt in der vorliegenden Erfindung im Bereich von einer Art bis zu Tausenden von Arten. Um das Expressionsmuster der mRNA zu analysieren, was ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ist es notwendig, Tausende Arten von DNA-Sonden zu immobilisieren. Andererseits reicht es für die Untersuchung beispielsweise einer Infektionskrankheit aus, eine bis mehrere Arten von DNA-Sonden zu immobilisieren.
Der Abstand zwischen benachbarten DNA-Sonden, z. B. zwischen den DNA-Sonden 1a und 1b, sollte klein sein, wenn viele Objekte untersucht werden sollen. Wenn dagegen die Zahl der zu messenden Objekte gering ist, kann der Abstand zwischen benachbarten DNA-Sonden vergrößert werden. Tatsächlich wird, wenn eine Mehrzahl von DNA-Sonden mit jeweils 20 bis 60 Basen in den ringförmigen Sondenregionen nach Arten getrennt angeordnet werden, können die DNA-Sonden 1a, 1b, 1c usw. etwa 1 μm bis 5 mm voneinander entfernt angeordnet werden. Es ist auch möglich, eine Mehrzahl von DNA-Sonden der gleichen Art zu immobilisieren oder je nach Wunsch ein oder mehrere Referenzproteine zu immobilisieren, was zu einer erhöhten Diversität der Messung führt. Im Hinblick auf den Fall, wo Spurenmengen von Objekten gemessen werden, ist es allgemein angezeigt, ein photosensibilisierendes System zu verwenden, bei dem eine Fluoreszenzemission oder eine chemische Lumineszenzemission für die Messung mittels einer DNA-Kapillare genutzt wird. Wenn die DNA-Sonden 1a, 1b, 1c usw. in der Kapillare 4 sehr nah aneinander immobilisiert werden, ist es notwendig, eine Mehrzahl von einzelnen Reaktionsmustern unter Verwendung einer Meßeinrichtung mit hoher Auflösung, wie eines Fluoreszensmikroskops, zu lesen. Wenn die DNA-Sonden andererseits mit großem Abstand voneinander angeordnet werden, d. h. mit Abständen von mehreren Millimetern, kann eine Untersuchung mit dem bloßen Auge mit Hilfe eines Transilluminators durchgeführt werden. Um die Lichtmessung zu erleichtern, wird vorzugsweise eine DNA-Kapillare verwendet, die aus einem beliebigen Material gebildet wurde, welches Licht sehr gut leiten kann, wie beispielsweise Kunststoff, Siliciumaterial, Glas, Polymer oder dergleichen. Insbesondere ist es bevorzugt, Glas oder Silicium zu verwenden, wenn ein Herstellungsverfahren angewendet wird, das eine Behandlung mit Silan einschließt, wobei es sich um den Schritt handelt, um die DNA-Sonde zu immobilisieren, welcher später beschrieben wird. Falls notwendig, kann die DNA-Kapillare teilweise Licht reflektieren oder abschirmen. Es ist günstig, die im Handel erhältlichen Glaskapillaren zu verwenden, da diese DNA-Kapillaren kosten günstig hergestellt werden können. Falls eine Kapillare verwendet wird, die aus Kunststoff besteht, wird vorzugsweise ein Kunststoff verwendet, der eine OH-Gruppe aufweist, die als Mittel fungiert, um die DNA-Sonde anzukuppeln. In diesem Fall kann ein Silan-Behandlungsmittel verwendet werden. Der verwendete Kunststoff ist jedoch nicht auf ein spezielles Material beschränkt. Es kann jede An von Kunststoff verwendet werden, solange der Kunststoff ein Mittel aufweist, um eine DNA-Sonde anzukuppeln.
Nun wird das Herstellungsverfahren für eine DNA-Kapillare beschrieben. 3 zeigt, wie verschiedene DNA-Sonden 1a, 1b, 1c usw. an der Innenwand 5 der Glaskapillare 4 immobilisiert werden. Das Aufbringen von verschiedenen Prozeßflüssigkeiten in den jeweiligen Herstellungsverfahren kann durch Eintragen der Prozeßflüssigkeit durch den offenen Eintragsendabschnitt 2a der Kapillare anhand geeigneter Austragseinrichtungen und durch Austragen der Verfahrensflüssigkeit durch den offenen Austragsendabschnitt 2b anhand einer geeigneten Saugvorrichtung bei der Nachbehandlung durchgeführt werden. Eine Austragseinrichtung wie eine Pipette oder eine andere geeignete Einrichtung kann als Austragseinrichtung verwendet werden. Ebenso kann jede An von Saugvorrichtung verwendet werden. Es ist auch möglich, sich des natürlichen Eintrags und des natürlichen Austrags durch Kapillarwirkung zu bedienen.
Nun wird das Herstellungsverfahren mit Bezug auf das in 3 dargestellte Schema beschrieben. Im ersten Schritt wird eine Lösung, die ein Silan-Kopplungsmittel für die Silanbehandlung enthält, auf die Kapillare 4 aufgebracht, um Aminogruppen (NH₂) an der Innenwand 5 zu bilden (Schritt S1). Dann wird eine Lösung, die ein Verkappungsmittel 7 enthält, das einer Photozersetzung nach Bestrahlung mit Licht einer vorgegebenen Wellenlänge, vorzugsweise Ultraviolettlicht, unterliegt, auf die Kapillare 4 aufgebracht, so daß das Verkappungsmittel 7 an sämtliche Aminogruppen an der Oberfläche der Innenwand 5 gekoppelt wird (Schritt S2). Im nächsten Schritt werden die Regionen, in denen DNA-Sonden 10 immobilisiert werden sollen, selektiv mit Ultraviolettlicht 8 bestrahlt, um das Verkappungsmittel 7 zu zersetzen und somit die Aminogruppen freizulegen (Schritt S3). Die Lithographietechnik, die auf dem Gebiet der Halbleiter angewendet wird, kann genutzt werden, um die gewünschten Regionen selektiv mit dem Ultraviolettlicht 8 zu bestrahlen. Genauer gesagt wird ein Maskenelement verwendet, um das Ultraviolettlicht selektiv abzuschirmen. Alternativ kann ein Linsensystem verwendet werden, um den Bestrahlungsbereich einzuengen. Da die Kapillare 4 zylindrisch ist, kann die Bestrahlung in beliebiger Richtung durchgeführt werden, solange das Bestrahlungslicht in einem Winkel einfällt, der im Wesentlichen senkrecht zur Seitenfläche der Kapillare ist. Da das Licht die gesamte Region der Kapillare 4 durchdringen kann, wird die Innenwand 5 in der Region, die mit dem Ultraviolettlicht bestrahlt wird, ringförmig entschützt.
Dann wird eine Flüssigkeit, die ein Linker-Molekül 9 enthält, auf die Kapillare 4 aufgebracht (Schritt S4). Das Linker-Molekül 9, das sich zwischen der Aminogruppe 6, die an die Innenwand 5 gebunden ist, und der DNA-Sonde 10 befindet, so daß es die Aminogruppe 6 mit der DNA-Sonde 10 verknüpft, weist an einem Ende einen Kupplungsabschnitt auf, der mit der Aminogruppe reagiert, so daß eine Verbindung entsteht, und an dem anderen Ende einen weiteren Kupplungsabschnitt, der mit der Aminogruppe oder einer Thiolgruppe reagiert, so daß eine Verbindung entsteht. Das Linker-Molekül 9, das auf die Kapillare 4 aufgebracht wird, wird an einem Ende durch den Kupplungsabschnitt an die Aminogruppe 6 gekoppelt (Schritt S4). In diesem Schritt bleibt der Kupplungsabschnitt am anderen Ende frei. Dann wird eine Flüssigkeit, welche die DNA-Sonde 10 enthält, an deren Endabschnitt eine Aminogruppe oder eine Thiolgruppe ausgebildet ist, eingeführt, so daß die DNA-Sonde 10 an das Linker-Molekül 9 gekoppelt werden kann (Schritt S5).
Übrigens kann das Immobilisierungsverfahren in jedem der Schritte S3, S4 und S5 durchgeführt werden, während ein Reinigen des Innenraums der Kapillare 4 anhand einer geeigneten Menge Waschflüssigkeit durchgeführt wird. Außerdem kann eine DNA-Sonde, wie in 2 dargestellt, d. h. eine DNA-Kapillare, in der die gewünschten DNA-Sonden 1a, 1b, 1c usw. unabhängig voneinander in Ringform an gewünschten Positionen immobilisiert sind, durch Wiederholen des obigen Verfahrens an anderer Stelle in gewünschtem Abstand von der ursprünglichen Position hergestellt werden. Der Ausdruck „ringförmig" oder „kreisförmig", der hierin verwendet wird, bezeichnet ver schiedene Formen, wie kreisförmige, polygonale und elliptische Formen, die dem Querschnitt der Hohlkapillare 4 entsprechen, welche den Fluidkanal bildet. Weiter bezeichnet der Ausdruck „Fluidkanal", wie er hierin verwendet wird, einen Kanal, der breit und hoch genug ist, damit mindestens die benötigte Menge an Prozeßflüssigkeit hindurchfließen kann. Außerdem wird der Fluidkanal so gewählt, daß er durch die Kapillarwirkung eine Strömung unterstützen kann. Daraus folgt, daß eine Oberfläche, auf der lediglich Formen wie
ausgebildet sind, nicht schon als Fluidkanal bezeichnet wird.
Das Silan-Kopplungsmittel, das in Schritt S1 verwendet wird, schließt beispielsweise Aminoethylaminopropyl-Trimethoxysilan ein, obwohl auch andere Verbindungen als Silan-Kopplungsmittel verwendet werden können, solange Aminogruppen auf ihrer Oberfläche gebildet werden können. Beispielsweise ist es auch möglich, Aminosilane, wie Aminoethylaminopropylmethyl-Dimethoxysilan, zu verwenden.
Das in Schritt S2 verwendete Verkappungsmittel schließt beispielsweise 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzylchlorformiat, 6-Nitroveratrylchlorformiat, 4-Nitrobenzylchlorformiat und o-Nitrobenzyl-p-nitrophenylcarbonat ein. Das Verkappungsmittel ist jedoch nicht auf diese Verbindungen beschränkt. Man kann jede beliebige Substanz als Verkappungsmittel verwenden, solange diese Substanz eine intramolekulare Spaltung zeigt, so daß die Bindung an die Aminogruppe nach Bestrahlung mit Ultraviolett- oder sichtbarem Licht gelöst werden kann.
In Schritt S3 wird im allgemeinen Licht mit einer Wellenlänge von etwa 350 nm verwendet. Es kann jedoch Licht mit einer Wellenlänge ausgewählt werden, die so angepaßt ist, daß eine optimale Photozersetzung erhalten wird, abhängig von der Art des verwendeten Verkappungs- und des verwendeten Lösemittels. Ebenso kann eine im Handel erhältliche optische Vorrichtung für die Bestrahlung mit speziellem Licht, wie Ultraviolettlicht, verwendet werden.
Das Linker-Molekül 9, das in Schritt S4 verwendet wird, schließt beispielsweise homo-bifunktionelle N-Hydroxysuccinimidyl- (NHS-) Ester ein, wie Disuccinimidylsuberat und Dimethyladipimidat-2-HCL. Das in Beispiel 1 verwendete Linker-Molekül weist Succinimid-Gruppen auf, die mit den endständigen Aminogruppe an beiden Seiten des Moleküls reagieren. Es ist jedoch auch möglich, daß die endständigen funktionellen Gruppen an beiden Seiten unterschiedlich sind. Beispielsweise kann ein Linker-Molekül verwendet werden, das eine endständige Atomgruppe aufweist, die mit einer Thiolgruppe oder eine Carboxylgruppe reagieren kann.
Eine DNA-Sonde, der im Synthetisierungsschritt eine Aminogruppe oder eine Thiolgruppe auf dem 5'-Terminus der DNA verliehen wurde, kann in Schritt S5 als DNA-Sonde verwendet werden. Die Aminogruppe oder Thiolgruppe kann anhand eines Kits, das ausschließlich für ein im Handel erhältliches DNA-Synthesegerät verwendet wird, eingebracht werden. Es kann eine Basensequenz, die mit einer beliebigen Sequenz hybridisiert werden kann, die auf dem Gebiet der Gentechnik, Biochemie, Immunologie oder Pathologe wichtig ist, in der DNA-Sonde 10 verwendet werden, und es kann jede beliebige Sequenz ausgewählt werden.
Die Behandlungsbedingungen im jeweiligen Verfahren der Schritte S1, S2, S3, S4 und D5 bezüglich der Innenwand 5 der Kapillare 4 können geeignet bestimmt werden, abhängig vom Material, von der Form und der Größe der verwendeten Kapillare oder der Art der DNA-Sonde.
Um die Messung anhand der vorbereiteten DNA-Kapillare durchzuführen, wird die Prozeßflüssigkeit, beispielsweise eine Probe, ein Reagens usw., durch den offenen Eintragsabschnitt 2a in die DNA-Kapillare eingeführt bzw. aus dem offenen Austragsabschnitt 2b aus dieser entfernt. Die gewünschte Reaktionszeit kann durch Variieren des Zeitpunkts für den Austrag aus dem offenen Austragsabschnitt 2b erhalten werden. Beispielsweise wird eine Probe durch die eine Öffnung der Kapillare 4 eingeführt, um bei Temperaturen von 10 bis 15°C unter dem Schmelzpunkt (Tm-Wert) der DNA eine Reaktion ablaufen zu lassen. Dann wird die Kapillare mit einer Waschflüssigkeit gereinigt, gefolgt von einer Fluorimetrie der Probe. Vorzugsweise sollte eine Waschflüssigkeit, deren Stringenz durch geeignete Änderung der angewendeten Temperatur und der Zusammensetzung angepaßt ist, als Waschflüssigkeit verwendet. Wenn das Verfahren, das an der Messung der Probe beteiligt ist, eine Hybridisierungsreaktion mit der immobilisierten DNA umfaßt, wird die DNA in der Probe für die Hybridisierung vorbereitet und dann auf die DNA-Kapillare aufgebracht. Wenn das biologische Untersuchungsmaterial an sich flüssig ist, kann das biologische Material als zu messende Probe verwendet werden. Ebenso kann ein flüssiges Material, das durch Lösen oder Dispergieren des zu messenden biologischen Materials in einem geeigneten Lösemittel hergestellt wird, als Probe verwendet werden. Kurz gesagt, kann eine Flüssigkeit in einem beliebigen Zustand als Probe verwendet werden.
In Beispiel 1 wird eine einzige Kapillare verwendet. Es können jedoch eine Mehrzahl von Kapillaren, die parallel oder gebündelt angeordnet sind, gleichzeitig bearbeitet werden. Die Mehrzahl von Kapillaren, die beliebig angeordnet werden können, sollten vorzugsweise so angeordnet werden, daß ihre Anordnung für einen Teil oder die Gesamtheit des Verfahrens paßt, das für die Messung angewendet wird.
In Beispiel 1 wird einmalig eine photochemische Reaktion durchgeführt, um die DNA-Sonde zu immobilisieren. Es ist jedoch auch möglich, photochemische Reaktionen beliebig oft durchzuführen, um in der Kapillare DNA-Sonden auszubilden.
Beispiel 2: 4 zeigt eine DNA-Kapillare gemäß einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Der in 4 dargestellte Typ ist dafür ausgelegt, auf effektive Weise eine Mehrzahl von DNA-Kapillaren herzustellen. Genauer gesagt können eine Mehrzahl von Fluidkanälen auf einmal hergestellt werden, und auf der Mehrzahl von Fluidkanälen können gleichzeitig DNA-Sonden immobilisiert werden. Die DNA-Kapillare in Beispiel 2 wird aus Gründen der Bequemlichkeit DNA-Kapillarenanordnung 24 genannt.
4A zeigt das gesamte System, und 4B ist eine Draufsicht auf das DNA-Kapillarsystem 24. Der Aufbau des DNA-Kapillarsystems 24 umfaßt ein Substrat 16, das aus einem unteren Substrat 16a und einem oberen Substrat 16b besteht, das mit dem unteren Substrat 16a verbunden ist. Sowohl das untere Substrat 16a als auch das obere Substrat 16b bestehen aus Glas, Silicium usw. Auf dem unteren Substrat 16a ist eine Nut mit einem Muster wie in der Figur dargestellt ausgebildet. In der Nut sind eine Vielzahl von DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. ausgebildet. Auch auf dem oberen Substrat 16b kann eine Nut mit einem Muster ausgebildet sein, das dem des unteren Substrats 16a ähnlich ist. Wie in 4B dargestellt, sind die Enden an einer Seite der DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. genau unter den einzelnen Eintrags-/Austrags-Öffnungen 14a, 14b, 14c usw. positioniert, so daß sie durch die einzelnen Eintrags-/-Austrags-Öffnungen 14a, 14b, 14c usw. zum Außenraum hin offen sind. Diese DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. sind an den anderen Enden miteinander verbunden, so daß sie einen gemeinsamen Fluidkanal 17 bilden, der sich so weit erstreckt, daß er den Bereich genau unter der gemeinsamen Eintrags-/Austrags-Öffnung 14 erreicht, und sind somit durch die gemeinsame Eintrags-/Austrags-Öffnung 15 zum Außenraum hin offen. Diese einzelnen Eintrags-/Austrags-Öffnungen 14a, 14b, 14c usw. und die gemeinsame Eintrags-/Austrags-Öffnung 15 können durch Ausbilden von dünnen Klebstoffschichten an vorgegebenen Stellen geformt werden, beispielsweise mittels einer Siebdrucktechnik, gefolgt vom Verbinden von röhrenförmigen Elementen, wie Glasröhren, mit den Klebstoffschichten. Die DNA-Sonden 12a, 12b, 12c usw. werden in voneinander getrennten ringförmigen Sondenregionen in den Fluidkanälen der DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c, usw. ausgebildet, wie in der Figur dargestellt.
Ein Verfahren, für das eine photochemische Reaktion verwendet wird, wie in Beispiel 1, kann ebenfalls angewendet werden, um die DNA-Sonden zu immobilisieren. Beispiel 2 ist effizient, weil eine Mehrzahl von Kapillaren gleichzeitig bearbeitet werden können. Genauer gesagt kann eine immobilisierende Prozeßlösung, die für das Immobilisieren der DNA-Sonden verwendet wird, von der gemeinsamen Eintrags-/Austrags-Öffnung 15 aus zugeführt werden, so daß die Prozeßlösung durch den gemeinsamen Fluidkanal 17 gleichzeitig in die DNA-Kapillaren fließen kann. Ebenso kann die Prozeßlösung im Inneren der Mehrzahl von DNA-Kapillaren gleichzeitig aus den gemeinsamen Eintrags-/Austrags-Öffnungen 15 entfernt werden.
Weiter kann das Bestrahlungsverfahren, das eine Zersetzung des Verkappungsmittels durch Ultraviolettlicht ermöglicht, ebenfalls gleichzeitig auf die Mehrzahl von Kapillaren angewendet werden. Genauer gesagt wird eine geeignete Ultraviolettlicht-Bestrahlungseinrichtung über den DNA-Kapillaren angeordnet. Vorzugsweise sollte die Ultraviolettlicht-Bestrahlungseinrichtung vom Scanner-Typ sein und eine Scanlänge aufweisen, die die ganze Mehrzahl der Kapillaren abdeckt und die in der Lage ist, sämtliche Kapillaren linear mit Ultraviolettlicht zu bestrahlen. Durch freies Bewegen der Ultraviolettlicht-Bestrahlungseinheit in X-Richtung, d. h. parallel zum Fluidkanal, in dem die DNA-Sonde immobilisiert ist, und/oder in Y-Richtung, d. h. senkrecht zum Fluidkanal, um die DNA-Kapillaren 13a, 13b, 3c usw. zu bestreichen bzw. zu scannen, werden diese DNA-Kapillaren linear mit Ultraviolettlicht bestrahlt. Anhand dieses Verfahrens werden die vorgegebenen Stellen sämtlicher DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. linear mit Ultraviolettlicht bestrahlt. Nach Entfernen des Verkappungsmittels durch die Bestrahlung werden die weiteren in Beispiel 1 beschriebenen Schritte durchgeführt, um die DNA-Sonde 12a zu immobilisieren. In Beispiel 2 ist es nicht unbedingt notwendig, daß das untere Substrat 16a lichtdurchlässig ist. Wenn zumindest das obere Substrat 16b lichtdurchlässig ist, wird die Wandfläche an einer gewünschten Stelle des Fluidkanals, der vom unteren Substrat 16a und vom oberen Substrat 16b gebildet wird, ringförmig mit Licht bestrahlt, so daß die DNA-Sonde entsprechend der Form der Belichtung ringförmig immobilisiert werden kann, so daß sie der Form der Belichtung entspricht. Dann werden eine ähnliche Scanner-Bestrahlung und Immobilisierung der DNA-Sonde 12b an einer Stelle durchgeführt, zu der die Bestrahlungsvorrichtung um einen vorgegeben Abstand in X-Richtung parallel zur den DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. bewegt wird, um eine zweite DNA-Sondenart zu immobilisieren. Dieses Verfahren wird wiederholt, um eine Mehrzahl von DNA-Regionen 12a, 12b, 12c usw. zu formen, die unabhängig voneinander angeordnet sind, wie in 4 dargestellt.
Wenn man es mit einer DNA-Kapillare zu tun hat, die im Scanbereich möglichst keiner Belichtung ausgesetzt werden sollte, kann die Belichtung der speziellen DNA-Kapillare beispielsweise durch selektives Schalten der Bestrahlung durch die Ultraviolett-Belichtungseinrichtung anhand eines geeigneten Schaltkreises vermieden werden. Anders ausgedrückt kann die Ultraviolettlicht-Bestrahlung einiger der DNA-Kapillaren während des Scan-Schrittes selektiv verhindert werden. Daher können für jede DNA-Kapillare DNA-Sonden mit verschiedenen Kombinationen immobilisiert werden, was zu einer Diversifikation der Meßgrößen führt. Dies ist von Vorteil, da es möglich ist, in den Fällen, wo für eine einzige Probe viele Meßgrößen ermittelt werden und wo für eine Mehrzahl von Proben unterschiedliche Meßgrößen ermittelt werden, nur die minimale Anzahl von Meßgrößen ermittelt werden muß. Da im Schritt der DNA-Kapillaren-Herstellung keine unnötigen DNA-Sonden immobilisiert werden müssen, kann das Material außerdem effizient genutzt werden. Es sei auch darauf hingewiesen, daß, falls in sämtlichen DNA-Kapillaren 13 DNA-Sonden der gleichen Kombination immobilisiert sind, die gleiche Messung maximal für so viele Proben durchgeführt werden kann, wie Kapillaren vorhanden sind.
Wie vorstehend beschrieben, wird die immobilisierende Prozeßflüssigkeit im Immobilisierungsprozeß durch den gemeinsamen Eintrags-/Austragskanal 15 in die DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. eingeführt. Vorzugsweise werden insbesondere die Prozeßflüssigkeit, die eine DNA-Sonde enthält (siehe Schritt S5 von 3) und die Waschflüssigkeit, die im anschließenden Schritt verwendet wird, unabhängig voneinander durch die individuellen Eintrags-/Austragskanäle 14a, 14b, 14c usw. ausgetragen. In diesem Fall kann praktisch vollkommen vermieden werden, daß es zu Beeinflussungen durch Verunreinigungen kommt, die auftreten, wenn mehrere verschiedene Flüssigkeitsarten verwendet werden. Weiter ist es wünschenswert, beim Messen der Proben die Probenflüssigkeiten usw. von den einzelnen Einlaß-/Austragskanälen 14a, 14b, 14c usw. aus einzuspritzen. In diesem Fall kann jede Flüssigkeit vollkommen getrennt von den anderen zum Fließen gebracht werden, was zu einer erhöhten Meßgenauigkeit führt.
Die DNA-Kapillare 13 kann abhängig vom Verwendungszweck in verschiedenen Größen hergestellt werden. In der Praxis kann es ausreichen, daß die DNA-Kapillare eine Breite von etwa 10 μm bis 5 mm, eine Tiefe von etwa 1 μm bis 500 μm, eine Länge von etwa 5 mm bis 100 mm und einen Abstand zwischen benachbarten Kapillaren von etwa 10 μm bis 5 mm aufweist. Allgemein sollte die DNA-Kapillare angesichts der Reaktionseffizienz jedoch vorzugsweise eine abgeflachte Querschnittsform mit einer großen Breite und einer geringen Tiefe aufweisen, da die Diffusionsrate der aus mRNA umgewandelten cDNA gering ist, d. h. etwa 5 μm/s. Man erwartet, daß die spezielle Querschnittsform der DNA-Kapillare die Reaktionszeit verkürzt, den Probenverbrauch verringert und das Sichtfeld im Beobachtungsschritt vergrößert.
Der Nutabschnitt der DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. kann auf verschiedene Weise ausgebildet werden, beispielsweise durch Excimerlaser-Ätzen und photolithographisches Ätzen. Nun wird als Beispiel ein Verfahren zur Nutbildung anhand einer Halbleitertechnik mit Bezug auf das in 5 dargestellte Schema beschrieben.
Im ersten Schritt wird ein Oxidfilm 19 mit einer Dicke von etwa 5000 A auf einem Siliciumwafer-Substrat 20 ausgebildet, gefolgt vom Ausbilden eines Resistfilms 18 auf dem Oxidfilm 19, wie in 5A dargestellt. Dann wird eine Maske, die dem Nutmuster auf dem Siliciumwafer-Substrat 20 entspricht, hergestellt, gefolgt vom selektiven Bestrahlen des Resistfilms 18 unter Verwendung eines Ausrichters, um das Nutmuster zu entwickeln, wie in 5B dargestellt. Der gemusterte Resistfilm wird im nächsten Schritt zum Ätzen des Oxidfilms 19 verwendet, wie in 5C dargestellt. Das Ätzen wird unter Verwendung eines Ätzmittels durchgeführt, das aus Fluorwasserstoffsäure und Ammoniumfluorid besteht, die in einem Mischungsverhältnis von etwa 1 : 9 gemischt sind.
Dann wird der Resistfilm 18 anhand eines Verfahrens entfernt, bei dem eine Mischlösung verwendet wird, die aus Schwefelsäure- und Wasserstoffperoxidlösung besteht, oder unter Verwendung von Sauerstoffplasma. Nach Entfernen des Resistfilms 18 wird das Siliciumwafer-Substrat 20 unter Verwendung des gemusterten Oxidfilms 19 geätzt, wie in 5E dargestellt. Es können verschiedene Ätzmethoden in diesem Schritt angewendet werden, einschließlich eines isotropen oder anisotropen Naßätzens und eines Trockenätzens mittels Plasmagas. Nach dem Ätzen auf dem Substrat 20 wird der Oxidfilm 19 entfernt, wie in 5F dargestellt. Da der Oxidfilm 19 einfach zu entfernen ist, kann in diesem Schritt eine verdünnte Lösung verwendet werden, z. B. eine 50%-ige Lösung, die beispielsweise durch Verdünnen einer Fluorwasserstoffsäure-Lösung mit reinem Wasser hergestellt wird. Schließlich wird das gesamte Siliciumwafer-Substrat 20 einschließlich des Nutabschnitts mit einem Siliciumoxidfilm 21 bedeckt, wie in 5G dargestellt.
Nach dem oben beschriebenen physikalischen Behandeln der Nut wird ein lichtdurchlässiger Deckel 23, wie in 5H dargestellt, darüber befestigt, um eine DNA-Kapillaranordnung herzustellen, in der die einzelnen Eintrags-/Austrags-Öffnungen 14a, 14b, 14c usw. und die gemeinsame Eintrags-/Austrags-Öffnung 15 ausgebildet sind wie in 4 dargestellt. Das in 4A dargestellte Substrat 16 entspricht dem Siliciumwafer-Substrat 20, das mit dem Oxidfilm 21 und dem Deckel 23 abgedeckt ist. Ein anodisches Bondverfahren kann für das Anbringen des Deckels 23 verwendet werden. Bei dem genannten anodischen Bondverfahren handelt es sich um ein Bondverfahren, bei dem eine Spannung von 1000 V zwischen dem Siliciumwafer-Substrat 20 und dem Deckel 23 angelegt wird, wobei das Substrat auf etwa 500°C erwärmt wird. Um das anodische Bondverfahren anzuwenden zu können, ist es notwendig, einen Deckel 23 zu verwenden, der beispielsweise aus Pyrex mit einem thermischen Expansionskoeffizienten besteht, der im wesentlichen dem von Silicium entspricht. Die Silanbehandlung kann entweder vor oder nach dem Bonden zwischen dem Siliciumwafer-Substrat 20 und dem Deckel 23 durchgeführt werden. Es ist nicht absolut notwendig; den Deckel 23 einer Silanbehandlung zu unterziehen. Es ist jedoch wünschenswert, den Deckel 23 einer Silanbehandlung zu unterziehen. Die Silanbehandlung, welcher der Deckel 23 unterzogen wird, kann entweder vor oder nach dem Bonden des Deckels 23 an das Substrat 20 durchgeführt werden. Wenn der Deckel 23 einer Silanbehandlung unterzogen wird, können die DNA-Sonden ringförmig immobilisiert werden, wie in 4 dargestellt, weswegen die Silanbehandlung günstig für die Immobilisierungseffizienz und die Reaktionsempfindlichkeit macht. Wenn der Deckel 23 andererseits keiner Silanbehandlung unterzogen wird, werden die DNA-Sonden nur im Nutabschnitt des Siliciumwafers durch eine photochemische Reaktion immobilisiert, um U-förmige Sondenregionen erhalten werden. Selbst in diesem Fall kann die resultierende Struktur als DNA-Kapillaren-Anordnung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Für die oben beschriebene Nutbildung wird ein Siliciumwafer-Substrat 20 verwendet. Es kann jedoch auch ein Glassubstrat, beispielsweise ein Quarzsubstrat oder ein Pyrexsubstrat, anstelle des Siliciumsubstrats verwendet werden. In diesem Fall wird eine Metallmaske, beispielsweise eine Goldmaske, anstelle des Oxidfilms 19 für das Ätzen des Substrats verwendet. Es kann auch ein anodisches Bondverfahren für das Verbinden des Deckels 23 mit dem Substrat 20 verwendet werden, wenn ein Siliciumdünnfilm zwischen dem Substrat 20 und dem Deckel 23 ausgebildet ist. Außerdem kann der Oxidfilm 19, der als Ätzmaske des Siliciumwafer-Substrats 20 verwendet wird, beispielsweise durch einen Siliciumnitridfilm oder einen Aluminiumoxidfilm ersetzt werden.
Die Funktionsweise und Wirkung der so hergestellten DNA-Kapillaranordnung 24 sind wie oben beschrieben. Da größere Mengen an DNA-Kapillaren auf einmal hergestellt werden können, können die Herstellungskosten gesenkt werden. Weiter ist die Handhabung der DNA-Kapillaren einfach. Es sei auch darauf hingewiesen, daß, da durch die Bestrahlung des auf der Kapillare ausgebildeten Fluidkanals mit ultraviolettem Licht eine ringförmige Entschützung durchgeführt werden kann, die DNA-Sonde effizient in Ringform an der Innenwand der Kapillare immobilisiert werden kann, so daß die Meßempfindlichkeit der Probe verbessert wird. Da eine Mehrzahl von DNA-Kapillaren als zusammenhängende Struktur ausgebildet werden, ist die DNA-Kapillaranordnung 24 außerdem für das Messen vieler Proben günstig. Beispielsweise können verschiedene Proben durch die einzelnen Eintrags-/Austrags-Öffnungen 14a, 14b, 14c usw. eingeführt werden, und nachdem über einen vorgegebenen Inkubierungszeitraum biologische Reaktionen abgelaufen sind, können die Proben zusammen aus der gemeinsamen Eintrags-/Austrags-Öffnung 15 ausgetragen werden. Außerdem können die Waschflüssigkeit und das Reagens für die Messungen gemeinsam bearbeitet werden, wodurch die Automation erleichtert und eine Vorrichtung bereitgestellt wird, die eine hohe Meßkapazität aufweist.
Die DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Beispiele beschränkt und kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Beispielsweise werden in jedem der oben beschriebenen Beispiele der Eintrag und der Austrag der flüssigen Probe usw. durch verschiedene offene Abschnitte hindurch vorgenommen, mit dem Ergebnis, daß sämtliche Flüssigkeiten ohne Ausnahme in die gleiche Richtung strömen. Es ist jedoch auch möglich, die Flüssigkeit durch den offenen Abschnitt hindurch auszutragen, durch den die Flüssigkeit zuvor eingeführt worden ist, so daß die Austragsrichtung der Eintragsrichtung entgegengesetzt ist. Weiter wird in Beispiel 1 eine Austragseinrichtung, beispielsweise eine Pipette, für den Eintrag einer Flüssigkeit für die Immobilisierungsbehandlung und einer Flüssigkeit für die Messung einer Probe in die Kapillare 4 verwendet. Es können jedoch auch andere Verfahren angewendet werden. Beispielsweise kann ein natürlicher Eintrag durch Kapillarwirkung erreicht werden, und zwar durch einfaches Tauchen des vorderen Abschnitts (des offenen Eintragsendabschnitts 2a) der Kapillare 4 direkt in einen Behälter, der eine benötigte Menge Flüssigkeit für die Immobilisierungsbehandlung oder eine Flüssigkeit für die Probenmessung enthält. Ebenso kann ein natürlicher Austrag erreicht werden, ohne eine spezielle Saugvorrichtung zu verwenden, indem man einfach den Vorderabschnitt (den offenen Austragsabschnitt 2b) mit einem Material in Kontakt bringt, das Wasser ohne weiteres absorbiert, beispielsweise mit einem Schwamm oder einem wasserabsorbierenden Polymer. Daher ist die entweder manuelle oder automatische Handhabung der DNA-Kapillare einfach. Weiter zeigt die Kapillare 4 in Beispiel 1 auch dann eine ähnliche Funktionsweise und Wirkung, wenn die Kapillare 4 in einer Lage verwendet wird, in der sie auf der Seite liegt oder aufgerichtet ist. Wenn die Kapillare 4 aufgerichtet ist, so daß der offene Eintragsabschnitt 2a den oberen Abschnitt darstellt, kann der Flüssigkeitseintrag durch den offenen oberen Eintragsabschnitt 2a vorgenommen werden, während die Flüssigkeit durch den offenen unteren Austragsabschnitt 2b ausgetragen wird, und vice versa.
In Beispiel 2 sind die parallel zueinander angeordneten DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. an einer Seite zum gemeinsamen Fluidkanal 17 zusammengefaßt. Es ist jedoch auch möglich, diese DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. radial anzuordnen, so daß die einen Endabschnitte dieser DNA-Kapillaren an der gemeinsamen Eintrags-/Austrags-Öffnung 15, die sich im Mittelabschnitt befindet; verbunden sind, wobei die anderen Endabschnitte auf einer einzeigen Kreislinie angeordnet sind. Wenn die mehreren DNA-Kapillaren 13a, 13b, 13c usw. so angeordnet sind, daß sie unabhängige Fluidkanäle bilden statt zu dem gemeinsamen Fluidkanal 17 zusammengefaßt zu werden, ist es möglich, eine zusammenhängende Anordnung bereitzustellen, welche die effiziente Verarbeitung einer Mehrzahl von Proben ermöglicht.
Die DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich zur Probenmessung auch für die Isolierung und Reinigung von DNA oder mRNA verwendet werden. Weiter kann ein Protein, das an der Antigen/Antikörper-Reaktion beteiligt ist, als Sonde verwendet werden, die in der DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung immobilisiert wird. Außerdem kann beim Messen der Probe die DNA-Sonde unter Verwendung von optischen Reaktionsprinzipien aus bekannten DNA-Sonden geeignet ausgewählt werden. Weiter können verschiedene Reagenzien, die für die Messung benötigt werden, beispielsweise Markierungsreagenzien, einschließlich von fluoreszierendem Material, chemisches Licht emittierendem Material und farbentwickelndem Material, gemäß der bekannten chemischen Analysetechnik verwendet werden. Falls notwendig, kann ein im Handel erhältliches Analysegerät, das für das gewählte Reaktionsprinzip geeignet ist, für die automatische Messung verwendet werden.
Wie oben beschrieben, bildet in der vorliegenden Erfindung die DNA-Kapillare an sich einen Fluidkanal, wodurch es möglich ist, auf einfache Weise verschiedene Reaktionen, wie Immobilisierung, Messung und Isolierung, ebenso wie das Waschen durchzuführen. Falls die DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung mit einer Flüssigkeitsbearbeitungs-Vorrichtung für die aufeinanderfolgende Bearbeitung verschiedener Flüssigkeiten verbunden wird, kann eine Reihe von Verfahren auf einfache Weise durchgeführt werden. Im Fall der Verwendung einer DNA-Sonde, in der im Voraus optionale Basensequenzen über die gesamte Länge der Basensequenz synthetisiert werden, kann die DNA-Sonde durch eine einzige Belichtung immobilisiert werden, was eine weitgehende Unterdrückung der Beschädigung der DNA-Sonde ermöglicht. Daraus folgt, daß ein zufriedenstellender Immobilisationszustand aufrechterhalten werden kann. Da außerdem eine Mehrzahl von DNA-Sonden in ringförmigen Sondenbereichen getrennt voneinander entlang des Fluidkanals angeordnet sind, können die mehreren DNA-Sonden gleichzeitig und effizient durch einfaches Eintragen der Probe in den Fluidkanal einer Kopplungsreaktion unterzogen werden. Da die Oberfläche, auf der die DNA-Sonde immobilisiert wurde, außerdem im Inneren der Kapillare geschützt ist, entfällt das Problem mit der Kontaminierung praktisch vollständig. Darüber hinaus ist die DNA-Kapillare leicht zu handhaben.
In Beispiel 2 wird eine optionale DNA-Sonde in der Kapillare durch eine einzige photochemische Reaktion immobilisiert, wie in Beispiel 1. Die photochemische Reaktion kann jedoch ganz nach Wunsch beliebig oft durchgeführt werden, um eine DNA-Sonde mit der gewünschten Basensequenz herzustellen.
Industrielle Verwertbarkeit
Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte DNA-Kapillare unterscheidet sich von einer herkömmlichen DNA-Kapillare insoweit, als die Immobilisierung der DNA, die Messung, usw. innerhalb eines geschlossenen Systems durchgeführt werden können, mit dem Ergebnis, daß die DNA-Kapillare der vorliegenden Erfindung gegen eine Kontaminierung beständig und leicht zu handhaben ist. Da in der vorliegenden Erfindung die Kapillarwirkung ausgenutzt wird, kann das Fluid, das für die verschiedenen Bearbeitungen notwendig ist, beispielsweise verschiedene Flüssigkeiten, einschließlich von beispielsweise einer Probe und einer Waschflüssigkeit, bei der Durchführung der Messung mittels der immobilisierten DNA-Sonde leicht gehandhabt werden. Falls ein gemeinsamer Kanal mit einer Mehrzahl von Fluidkanälen verbunden wird, können außerdem durch den gemeinsamen Kanal verschiedene Bearbeitungs flüssigkeiten gemeinsam in die Kapillaren eingeführt oder aus diesen gewonnen werden, was zu einer erhöhten Verarbeitungsleistung führt. Außerdem kann der immobilisierte Bereich innerhalb des ringförmigen Kanals durch Anwenden einer photochemischen Reaktion auf den lichtdurchlässigen Fluidkanal vergrößert werden, wodurch es möglich wird, eine Messung usw. effizienter durchzuführen, selbst wenn nur Spuren von Proben verwendet werden. Da eine Mehrzahl von verschiedenen DNA-Sonden in einem einzigen Fluidkanal immobilisiert werden, kann die Messung außerdem noch wirksamer durchgeführt werden. Außerdem sei darauf hingewiesen, daß eine DNA-Sonde mit mindesten 20 Basen durch Immobilisieren einer DNA-Sonde, in der eine gewünschte Basensequenz im Voraus synthetisiert wurde, anhand einer einzigen Photoreaktion stabil immobilisiert werden kann.

Claims

DNA-Kapillare, umfassend: einen Fluidkanal, der mindestens teilweise durch eine Wand begrenzt ist, die lichtdurchlässig ist; eine Vielzahl von unabhängigen Sondenregionen, die in der Innenwand des Fluidkanals ausgebildet sind; und DNA-Sonden, die jeweils in diesen Sondenregionen immobilisiert sind, wobei die immobilisierten DNA-Sonden sich untereinander unterscheiden.
DNA-Kapillare nach Anspruch 1, worin die Fluidkanäle aus einer Hohlkapillare bestehen, deren Enden offen sind.
DNA-Kapillare nach Anspruch 2, worin der Fluidkanal zylindrisch ist.
DNA-Kapillare nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Kapillare eine Vielzahl dieser Fluidkanäle umfaßt, die so angeordnet sind, daß sie eine zusammenhängende Struktur bilden.
DNA-Kapillare nach Anspruch 4, worin alle aus dieser Mehrzahl von Fluidkanälen an einer Seite zu einem gemeinsamen Fluidkanal verbunden sind.
DNA-Kapillare nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin jede Art von DNA-Sonde unabhängig in ringförmigen Sondenregionen angeordnet ist, die getrennt voneinander entlang des Fluidkanals ausgebildet sind.
DNA-Kapillare nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Fluidkanal dadurch ausgebildet wird, daß eine Ätzbehandlung auf einem Glas- oder Siliciumsubstrat durchgeführt wird.
DNA-Kapillare nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die DNA-Sonde mittels einer photochemischen Reaktion immobilisiert wird.
DNA-Kapillare nach Anspruch 8, worin die DNA-Sonde so synthetisiert wird, daß sie vor der Immobilisierung eine vorgegebene Basensequenz aufweist, und durch Anwendung einer einmaligen photochemischen Reaktion in der Sondenregion immobilisiert wird.