DE10048997A1

DE10048997A1 - Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromoleküle

Info

Publication number: DE10048997A1
Application number: DE2000148997
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Henschel; Max Christian Lemme; Margarete Odenthal
Original assignee: SANTRON AG
Current assignee: SANTRON AG
Priority date: 2000-09-27
Filing date: 2000-09-27
Publication date: 2002-04-11
Also published as: WO2002027319A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromoleküle, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einem elektrisch leitfähigen Lösemittel, basierend auf einer Kapazitätsmessung an einem Schichtsystem aus einer das Lösemittel aufweisenden Probelösung, einem Isolator und einem Halbleiter, bestehend aus einem flächenhaft ausgedehnten dotierten Halbleiter (1), auf dessen eine Oberfläche sich eine Isolatorschicht (3) befindet, wobei weiterhin ein Teilbereich der Oberfläche der Isolatorschicht (3) als Sensorfläche (9) zur selektiven Anlagerung, insbesondere Adsorption oder Bindung der nachzuweisenden Makromoleküle, ausgebildet ist. Die Sensorfläche (9) ist dazu vorgesehen, dass ein Tropfen (5) der Probelösung auf sie aufgebracht wird, auf die Isolatorschicht (3) in unmittelbarer Nachbarschaft der Sensorfläche (9) ist eine elektrisch leitfähige Struktur (7) aufgebracht, welche dazu vorgesehen ist, einen elektrischen Kontakt mit diesem Tropfen (5) herzustellen, auf die Sensorfläche (9) ist ein Fixierungsmittel (13) aufgebracht, welches dazu vorgesehen ist, die räumliche Lage des Tropfens (5) festzulegen, die Sensorfläche (9) ist räumlich begrenzt und eine Messvorrichtung (9) zur Erfassung von Kapazitätsänderungen des aus Halbleiter (1)/Isolatorschicht (3)/Sensorfläche (9) und Tropfen (5) gebildeten Kondensatorsystems vorgesehen ist, welche durch Anlagerung, insbesondere Adsorption und Bindung von geladenen Makromolekülen, an der Sensorfläche (9) ...

Description

Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung ist eine Vorrichtung zum Nachweis von Makromolekülen in einer Probelösung gemäß des Oberbegriffs des Hauptanspruchs.

Es sind vielfältige Verfahren zum Nachweis von Makromolekülen in einer Probelösung bekannt. Ein Teil dieser Verfahren basiert auf einer spezifischen Reaktion der nachzuweisenden Makromoleküle mit sogenannten Fängermo lekülen, wobei diese Reaktion eine hohe Spezifität für die nachzuweisenden Makromoleküle aufweist. Eine solche wird z. B. bei einer Hybridisierungs reaktion von Makromolekülen, die eine doppelsträngige Gleichgewichtskon formation aufweisen, beobachtet. Beispiel hierfür ist z. B. die Hybridisierung einer DNA-Sequenz, bei der sich zwei komplementäre Einzelstränge zu einem doppelsträngigen Molekül vereinigen. Weiterhin tritt eine hohe Spezifität bei spielsweise auch bei Antikörper-Antigenreaktionen auf.

Die erwähnten Nachweisverfahren basieren in der Regel darauf, dass die nachzuweisenden Makromoleküle mit geeigneten Markierungen versehen werden und mittels spezifischer Reaktionen mit markierten Nachweismole külen, die an einer Grenzfläche fixiert sind, an dieser Grenzfläche angerei chert werden und damit in einer Konzentration vorliegen, die eine Erfassung der Markierung möglich machen. So kann z. B. eine stimulierte Lichtemissi on der fluoreszierenden Marker von der Grenzfläche beobachtet oder die vom Zerfall der radioaktiven Marker herrührende radioaktive Strahlung nachgewiesen werden.

Eine derartige Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle weist je doch Nachteile auf. So müssen Verfahren zur Markierung der nachzuwei senden Makromoleküle entwickelt werden. Die Markierung darf die Molekül eigenschaften möglichst wenig verändern. Weiterhin macht die Markierung zusätzliche Arbeitsschritte im Rahmen des Nachweisverfahrens erforderlich. Neuere Nachweisverfahren konzentrieren sich darauf, intrinsische Molekül eigenschaften zum Nachweis zu verwenden, um eine Markierung überflüssig zu machen.

So ist aus der US 5,164,319 ein kapazitives Nachweisverfahren für Makro moleküle in Lösung bekannt, welches auf der Beobachtung beruht, dass viele Makromoleküle in Lösung in dissoziierter Form vorliegen und damit teilweise eine hohe Ladung (je nach Größe des Makromoleküls bis zu einigen tausend Elementarladungen) tragen können. Durch eine spezifische Nach weisreaktion mit auf einer Trägeroberfläche fixierten Fängermolekülen kann eine starke Anreicherung von geladenen Makromolekülen an der Träger oberfläche erzielt werden, welche mit einem kapazitiven Messverfahren nachgewiesen werden kann. Hiermit wird der Offenbarungsgehalt der US 5,164,319 vollumfänglich zum Gegenstand der vorliegenden Patentanmel dung gemacht, weiterhin wird explizit auf die in der US 5,164,319 genannten Dokumente Bezug genommen.

Dabei wird als Träger ein Schichtsystem aus einem dotierten Halbleiter und einem darauf befindlichen Isolator verwendet. Die (elektrisch leitfähige) Pro belösung ist in Kontakt mit dem Isolator. Das Gesamtsystem Halbleiter/I solator/Probelösung bildet einen Kondensator dessen Kapazität mit geeig neten Messverfahren erfasst werden kann, die aus dem Stand der Technik bereits bekannt sind. Beispielhaft hierfür sei die Veröffentlichung der Fa. Hewlett Packard, Application Note 322, Analysis of Semiconductor Capacitance Characteristics des, z. B. S. 2, genannt. Hieraus ist auch die C-U-Kennlinie (Kapazität C über angelegter Spannung U) eines solchen aus einem Halblei ter/Isolator/Leiter-Übergang bestehenden Kondensators ersichtlich.

Bei der spezifischen Nachweisreaktion der in der Probelösung gelösten und in Lösung dissozierten, nachzuweisenden Makromoleküle mit an der Isola toroberfläche fixierten Fängermolekülen findet eine starke Anreicherung von Ladungen an der Isolatoroberfläche statt. Diese Anreicherung führt zu einer Verschiebung von Ladungsträgern im Halbleiter und damit zu einer Verän derung der Kapazität des aus Halbleiter/Isolator/Probelösung bestehen den Kondensators, welche erfasst werden kann. Es tritt eine Verschiebung der C-U-Kennlinie des Kondensators auf die leicht detektiert werden kann, z. B. indem die Kapazität des Kondensators an einem geeignet gewählten Ar beitspunkt erfasst wird. Als Arbeitspunkt wird hierzu vorteilhaft ein Punkt hoher Steigung der C-U-Kennlinie gewählt. Hierzu wird in Rahmen der Aus führungsbeispiele genauer ausgeführt, Details können auch der US 5,164,319 entnommen werden.

Die zur Durchführung des genannten kapazitiven Messverfahrens aus der US 5,164,319 bekannte Vorrichtung arbeitet mit Sensorflächen, die auf die Oberfläche eines oberflächlich oxidierten, dotierten Silizium-Trägers aufge bracht sind. Rückseitig ist jede Sensorfläche mit einer individuellen Elektro de versehen. Ein solches Elektrode/Halbleiter/Isolator-Schichtsystem wird die leitfähige Probelösung eingebracht, in der sich auch eine inerte Gegen elektrode befindet. Mittels geeigneter Messverfahren, die der US 5,164,319 im Detail entnommen werden können, kann die C-U-Kennlinie des dergestalt gebildeten, wässrigen Kondensatorsystems bestimmt werden.

Um eine hohe Effizienz des Nachweisverfahrens zu erzielen, ist es aus dem Stand der Technik bekannt, das Verfahren mit einem Array von geeigneten Vorrichtungen gleichzeitig mit einer Vielzahl von verschiedenen Fängermolekülen an einer gemeinsam zu untersuchenden Probelösung durchzuführen. Hierzu ist aus der US 5164,319 ein Array o. g. Kondensatoren individuellen Sensorflächen bekannt, die alle jeweils rückseitige Elektroden aufweisen und elektrisch gegeneinander isoliert ausgeführt sind. Vorderseitig wird die ge samte Array-Oberfläche einheitlich von der Probelösung bedeckt und diese mittels einer für alle Kondensatoren gemeinsamen Gegenelektrode kontak tiert.

Diese Vorrichtung weist eine Reihe von Nachteilen auf. So ist zur Bedeckung der gesamten Arrays eine große Menge von Probelösung erforderlich, die in vielen Fällen nicht zur Verfügung steht. Die erzielte Nachweisempfindlich keit, die im Bereich von Mikromol/Liter der nachzuweisenden Makromole küle liegt, ist deutlich zu gering, um die Vorrichtung z. B. in der analytischen Medizin einsetzen zu können. Weiterhin muss nasschemisch, hier genauer elektrochemisch gearbeitet werden. Dadurch wird ein einfacher Einsatz in einem Labor erschwert.

Die erwähnte relativ grosse Menge von Probelösungen wird für einen einzi gen Versuch benötigt. Hierin liegt der Nachteil, dass individuelle Entwick lungen nicht im Einzelnen überprüft oder in nachfolgenden Messungen stu diert werden können. Es hat sich gezeigt, dass es auf den einzelnen Sensor flächen zu Anlagerungen verschiedenster Art kommen kann, die nicht ein zeln studiert werden können. Eine Nullmessung ohne nachzuweisende Mo leküle und nur mit dem Lösemittel benötigt eine gesamte Anordnung mit ei nem kompletten Array.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Vorrichtung an zugeben, die gegenüber der vorbekannten Vorrichtung eine deutlich erhöhte Nachweisempfindlichkeit aufweist und zudem eine verringerte Menge von Probelösung für die Durchführung des Nachweisverfahrens benötigt. Schließlich soll die Vorrichtung zum Aufbau eines Arrays geeignet sein. Sie soll einfach handhabbar sein.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Hauptanspruchs.

Mit dieser Vorrichtung und mit dem sich bei Benutzung der Vorrichtung einstellenden Verfahren kann gezielt mit einer sehr geringen Menge an Pro belösungen gearbeitet werden. Es wird jeweils nur die Sensorfläche ein schliesslich zumindest eines Teils der elektrisch leitfähigen Struktur benetzt. Jedenfalls ist eine grössere Benetzung nicht erforderlich. Dies bedeutet, dass die jeweilige Menge an Probelösungen sehr gering sein kann.

Auf diese Weise können unterschiedliche Probelösungen getestet werden, dies ist ganz im Gegensatz zum genannten Stand der Technik. Als Probelö sung kann zunächst das reine Lösemittel eingesetzt werden. Dann kann als Probelösung eine Mischung aus Lösemittel und den nachzuweisenden Mak romolekülen eingesetzt werden. Weiterhin kann als Probelösung dem reinen Lösemittel ein beliebiger Zusatz beigegeben werden, auch einer Probelösung aus Lösemittel und Makromolekülen kann ein beliebiger Zusatz beigegeben werden. Es kann mit unterschiedlichen Temperaturen gearbeitet werden. Insgesamt kann die Messung daher wesentlich differenzierter gemacht wer den, als dies nach dem Stand der Technik möglich ist.

Die einzelnen Tropfen an Probelösung werden jeweils auf die Sensorflächen und die sich daran unmittelbar anschliessenden elektrisch leitfähigen Strukturen aufgebracht. Eine komplette Flüssigkeitszelle wie beim Stand der Technik ist nicht erforderlich. Damit entfallen auch alle elektrochemischen Massnahmen, die mit einer grösseren Flüssigkeitszelle als beim Stand der Technik verbunden sind.

Die Sensorfläche zusammen mit dem Teil, der elektrisch leitfähigen Struktur, die von dem Tropfen an Probelösung benetzt wird, wird im folgenden als Benetzungsfläche bezeichnet. Die Sensorfläche zusammen mit der elektrisch leitfähigen Struktur wird als Gesamtfläche bezeichnet. Die Benetzungsfläche ist höchstens so gross wie die Gesamtfläche. Die Gesamtfläche ist nach aus sen hin ringförmig abgeschlossen, vorzugsweise durch Hydrophobe ausges taltet des die Gesamtfläche umgebenden Bereichs der Isolatorschicht. Vor zugsweise ist die Isolatorschicht an dieser Stelle auch mit einer dicken Deckschicht abgedeckt.

Auf der Sensorfläche befindet sich das Fixierungsmittel. Hier ist ein geeig netes, aus dem Stand der Technik für die jeweils gewählte Probelösung ab leitbares Mittel, das auf der Isolatorschicht hält, vorgesehen.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung wird die Benetzungsfläche durch mechanische Massnahmen begrenzt. Hierunter ist insbesondere ein umlaufender Wall und insgesamt ein umlaufender Rand zu verstehen, durch den der Tropfen zwangsweise örtlich begrenzt wird.

Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus den Unteransprüchen sowie den nun folgenden Ausführungsbeispielen, die anhand der Zeichnung er läutert werden. In dieser zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische Darstellung einer Sensorvorrichtung nach der Erfindung,

Fig. 2 eine Darstellung entsprechend Fig. 1 von insgesamt sieben Senso ren auf einem gemeinsamen Substrat,

Fig. 3 eine perspektivische Darstellung wie Fig. 1 einer einzelnen Sensor vorrichtung, jedoch nunmehr mit einem Tropfen einer Probelösung,

Fig. 4 eine Wiedergabe eines optischen Mikroskopiebildes eines Arrays photolithographisch hergestellter, erfindungsgemässer Nachweisvor richtungen in Aufsicht, gezeigt ist ein Ausschnitt,

Fig. 5 ein Diagramm für die Abhängigkeit der Kapazität C in pF von der Spannung U in V und

Fig. 6 ein Diagramm für drei Messpunkte für die Flachbandspannung Ufb in V bei drei unterschiedlichen Probelösungen, nämlich einmal reines Wasser, einmal Einzelstrang-DNA ss im Lösemittel Wasser und ein mal Doppelstrang-DNA ds im Lösemittel Wasser.

Im Rahmen des Ausführungsbeispiels gem. Fig. 1 wurde eine Vorrichtung mit dem folgenden Aufbau realisiert:
Als Halbleiter 1 dient ein n- oder p-dotierter Silizium-Quader, dessen Leitfä higkeit typisch auf 1 bis 100 Ohmmeter eingestellt ist. Die Dicke des Silizi um-Quaders beträgt etwa 550 Mikrometer. Rückseitig eine vollflächige me tallische Gegenelektrode 15 aus einem typischen Elektrodenmaterial aufge bracht ist, z. B. ein thermisch aufgedampfter oder aufgesputterter, zusam menhängender Al-Film mit einer Dicke von etwa 200 nm, dessen Dicke je denfalls zur Ausbildung metallischer Eigenschaften ausreicht. Er ist mit ei nem Anschluss einer Messvorrichtung 27 verbunden. Es wird ein Gerät HP 4280 A der Firma Hewlett Packard verwendet.

Der Silizium-Quader ist oberseitig bis zu einer Tiefe ca. 20 nm oxidiert, so dass sich an der Oberfläche des Silizium-Wafers eine nichtleitende SiO₂- Isolatorschicht 3 befindet. Die hierzu benötigten Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Auf die Isolatorschicht 3 wird oberseitig vollflächig eine metallische Schicht aufgebracht, die anschliessend mittels photolithographischer Methoden ge eignet strukturiert wird, so dass sich auf der Oberfläche der Isolatorschicht 3 eine leitfähige Struktur 7 ausbildet. Als metallische Schicht kommt z. B. ein aufgedampfter oder aufgesputterter Aluminium-, Titan-, Ohrom-, Gold-, Silber oder Platinfilm mit einer Dicke, die mindestens ausreichend zur Ausbildung metallischer Eigenschaften ist, in Betracht. Typische Filmdicken lie gen im Bereich von einigen hundert Nanometern.

Zur Strukturierung der metallischen Schicht werden vorzugsweise photoli thographische Verfahren eingesetzt, d. h. nach dem vollflächigen Aufdampfen eines Metallfilms aus Aluminium einer Dicke von 200 nm Aufbringen eines Photolackes auf die gesamte Oberfläche dieses Metallfilms, Belichten des Photolackes durch eine geeignet strukturierte Maske, Entfernen des belich teten Photolackes, nachfolgendes Ätzen der freigelegten Oberfläche mit zum Metallabtrag geeigneter Ätzlösung und gegebenenfalls Entfernen des restli chen Photolackes. Entsprechende Verfahren sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Alternativ hierzu kommen auch andere Strukturie rungsverfahren wie Elektronenstrahl- oder Ionenstrahlbelichtung in Frage, die Wahl des geeigneten Strukturierungsverfahren richtet sich in erster Linie nach den zu erzielenden Strukturgrößen. Auch Ionenimplantation ist geeig net zur Herstellung der Struktur 7.

In Fig. 1 ist eine Ringform für die Struktur 7 gezeigt, deren Aussendurch messer etwa 0,5 bis 1 Millimeter beträgt. Die Ringbreite beträgt etwa 100 bis 300 Mikrometer, so dass sich im Zentrum der Ringstruktur eine Sensorflä che 9 mit einem Durchmesser von etwa 500 Mikrometern befindet, in der die Oberfläche der Isolatorschicht 3 frei zugänglich ist.

Auf diese Sensorfläche 9 können nunmehr mittels geeigneter Verfahrens schritte, die ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt sind, Fängermo leküle 17 aufgebracht werden (siehe Fig. 4), die eine spezifische chemische Reaktion mit den nachzuweisenden Makromolekülen zeigen. Hierbei kann es sich zum Beispiel um die komplementäre Sequenz zu einer einzelsträngig vorliegenden, nachzuweisenden Polynucleotidsequenz handeln. Die Fänger moleküle 17 sind vorzugsweise an der Oberfläche der Isolatorschicht 3 che misch fixiert, z. B. durch chemische Reaktion spezifischer chemischer End gruppen mit einer auf die Sensorfläche 9 aufgebrachten, vorzugsweise che misorbierten, Linkerschicht 19. Einzelheiten hierzu sind aus dem Stand der Technik bekannt und richten sich in erster Linie nach den chemischen Ei genschaften der Isolatorschicht 3 und den zur Verfügung stehenden End gruppen der Fängermoleküle 17. Die Isolatorschicht 3 im Zentrum der elekt risch leitfähigen Struktur 7, also die Sensorfläche 9, gemeinsam mit den darauf aufgebrachten bzw. fixierten Fängermolekülen 17 wird als präparierte Sensorfläche 9 bezeichnet.

Im Aussenbereich ist die elektrisch leitfähige (Ring-)Struktur 7 über eine Zuleitung 21 mit einer Anschlussfläche 23 verbunden. An diese Anschluss fläche ist die zweite Anschlussleitung der Messvorrichtung 27 zur Erfassung von Kapazitätsänderungen angeschlossen. Anschlussfläche 23 und Zulei tung 21 sind ebenfalls photolithographisch hergestellt, vorzugsweise in ei nem Arbeitsgang mit der Herstellung der elektrisch leitfähigen Struktur 7.

Fig. 2 zeigt eine Array-Anordnung der aus Fig. 1 ersichtlichen erfindungs gemäßen Vorrichtung, die vorteilhaft mittels photolithographischer Verfah ren hergestellt werden kann. Eine Array-Anordnung kann zur massiv parallelen Analyse einzelner Tropfen einer Probelösung auf eine Vielzahl ver schiedener Makromoleküle eingesetzt werden. Eine entsprechende Verfah rensweise ist z. B. aus dem Nachweis von Polynucleotidsequenzen mittels Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen bekannt. Die Arrayanordnung kann insgesamt auch in ein ausreichend grosses Volumen an Probelösung einge bracht werden.

Fig. 3 zeigt die aus Fig. 1 ersichtliche erfindungsgemäße Vorrichtung in Kontakt mit einem Tropfen Probelösung 5. Dieser Tropfen weist ein definier tes Volumen von typisch einigen Nanolitern auf. Tropfen dieser Größe kön nen mittels gängiger Pipettierungsverfahren erzeugt werden. Vorzugsweise wird der Tropfen 5 mittels einer automatisierten Positionierungsvorrichtung auf der Sensorfläche 9 positioniert und abgesetzt.

Um eine genaue Positionierung des Tropfens 5 auf der Sensorfläche 9 zu er halten, ist ein Fixierungsmittel vorgesehen, welches die Lage des Tropfens 5 im wesentlichen auf die Sensorfläche 9 festlegt. Im diskutierten Ausfüh rungsbeispiel ist die ausserhalb der elektrisch leitfähigen Struktur 7 gelege ne Oberfläche der Isolatorschicht 3 durch gezieltes Aufbringen einer hydro phoben Monoschicht, z. B. von OTS, hydrophobisiert, so dass ein auf diesen Bereich aufgebrachter Tropfen 5 der Probelösung einen hohen Kontaktwin kel, vorzugsweise von größer als 45° aufweist, insbesondere im Bereich von 90° und darüber.

Die Oberfläche der elektrisch leitfähigen Struktur 7 ist vorzugsweise metal lisch, wodurch sich im allgemeinen eine gute Benetzbarkeit durch wässrige Lösungen ergibt. Viele saubere Metalloberflächen, z. B. von Edelmetallen, zei gen vollständige Benetzbarkeit durch Wasser, gekennzeichnet durch einen Kontaktwinkel von 0°.

Die Sensorfläche 9 wird vorzugsweise ebenfalls durch gezieltes Aufbringen einer Monoschicht geeigneter Moleküle hydrophilisiert, so dass sich auch auf der Sensorfläche 9 ein niedriger bis verschwindender Kontaktwinkel der Pro belösung ausbildet. Insgesamt wird also die Oberfläche der elektrisch leitfä higen Struktur 7 und der Sensorfläche 9 hydrophil ausgeführt, wohingegen die umgebene freie Oberfläche der Isolatorschicht 3 hydrophobisiert wird, d. h. es wird gezielt ein Benetzungskontrast zwischen elektrisch leitfähiger Struktur 7 und Sensorfläche 9 einerseits und freier Oberfläche der Isolator schicht 3 andererseits eingestellt. Sofern das Volumen des aufgebrachten Tropfens eine bestimmte, von der Geometrie und den Benetzungseigen schaffen der erfindungsgemäßen Vorrichtung abhängenden Wert nicht über schreitet, kann mittels des diskutierten Benetzungskontrasts der Tropfen 5 der Probelösung weitgehend vollständig auf die Sensorfläche 9 und die elektrisch leitfähige Struktur 7 festgelegt werden. Die Gesamtheit der Benet zungseigenschaften mit den dazu ggf. auf die Oberfläche der Isolatorschicht aufzubringenden Monoschichten stellt damit in dieser Ausführung das er findungsgemäße Fixierungsmittel dar. Die hydsorphile Ausbildung der Sen sorfläche 9 erfolgt vorzugsweise vor dem Aufbringen der Fängermoleküle 17, sie kann aber auch danach erfolgen.

Alternativ hierzu kann beispielsweise eine Festlegung des Tropfens 5 auf die Sensorfläche 9 mittels eines geometrischen "confinements" geschehen, d. h. es wird beispielsweise die freie Oberfläche der Isolatorschicht 3 mit einer Passivierungsschicht 25 großer Dicke (z. B. einige 100 Nanometer PMMA (Polymethylmethacrylat) bedeckt, die eine Bedeckung der Oberfläche der I solatorschicht 3 mit der Probelösung aufgrund eines Walls oder einer Bö schung (Flanke) geometrisch verhindert bzw. einen so grossen Abstand zwi schen Tropfen und Halbleiter/Isolator-Schichtsystem herstellt, dass die jenigen Teile des Tropfens 5, die auf der Passivierungsschicht 25 sitzen, nicht mehr zum kapazitiven Messsignal beitragen.

Ein derartiges confinement wird in der Ausführung nach Fig. 1 schon da durch erreicht, dass sich die Sensorfläche 9 innerhalb der Struktur 7 befin det, die eine gewisse Dicke aufweist. Der Rand dieser Struktur bildet daher eine Flanke, die umläuft und die den Tropfen 5 schon zwangsläufig festhält. Es genügt schon der elektrische Kontakt dieser Seitenfläche der Struktur 7 mit dem Tropfen 5, um die elektrische Kontaktierung herzustellen.

Fig. 4 zeigt schliesslich ein optisches Mikroskopiebild eines Arrays photo lothographisch hergestellter erfindungsgemäßer Vorrichtungen in Aufsicht, deren Struktur derjenigen aus Fig. 1 entspricht (200 nm Al-Struktur auf 20 nm SiO₂ auf 550 Mikrometer p-Si). In dieser experimentellen Realisierung wird das Fixierungsmittel 13 durch die (optisch sichtbare) elektrisch leitfähi ge Struktur 7 sowie eine (nicht sichtbare) hydrophile Beschichtung im Inneren der elektrisch leitfähigen Struktur 7 in Verbindung mit der hydrophoben ungebundenen Oberfläche (Kontaktwinkel etwa 30°) der Isolatorschicht 3 gebildet. Wird ein Tropfen 5 wässriger Probelösung auf die gezeigte Struktur gesetzt, so breitet sich der Tropfen bis an die äußere Berandung der hydrophilen elektrisch leitfähigen Struktur 7, also auf der Gesamtfläche, aus. Dabei wird das Innere der elektrisch leitfähigen Struktur 7, welches als Sensorfläche 9 ausgebildet ist, vollständig vom Tropfen 5 bedeckt.

Vorabmessungen an Leerstrukturen

Die der Erfindung zugrunde liegenden Messverfahren und Messstrukturen wurden zunächst durch Messungen mit Lösemitteln unterschiedlicher pH- Werte verifiziert. Dabei waren keine Makromoleküle im Lösemittel enthalten.

In Abhängigkeit von der Protonenkonzentration (pH = -log a_H⁺ mit a = Akti vität) variiert das Oberflächenpotential des Isolators durch eine Verschie bung des Protolysegleichgewichtes. Für den vorliegenden Fall einer Isolator schicht 3 aus SiO₂ wird das Oberflächenpotential durch die folgenden Reak tionen bestimmt:

SiOH + H⁺ ↔ SiOH₂ ⁺

SiOH + OH^- ↔ SiO^- + H₂O

Anlagerungen oder Abspaltungen der Protonen von endständigen OH- Gruppen des Oxides bewirken eine Aufladung der Oberfläche, damit verbun den eine Verschiebung des Flachbandpotentials. Mit Hilfe der Nernst'schen Gleichung lässt sich die pH-Abhängigkeit des Flachbandpotentials zu 59 mV/pH bestimmen:

E = E₀ + 0,059loga_H⁺

Die Messungen wurden in Natriumhydrogenphosphatpuffer (10 mM) bei pH- Werten von 5, 7 und 9 und einem Volumen von 500 nL durchgeführt. Im Spannungsbereich von -5 V bis 1 V wurde die Kapazität durch Addition einer Wechselspannung mit 20 mV Amplitude und einer Frequenz von 100 kHz gemessen. Die erhaltenen C-U-Kennlinien des aus dotiertem Halb leiter 1, Isolatorschicht 3 aus SiO₂ und gepufferter wässriger Lösung sind in Fig. 5 dargestellt.

Alle Messungen zeigen eine deutliche Verschiebung der gesamten Kennlinie gegenüber der Referenzmessung auf einer unbenetzten, trockenen Struktur. Dabei wird eine geringe Streubreite der einzelnen Messungen beobachtet. Auch innerhalb der Messreihe ist ein Gang der Flachbandspannung in Ab hängigkeit vom pH-Wert deutlich erkennbar.

Damit ist gezeigt, dass eine Veränderung der Oberflächenladung im Bereich der Sensorfläche 9 zu einer Verschiebung der gesamten C-U-Kennlinie des o. g. Kondensatorsystems führt. Wählt man einen Arbeitspunkt fester Span nung auf der Flanke der C-U-Kennlinie, insbesondere den dort zu beobach tenden Wendepunkt, und beobachtet die Veränderung der Kapazität durch Adsorption geladener Makromoleküle auf der Sensorfläche 9, so lässt sich eine hohe Nachweisempfindlichkeit durch einfache Messung der Kapazitäts änderung des Gesamtsystems erzielen. Innerhalb gewisser adsorbierter La dungsmengen, d. h. Partikelzahl der nachzuweisenden Makromoleküle kann sich ein linearer oder quadratischer Zusammenhang zwischen Partikelzahl und Kapaziätsänderung ergeben.

Nukleinsäuren-Vorbereitung Herstellung der Nukleinsäuren

Ausgehend von einer Insertsequenz +1 bis 646, die im Polylinker des Plas mids p156 inseriert war, wurde einzelsträngige und doppelsträngige DNA en zymatisch hergestellt. Als Matritze für eine Einzelstrang- bzw. Doppelstrang- PCR wurde im Polylinker Hind III lineraisiertes Plasmid 156 in einer Konzentration von 10 ng/µl eingesetzt. Die verwendeteten Primer 65 und 19 für die Synthese lagen in einer Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10 µM vor.

Die PCR-Reaktionen wurden in einem PTC 200 von MJ Research Inc. durch geführt.

Einzelstrang-PCR

Doppelstrangstrang-PCR

Aufreinigung der Nukleinsäuren

10 Ansätze der Einzeistrang- bzw. der Doppelstrang-PCR wurden nach der Amplifikation vereinigt und entweder einer Phenol/Choroform-Extraktion mit anschließender Ammonium-acetat-Fällung oder einer Aufreinigung mit dem Wizzard-Purification Hit (Promega) unterzogen. Die Nukleinsäuren wurden in Chromatographie-Wasser der Firma Merck aufgenommen.

Dialyse

Die Proben wurden in QuixSep-Dialysier-Gefäße der Firma Membrane Filt ration Products, Inc. überführt. Der verwendetete Dialysierschlauch der Firma Roth hatte eine Porengröße von 25 bis 50 Angström. Es wurde zwei mal im 1000-fachen Volumen Chromatographie-Wasser für jeweils 1 Stunde dialysiert.

Konzentrationsbestimmung und Kontrolle der Nukleinsäuren

Die Konzentrationen wurden spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.

Aliquots der Proben wurden zur Überprüfung der Reinheit von Doppelsträn gen bzw. Einzelsträngen in einer Submarin-Agarose-Gelelektrophorese bei konstanter Spannung von 80 Volt aufgetrennt und ihr Laufverhalten unter einem UV-Transillumunator dokumentiert.

Ebenfalls wurden zur Kontrolle der Reinheit der Proben Schmelzkurven in einem GeneAmp 5700 der Firma Perkin Eimer Biosystems durchgeführt. Hierzu wurde SYBR-Green-Lösung der Firma FMC Bioproducts zu den Aliquots der Proben in einer Verdünnung 1 : 10000 zugeführt und das Tempe raturprofil von 95°C bis Raumtemperatur aufgezeichnet.

Konzentrationen der C/U-gemessenen Proben

Einzelstrang-DNA	Doppelstrang-DNA (Hybrid)
a. 7,5 ng/µl = 50 fmol/µl	a. 75 ng/µl = 50 fmol/µl
b. 75 ng/µl = 500 fmol/µl	b. 150 ng/µl = 500 fmol/µl

Es wurden zw. 100 nl und 500 nl in die C/U-Messungen eingesetzt.
Lösungsmedium: hier Chromatographie-Wasser (siehe Dialyse)

Messungen mit DNA-haltiger Probelösung

Zur Messung des Hybridisierungszustandes (Einzel- bzw. Doppelstrang) von DNA-Lösungen wurde eine 5.10^-7 molare DNA-Lösung in H₂O mit der oben beschriebenen DNA-Sequenz von 409 Basen bzw. Basenparen verwendet. Bei einem verwendeten Volumen von nur 500 nL pro Messung wurden damit lediglich 250 fmol DNA auf die erfindungsgemässe Vorrichtung aufgebracht.

Aufgrund der Tatsache, dass die nachzuweisenden Makromoleküle, hier die o. g. Polynucleotidsequenzen in Lösung dissozieren und damit geladen sind, tritt an der präparierten Sensorfläche 9 eine Adsorption der dissozierten Po lynucloetidsequenzen an der Isolatoroberfläche auf. Je nach Vorliegen einer einzeisträngigen oder doppelsträngigen Polynucleotidsequenz trägt diese Se quenz weniger oder mehr Ladungen, die bei einer Adsorption auf der präparierten Sensorfläche 9 zu einer unterschiedlich starken Veränderung der ad sorbierten Ladungsmenge und damit zu unterschiedlichen Verschiebungen der C-U-Kennlinien, d. h. Veränderungen der Kapazität des Gesamtsystems am Arbeitspunkt führen.

Im Spannungsbereich von -5 V bis 1 V wurde die Kapazität des Kondensa torsystems durch Addition einer Wechselspannung mit 20 mV Amplitude und einer Frequenz von 100 kHz gemessen und das Flachbandpotential be stimmt.

Wie Fig. 6 zeigt, konnte eine eindeutige und gut unterscheidbare Verschie bung des Flachbandpotentials um 16 mV zwischen Einzel- und Doppel strang-DNA bei identischer DNA-Konzentration und -Länge nachgewiesen werden.

Damit ist nachgewiesen, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß o benstehenden Ausführungsbeispiels eine ausreichende Genauigkeit auf weist, um eine Gesamtpartikelzahl von ca. 250 Femtomol in einem Tropfen von ca. 500 Nanolitern nachzuweisen.

Eine Verbesserung der Messgenauigkeit kann noch erzielt werden, indem ei ne Probelösung auf einer ersten erfindungsgemäßen Vorrichtung gegen eine Referenzlösung auf einer zweiten erfindungsgemäßen Vorrichtung gemessen wird, d. h. in Fig. 6 die relative Lage der mit "ss" (single stranded) und "ds" (double stranded) bezeichneten Meßpunkte gegenüber dem mit "H₂O" be zeichneten Meßpunkt bestimmt wird.

Hierzu hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, in einer Wheatstone- Brücke eine erste erfindungsgemässe Vorrichtung und eine zweite erfin dungsgemässe Vorrichtung anzuordnen und nur die Änderungen zwischen beiden zu erfassen.

Claims

1. Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromoleküle, insbesondere von Polynucleotidsequenzen, in einem elektrisch leitfähigen Lösemittel, basie rend auf einer Kapazitätsmessung an einem Schichtsystem aus einer das Lösemittel aufweisenden Probelösung, einem Isolator und einem Halb leiter, bestehend aus einem flächenhaft ausgedehnten dotierten Halblei ter (1), auf dessen eine Oberfläche sich eine Isolatorschicht (3) befindet, wobei weiterhin ein Teilbereich der Oberfläche der Isolatorschicht (3) als Sensorfläche (9) zur selektiven Anlagerung, insbesondere Adsorption o der Bindung der nachzuweisenden Makromoleküle ausgebildet ist, da durch gekennzeichnet, dass:

a) die Sensorfläche (9) dazu vorgesehen ist, dass ein Tropfen (5) der Pro belösung auf sie aufgebracht wird,
b) auf die Isolatorschicht (3) in unmittelbarer Nachbarschaft der Sensor fläche (9) eine elektrisch leitfähige Struktur (7) aufgebracht ist, welche dazu vorgesehen ist, einen elektrischen Kontakt mit diesem Tropfen (5) herzustellen,
c) auf die Sensorfläche (9) ein Fixierungsmittel (13) aufgebracht ist, wel ches dazu vorgesehen ist, die räumliche Lage des Tropfens (5) festzulegen,
d) die Sensorfläche (9) räumlich begrenzt ist
e) und eine Messvorrichtung (9) zur Erfassung von Kapazitätsänderun gen des aus Halbleiter (1)/Isolatorschicht (3)/Sensorfläche (9) und Tropfen (5) gebildeten Kondensatorsystems vorgesehen ist, welche durch Anlagerung, insbesondere Adsorption und Bindung von gelade nen Makromolekülen an der Sensorfläche (9) verursacht werden.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixie rungsmittel (13) durch einen definierten Benetzungskontrast für das Lö semittel der Probelösung zwischen einerseits Isolatorschicht (3) und an dererseits Sensorfläche (9) sowie ggf. elektrisch leitfähiger Struktur (7) gebildet wird.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fixie rungsmittel (13) die räumliche Lage des Tropfens (5) auf der Sensorfläche (9) durch geometrische Begrenzung festlegt.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elekt risch leitfähige Struktur (7), die Sensorfläche (9) ringförmig umschließt.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elekt risch leitfähige Struktur (7) in Dünnschichttechnik auf die Isolator schicht (3) aufgebracht ist, vorzugsweise in Form eines strukturierten Metallfilms.

6. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe lösung die Sensorfläche (9) benetzt, vorzugsweise vollständig benetzt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe lösung die Oberfläche der elektrisch leitfähigen Struktur (7) benetzt, vor zugsweise vollständig benetzt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die außer halb der Sensorfläche (9) und der elektrisch leitfähigen Struktur (7) lie gende Oberfläche so ausgebildet ist, dass sie von der Probelösung unvoll ständig benetzt, vorzugsweise positiv nicht benetzt wird.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass auf die außerhalb der Sensorfläche (9) und der elektrisch leitfähigen Struktur (7) liegende Oberfläche der Isolatorschicht (3) eine Deckschicht (11) aufge bracht ist, deren Dicke größer ist als die Dicke der Isolatorschicht (3), vorzugsweise mindestens 5 mal größer.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Sensorfläche (9) Fängermoleküle (13) verankert, insbesondere chemisor biert sind, an die die nachzuweisenden geladenen Makromoleküle spezi fisch binden können.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vor richtung zum Nachweis von im Gleichgewicht doppelsträngigen Makro molekülen vorgesehen ist, wobei die Fängermoleküle (13) durch Einzel stränge der nachzuweisenden Makromoleküle gebildet werden.

12. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elek trisch leitfähige Struktur (7) eine Anschlussfläche (13) für eine elektri sche Zuleitung aufweist.