JP2005283308A - プローブアレイの製造方法 - Google Patents

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秀晃 岡部
Hideo Tashiro
英夫 田代
Yasumitsu Kondo
恭光 近藤
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Abstract

【課題】 筒状部材の中空部にプローブが配列したプローブアレイを容易に製造する。
【解決手段】 プローブ固定化面１１０を有する可撓性シート状部材１１を、プローブ固定化面１１０が内周面を構成するように円筒状に成形する。
【選択図】 図３

Description

本発明はプローブアレイの製造方法に関する。
近年、標的物質と反応できるプローブ（例えば、ＤＮＡ、タンパク質等の生体物質）をガラス、シリコン等のプレート状担体に固定化し、標的物質の検出を行うＤＮＡチップ、プロテインチップ等のプローブアレイが開発されている（例えば、特許文献１参照）。
プローブアレイによる標的物質の検出は、標的物質を含む液体試料をプレート状担体上に添加し、乾燥を防ぐためにカバーグラス等を被せ、プローブと標的物質とを反応させた後、洗浄してプローブと反応した標的物質以外の物質を除去し、予め標的物質に結合させておいた標識物質（例えば、蛍光物質、酵素等）を検出することにより行われる。この際、微量な液体試料をマイクロピペットで吸い取り、均一にプレート状担体に添加し、カバーグラスを被せ、反応後にカバーグラスを外して均一にプレート状担体を洗浄するという操作を手作業で行わなければならず、各作業は非常に繊細であるため、作業する者によって結果に大きな差が生じ、再現性のある結果を得ることが困難であった。また、検出を自動的に行う装置も開発されているが、非常に高価であり容易に入手することはできない。
このような状況の下、光透過性の円筒状キャピラリーの内壁に複数種類のプローブが縞状に固定されたプローブアレイが開発されている（特許文献２参照）。このようなプローブアレイによれば、円筒状キャピラリーの中空部に対する液体試料、洗浄液等の流入及び流出という簡便な操作により、再現性よく標的物質を検出することができる。
特開平１１−１０８９２８号公報 特開平１１−７５８１２号公報
プローブアレイの製造方法としては、（１）スポッティング用ピン内に吸い上げられたプローブ含有液を基材上の所定部位にスポッティングする方法（米国特許第５，８０７，５２２号公報）、（２）半導体製造のフォトリソグラフィー技術を応用して基材上で直接オリゴヌクレオチドを合成する方法（米国特許第５，４２４，１８６号公報）が知られているが、円筒状キャピラリーの内壁に複数種類のプローブを固定する際、上記（１）の方法を利用することは困難であるため、上記（２）の方法を利用せざるを得ず、上記特許文献２でも上記（２）の方法を利用している。
しかしながら、上記（２）の方法を利用する場合、特殊な試薬を利用した複雑な反応工程が必要となる。
そこで、本発明は、筒状部材の中空部にプローブが配列したプローブアレイを容易に製造することができるプローブアレイの製造方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明は、第一に、筒状部材と前記筒状部材の中空部に配列したプローブとを備えたプローブアレイの製造方法であって、プローブ固定化面を有する可撓性シート状部材を、前記プローブ固定化面が内周面を構成するように筒状に成形する工程を含む前記製造方法を提供する。
また、本発明は、第二に、筒状部材と前記筒状部材の中空部に配列したプローブとを備えたプローブアレイの製造方法であって、プローブ固定化面を有する可撓性シート状部材を、前記プローブ固定化面が前記筒状部材の中空部に露出するように、前記筒状部材の内周面に密着させる工程を含む前記製造方法を提供する。
本発明によれば、筒状部材の中空部にプローブが配列したプローブアレイを容易に製造することができる。
以下、本発明を図面に基づいて詳細に説明する。
図１及び図２はプローブ固定化面を有する可撓性シート状部材の斜視図、図３は第一実施形態に係る製造方法により製造されるプローブアレイの斜視図、図４は第二実施形態に係る製造方法により製造されるプローブアレイの斜視図である。
〔第一実施形態〕
第一実施形態に係る製造方法は、プローブアレイ１ａ（図３参照）の製造方法であって、プローブ固定化面１１０を有する可撓性シート状部材１１（図１及び図２参照）を、プローブ固定化面１１０が内周面を構成するように円筒状に成形する工程を含む。
可撓性シート状部材１１の材質は、可撓性を有し、液体試料、洗浄液等に不溶性である材質である限り特に限定されるものではなく、例えば、ポリエチレン、ポリエチレン共重合体（例えば、エチレン−アクリル酸エチル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体）等のポリエチレン系樹脂；ポリプロピレン；ポリスチレン、ポリスチレン共重合体（例えばアクリロニトリル−スチレン共重合体、アクリロニトリル−スチレン−ブタジエン共重合体）等のポリスチレン系樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂；ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル等のアクリル樹脂；ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート等のポリエステル；ポリカーボネート等の熱可塑性樹脂が挙げられる。
可撓性シート状部材１１は多孔質であってもよいし無孔質であってもよいが、多孔質である場合には、可撓性シート状部材１１の表面積が増加するので、可撓性シート状部材１１の表面により多くのプローブを固定することができる。
可撓性シート状部材１１の材質は透明又は半透明である（光透過性を有する）ことが好ましい。これにより標的物質に結合している標識物質をプローブアレイ１ａの外部にて検出することができるので、プローブアレイ１ａを切り開くことなく標的物質を検出することができる。
可撓性シート状部材１１は、例えば、上記熱可塑性樹脂からなるシート又はそれらの積層シートであり、その厚みは例えば１０〜２００μｍであるが、可撓性が保持される範囲内において適宜変更が可能である。
可撓性シート状部材１１のプローブ固定化面１１０には、図１及び図２に示すように、プローブ群Ｐ１〜Ｐｎ（ｎは１以上の整数、好ましくは２以上の整数である）がそれぞれ筋状又はスポット状に固定されており、各プローブ群に含まれるプローブの種類は、各プローブ群の固定位置に基づいて識別できるようになっている。各プローブ群は、プローブの種類と位置とが対応付けられる限りいかなる形態で固定されていてもよい。また、各プローブ群の配置、スポットの大きさ等は適宜変更が可能である。
プローブ群Ｐ１〜Ｐｎにおいて、１つのプローブ群には同一種類のプローブが複数含まれている。各プローブ群に含まれるプローブは、例えば、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質である。異なるプローブ群に含まれるプローブの種類は同一種類であってもよいし異なる種類であってもよいが、プローブ群全体で複数種類のプローブが含まれることが好ましい。プローブ固定化面１１０に複数種類のプローブが固定されていることにより、複数種類の標的物質を同時に並列して検出することができる。
プローブ群Ｐ１〜Ｐｎは、例えば、静電結合、共有結合、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−低分子相互作用等を利用して可撓性シート状部材１１の表面に固定することができ、このような固定化が可能となるように、公知の技術を用いて可撓性シート状部材１１の表面又はプローブに適当な化学修飾を施すことができる。
静電結合を利用する場合には、例えば、可撓性シート状部材１１の表面をポリカチオン性物質でコーティングする。「カチオン性物質」とは、分子中にカチオン性基を有する物質を意味し、カチオン性物質は静電的相互作用により核酸と複合体を形成することができる。カチオン性基としては、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられ、カチオン性物質としては、例えば、カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体；ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー等が挙げられる。
共有結合を利用する場合には、例えば、可撓性シート状部材１１の表面又はプローブに存在する官能基を利用して共有結合を形成させる。共有結合を形成し得る官能基の具体例として、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。可撓性シート状部材１１の表面にカルボキシル基が存在する場合には、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、プローブに存在するアミノ基と反応させることにより、可撓性シート状部材１１とプローブとをアミド結合させることができる。また、可撓性シート状部材１１の表面にアミノ基が存在する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、プローブに存在するアミノ基と反応させることにより、可撓性シート状部材１１とプローブとをアミド結合させることができる。
この他、ストレプトアビジン又はアビジン／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用して、プローブを可撓性シート状部材１１に固定することができる。
可撓性シート状部材１１は、例えば、接着剤を利用して円筒状に成形することができる。
接着剤としては、例えば、アクリル系、ポリエステル系、ウレタン系、ゴム系、シリコーン系等の粘着剤を利用することができる。アクリル系粘着剤としては、例えば、（メタ）アクリル酸ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸２−ジエチルブチル、（メタ）アクリル酸イソオクチル、（メタ）アクリル酸２−メトキシエチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸デシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸トリデシル等の（メタ）アクリル酸エステルの一種又は二種以上と、それら（メタ）アクリル酸エステルと共重合可能な（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、メタクリル酸メチルアミノエチル、（メタ）アクリル酸メトキシエチル等の官能性モノマーとの共重合物を利用することができ、ゴム系粘着剤としては、例えば、スチレン−イソプレン−スチレンブロック共重合体ゴム、スチレン−ブタジエンゴム、ポリブテンゴム、ブチルゴム等の合成ゴムや天然ゴムを主成分とするものを利用することができ、ビニルエーテル系粘着剤としては、例えば、エチルビニルエーテル、プロピルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、２−エチルヘキシルビニルエーテル等を利用することができ、シリコーン系粘着剤としては、例えば、ジメチルシロキサンガムとジメチルシロキサンレジンとの混合物及び／又は重合物により構成されるものを利用することができる。粘着剤型は溶剤型及びエマルジョン型のいずれであってもよい。その他、エポキシ系、ウレタン系、シアノアクリレート系等の接着剤を利用することもできる。
可撓性シート状部材１１が熱融着性の材質（例えば熱可塑性樹脂）からなる場合には、適当な加熱、加圧、時間等の条件下で処理することにより、接着剤を利用することなく、熱融着により円筒状に成形することができる。
こうして製造されるプローブアレイ１ａは、可撓性シート状部材１１が円筒状に成形されてなるプローブアレイであり、その中空部にはプローブ群Ｐ１〜Ｐｎが配列している。
プローブアレイ１ａの長さは例えば１〜３０ｃｍであり、内径は例えば１ｍｍ〜１ｃｍであるが、適宜変更が可能である。
本実施形態において、例えば、次のような変更が可能である。
可撓性シート状部材１１は、プローブ固定化面１１０が内周面を構成する限り、円筒状以外の筒状（例えば角筒状）に成形してもよい。
可撓性シート状部材１１の代わりに、プローブ群Ｐ１〜Ｐｎが順次固定された可撓性シート状部材１１’（図５参照）を使用してもよい。この場合、図５に示すように、可撓性シート状部材１１’を円筒状に成形した後、プローブ群Ｐ１〜Ｐｎが含まれるように成形体を切断することにより、プローブアレイ１ａを製造することができる。
プローブアレイ１ａを利用した標的物質の検出は、例えば、次のようにして行うことができる。
第１工程：標識物質が結合した標的物質を含有する液体試料をプローブアレイ１ａの中空部に流入させ、標的物質とプローブ群Ｐ１〜Ｐｎとを接触させる。
標的物質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、核酸、タンパク質、抗原、抗体、酵素、糖鎖等の生体物質が挙げられ、プローブ及び標的物質の組み合わせとしては、例えば、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原等が挙げられる。なお、核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。
標識物質としては、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン等の蛍光物質、；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステルの化学発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光物質等が挙げられる。液体試料の溶媒は、例えば、水、緩衝液、有機溶媒であり、標的物質の種類に応じて適宜選択することができる。液体試料は、例えば、毛細管現象、シリンジ等を利用してプローブアレイ１ａの中空部に流入させることができる。
第２工程：プローブアレイ１ａの中空部から液体試料を流出させた後、プローブアレイ１ａの中空部に対して洗浄液を流入及び流出させ、プローブアレイ１ａの中空部を洗浄する。これにより、プローブ群Ｐ１〜Ｐｎと反応した標的物質以外の物質を除去することができる。
第３工程：標的物質に結合している標識物質を検出する。
標識物質が蛍光物質である場合、プローブ固定化面１１０に励起光を照射し、プローブ固定化面１１０から発せられる蛍光を蛍光検出器で検出することによって、標的物質を検出することができる。プローブ固定化面１１０への励起光の照射及びプローブ固定化面１１０から発せられる蛍光の検出は、プローブアレイ１ａを切り開いた後に行うことができる。また、プローブアレイ１ａが透明又は半透明であり、かつ蛍光検出波長において蛍光を発しない場合には、プローブアレイ１ａを切り開くことなく行うことができる。
標識物質が酵素である場合には酵素呈色反応により標的物質を検出することができる。酵素呈色反応後の呈色の検出は、プローブアレイ１ａを切り開いた後に行うことができる。また、プローブアレイ１ａが透明又は半透明である場合（光透過性を有する場合）には、プローブアレイ１ａを切り開くことなく行うことができる。
〔第二実施形態〕
第二実施形態に係る製造方法は、プローブアレイ１ｂ（図４参照）の製造方法であって、プローブ固定化面１１０を有する可撓性シート状部材１１（図１及び図２参照）を、プローブ固定化面１１０が円筒状部材１２の中空部に露出するように、円筒状部材１２の内周面に密着させる工程を含む。
本実施形態で使用する可撓性シート状部材１１は第一実施形態と同様である。
円筒状部材１２の材質は、液体試料に不溶性である材質である限り特に限定されるものではなく、例えば、上記熱可塑性樹脂等のプラスチック；鉄、銅、アルミニウム等の金属；ガラス；セラミックス；これらの複合材料等が挙げられる。
円筒状部材１２の長さは例えば１〜３０ｃｍであり、内径は例えば１ｍｍ〜１ｃｍであるが、適宜変更が可能である。
可撓性シート状部材１１は、例えば接着剤等を利用して円筒状部材１２の内周面に密着させることができるが、その可撓性によって接着剤等を使用しなくても円筒状部材１２の内周面に密着させることができる。
こうして製造されるプローブアレイ１ｂは、可撓性シート状部材１１がＣ字状に変形した状態で円筒状部材１２の内周面に密着してなるプローブアレイであり、その中空部にはプローブ群Ｐ１〜Ｐｎが配列している。
本実施形態において、例えば、次のような変更が可能である。
円筒状部材１２の代わりに、円筒状以外の筒状（例えば角筒状等）の部材を使用してもよい。
可撓性シート状部材１１は、円筒状に変形させた状態で円筒状部材１２の内周面と密着させてもよい。
プローブアレイ１ｂを利用した標的物質の検出は、プローブアレイ１ａと同様にして行うことができる。標的物質に結合している標識物質の検出は、可撓性シート状部材１１を円筒状部材１２から取り出した後に行うことができる。また、可撓性シート状部材１１及び筒状部材１２が透明又は半透明である場合（光透過性を有する場合）には、可撓性シート状部材１１を筒状部材１２から取り出すことなく、標的物質に結合している標識物質を検出することができる。
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。
（１）プラスチックフィルム上へのプローブＤＮＡの固定
厚さ５０μｍのポリエチレンテレフタレートフィルム（以下「ＰＥＴフィルム」という。）を３ｃｍ×１ｃｍの大きさに切断し、ポリＬ−リジン溶液（濃度：０．０１％、溶媒：０．１×ＰＢＳ）に浸して、１時間振盪した。次いで、超純水中で４回激しく洗浄し、余分なポリＬ−リジンを洗い流した。次いで、バキュームオーブンによりＰＥＴフィルムを６０℃で４時間乾燥させ、ポリＬ−リジンをＰＥＴフィルムに密着させた。
ポリＬ−リジンでコーティングしたＰＥＴフィルムに、ポジティブコントロール用プローブＤＮＡ及びネガティブコントロール用プローブＤＮＡ（濃度：１００ｐｍｏｌ／μＬ、溶媒：超純水）を各１０μＬずつスポッティングした。スポッティングは１点ずつ１ｃｍの間隔で２列にして行った。なお、ポジティブコントロール用プローブＤＮＡとしては２００〜５００ｍｅｒのポリ（ｄＡ）を使用し、ネガティブコントロール用プローブＤＮＡとしては２００〜５００ｍｅｒのポリ（ｄＴ）を使用した。次いで、スポッティング液を乾燥させ、ＵＶクロスリンカーにより紫外線を６００ｍＪ照射した。次いで、フィルム表面をブロッキングするために、フィルムをブロッキング溶液（１−メチル−２−ピロリドン ９５．７ｍＬ、無水コハク酸 １．６ｇ、１Ｍ ホウ酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０） ４．３ｍＬ）に浸漬して２０分間振盪させた後、９５℃の超純水ですすぎ、９５％エタノールに浸漬して１〜２分間振盪させた後、乾燥させた。
（２）プラスチックキャピラリーの作製
上記（１）で作製したプローブＤＮＡ固定化ＰＥＴフィルムを、プローブＤＮＡ固定化面が内周面を構成するように筒状に丸め、内径３ｍｍ、長さ３ｃｍで厚み１００μｍのＰＥＴ製透明プラスチック筒に挿入した。
（３）ハイブリダイゼーション
上記（２）で作製したプラスチックキャピラリーの中空部に、標的オリゴヌクレオチドを含むハイブリダイゼーション溶液（標的オリゴヌクレオチド濃度：１ｐｍｏｌ／μＬ、イーストｔＲＮＡ濃度：１μｇ／μＬ、溶媒：０．２％ＳＤＳ含有３×ＳＳＣ）１００μＬを吸い上げ、プラスチックキャピラリーの両端をパラフィルムで閉じて４０℃の恒温槽内で一晩加温した。なお、標的オリゴヌクレオチドとしては５’末端にビオチンを結合させた２２ｍｅｒのポリ（ｄＴ）を使用した。
（４）ポストハイブリダイゼーション洗浄
恒温槽からプラスチックキャピラリーを取り出し、ハイブリダイゼーション溶液を排出した後、非特異的に吸着した標的オリゴヌクレオチドを洗い流すために、プラスチックキャピラリーの中空部を洗浄バッファー１（２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で満たして１０秒間放置した。洗浄バッファー１を排出した後、洗浄バッファー２（１×ＳＳＣ）を満たして１０秒間放置し排出する操作を３回繰り返した。次いで、洗浄バッファー３（０．２×ＳＳＣ）についても洗浄バッファー２と同様の操作を行った。
（５）ブロッキング及び標的オリゴヌクレオチドの検出
プラスチックキャピラリーの中空部をブロッキング溶液（１％カゼイン、３×ＳＳＣ）で満たし、室温で３０分間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を排出した後、ストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体溶液（原液を０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、１％ カゼイン溶液で２０００倍に希釈したもの）を満たし、室温で３０分間反応させた。ストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体溶液を排出した後、緩衝液Ａ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を満たし、５分間放置した後、排出した。これを２回繰り返し、標的オリゴヌクレオチドに結合しているビオチンに結合しなかったストレプトアビジン／アルカリフォスファターゼ複合体を除去した。次いで、緩衝液Ｂ（０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））を満たして１０秒間放置した後、排出した。最後に基質溶液（緩衝液Ｂ １０ｍＬ、ＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート）溶液９μＬ、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）溶液１８μＬ）を満たし、室温で３時間放置し、発色反応を行った。
その結果、標的オリゴヌクレオチドと相補的であるポジティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した部分には明瞭なシグナルが現れたが、標的オリゴヌクレオチドと相補的でないネガティブコントロール用プローブＤＮＡを固定化した部分にはシグナルが全く現れなかった。
プローブ固定化面を有する可撓性シート状部材の斜視図である。 プローブ固定化面を有する可撓性シート状部材の斜視図である。 第一実施形態に係る製造方法により製造されるプローブアレイの斜視図である。 第二実施形態に係る製造方法により製造されるプローブアレイの斜視図である。 第一実施形態に係る製造方法の変更例を示す斜視図である。
符号の説明
１ａ，１ｂ・・・プローブアレイ
１１・・・可撓性シート状部材
１１０・・・プローブ固定化面
Ｐ１〜Ｐｎ・・・プローブ群
１２・・・円筒状部材

Claims (2)

  1. 筒状部材と前記筒状部材の中空部に配列したプローブとを備えたプローブアレイの製造方法であって、
    プローブ固定化面を有する可撓性シート状部材を、前記プローブ固定化面が内周面を構成するように筒状に成形する工程を含む前記製造方法。
  2. 筒状部材と前記筒状部材の中空部に配列したプローブとを備えたプローブアレイの製造方法であって、
    プローブ固定化面を有する可撓性シート状部材を、前記プローブ固定化面が前記筒状部材の中空部に露出するように、前記筒状部材の内周面に密着させる工程を含む前記製造方法。
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