MXPA01007638A

MXPA01007638A - Configuracion replicable de sonda.

Info

Publication number: MXPA01007638A
Application number: MXPA01007638A
Authority: MX
Inventors: Melvin J Swanson
Original assignee: Surmodics Inc
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2002-03-14
Also published as: US20030170914A1; EP1147222A1; EP1147222B1; AU2737800A; AU776309B2; DE60031953D1; ATE346166T1; CA2361163A1; WO2000044939A1; JP2002535013A; US6514768B1

Abstract

Se describe un sistema para producir configuraciones de sonda (por ejemplo, acido nucleico) de ligandos especificos de enlace sustancialmente identicos, por ejemplo, al replicar y preparar una configuracion maestra original y/o al suministrar una configuracion de ensayo re-utilizable que es capaz de regenerarse. En una modalidad, el sistema incluye la preparacion y el uso de a una superficie de configuracion maestra que tiene secuencias de direccion inmovilizadas en forma de una configuracion de patron y opcionalmente, aleatoria, b) un conjugado multi-ligando que tienen un dominio de enlace complementario a una secuencia de direccion, un dominio de enlace complementario a la secuencia objetivo, y un tercer ligando para usarse en la formacion de los conjugados (por ejemplo, por enlace o polimerizacion) dentro o sobre la superficie de la configuracion de ensayo, la cual se puede usar con o sobre la disasociacion de la direccion y sus secuencias complementarias.

Description

CONFIGURACIÓN REPLICABLE DE SONDA Campo de la Invención La presente invención se refiere a la inmovilización de ligandos específicos de enlace tales como ácidos nucleicos y otros ligandos, en una disposición espacial conocida. En otro aspecto, la invención se refiere a soportes sólidos tales como microplaquetas de oligonucieót idos que incorporan tales ácidos nucleicos. Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a grupos fotoreact ivos , a moléculas y/o superficies derivadas con tales grupos y a la colocación de tales moléculas a las superficies de soporte por la activación de tales grupos. Antecedentes de la Invención El desarrollo de configuraciones de sonda de oligonucleótidos, mas comúnmente conocidos como "microplaquetas de ADN" y "GENE CHIP" (una marca registrada de Affymetrix, Inc.), ha hecho avances significativos en los últimos años y se han vuelto el centro de una atención cada vez mas creciente y de mayor importancia. Ver por ejemplo, Stipp, D., Fortune, p.56, Marzo 31, 1997. Ver también Borman, S., C&EN, p.42, Diciembre 9, 1996. Y Travis, J., Science News 151:144-145 (1997) . Estas Ref: 131747 microplaquetas cuadradas de 2 o 3 centímetros son capaces de contener decenas de miles hasta cientos de miles de oligonucleótidos inmovilizados, permitiendo a los investigadores testificar por primera vez el comportamiento de miles de genes que actúan en conjunto. Las microplaquetas de ADN, son útiles para observar patrones únicos de expresión de genes, midiendo el éxito con el tratamiento por medicamentos, ajustando las medicinas a los pacientes con base en su contribución genética, formación de secuencia de genes y llevando a cabo investigaciones en el área de la medicina genética. Ver también, "Microchip Arrays Put DNA on the Spot", R. Service, Science 282 (5388) : 396-399, 16 Octubre 1998; y "Fomenting a Revolution, in Miniature" , I. Amato, Science 282 (5388) : 402-405, 16 October 1998. Típicamente, las configuraciones de sonda de oligonucleótidos despliegan secuencias específicas de oligonucleótidos en ubicaciones precisas en un formato rico en información. Durante el uso, el patrón de hibridación de un objetivo de ácido nucleico etiquetado fluorescentemente, se usa para obtener información primaria de la estructura para el objetivo. Este formato se puede aplicar a un amplio rango de problemas de análisis de secuencia de ácidos nucleicos, incluyendo la identificación de patójenos, aplicaciones forenses, observación de la expresión del mARN y formación de secuencias de n ovo . Ver por ejemplo, Lipshutz, R.J., et al., BioTechniques 19 ( 3 ) : 442 - 7 (1995) . Tales configuraciones necesitan algunas veces llevar varias decenas de miles, o aún cientos de miles de sondas individuales. Las microplaquetas también necesitan suministrar un alto rango de sensibilidades con objeto de detectar las secuencias que se pueden expresar en niveles entre 1 a 10 000 copias por célula. Se han desarrollado una diversidad de enfoques para la fabricación y/o uso de las configuraciones de sonda de oligonucleótidos. Ver por ejemplo, Weaver, et al. (WO 92/10092) que describe una estrategia sintética para la creación de diversidad química a gran escala sobre un soporte de fase sólida. El sistema emplea química de fase sólida, grupos protectores fotolábiles y fotolitografía para alcanzar una síntesis química paralela espacialmente dirigible, dirigida por luz. Al usar la secuencia adecuada de máscaras y reacciones químicas por etapas, se puede construir un conjunto definido de oligonucleótidos cada uno en una posición predefinida sobre la superficie de la configuración. Usando esta tecnología, Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) , ha desarrollado colecciones de oligonucleótidos de hebra doble unimoleculares sobre un soporte sólido. Ver por ejemplo la patente U.S. No. 5,770,722 que describe configuraciones que contienen oligonucleótidos desde 4 hasta 100 nucleótidos de longitud. Las configuraciones comprenden un soporte sólido, un espaciador opcional, un primer oligonucleótido, un segundo oligonucleótido que es complementario al primero, y un ligador o sonda flexible. Las colecciones descritas son útiles para el tamizado de tales receptores como proteínas, ARN u otras moléculas que se enlazan al ADN de doble hebra. Otra configuración desarrollada por Affymetrix se describe en la patente U.S. No .5 , 837 , 832. Esta referencia describe métodos para elaborar configuraciones de alta densidad de sondas de oligonucleótidos sobre microplaquetas de sílice. Las sondas de oligonucleótidos tienen de 9 a 20 nucleótidos de longitud y se sintetizan directamente sobre un soporte sólido. Las configuraciones comprenden sondas de oligonucleótidos que son complementarias a una sección de la secuencia de referencia. Synteni (Palo Alto CA) produce configuraciones de cADN al aplicar polilisina a placas de vidrio, seguido por la impresión de cADN encima de las placas recubiertas. Las configuraciones se exponen después a la luz ultravioleta con objeto de reticular el ADN con la polilisina. La polilisina que no reaccionó se bloquea después por reacción con anhídridos succínicos. Estas configuraciones, denominadas "microconfiguraciones de expresión de genes" (GEM™) se usan por etiquetado de mARN preparado a partir de una célula normal con un colorante fluorescente, etiquetando después el mARN de una célula anormal con un colorante fluorescente de un color diferente. Estas dos moléculas etiquetadas de mARN se aplican simultáneamente a la microconfiguración , en donde se enlazan competitivamente a las moléculas inmovilizadas de cADN . Esta técnica de codificación de dos colores se usa para identificar las diferencias en la expresión de genes entre dos muestras de células. (Heller, R.A., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94:2150-2155 (1997) ) . Al menos un grupo, Cantor y colaboradores (US patente No .5 , 795 , 714 ) , describen métodos para replicar configuraciones de sondas que se dice que son útiles para la fabricación a gran escala de ayudas de diagnóstico. La patente incluye un método para replicar una configuración de sondas de hebras simples sobre un soporte sólido que comprende las etapas de: a) sintetizar una configuración de ácido nucleico, cada una comprende una secuencia no variante de longitud C en la terminación 3' y una secuencia variable de longitud R en la terminación 5 ' ; b) fija.: la configuración a un primer soporte sol ido ; c) sintetizar un conjunto de ácidos nucleicos que comprende cada uno una secuencia complementaria a la secuencia no variante; d) hibridizar los ácidos nucleicos del conjunto a la configuración; e) extender enzimáticamente los ácidos nucleicos del conjunto usando las secuencias variables de la configur ción como plantillas; f) desnaturalizar el conjunto de ácidos nucleicos extendidos; y g) fijar los ácidos nucleicos desnaturalizados del conjunto a un segundo soporte sólido para crear la configuración replicada de sondas de hebra simple. En un asunto separado, el cesionario de la presente invención ha descrito previamente una diversidad de aplicaciones para el uso de la fotoquímica y en particular de grupos fotoreac ivos por ejemplo, para colocar polímeros y otras moléculas a superficies de soporte. Ver por ejemplo las patentes americanas No. 4,722,906, 4,979,959, 5,217,492, 5,512,329, 5,563,056, 5,637,460, y 5,714,360 y la solicitud internacional de patente No . PCT/US 96/ 08797 (Virus Inactivating Coatings), PCT/US 96/ 07695 (Capillary Endothelialization) , y PCT/US 97 / 05344 (Chain Transfer Agents) . A pesar de los diversos desarrollos a la fecha, permanece la necesidad de métodos y reactivos que mejoren la inmovilización de ácidos nucleicos sobre una variedad de materiales de soporte, por ejemplo, para formar configuraciones de sonda de oligonucleótidos. Lo que se necesita claramente son métodos y reactivos nuevos y ^^¿¿l¡í¿¿j?¡^^^^^^^^m^^^^^^^^^^^^^^^m¡^^^^^^^^^^^^í^lt-tl^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ mejorados para preparar de forma reproducible configuraciones de ligandos específicos de enlace (por ejemplo ácido nucleico) en una forma eficiente y efectiva en costo mientras se mantiene un producto sensible y preciso. Breve Descripción de la Invención La presente invención en una modalidad preferida, suministra un sistema para producir configuraciones de sonda de ligandos específicos de enlace sustancialmente idénticos (por ejemplo ácidos nucleicos) por ejemplo, al preparar y replicar una configuración "maestra" original y/o al suministrar una configuración de ensayo reutilizable que es capaz de regenerarse. El enfoque actual se puede contrastar con el enfoque tradicional de preparar separada e individualmente cada configuración de sonda nuevamente, sin la eficiencia de replicar una configuración maestra o la posibilidad de regenerar una configuración para un uso posterior. El método actual se puede adaptar para su uso con configuraciones convencionales con objeto de suministrar replicados de las mismas, pero se usa preferiblemente con una configuración maestra (y tfjttla»aHJJaaaa*Eaaa^J^J«ri_Btfaa^^^^^^^^^¿^^^_^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^aa^^^_^^^^^_^^^ otros componentes) diseñados específicamente para tales propósitos en la forma aquí descrita. En tal modalidad preferida, la presente invención proporciona un método y sistema para preparar de forma reproducible una configuración de ensayo, el sistema comprende: a) una configuración maestra que comprende una superficie de soporte que tiene una pluralidad de ligandos "de dirección" (por ejemplo secuencias de oligonuc Leót idos ) inmovilizados en la misma por ejemplo, directamente o por medio de los agentes respectivos de enlace tales como "micro-perlas" u otros ligadores apropiados, los ligadores se inmovilizan en forma de una configuración con un patrón y opcionalmente aleatoria; b) una pluralidad de conjugados multiligando, cada conjugado multiligando comprende un núcleo (por ejemplo sólido o molecular) que tiene (preferiblemente de forma independiente) colocado al mismo: (i) al menos una molécula de un primer dominio de enlace de ligandos (por ejemplo oligonucleótidos) que comprende un ligando seleccionado para enlazarse de una forma complementaria a un ligando de dirección particular de la configuración maestra, (ii) al menos una molécula de un segundo dominio de enlace de ligando (por ejemplo oligonucleótido), que comprende un ligando seleccionado para enlazarse de una manera complementaria al ligando característico de una secuencia objetivo de ácido nucleico (por ejemplo, un gen y/o un fragmento de gen), y (iii) al menos una molécula de un tercer ligando (y preferiblemente no oligonucleótido) seleccionado del grupo que consiste de ligandos de enlace y grupos polimerizables (por ejemplo grupos acrílico o vinilo) y c) un soporte de la configuración de ensayo, que comprende una superficie de soporte para la configuración replicada, por ejemplo, recubierta con los sitios de colocación para el tercer ligando (tales como moléculas inmovilizadas de un patrón correspondiente de enlace específico para el tercer ligando) . Un método preferido correspondiente de la invención, en donde los ligandos de dirección y objetivos son ambos ácidos nucleicos, preferiblemente oligonucleótidos, involucra las etapas de: (1) suministrar una configuración maestra como se describió arriba, (2) colocar los conjugados multiligando a la misma, al permitir que se hibridicen sus dominios de enlace respectivos de oligonucleótidos a las secuencias complementarias de dirección de la configuración maestra, (3) traer el soporte de la configuración de ensayo a una proximidad suficiente con la configuración maestra bajo condiciones apropiadas que permitan que los conjugados multiligando colocados se coloquen al soporte de la configuración de ensayo (por ejemplo al enlazar entre los terceros ligandos y los sitios correspondientes de colocación presentes en la superficie de soporte del ensayo), y (4) desasociar los oligonucleótidos hibridizados complementarios bajo condiciones apropiadas que permitan que se recupere y use el soporte de la configuración de ensayo. La configuración de ensayo resultante comprende un soporte de la configuración de ensayo que tiene colocadas al mismo una pluralidad de conjugados multiligando (preferiblemente que tienen todavía oligonucleótidos objetivo complementarios sobre el mismo) presentes en un patrón establecido por la configuración maestro. En una modalidad alternativa preferida, en donde el conjugado incluye un grupo polimerizable (por ejemplo además del tercer ligando de enlace o en lugar del tercer ligando de enlace) se pueden mantener los conjugados multiligando en sus posiciones orientadas sobre la superficie de la configuración maestra al polimerizar esos grupos i n s i t u , con objeto de formar un respaldo polimérico suficiente para permitir que la capa polimerizada resultante se soporte y use por ejemplo, transferida a un soporte de la configuración de ensayo mientras retiene la distribución espacial establecida por las direcciones de la configuración maestra. Una vez transferido a un soporte de la configuración de ensayo, los segundos dominios de enlace ele oligonucleótidos a su vez, se pueden usar de una forma convencional para determinar la presencia (por ejemplo en cantidades absolutas o relativas) de uno o más ácidos nucleicos objetivo en una muestra. El orden o distribución de los segundos dominios de enlace se predeterminan y mantiene en el curso del método replicante aquí establecido. Por ejemplo, se puede usar la configuración de ensayo resultante de una forma convencional esto es, al hacer contacto la configuración con una muestra que pudiera contener el ácido nucleico objetivo bajo condiciones apropiadas para permitir que se hibridice y detecte cualquier ácido nucleico objetivo. En otros aspectos, la invención suministra un método 5 para usar dicho sistema, los diversos componentes para el uso en tal sistema incluyendo un estuche o combinación de uno o mas componentes, así como una configuración de ensayo formada por el método de la invención. 10 Descripción Detallada de la Invención La presente invención suministra un método y sistema para preparar de forma reproducible una configuración de un ligando específico de enlace tal como una configuración de ácido nucleico. Como se usa aquí, los "ácidos nucleicos" incluyen moléculas poliméricas tales como un ácido desoxiri oonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN), ácidos nucleicos de péptidos (ANP) o cualquier secuencia de lo que se refiere comúnmente como bases unidas por una columna química que tiene la capacidad de formar pares base o hibridizarse con una estructura química complementaria. Los ácidos nucleicos se pueden suministrar en una forma apropiada por ejemplo aislados de fuentes naturales, producidos de forma ?i?imm t?i^ recombinante o sintetizados artificialmente. La palabra "oligonucleótido" a su vez, se usará intercambiablemente con él término "ácido nucleico" para referirse generalmente a secuencias de ácido nucleico de cadena corta (por ejemplo menores de alrededor de 100 nucleótidos de longitud y típicamente de 20 a 50 nucleótidos de longitud), por ejemplo, como se preparan utilizando técnicas sintéticas disponibles actualmente en el arte, tales como síntesis de ácido nucleico en soporte sólido. Ya que la invención se describirá con referencia particular a los ácidos nucleicos (y su capacidad para "enlazar" específicamente por medio de hibridación), se entiende que la invención tiene aplicabilidad a otros ligandos específicos de enlace también, tales como pares de enlace inmunológicos u otros pares de enlace ligando/ ntiligando. En una modalidad, la presente invención proporciona una configuración maestra que tiene inmovilizado en la misma una pluralidad de oligonucleótidos de dirección, el patrón de los cuales se puede controlar y/o determinar por cualquier medio apropiado. De allí en adelante, una composición que comprende una pluralidad de conjugados multiligando se traslada a una proximidad de enlaces con la configuración maestra, bajo condiciones apropiadas para permitir un primer dominio de enlace (por ejemplo oligonucleótido) del conjugado multiligando que se enlace (por ejemplo hibridizar) con los oligonucleótidos de dirección complementarios sobre el soporte de la configuración maestra. En una modalidad particularmente preferida, el tercer ligando se suministra en forma de un ligando de enlaces (por ejemplo biotina). La configuración maestra y el conjugado multiligando se pueden preparar y combinar de una forma substancialmente descrita arriba, con el tercer ligando de enlaces sirviendo entonces a la transferencia del complejo de conjugados resultante al soporte de la configuración de ensayo. La configuración maestra, que contiene moléculas conjugadas enlazadas se puede trasladar a una proximidad de enlace con el soporte de la configuración de ensayo. El soporte de la configuración de ensayo a su vez, soporta sitios de distribución (por ejemplo moléculas asociadas de enlace) adaptadas para enlazarse (por ejemplo de forma no covalente) con el tercer -i- — ligando de enlace del conjugado multiligando. El soporte de la configuración de ensayo se puede trasladar a una proximidad de enlace bajo condiciones apropiadas que permitan a las moléculas asociadas de enlace del soporte de la configuración de ensayo enlazarse a los ligandos correspondientes de enlace sobre el conjugado multiligando, formando así una estructura transitoria "intercalada" en forma de la configuración maestro-conjugado mult iligando-soporte de la configuración de ensayo. En una modalidad opcional preferida, el conjugado multiligando de la presente invención comprende además un grupo polimerizable (por ejemplo un grupo acrílico o vinilo) . En esta modalidad, una vez que los oligonucleótidos de dirección de la configuración maestra han sido hibridizados cada uno con sus dominios respectivos de primer enlace de los conjugados multiligando, se puede hacer reaccionar el grupo polimerizable utilizando reactivos y condiciones dentro del conocimiento de aquellos en el arte, para permitir la formación de una película de polímero. Los grupos polimerizables se copolimeri zan dentro de un respaldo de película mientras que mantienen substancialmente sus posiciones respectivas. La película se puede usar como es, o estabilizarse opcionalmente (por ejemplo gelificarse, laminarse con otra capa, o solidificarse de otra manera) de manera que sea suficientemente estable (por ejemplo autosoportable) para mantener las ubicaciones definidas espacialmente de cada "dirección". Simultáneamente o de allí en adelante, este soporte polimérico se puede transferir a, o incorporarse de otra manera dentro de, una superficie de la configuración de ensayo de una forma que mantiene la orientación deseada de los conjugados. Una vez que se ha formado la estructura "intercalada", se puede después desasociar el apareamiento base entre los oligonucleótidos de dirección (de la configuración maestra) y los oligonucíeót idos complementarios (del conjugado), con objeto de permitir a la configuración de ensayo que se elimine con los conjugados multiligando colocados a la misma. Los conjugados se colocan en una relación espacial que es suficientemente real con aquella establecida para su enlace inicial con la superficie maestra de la configuración, permitiendo con lo cual mantenerse y determinarse la ubicación de los ácidos nucleicos objetivo. La configuración maestra a su vez, se puede re-utilizar repetidamente y de una forma similar suministrar configuraciones de ensayo adicionales y substancialmente idénticas. En otro aspecto, la presente invención suministra una pluralidad de configuraciones de ensayo idénticas, por ejemplo formadas al replicar una configuración maestra común o al replicar secuencialmente una o más configuraciones de ensayo . Todavía en otro aspecto, la presente invención suministra un método y un sistema para preparar directamente configuraciones de ácidos nucleicos re-ut ili ables , sin necesidad de preparar primero o replicar una configuración maestra, por ejemplo, en donde la superficie de la configuración de ensayo se suministra en forma de una configuración de fibra óptica. En tal modalidad, cada una de las fibras se suministra con un ácido nucleico adaptado para hibridizar a su ácido nucleico complementario en una forma detectable. Las configuraciones apropiadas de fibra para su uso en tal modalidad se describen por ejemplo en (K. Michael et al), Analytical Chem. 70 ( 7 ) : 1242 ( 1998 ) .

Las configuraciones de ensayo de esta invención a su vez, se adaptan preferiblemente para detectar una amplia variedad de ácidos nucleicos en una muestra biológica. En el transcurso de su uso, una configuración de ensayo puede exponerse a una solución de prueba de la que se sospecha que contiene uno o más ácidos nucleicos objetivo (por ejemplo genes o fragmentos de genes), bajo condiciones apropiadas para permitir que los ácidos nucleicos objetivo se enlacen a través de hibridación a su complemento correspondiente del dominio de enlace de oligonucleótidos en la configuración de ensayo. La presencia o ausencia del ácido nucleico objetivo en la configuración de ensayo, se puede determinar con la generación de señal escogida y el sistema de detección. Un sistema de la presente invención suministra diversas ventajas sobre los métodos actuales incluyendo por ejemplo, una combinación óptima de propiedades tales como densidad de la sonda de ácidos nucleicos, facilidad de uso, reproduc ibilidad, y costo reducido. La presente invención puede por ejemplo, suministrar una densidad superior de sonda de ácidos nucleicos que los enfoques comerciales en los cuales se soporta actualmente la fotolitografía. Tal densidad de sonda se alcanza por ejemplo, con el uso de micro-perlas que son más pequeñas que la longitud de onda de los sistemas de luz de fotolitografía. Además, la presente invención puede suministrar una especificidad mejorada de ensayo, por ejemplo, por el uso de oligonucleótidos que son más extensos (y por lo tanto más específicos en cuanto a enlace) que aquellos actualmente disponibles a través de la síntesis fotolitográficas . Además, la configuración de ensayo actual se puede usar con lectores de configuración convencionales para suministrar una diversidad de capacidades de ácidos nucleicos objetivo, dependiendo por ejemplo de la densidad de área de la configuración inmovilizada. El sistema actual puede también suministrar una reducción importante en el costo de manufactura de las capas de configuración de alta densidad. El costo de preparación de la configuración maestra puede por si mismo reducirse por ejemplo, a través del uso de una deposición bajo patrón y la inmovilización de secuencias de dirección de oligonucleótidos, opcionalmente con el uso de micro-perlas.

En una modalidad preferida, el sistema emplea el uso de una configuración maestra dedicada que comprende una pluralidad de oligonucleótidos de dirección diferentes. La superficie de soporte de tal configuración se puede fabricar a partir de cualquier material apropiado para suministrar una combinación óptima de propiedades deseadas tales como estabilidad, dimensiones, forma y uniformidad de la superficie. Los oligonucleótidos de dirección se pueden colocar a la superficie de soporte directamente o por medio de enlazadores a la superficie (por ejemplo, al suministrar y/o derivar la superficie, el oligonucleótido o ambos, con grupos mutuamente reactivos) . En una modalidad particularmente preferida, la superficie de soporte de la configuración maestra se recubre con una pluralidad de micro-perlas de enlace que a su vez, tienen oligonucleótidos colocados a las mismas. Así, cuando se usan en combinación con micro-perlas de enlace, la superficie de soporte de la configuración maestra se suministra preferiblemente con uniformidad suficiente tal que las irregularidades topográficas son más pequeñas que el radio de la micro-perla de enlace (por ejemplo una rugosidad no mayor al 50% del diámetro de las micro-perlas de enlace de la configuración maestra ) . Una superficie de soporte de la configuración maestra de esta clase, se suministra preferiblemente en forma de un soporte sólido plano no poroso que tiene al menos una primera superficie. Se pueden colocar una pluralidad de oligonuc Leótidos diferentes a la primera superficie del soporte sólido a una densidad que supera 100 oligonucleótidos diferentes/cm2 , y preferiblemente excediendo 1000 oligonucleótidos diferentes /cm2 , en donde cada uno de los oligonucleótidos diferentes se coloca a la superficie del soporte sólido en una región diferente predefinida, tiene una secuencia diferente determinable y tiene al menos 4 nucleótidos de longitud y preferiblemente al menos 10 nucleótidos y más preferiblemente 30 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos se suministran en una longitud suficiente para suministrar diversidad apropiada de "dirección" en la configuración maestra, mientras que al mismo tiempo se evita la complementariedad substancial para secuencias objetivo de ácidos nucleicos (por ejemplo que se presentan naturalmente) a ser detectadas por la configuración de ensayo. En una modalidad preferida, la configuración maestra incluye al menos 1,000 y más preferiblemente al menos 10,000 oligonucleótidos de dirección diferentes colocados en la primera superficie del soporte sólido, cada una localizada (por ejemplo manchada) en una región predefinida separada físicamente de otras regiones. Dadas las preferencias por sitios múltiples de cada oligonuc Leót ido, el número total de sitios de oligonucleótidos en una configuración simple puede a menudo superar los 10,000. La configuración maestra se puede fabricar de cualquier material apropiado incluyendo por ejemplo, materiales orgánicos o inorgánicos biológicos o no biológicos. Por ejemplo, se puede fabricar la configuración maestra a partir de cualquier plástico o polímero apropiado, silicio, vidrio, cerámica o metal, y se puede suministrar en forma de un sólido, resina, gel, película rígida, o membrana flexible. Los polímeros apropiados incluyen poliestireno, poli ( alquil ) metacrilato, poli ( vinilbenzofenona ) y policarbonatos. Los materiales preferidos incluyen vidrios y silicio. En una modalidad particularmente preferida, la configuración maestra se suministra con dimensiones planas de entre alrededor de medio centímetro y alrededor de 7.5 cm en longitud, entre alrededor de medio cm y 7.5 cm y preferiblemente alrededor de 1 y 2 cm en ancho. Las configuraciones pueden ser también posicionadas simplemente o múltiplemente en otros soportes tales como placas de microscopio (por ejemplo que tienen dimensiones de alrededor de 7.5 cm por 2.5 cm) . La superficie de soporte de la configuración maestra, se puede también preparar por reactivos bi o polifuncionales fotoreact ivos que se distribuyen uniformemente en la superficie y posteriormente acoplar estos reactivos a la superficie. En una modalidad por ejemplo, una microplaqueta de silicio con uniformidad suficiente, se limpia y reacciona con un reactivo de organosiloxano fotoreact ivo . Este reactivo se puede preparar por ejemplo, al unir un reactivo comercial de organosiloxano (tal como aminopropildimetilmetoxi siloxano) con un fotoreactivo t ermoquímicamente reactivo tal como el cloruro ácido del ácido benzoilbenzoico. El reactivo de siloxano fotoreactivo resultante, puede después reaccionar con la superficie de óxido de silicio del soporte de la configuración maestra para suministrar una superficie uniforme, cebada con grupos fotoact ivables . Los grupos fotoreac t ivos sobre la superficie cebada resultante se pueden activar y usar para recubrir los oligonucleótidos, directa o indirectamente por medio de ligadores sobre la superficie. En una modalidad alternativa, se puede usar una solución concentrada o fundida de un reactivo que tiene grupos reactivos latentes (por ejemplo fotoreact ivos ) y grupos que atraen ligandos (por ejemplo catiónicos cargados) . Por ejemplo, un derivado de poliestireno que contiene uno o más de ambos tipos de grupos (por ejemplo derivados de tiocolina del ácido polivinilbenzoico ) se pueden depositar sobre la superficie de la configuración maestra para proporcionar una película reactiva de superficie para la inmovilización de los oligonucleótidos de dirección. La superficie de la configuración maestra se puede iluminar para generar una superficie uniforme fotoreact iva . Opcionalmente, se separa si se desea el grupo ligando-atractivo (por ejemplo catión/t iocolina ) .

Como se usa aquí, se usará el término "oligonucleótido de dirección" para referirse a secuencias de ácido nucleico que se seleccionan para ser no complementaria con secuencias de ácidos nucleicos objetivo presentes en una muestra biológica a ser probada. Como resultado, los oligonucleótidos de dirección se espera que no formen pares bases o se hibridicen de otra manera con cualesquiera ácidos nucleicos objetivo encontrados en una muestra de prueba biológica particular, con lo cual se evita o minimiza la posibilidad de respaldo o lectura falsas positivas. Preferiblemente, estos oligonucleótidos de dirección tienen entre 10 y 100 nucleótidos de longitud y más preferiblemente entre 20 y 50 nucleótidos de longitud. La deposición de los oligonucleótidos de dirección sobre la superficie de configuración maestra, se puede alcanzar en cualquier forma apropiada incluyendo por ejemplo, mediante la colocación directa o indirecta a través de un enlazador (por ejemplo una micro-perla enlazante) . Por ejemplo, si el oligonucleótido de dirección se enlaza a una micro-perla, que a su vez se enlaza a una con iguración maestra, se puede lograr la deposición por un método basado en gravedad en el cual la gravedad específica de las micro-perlas provoca que la micro-perla individual que lleva el oligonucleótido de dirección haga contacto con la superficie de la configuración maestra. Esta deposición forma un patrón ordenado pero aleatorio sobre la superficie de la configuración maestra. La superficie resultante puede después iluminarse bajo condiciones apropiadas para activar los grupos fotoreact ivos y provocar la formación de enlaces entre la micro-perla que lleva el oligonuc Leót ido de dirección y la superficie de soporte de la configuración maestra. En una modalidad particularmente preferida, los oligonucleótidos se inmovilizan sobre la superficie de la configuración maestra usando compuestos fotoact ivables para formar enlaces entre el oligonucleótido de dirección y la superficie de soporte de la configuración maestra. Estos compuestos fotoact ivables se pueden suministrar de cualquier forma apropiada por ejemplo, mediante la superficie de soporte de la configuración maestra o los oligonucleótidos de dirección por sí mismos. En una modalidad por ejemplo, la superficie de soporte de la _ - i r configuración maestra se recubre con un reactivo fotoreactivo (por ejemplo fotosiloxano ) con objeto de suministrar una superficie reactiva latente para la formación de enlaces con los oligonucleótidos de dirección. Posteriormente, una solución que contiene una pluralidad de oligonucleótidos de dirección se puede aplicar a la superficie de soporte de la configuración maestra. La configuración maestra se ilumina con luz ultravioleta de longitud de onda extensa o luz visible para fijar fotoquímicamente los oligonucleótidos de dirección sobre la superficie de soporte de la configuración maestra. En una modalidad alternativa, los oligonucleótidos de dirección son por sí mismos fotoreact ivos . Preferiblemente, los oligonucleótidos de dirección de la presente invención incluyen uno o más grupos colgantes reactivos latentes (preferiblemente fotoreact ivos ) que se colocan covalentemente directa o indirectamente a los mismos. Los grupos fotoreact ivos se definen aquí y los grupos preferidos son suficientemente estables para almacenarse bajo condiciones en las cuales retengan tales propiedades. Ver por ejemplo la patente U.S. No. 5,002,582, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia. Los grupos reactivos latentes se pueden escoger para que tengan respuesta a diferentes porciones del espectro electromagnético, siendo particularmente preferidos aquellos con respuesta a las porciones visibles y ultravioleta del espectro (referido aquí como "fotoreactivo"). Los grupos fotoreactivos responden a estímulos externos aplicados específicos para someterse a una generación activa de especies con el enlace covalente resultante para una estructura química adyacente por ejemplo, como se suministra por una molécula igual o diferente. Los grupos fotoreactivos son aquellos grupos de átomos en una molécula que retienen sus enlaces covalentes sin cambio bajo condiciones de almacenamiento, pero que mediante activación por una fuente externa de energía, forman enlaces covalentes con otras molécula s . Los grupos fotoreact ivos generan especies activas tales como radicales libres y particularmente nitrenos, carbenos y estados excitados de cetonas con la absorción de energía electromagnética. Los grupos fotoreact ivos se pueden escoger para responder a diversas porciones del espectro electromagnético, y se prefieren los grupos fotoreactivos que tienen respuesta a por ejemplo, las porciones ultravioleta y visible del espectro y se pueden referir aquí ocasionalmente como "grupos fotoquímicos" o "fotogrupo". Las aril cetonas fotoreactivas se prefieren tales como acetofenona, benzofenona, antraquinona, antrona y heterociclos como la antrona (esto es, análogos heterocíclicos de antrona tales como aquellos que tienen N, 0 o S en la posición 10) o sus derivados substituidos (por ejemplo substituidos en el anillo) . Ejemplos de las aril cetonas preferidas incluyen derivados heterocíclicos de la antrona incluyendo acridona, xantona y tioxantona y sus derivados substituidos en el anillo. Particularmente preferidas son las tioxantonas y sus derivados que tienen energías de excitación mayores a alrededor de 360 nm . Se prefieren los grupos funcionales de tales cetonas ya que son fácilmente capaces de someterse al ciclo activación/inactivación/reactivación aquí descrito. La benzofenona es una porción fotoreactiva particularmente preferida, ya que es capaz de la excitación fotoquímica con la formación inicial de un estado excitado de singlete que se somete a un intersistema que cruza al estado triplete. El estado excitado triplete se puede insertar dentro de los enlaces carbono-hidrógeno por abstracción de un átomo de hidrógeno (de una superficie de soporte por ejemplo), creando así un par radical. El colapso posterior del par radical conduce a la formación de un nuevo enlace carbono-carbono. Si no está disponible un enlace reactivo (por ejemplo carbono-hidrógeno) para enlazado, la excitación inducida por luz ultravioleta del grupo benzofenona es reversible y la molécula regresa a un nivel de energía de fase mínima con la eliminación de la fuente de energía. Las aril cetonas fotoact ivables tales como la benzofenona y la acetofenona son de importancia particular en cuanto a que estos grupos se someten a la reactivación múltiple en agua y suministran así una eficiencia de recubrimiento incrementada. Las azidas constituyen una clase preferida de grupos fotoreact ivos e incluyen arilazidas (C6RsN3) tal como la fenil azida y particularmente 4-fluoro 3-nitrofenil azida, acil azidas (-CO-N3) tal como la azida de benzoilo y la azida de p-met ilbenzoilo, azido formiatos (-0-CO-N3) tales como el etil azidoformiato , fenil azidoformiato , sulfonil azidas (-S02-N3) tales como la bencensulfonil azida, y fosforil azidas (R0)2P0N3 tales como la difenil fosforil azida y dietil fosforil azida. Los compuestos diazo constituyen otro tipo de grupos fotoreact ivos e incluyen diazoalcanos (-CHN2) tal como el diazometano y difenildiazometano, diazocetonas (-C0-CHN2) tal como la diazoacetofenona y l-t r i fluoromet il 1-diazo 2-pentanona, diazoacetatos (-0-CO-CHN2) tal como el t-butil diazoacetato y fenil diazoacetato, y beta-ceto-alfa-diazoacetato ( -Co-CN2-CO-0- ) tal como el alfa diazoacetoacetato de t-butilo. Otros grupos fotoreact ivos incluyen las diazirinas (-CHN2) tal como la 3-tri fluoromet il 3-fenildiazirina , y cetenas (-CH=C=0) tal como la cetena y la difenilcet ena . Con la activación de los grupos fotoreact ivos , las moléculas reactivas se enlazan de forma covalente una con la otra y/o a la superficie del material por enlaces covalentes a través de residuos de los grupos fotoreact ivos . Los grupos fotoreac ivos ejemplares y sus residuos con la activación se muestran como siguen.

Los ácidos nucleicos fotoactivables de la invención, se pueden aplicar a cualquier superficie que tenga enlaces carbono-hidrógeno, con las cuales los grupos fotoreactivos pueden reaccionar para inmovilizar los ácidos nucleicos a la superficie. Ejemplos de los substratos apropiados incluyen pero no se limitan a polipropilenos, poliestirenos, policloruro de vinilo, policarbonato, poli (metil metacrilato), parileno y cualquiera de los numerosos organosilanos usados para pretratar vidrio u otras superficies inorgánicas. Los ácidos nucleicos fotoact i ables se pueden imprimir sobre superficies en las configuraciones, y fotoact ivar se después por iluminación uniforme para inmovilizar la superficie en patrones específicos. Pueden también aplicarse secuencialmente de forma uniforme a la superficie, fotoact ivarse después por iluminación a través de una serie de máscaras para inmovilizar las secuencias específicas en regiones específicas. Así, las aplicaciones secuenciales múltiples de ácidos nucleicos específicos fotoderivados con iluminaciones múltiples a través de diferentes máscaras y un lavado cuidadoso para separar los ácidos fotonucleicos no acoplados después de cada etapa de fot oacoplamient o , se pueden usar para preparar configuraciones de ácidos nucleicos inmovilizados. Los ácidos nucleicos fotoact ivables se pueden también inmovilizar uniformemente sobre " —**- -*--superficies por la aplicación y fotoinmovili zación . La inmovilización del oligonucleótido de dirección sobre la superficie de soporte de la configuración maestra, se puede también llevar a cabo por ejemplo al colocar micro-perlas cargadas con oligonucleótidos de dirección en direcciones específicas sobre una superficie fotoreactiva . Se pueden colocar las micro-perlas por ejemplo, por técnicas tales como la atracción electrostática, electrodos o sondas magnéticas o pinzas ópticas. Más preferiblemente, las micro-perlas de enlace que contienen oligonucleótidos de dirección, se inmovilizan en una relación espaciada sobre la superficie de soporte de la configuración maestra. En tal modalidad, se puede usar una pantalla tejida que tiene espacios solamente ligeramente mayores que el diámetro de la perla o posicionarse sobre la superficie de la configuración maestra con objeto de promover la deposición de las micro-perlas sobre la superficie en una configuración separada pero ordenada. Otros métodos apropiados para inmovilización del oligonucleótido de dirección, incluyen la modificación química del oligonucleótido (por ejemplo, modificación del tiol), y la colocación no covalente por agentes de enlace de alta afinidad (por ejemplo, avidina-biot ina ) . La superficie del soporte de configuración maestra a su vez, se puede derivar (por ejemplo, por grupos amina) con objeto de unir un grupo reactivo correspondiente suministrado por el oligonuc Leótido mismo o un reactivo apropiado de reticulado. Alternativamente, se puede colocar directamente un compañero de enlace (por ejeraplo, estreptavidina) a la superficie de soporte de la configuración maestra, permitiendo la interacción entre el oligonucleótido de dirección y la superficie de soporte de la configuración maestra. Otros métodos incluyen la absorción de oligonucleótidos no modificados o modificados, así como la inmovilización de los oligonucleótidos sobre la superficie de soporte por inyección de tinta o impresión de "aguja" con la inmovilización termoquímica de sondas solubles sobre una superficie de soporte activada de la configuración maestra . La configuración maestra típica de la presente invención, incluye un gran número de oligonucleótidos de dirección inmovilizados sobre su superficie, cada uno en una ubicación o dirección discreta. La palabra "dirección" como se usa en este sentido, se refiere a una ubicación espacialnaente definida sobre la superficie de soporte, que es suficientemente diferente para permitir que un oligonucleótido se enlace a la misma para identificarse y distinguirse. El resultado de esta configuración cristalina inmovilizada, suministra una configuración maestra que contiene un gran número de "direcciones" únicas sobre su superficie. En una modalidad particularmente preferida de la invención, la superficie de soporte de la configuración maestra contiene oligonucleótidos de dirección redundantes inmovilizados sobre la misma, tales que una dirección particular aparece en una pluralidad de ubicaciones espacialmente definidas sobre la configuración maestra. Como resultando de esta redundancia, un conjugado particular multiligando que contiene la secuencia complementaria al oligonucleótido de dirección específico, será capaz de enlazarse a cualquiera de la pluralidad de ubicaciones en la configuración maestra. Esta redundancia de alguna dirección particular sobre la configuración maestra, sirve para incrementar la sensibilidad del ensayo para la detección del ácido nucleico objetivo correspondiente dentro de una muestra. Por ejemplo, en una modalidad, la configuración maestra contendrá una secuencia de dirección que se inmoviliza a la superficie de soporte a entre 1 y 100, preferiblemente entre 2 y 10, diferentes ubicaciones. En tal modalidad preferida, por lo tanto, la detección de un ácido nucleico objetivo asociado con la dirección redundante, tomará lugar en una diversidad de ubicaciones diferentes sobre la configuración maestra. En una modalidad arriba descrita, los oligonuc Leót idos de dirección se pueden suministrar en una forma inmovilizada, por ejemplo, en forma de micro-perlas, ligadas individuales, cada una soportando una pluralidad de secuencias idénticas de oligonucleótidos de "dirección". En tal modalidad, una configuración organizada de micro-perlas de enlace cargadas con los oligonucleótidos de dirección, se puede depositar sobre una superficie de soporte uniforme de la configuración maestra cebada con grupos fotoreactivos .

Las micro-perlas de enlace se pueden suministrar de fuentes comerciales, y cargarse con los oligonucleótidos mediante el uso de procesos y materiales comercialmente disponibles. Preferiblemente, las micro-perlas de enlace se seleccionan para tener una gravedad específica suficiente que les permite asentarse sobre la superficie de la configuración maestra por gravedad (al tiempo que evitan los efectos del movimiento Browniano). La colocación de los oligonucleótidos de dirección a la micro-perla de enlace, se lleva a cabo preferiblemente por la formación de enlaces co-valentes entre el oligonuc Leótido y la perla. En una modalidad particularmente preferida, la superficie de la micro-perla de enlace reacciona con un reactivo de organosi Loxano que contiene un grupo termoquímicamente reactivo (por ejemplo, un epoxi). El glicidoxipropiltrietoxi siloxano, por ejemplo, puede reaccionar con las micro-perlas para proporcionar una superficie epoxi. La terminación 5' del oligonucleótido de dirección es, a su vez, modificada para producir una terminación que contiene grupos alquilamina en los espaciadores. El epoxi siloxano de la superficie de la micro-perla reacciona con la alquilamina posicionada en la terminación del oligonucleótido de dirección, formando un enlace entre el oligonucleótido de dirección y la superficie de la micro-perla. Se puede depositar una configuración de micro-perlas a partir de una suspensión acuosa, que contiene opcionalmente copolímeros de bloque que tienen grupos fotoreactivos y grupos que atraen ligandos (por ejemplo, grupos iónicos tales como aminas cuaternarias) en los mismos. Las micro-perlas monodispersas (por ejemplo, entre alrededor de medio micrón y 5 micrones de diámetro), previamente cargadas con los oligonucleótidos de dirección, se aplican a la superficie de soporte de la configuración maestra a partir de la suspensión en la solución acuosa de los copolímeros. El grupo reactivo catiónico sirve para asociarse con las secuencias de oligonucleótidos en las perlas, mientras que el bloque aromático (por ejemplo oligoest ireno) sirve para asociarse y acoplarse a la superficie fotoreactiva . En una modalidad particularmente preferida, las micro-perlas de enlace se suministran en ligero exceso.

La superficie de soporte de la configuración maestra fotoreactiva plana y uniforme, se expone a una suspensión de micro-perlas de enlace con secuencias de oligonucleótidos de dirección inmovilizadas sobre la misma, en un número suficiente para suministrar al menos una monocapa de micro-perlas de enlace de la superficie de soporte de la configuración maestra. Esta suspensión comprende aproximadamente un número igual de perlas con cada una de las secuencias deseadas de oligonucleótidos de dirección, más un múltiplo de perlas (por ejemplo, al menos 3 veces) que no contienen oligonucleótidos. El número de perlas recubiertas con oligonucleótidos es suficiente para proporcionar una pequeña redundancia (por ejemplo, al menos 3 veces) de cada sitio específico de ácido nucleico objetivo. La configuración maestra se incuba en la solución que contiene las micro-perlas de enlace en luz oscura o tenue, para evitar la activación prematura de los fotogrupos. Cuando el solvente (preferiblemente acuoso) se evapora del depósito de suspensión en la superficie fotoreactiva, se empacan las perlas de tamaño uniforme en una disposición "cristalina" de dos dimensiones, estando opcionalmente espaciada y posicionada, por ejemplo, usando una micropantalla como se describe aquí . Esta disposición ordenada se puede después "fijar" en su lugar, por ejemplo, por iluminación en el estado seco para formar enlaces carbono-carbono entre los grupos fotoreactivos sobre la superficie de soporte de la configuración maestra y los grupos orgánicos (principalmente oligonuc Leótidos ) sobre las micro-perlas de enlace. Una configuración en patrones de perlas, que se ha asentado por gravedad sobre la superficie fotoreactiva, se puede fijar fotoquím icamente a la superficie por iluminación con luz visible o ultravioleta de onda larga. Esta iluminación activa al reactivo de organosiloxano fotoreactivo el cual a su vez, forma enlaces con los oligonucleótidos de dirección. Opcionalmente, una vez que las micro-perlas de enlace configuradas se han fotoacoplado a la superficie de soporte de la configuración maestra, el copolímero de bloque no enlazado se puede enjuagar de la configuración maestra. Este enjuague elimina la interferencia posterior (por ejemplo, durante las etapas de hibridación) con las secuencias de oligonucleótidos en la superficie exterior de las perlas . La ubicación definida espacialmente de cada oligonucleótido de dirección inmovilizado, se puede determinar usando cualquier medio apropiado, por ejemplo, hibridación fluorescente que involucra la adición secuencial de secuencias complementarias etiquetadas fluorescentes a la configuración, seguido por el enjuague y barrido entre cada adición. Los oligonucleótidos etiquetados fluorescentes complementarios a cada una de las secuencias de oligonucleótidos de dirección, están disponibles o se pueden sintetizar para contener uno de varios (por ejemplo, diez o más) compuestos fluorescentes diferentes conocidos comúnmente para diferenciarse uno del otro. Se puede preparar una pluralidad (por ejemplo, diez) de oligonucleótidos diferentes cada uno teniendo una secuencia conocida diferente complementaria con una secuencia de dirección sobre la superficie y cada una teniendo un fluorofo o diferenciable correspondiente. Las sondas etiquetadas, se pueden aplicar simultáneamente a la superficie e hibridi zarse , or ejemplo, a 55°C durante 30 minutos. La superficie se enjuaga después y se barre para identificar las ubicaciones de cada una de las diez -secuencias. Otro conjunto de diez secuencias se hibridiza después a la superficie y se barre para identificar el segundo conjunto de diez secuencias. Este proceso se continúa hasta que todas las direcciones se identifican, después de lo cual, se agota la configuración maestra de oligonucleótidos hibridizados, por ejemplo, al sumergir en agua hirviente durante dos minutos, y usarse para preparar configuraciones de ensayo replicadas . Un sistema preferido de la presente invención incluye además un conjugado multiligando que contiene una pluralidad de dominios activos (por ejemplo, de enlace o polimerizables) . De conformidad con la invención, se pueden colocar los ligandos individuales a un átomo de núcleo o molécula en cualquier forma y/u orden apropiado, por ejemplo, individualmente o juntos (por ejemplo, en secuencia lineal y en una ubicación simple o en una pluralidad de ubicaciones) . Por ejemplo, en una modalidad, los ligandos se colocan al núcleo simultáneamente, por ejemplo, bajo condiciones similares de reacción. Opcionalmente, el ligando que sirve como el tercer ligando se coloca al núcleo después de la hibridación entre el oligonucleótido de dirección de la configuración maestra y el oligonucleótido complementario suministrado por el conjugado multiligando. En esta modalidad, el tercer ligando está presente como un reactivo separado, sin embargo, la colocación del tercer ligando es capaz de tomar lugar bajo condiciones iguales o similares de reacción como el primero y segundo dominios de enlace. Todavía en otra modalidad, cada uno de los ligandos se coloca al núcleo de transferencia bajo condiciones separadas de reacciones separadas. La secuencia de colocación de estos ligandos al núcleo del conjugado multiligando, no es crucial para la presente invención, y con tal de que los dominios activos individuales (por ejemplo, de enlace) estén disponibles para enlazarse a su complemento específico, pueden colocarse al núcleo o a algún otro en cualquier orden. En una modalidad particularmente preferida, cada dominio individual de enlace se coloca al núcleo individualmente, en una pluralidad de ubicaciones sobre la superficie.

Opcionalmente, el núcleo del conjugado multiligando es por sí mismo suministrado en forma de una micro-perla de transferencia. Las micro-perlas útiles para preparar un conjugado multiligando, pueden ser de la misma variedad a aquellas descritas arriba con respecto a "micro-perlas de enlace". Las perlas preferidas son deseablemente esféricas, y homogéneas en tamaño, con una gravedad específica mayor a la del agua. También, las perlas preferidas tienen una composición química, o al menos superficie, que está sometida a enlace con reactivos orgánicos. Por ejemplo, las esferas homogéneas de sílice de entre alrededor de 0.5 micrones y alrededor de 5 micrones (µ) de diámetro, pueden reaccionar con un reactivo de organosiloxano que contiene un grupo termoquímicamente reactivo (por ejemplo, epoxi), con objeto de acoplar el reactivo a los grupos correspo dientes de un ligando de enlace. En tal modalidad, por ejemplo, el glicidox ipropil t rietoxisiloxano reacciona con micro-perlas de vidrio bajo condiciones de reacción publicadas, para proporcionar superficies epoxi-vidrio . Los tres dominios de enlace de la presente invención, cada uno terminado con grupos alquilamina sobre los espaciadores, se pueden acoplar fácilmente con los grupos epoxi sobre la superficie de la perla. Los primero y segundo dominios de enlace de oligonuc.Leótido, se pueden colocar a la micro-perla de transferencia de cualquier forma apropiada, por ejemplo, los dominios de enlace terminados en alquilamina se pueden sintetizar y colocar termoquímicamente. Para el primero y segundo dominios de enlace de oligonucleótido, se optimizan las longitudes de los oligonucleótidos para la resistencia y cinética de hibridación deseada (usualmente en el rango de 20-50 nucleótidos) . El primer dominio de enlace comprende un oligonucleótido que es complementario al oligonucleótido de dirección inmovilizado sobre la superficie de soporte de la configuración maestra, mientras que el segundo dominio de enlace, es complementario con un ácido nucleico objetivo escogido que se sospecha o se sabe que está en una muestra a ser probada. Preferiblemente, las secuencias del primer dominio de enlace no son complementarias una con la otra o con alguna secuencia conocida de gen natural y/o fragmentos de genes con probabilidad significativa de estar presentes en la muestra biológica. Como resultado, las primeras secuencias de oligonucleótido del dominio de enlace se hibridizarán solamente con sus respectivas secuencias complementarias de oligonucleótidos de dirección inmovilizadas sobre la superficie de soporte de la configuración maestra. Esto evita la reactividad cruzada (por ejemplo, hibridación cruzada) entre el primer dominio de enlace que es responsable de colocar al conjugado multiligando en una ubicación espacialmente definida sobre la superficie de soporte de la configuración de ensayo, y las secuencias de ácido nucleico objetivo tamizadas en la muestra de prueba. Los oligonucleótidos se seleccionan para el primer dominio de enlace al preparar la secuencia complementaria a las secuencias aleatorias que comprenden los oligonucleótidos de dirección de la configuración maestra. Esta preparación se puede llevar a cabo usando cualquiera de los métodos apropiados conocidos en el arte, por ejemplo, por síntesis de ADN en fase sólida. Una vez que los oligonucleótidos para el dominio de enlace han sido sintetizados, se puede modificar una -'—-'--' -16 *- terminación de cada oligonucleótido para contener un grupo alquilamina en el espaciador. Los oligonucleótidos se seleccionan para el segundo dominio de enlace al seleccionar primero los ácidos nucleicos objetivo (por ejemplo, genes y/o fragmentos de genes) para detectarse por la microconfiguración a ser fabricada de conformidad con la invención. Las secuencias de estos genes y/o fragmentos de genes, pueden ser conocidas o se pueden determinar usando técnicas bien conocidas en el arte (por ejemplo, el método dideoxi de Sanger, formación de secuencias PCR, etc.) . Una vez que los segundos dominios de enlace han sido escogidos, se puede modificar una terminación de cada oligonucleótido para contener un grupo alquilamina en el espaciador. El tercer ligando (por ejemplo, un dominio de enlace o grupo polimerizable) puede ser de cualquier tipo apropiado, y se puede colocar al núcleo o transferir la micro-perla en cualquier forma apropiada. En una modalidad preferida, por ejemplo, el tercer ligando es un ligando de enlace suministrado en forma de un derivado de biotin-poli ( alquilenóxido ) amina . Tal derivado se puede preparar,, por ejemplo, al reaccionar un éster de N-oxisuccinimida de biotina con una poli (etilenóxido) diamina de aproximadamente la misma longitud molecular que los derivados de oligonucleótidos para colocarse en el mismo núcleo o micro-perla. Se pueden fabricar los conjugados de multi-ligandos para incluir oligonucleótidos que son complementarios y así se hibridizarán con cualquier ácido nucleico objetivo deseado que se encuentre en una muestra biológica, y que tenga una secuencia conocida o determinable. En una modalidad, los diversos segundos dominios de enlace de los conjugados mult i-ligando de la presente invención, pueden comprender una configuración amplia de oligonucleótidos que son complementarios a los diversos ácidos nucleicos objetivo encontrados en una muestra biológica. En una modalidad alternativa, los segundos dominios de enlace de los conjugados multi-ligando, se fabricarán de manera tal que la configuración de ensayo resultante localizará los ácidos nucleicos objetivo de una familia particular de genes que se presentan naturalmente. Un ejemplo de esta modalidad particular, sería un conjunto de conjugados muít i-ligando que contienen segundos dominios de enlace complementarios a las 50-60 secuencias conocidas objetivo de fibrosis quística. Así, la configuración de ensayo resultante se fabricaría de manera que detecte la presencia de las secuencias conocidas que se asocian solamente con esta enfermedad. El tercer ligando del conjugado muíti-ligando de la presente invención, comprende opcionalmente un ligando de enlace adaptado para formar enlaces con una pareja correspondiente de enlaces. El tercer ligando se puede colocar directamente al núcleo o micro-perla de transferencia del conjugado mult i-ligando, o indirectamente por el uso de un espaciador, en una forma que permite que el ligando esté libre de obstrucción estérica (por ejemplo, obstrucción estérica provocada por la proximidad del ligando a la micro-perla de transferencia) . En otras palabras, el uso de un espaciador para colocar el tercer ligando, asegurará que el ligando esté lo suficientemente alejado del núcleo o superficie de la micro-perla de transferencia para permitir que lleve a cabo su función deseada, por ejemplo, polimerizar o enlazar con la pareja correspondiente de enlace contenida en la superficie de la configuración de ensayo. En una modalidad particularmente preferida, el tercer ligando se coloca al núcleo o micro-perla de transferencia por medio de un espaciador hidrofílico, por ejemplo, un espaciador de polietilen glicol, de longitud suficiente para permitir que el dominio de enlace esté libre de obstrucción estérica. En una modalidad alternativa, el tercer ligando se suministra en solución, más que colocada a la micro-perla o núcleo del conjugado mult i-ligando . En esta modalidad, el tercer ligando se incorpora después de la hibridación del oligonucleótido de dirección de la configuración maestra con su dominio complementario del primer enlace del conjugado mult i-ligando . Por lo tanto, en esta modalidad, el tercer ligando se incorpora dentro del complejo formado sobre la configuración maestra después de colocar el conjugado multiligando, y antes de que la configuración de ensayo se coloque en proximidad de enlace con la configuración maestra. Preferiblemente, la adición del tercer ligando no requiere condiciones diferentes de reacción de aquellas de los primero y segundo dominios de enlace, más bien, la adición ...l^atu. -ütt^Jj¿¿2£J_ del tercer ligando puede tener lugar bajo las mismas condiciones. En una modalidad preferida, el tercer ligando se coloca al conjugado mult i-ligando usando química fotoreactiva. En esta modalidad, la superficie de una micro-perla es pre-tratada, por ejemplo, con un organosiloxano con objeto de preparar la superficie para reaccionar con los compuestos fotoreactivos. En esta modalidad, el tercer ligando se coloca a un espaciador hidrofíl co el cual es, a su vez, colocado a un grupo fotoreactivo. El grupo fotoreactivo permite la formación de enlace entre el espaciador (colocado al ligando de enlace) y la micro-perla de transferencia. En una modalidad alternativa, en donde la invención incluye el uso de micro-perlas porosas de enlace inmovilizadas sobre la superficie de la configuración maestra, tales micro-perlas tienen colocadas en ellas oligonucleótidos de dirección, no se requiere la micro-perla de transferencia del conjugado multiligando. En esta modalidad, las micro-perlas porosas de enlace se pueden inmovilizar sobre la superficie de la configuración maestra, cada micro-perla porosa tiene una pluralidad de oligonucleótidos de dirección colocados en su superficie. En esta modalidad, los conjugados mult i-ligando comprenden un primer dominio de enlace complementario al oligonucíeótido de dirección, un segundo dominio de enlace complementario a una secuencia objetivo de ácido nucleico encontrada en una muestra biológica, y un tercer ligando que comprende un ligando de enlace. El conjugado multiligando contiene una micro-perla de transferencia pero, además, un núcleo químico (por ejemplo, atómico o molecular ) . Se aplica una pluralidad de conjugados multiligando a la configuración maestra y se incuban bajo condiciones apropiadas para permitir la hibridación de la secuencia de dirección de la configuración maestra con su oligonucleótido complementario contenido dentro del conjugado multi-ligando . Aquellos hábiles en el arte, podrán determinar condiciones apropiadas de temperatura, concentración de sal y composición de la solución amortiguadora. Para una discusión de las condiciones y métodos de hibridación para aplicarlos, ver Nucleic Acid Hybridization: A Practica! Approach, Hames and Higgins, editores, 1985, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia. El tercer ligando del conjugado mult i-ligando se pueoe suministrar en forma de un grupo polimerizable, por ejemplo, para permitir que los conjugados formen una película estable mientras están en posición sobre la configuración maestra. Los grupos polimerizables apropiados incluyen, por ejemplo, grupos acrílico y vinilo. En una modalidad preferida, los grupos polimerizables se adaptan para someterse a polimerización de adición, en presencia de monómeros agregados y otros reactivos (por ejemplo, iniciadores), para formar una película estable. La polimerización puede tomar lugar por medio de cualquier reacción apropiada, incluyendo polimerización en solución acuosa de radicales libres, exposición a calor, radiación de alta energía, ondas ultrasónicas, radiación ultravioleta, y catalizadores de polimerización iónica para producir polímeros solubles en agua o expansibles. Además, la polimerización de los grupos puede tomar lugar por medio de una polimerización por transferencia de bases catalizada por hidrógeno. Aquellos hábiles en el arte, dada la presente descripción, apreciarán la forma en la cual tales grupos se pueden usar para co-polimeri zar los ligandos con otros' monómeros, y a su vez, los conjugados correspondientes, dentro de la forma de una estructura polimérica integral, por ejemplo, un respaldo de película, que puede, a su vez, usarse o transferirse a una superficie de soporte de configuración de ensayo. El soporte de la configuración de ensayo de la presente invención, se puede fabricar a partir de cualquier material apropiado para suministrar una combinación óptima de propiedades tales como estabilidad de dimensión, forma y uniformidad. Los materiales apropiados para su uso en la fabricación de la configuración de ensayo, incluyen aquellos descritos como útiles para la configuración maestra misma, y preferiblemente incluyen silicio y vidrio. En una modalidad particularmente preferida, el soporte de ensayo se suministra con dimensiones que miden 50 µm cuadrados. Preferiblemente, el soporte de la configuración de ensayo es de dimensiones comparables con la configuración maestra, con objeto de suministrar relaciones espaciales directas .

La superficie de un soporte discreto de la configuración de ensayo, se puede pre-tratar para facilita.r la colocación de la capa conjugada u orientada. En una modalidad preferida, la configuración de ensayo se suministra en forma de una micro-plaqueta de silicio que ha sido limpiada, pulida y tratada para proporcionar una superficie uniforme de óxido de silicio. La superficie de óxido de silicio puede después tratarse con un reactivo de organosiloxano (como se describe aquí) para suministrar una superficie uniforme fotoactivable . En una modalidad, la superficie de la configuración de ensayo de la presente invención, se puede recubrir con moléculas de la pareja de enlace adaptadas para formar enlaces con el tercer ligando del conjugado mult i-ligando . La superficie de soporte de la configuración de ensayo se puede preparar al recubrir la superficie con un compuesto fotoact ivable (por ejemplo, reactivo de siloxano fotoreactivo) para resultar en una superficie fotoreactiva. De ahí en adelante, la superficie de soporte de la configuración de ensayo se puede exponer a una solución que contiene moléculas de la pareja de enlace (por ejemplo, avidina), y la solución iluminada con objeto de permitir la formación de enlaces entre la pareja de enlace y la superficie de la configuración de ensayo. Opcionalmente, la superficie de la configuración de ensayo se pasiva antes de y/o después de la exposición a la pareja de enlace, por ejemplo, con un tensoactivo (por ejemplo, un copolímero de tribloque de biotina), para evitar el enlace no específico de moléculas encontradas en la muestra de prueba a la superficie de soporte de la configuración de ensayo . En una modalidad particularmente preferida, la pareja de enlace se suministra en forma de una monocapa sobre la superficie de soporte de la configuración de ensayo. Opcionalmente, la pareja de enlace se puede suministrar en forma de una capa tri-dimensional , por ejemplo, un compuesto de avidina-hidrogel de hasta un micrón de espesor. Tal estructura se puede obtener, por ejemplo, al cargar la superficie de la configuración de ensayo fotoreactiva con una solución de avidina más un hidrogel fotoreactivo (por ejemplo, copolímero de benzoilbenzamidopropil metacrilamida con vinilpirrolidona o acrilamida) e iluminarla mientras esté húmeda. En otra modalidad particularmente preferida, se aplica una película delgada del fotopolímero a 5 una superficie de soporte de la configuración de ensayo dimensionalmente estable. Se aplica una película de monocapa auto-ensamblable de un tensoactivo pasivador que contiene una alta densidad de superficie (por ejemplo, 0.1 pmol/mm2) de un grupo ligando de alta afinidad (por ejemplo, biotina) a la superficie fotoreactiva. La película tensoactiva de monocapa se foto-acopla después a la superficie y cualquier tensoactivo no enlazado se enjuaga. La superficie pasivada cargada con el ligando se satura con la molécula de la pareja de enlace de alta afinidad (por ejemplo X-avidina), y cualquier exceso de la pareja de enlace se enjuaga. Las moléculas apropiadas de parejas de enlace de alta afinidad incluyen, por ejemplo, película x-avidina, o anticuerpos de alta afinidad (por ejemplo, anti-digoxigenina). Opcionalmente, el sistema incluye además otros componentes también incluyendo por ejemplo, medios (por ejemplo reactivos) para usarse en desasociar oligonuc Leót idos complementarios (por ejemplo, el ^ü-MMiWi oligonuc Leótido de dirección de la configuración maestra y su oligonucleótido complementario llevado por el conjugado muít i-ligando ) . Por ejemplo, los medios apropiados para desasociar el ADN hibridizado incluyen alterar la temperatura, pH, o concentración de sal del sistema. Opcionalmente, el sistema comprende además un lector óptico de barrido, como está comercialmente disponible (por ejemplo, un microscopio de fluorescencia conofocal disponible de Molecular Dynamics) para detectar la hibridación de los objetivos de ácido nucleico a direcciones específicas . En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar de forma reproducible una configuración de ácido nucleico, el método comprende: a) suministrar una configuración maestra que tenga una superficie de soporte; b) inmovilizar (por ejemplo, depositar y fijar, por ejemplo, directamente o por medio de ligadores respectivos o micro-perlas de "enlace") una pluralidad de oligonucleótidos de dirección sobre la superficie de soporte de la configuración maestra en forma de una configuración que forma un patrón y opcionalmente aleatoria; c) determinar y registrar el patrón de los oligonucleótidos de dirección inmovilizados (por ejemplo, usando oligonucleótidos acoplados con fluoróforo para hibridación al oligonucleótido de dirección) ; d) suministrar una pluralidad de conjugados mult i-ligando libres (esto es, no inmovilizados), cada conjugado mult i-ligando comprende un núcleo que tiene (preferiblemente de manera independiente) colocado al mismo: (i) al menos una molécula de un primer dominio de enlace de oligonucleótido, que comprende una secuencia de oligonucleótido seleccionada para ser complementaria a una secuencia particular del oligonuc Leótido de dirección de la configuración maestra, (ii) al menos una molécula de un segundo dominio de enlace de oligonucleótido, que comprende una secuencia de oligonucleótido seleccionada para ser complementaria a una secuencia característica de oligonucleótido de una secuencia objetivo de ácido nucleico (por ejemplo, un gen y/o fragmento de gen), y (iii) al menos una molécula de un tercer ligando (y preferiblemente no oligonucleótido), seleccionado del grupo que consiste de ligandos de enlace y grupos polimerizables (por ejemplo, grupos acrílico o vinilo) ; e) poner en contacto e incubar los conjugados muít i-ligando con la superficie de soporte de la configuración maestra bajo condiciones apropiadas que permitan que cada oligonucleótido de dirección se hibridize con su primer dominio de enlace de oligonucleótido complementario de los conjugados mult i-ligando (y separar opcionalmente los conjugados muíti-ligando no hibridizados); f) suministrar una superficie de soporte de una configuración de ensayo; g) poner en contacto los conjugados multi-ligandos hibridizados con la superficie de soporte de ensayo bajo condiciones apropiadas que permitan a los conjugados transferirse al soporte de ensayo en un pa.trón correspondiente a su patrón sobre la configuración maestra, por ejemplo, ya sea por polimerización de un tercer ligando (suministrado en forma de un grupo polimerizable), o al enlazar un tercer ligando (suministrado en forma de un tercer ligando de enlace) con un sitio de colocación correspondiente suministrado por la superficie de soporte de ensayo; y h) desasociar el primer dominio de enlace del soporte de la configuración maestra en una forma que permita a los conjugados permanecer en la superficie de soporte de ensayo en el patrón deseado . En uso, el núcleo (por ejemplo, micro-perlas de transferencia) que soporta tres o más ligandos se puede mezclar en números iguales y suspenderse en solución amortiguadora acuosa. Esta suspensión puede contener un exceso (sobre la capacidad de hibridación de las micro-perlas en la configuración maestra) de cada micro-perla de transferencia que lleva la secuencia de oligonuc Leót ido complementaria a una secuencia característica de oligonucleótido de un ácido nucleico objetivo que se espera detectar en una muestra . La superficie de la configuración maestra se puede inundar con esta suspensión de la mezcla escogida de conjugado mult i-ligando, y se puede permitir que la hibridación de estado sólido proceda cercana al equilibrio. Los conjugados mult i-ligando en exceso se pueden después •una ^r *. ****. recuperar de la configuración maestra hibridizada al enjuagar, y los conjugados enlazados ya sea copolimerizados para formar un respaldo estable o enlazados para parejas de enlace correspondientes en la configuración de ensayo. La configuración maestra está entonces disponible para un proceso de replicación repetida. La configuración maestra puede usarse repetidamente para preparar configuraciones de ensayo correspondientes, las cuales, a su vez, se pueden empacar, almacenar y transportar, por ejemplo, en estado húmedo o seco. Al separarla de su empaque, una configuración de ensayo estará lista para usarse en un protocolo de ensayo de hibridación de rutina con un lector óptico de barrido. Además, la presente invención suministra una configuración maestra que es versátil en su uso -la configuración maestra se puede usar y re-usar, para crear configuraciones idénticas o cambiar la función de la configuración (por ejemplo, alterar la secuencia de oligonucleótido complementaria a una secuencia característica de oligonucleótido de un ácido nucleico objetivo, de manera tal que el usuario pueda alterar el ácido nucleico objetivo para detectarse en una muestra) .

Aquellos hábiles en el arte, dada la presente descripción, apreciarán la forma en la cual las micro-configuraciones disponibles comercialmente pueden por si mismas usarse como configuraciones maestras de la presente invención, para replicarse una o más veces para formar configuraciones de ensayo correspondientes. En este caso, los ácidos nucleicos individuales de la configuración comercial, independientemente de su especificidad original, puede cada uno considerarse como meras secuencias de dirección, y usarse en la forma aquí descrita para suministrar configuraciones de ensayo de cualquier especificidad deseada. Todavía en un aspecto adicional, y particularmente en donde el tercer ligando se suministra en la forma de un tercer ligando de enlace, la presente invención proporciona una configuración intercalada que comprende: a) una configuración maestra que comprende una superficie de soporte que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de dirección inmovilizados en la misma (por ejemplo, directamente o por medio de ligadores respectivos o micro-perlas de "enlace"), las secuencias de oligonucleótidos están inmovilizadas en la forma de una configuración con patrón, y opcionalmente aleatoria; b) una pluralidad de conjugados multiligando, cada conjugado mult i-ligando comprende un núcleo que tiene (preferiblemente de manera independiente) colocado a la misma: (i) moléculas de un primer dominio de enlace de oligonucleótidos, cada molécula comprende una secuencia de oligonucleótido complementaria a una secuencia particular de oligonucleótido de dirección de la configuración maestra, (ii) moléculas de un segundo dominio de enlace de oligonucleótido, cada molécula comprende una secuencia complementaria de oligonucleótido a una secuencia característica de oligonucleótido de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un gen y/o fragmento de gen), y (iii) al menos una molécula de un tercer ligando de enlace (y preferiblemente no oligonucleótido) seleccionado del grupo que consiste de ligandos de enlace y grupos polimeri ables (por ejemplo, grupos acrílico o vinilo), en donde el primer dominio de enlace del oligonucleótido se hibridiza a los oligonucleótidos de dirección correspondientes inmovili ados sobre la configuración maestra; y c) un soporte de una configuración de ensayo que comprende una superficie de soporte recubierta con sitios de colocación para el tercer ligando de enlace ¡tal como, moléculas inmovilizadas de una pareja de enlace correspondiente específica para el tercer ligando de enlace), en donde el sitio de colocación de la configuración de ensayo se enlaza al ligando de enlace correspondiente de los conjugados mult i-ligando . Opcionalmente, la configuración intercalada comprende además una micro-perla de enlace inmovilizada sobre la superficie de la configuración maestra, la micro-perla de enlace tiene colocada a la misma una pluralidad de oligonucleótidos de dirección. Todavía en otra modalidad alternativa, la presente invención suministra un estuche correspondiente que comprende uno o más componentes para preparar de manera reproducible una configuración de ácido nucleico, los componentes del estuche seleccionados del grupo que consiste de: a) una configuración maestra que comprende una superficie de soporte que tiene una pluralidad de secuencias de oligonucleótidos de dirección inmovilizados en la misma (por ejemplo, directamente o por medio de ligadores respectivos o micro-perlas de "enlace"), las secuencias de oligonucleótidos están inmovilizadas en la forma de una configuración con patrón, y opcionalmente aleatoria; b) una pluralidad de conjugados multi-ligandos, cada conjugado mult i-ligando comprende un núcleo que tiene (preferiblemente de manera independiente) colocado a la misma: (i) moléculas de un primer dominio de enlace de oligonucleótidos, cada molécula comprende una secuencia de oligonucleótido complementaria a una secuencia particular de oligonucleótido de dirección de la configuración maestra, (ii) moléculas de un segundo dominio de enlace de oligonucleótido, cada molécula comprende una secuencia complementaria de oligonucleótido a una secuencia característica de oligonucleótido de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo, un gen y/o fragmento de gen), y (iii) al menos una molécula de un tercer ligando de enlace (y preferiblemente no oligonucleótido) seleccionado del grupo que consiste de ligandos de enlace y grupos polimerizables (por ejemplo, grupos acrílico o vinilo) ; c) un soporte de la configuración de ensayo que comprende una superficie de soporte para la configuración replicada, por ejemplo, recubierta con sitios de colocación para el tercer ligando (tal como, moléculas inmovilizadas de una pareja de enlace correspondiente específica para el tercer ligando de enlace) ; y d) un lector de configuración para determinar la ubicación de los oligonucleótidos de dirección sobre la configuración maestra y la presencia de ácidos nucleicos objetivo hibridizados en la configuración de ensayo. Todavía en otra modalidad alternativa, la presente invención proporciona un método y sistema para preparar directamente una configuración replicable en forma de una configuración reutilizable de ácido nucleico. En esta modalidad, la superficie a la cual se inmoviliza el ácido nucleico se suministra por una configuración de fibra óptica, la superficie de soporte de la configuración de ensayo se suministra por terminales distales de las fibras mismas. Opcionalmente, y preferiblemente, los micropozos son grabados con ácido en las terminales distales de las fibras ópticas. En tal modalidad, un grupo de fibras ópticas convencionales se puede adaptar para usarse como el sistema biosensor de la configuración de enlace específica para detectar una diversidad de ácidos nucleicos objetivo en una muestra. Las fuentes comerciales suministran grupos de fibras ópticas formadoras de imágenes que comprenden miles (por ejemplo, 3,000-100,000) de fibras ópticas recubiertas individualmente, y empacadas hexagonaímente . Cada fibra en la configuración lleva su señal óptica aislada y propia de un extremo de la fibra al otro. Los ligandos de enlace específicos individuales se pueden enlazar a un extremo de cada fibra y el otro extremo se conecta funcionalmente a un analizador óptico de señal (por ejemplo, una cámara CCD) . La terminal de ensayo (que contiene los ligandos específicos de enlace) del grupo de fibras, se expone a una solución de muestra que contiene el objetivo desconocido y otros reactivos necesarios (si hay algunos) del sistema de ensayo óptico. El patrón de señal óptica se registra y analiza en el otro extremo del grupo, usando un sistema analizador de imágenes. La solicitante ha encontrado que los dominios de enlace de oligonucleótidos, complementarios a las secuencias objetivo, se pueden colocar a la superficie de soporte de la configuración de ensayo óptica en cualquier forma apropiada, por ejemplo, ya sea directamente o por medio de moléculas o micro-perlas de unión enlazadas reversible o irreversiblemente. A su vez, la ubicación final de los dominios de enlace de oligonucleótido se puede determinar (por ejemplo, por medios ópticos y ensayo), preferiblemente controlada (por ejemplo, por el uso de dominios de dirección re-ut i li zables ) , y opcionalmente replicada (por ejemplo, por el uso de ligadores reversibles ) . En una modalidad preferida, el sistema comprende una pluralidad de conjugados multi-ligando, cada conjugado mult i-ligando comprende moléculas de a) un primer dominio de enlace de oligonucleótidos adaptado para enlazarse con un ligando correspondiente de dirección, y b) un segundo dominio de enlace de oligonucleótidos complementario a una secuencia característica de oligonucleótidos de un ácido nucleico objetivo (por ejemplo un gen y/o fragmento de gen) . Los ligandos de dirección se inmovilizan sobre el extremo distal de la configuración maestra, ya sea directamente, o por el uso de un ligador o micro-perla. Los conjugados multi-ligando cargarían después cada una de las fibras dirigidas con un ligando específico de un analito conocido. Se puede cambiar como se quiera el conjunto de ligandos específicos de analito en las fibras dentro del grupo. En otra modalidad, la colocación del dominio de enlace de oligonucleótido se lleva a cabo usando una micro-perla. En esta modalidad, la micro-perla se prepara de tal manera que se coloca al dominio de enlace del oligonucleótido. La micro-perla y el dominio de enlace se colocan después a la superficie de soporte de la configuración de ensayo. La colocación de la micro-perla se puede llevar a cabo usando cualquier par de enlace apropiado, tal como, por ejemplo, avidina-biot ina . En una modalidad alternativa, los reactivos fotoreactivos se pueden usar para colocar la micro-perla a la superficie de soporte de la configuración de ensayo.

Opcionalmente, y preferiblemente, el sistema comprende además un analizador de imágenes. En esta modalidad, el grupo de fibras se conecta en un extremo a un sensor óptico que recolecta las señales y procesa la información de estos sensores múltiples (por ejemplo, fibras). En tal enfoque, la invención proporciona una configuración de ácido nucleico re-utilizable, en la cual el usuario puede cambiar la función de la configuración de ácido nucleico para cada uso particular. Por ejemplo, se puede recubrir el enlazador o micro-perla con iminobiot ina , y la superficie de soporte de la configuración de ensayo puede recubrirse con biotina. El ligador o micro-perla puede así colocarse reversiblemente a la superficie de soporte de la configuración de ensayo. El ligador o micro-perla se puede disociar al alterar el pH de manera tal que un pH más bajo provoca que el ligador o micro-perla se disocie con la superficie de soporte de la configuración de ensayo. En una modalidad, se pueden grabar los micro-pozos dentro de la terminal distal de cada fibra óptica usando técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, un procedimiento químico de grabado en - - --'-"• -'• húmedo se puede usar para grabar selectivamente los núcleos de las fibras individuales. Esta técnica aprovecha la diferencia en las velocidades de grabado entre el núcleo y los materiales de revestimiento de la fibra. Al controlar el tiempo de grabado, aquellos con habilidad en el arte apreciarán la forma en la cual se obtienen las configuraciones ordenadas de micro-pozos de alta densidad de forma conocida y volumen de pozo. La arquitectura del pozo se determina por la fibra de imagen pre-formada. Ya que cada micropozo está contenido en el extremo de su propia fibra óptica, cada pozo puede servir como un sensor individual. Preferiblemente, el diámetro de los micropozos grabados es ligeramente mayor que aquel de las micro-perlas de enlace individuales usadas en conexión con los mismos. En una modalidad, por ejemplo, una solución que contiene una pluralidad de micro-perlas que tienen uno o más dominios de enlace de oligonucleótido complementarios al ácido nucleico objetivo colocados a la misma, se agregan a la superficie de un grupo de fibras ópticas. Las micro-perlas individuales de enlace se asientan individualmente dentro de cada micro-pozo cuando se deja la solución evaporar de la superficie del grupo de fibras ópticas. Opcionalmente, y en el caso de que un compuesto fotoreactivo se use en conjunto con esta modalidad, las fibras ópticas se iluminan para permitir que la micro-perla de enlace se fotoacople a la superficie de cada fibra óptica. Opcionalmente, las micro-perlas en exceso se lavan después de la superficie del grupo de fibras . Por ejemplo, la inmovilización de un perla o dominio de enlace de oligonucleótido sobre la terminal distal de la fibra, dentro del micro-pozo, puede llevarse a cabo usando compuestos fotoact ivables para formar enlaces con la superficie del pozo. En una modalidad, la superficie del pozo de la fibra óptica se recubre con un reactivo de siloxano fotoreactivo, y de ahí en adelante, se aplica una solución que contiene un dominio de enlace de oligonucleótido libre (esto es, sin enlazar) a la superficie del pozo. La solución se ilumina después, activando los grupos fotoreactivos y provocando la formación de enlace entre el dominio de enlace de oligonucleótido y la superficie del pozo. Se alcanza la iluminación al pasar luz activadora a través de la fibra dentro del pozo. Como se discutió arriba, cada fibra individual del grupo de fibras puede cortarse en un extremo para proporcionar un receptáculo cóncavo para una micro-perla. Se puede preparar un reactivo de organosiloxano fotoreactivo al enlazar un reactivo comercial de organosiloxano, tal como el aminopropildimet il metoxi siloxano, con un fotoreactivo termoquímicamente reactivo, tal como el cloruro ácido del ácido benzoilbenzóico . El reactivo fotoreactivo de siloxano se hace reaccionar con la superficie de óxido de silicio de las fibras ópticas cortadas en el grupo analizador de imágenes. En una modalidad alternativa, cada micro-pozo se recubre con X-avidina para crear una superficie que reaccionará con la biotina. En esta modalidad, las micro-perlas se recubren con biotina o derivados de iminobiot ina . Preferiblemente, las micro-perlas de enlace son esféricas, y de un diámetro aproximadamente igual a (o ligeramente menor que) aquel de las fibras ópticas individuales. Las micro-perlas de enlace de la presente invención se fabrican de cualquier material apropiado, incluyendo, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polivinilbenzofenona, vidrio recubierto con fotopolisiloxano . Preferiblemente, las micro-perlas tienen una gravedad específica mayor a la del agua, y tienen una composición química que está sujeta al enlace con reactivos orgánicos. Los derivados de oligonucleótidos pueden sintetizarse de acuerdo con los métodos publicados y comercialmente utilizados, como se describió en mayor detalle aquí. La longitud de las secuencias de oligonucleótidos se optimizan para la resistencia y velocidad de hibridación deseadas (usualmente en el rango de 20-50 nucleótidos) . Las secuencias de oligonucleótidos son complementarias al ácido nucleico objetivo escogido. Los derivados de "oligonucleótido de dirección" se pueden acoplar a las micro-perlas de enlace activadas por epoxi para las terminales de fibra óptica. En una modalidad preferida, por ejemplo, se hacen reaccionar esferas de sílice homogéneas de aproximadamente el diámetro de la fibra con un reactivo comercial de organosiloxano que contiene un grupo termoquímicamente reactivo (por ejemplo, epoxi) útil para acoplar los grupos amino de los derivados de oligonucleótido en esta invención. El glicidoxipropiltrietoxi siloxano se hace reaccionar con las micro-perlas de vidrio bajo las condiciones de reacción publicadas, para 5 proporcionar una superficie epoxi-vidrio . Los derivados de oligonucleótidos de dirección de esta invención, terminan con grupos alquilamina en los espaciadores para acoplarse fácilmente con los grupos epoxi sobre la superficie de las micro- 10 perlas de enlace. El grupo de fibras ópticas fotoreact ivas grabadas, se expone a una suspensión de micro- perlas de enlace (en número suficiente para proporcionar al menos un tipo de oligonucleótido de dirección por fibra), cada micro-perla tiene secuencias de oligonucleótido de dirección inmovilizadas en su superficie. Preferiblemente, un dominio de enlace de oligonucleótido se enlaza a cada pozo de fibra óptica. En esta modalidad, la configuración maestra es reutilizable. Esta suspensión espesa comprende números aproximadamente iguales de perlas con cada una de las secuencias deseadas de oligonucleótidos de dirección. El número de perlas que suministran las secuencias de oligonucleótidos es suficiente para rt » rmüitTiffl.- -r n i i , t t n-.? r , T ,.T - T TUV- , , ..., . . ^ , _, proporcionar una redundancia (al menos 3 veces) de cada uno de los sitios específicos de ácido nucleico objetivo. Cuando el solvente (preferiblemente acuoso) se evapora del depósito de suspensión espesa sobre la superficie fotoreactiva en luz tenue u oscura, se dejan las perlas de tamaño uniforme en las hendiduras cóncavas en las terminales de la disposición ordenada de las fibras. Las micro-perlas de enlace que suministran las secuencias de oligonucleótidos se "fijan" después por iluminación en el estado seco para formar enlaces carbono-carbono entre los grupos fotoreactivos sobre la superficie de fibra óptica y los grupos orgánicos (principalmente oligonucleótidos) sobre las perlas de oligonucleótidos de dirección. Las micro-perlas en exceso se enjuagan del sistema. El grupo resultante de fibras ópticas tendrá una disposición ordenada y estable de los oligonucleótidos, complementaria a las secuencias objetivo de ácido nucleico en un extremo de sus fibras, y las ubicaciones de las secuencias de oligonucleótidos se pueden entonces determinar por métodos convencionales de hibridización fluorescente, que comprende la adición secuencial a la configuración, de secuencias complementarias etiquetadas fluorescentes con enjuague y lectura de lá configuración entre cada adición, como se discute aquí en detalle. En una modalidad preferida, las secuencias complementarias se etiquetan con fluoróforos. Los oligonuc Leótidos etiquetados fluorescentes complementarios a cada una de las secuencias se sintetizan, cada uno conteniendo varios compuestos fluorescentes diferentes (por ejemplo, de uno de diez) que pueden distinguirse uno del otro. Cada oligonucleótido, por lo tanto, tiene una secuencia conocida y una etiqueta conocida identificable . Los diversos oligonucleótidos, cada uno teniendo una secuencia conocida diferente complementaria a la secuencia de oligonucleótido sobre la superficie y una de un número comparable de fluoróforos diferenciables , se aplica simultáneamente sobre la superficie y se hibridiza a 55°C durante 30 minutos. La superficie se enjuaga después y se analiza para identificar las ubicaciones de cada una de las secuencias. Otro conjunto de secuencias se hibridiza entonces a la superficie y se barre para identificar el segundo conjunto de secuencias.

Este proceso se continúa hasta que todas las ubicaciones se identifican, después de lo cual la configuración maestra se agota al sumergir en agua hirviente durante dos minutos. Está después lista para usarse para detectar la presencia de ácidos nucleicos objetivo en una muestra. En uso, la configuración maestra se expone a una solución de prueba que contiene una pluralidad de secuencias objetivo de ácido nucleico (por ejemplo genes y/o fragmentos de genes) . La solución de prueba se etiqueta por medio de una etiqueta fluorescente para permitir la visualización de los resultados. La solución de prueba se incuba bajo condiciones para permitir que el dominio de enlace de oligonucleótido hibridize al ácido nucleico objetivo contenido dentro de la muestra. La solución no enlazada se enjuaga después de la configuración maestra. Las secuencias hibridizadas de ácido nucleico se visualizan usando un lector de configuración de ensayo, tal como aquel mencionado arriba de Molecular Dynamics. Las configuraciones de ensayo se lavan con una solución salina amortiguadora de fosfato que contiene Tween 20 al 0.05% (PBS/Tween), después se m, bloquean con una solución amortiguadora de hibridización, que consiste de SCC 4X (NaCl 0.6 M, citrato 0.06M, pH 7.0), lauroilsarcosina al 0.1% (p/v), y dodecil sulfato sodio al 0.02% (p/v), a 55°C durante 30 minutos. Una muestra que contiene ADN que tiene una secuencia complementaria a una de las sondas inmovilizadas de oligonucleótido en la configuración, se aplica a la superficie de soporte de la fibra y se incuba durante una hora a 55°C en una cámara de hibridación sellada. La superficie de soporte se lava después con SSC 2X que contiene SDS al 0.1% (dodeciisulfato de sodio) durante 5 minutos a 55°C, después de lo cual 50 fmol de una sonda de detección etiquetada fluorescente que es complementaria a otra secuencia en el ADN objetivo, se aplica a la superficie de soporte y se incuba durante una hora a 55°C. La superficie de soporte se lava entonces con SSC 2X que contiene SDS al 0.1% durante 5 minutos a 55°C, seguida por un lavado con SSC O.lx, secada después y el patrón de fluorescencia registrado por el instrumento de análisis de imágenes, por ejemplo un lector de configuración (por ejemplo, como está comercialmente disponible de Molecualr Dynamics) .

Alguien con habilidad en el arte, apreciará que la presente invención puede suministrar una diversidad de secuencias de oligonucleótidos en asociación con un grupo particular de fibras. En 5 una modalidad, por ejemplo, los pozos de fibras se recubren individualmente con agentes específicos de enlace. En otra modalidad, los pozos de fibras se recubren simultáneamente con un agente general de enlace (por ejemplo, iminobiotina ) . En esta modalidad, los pozos de fibras se cargan de una mezcla de micro-perlas específicas de agente de enlace cada una conteniendo el complemento al agente general de enlace (por ejemplo, X-avidina). 15 Opci nalmente, el sistema incluye, además, un lector de configuración, por ejemplo, un lector de configuración de ensayo tal como el que está comercialmente disponible de Molecular Dynamics. La configuración resultante de ensayo puede usarse de manera convencional, por ejemplo, la configuración de ensayo puede leerse por un lector estándar de configuración, mientras que la configuración maestra se puede re-utilizar para preparar más configuraciones de ensayo al repetir algunas o todas las etapas arriba establecidas. rt?aaalMiM^^BM^^^^^^^,,^ Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resuLta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. Un sistema para replicar una configuración de sonda específica de ligandos de enlace, el sistema caracterizado porque comprende: a) una configuración maestra que comprende una superficie de soporte que tiene una pluralidad de ligandos de dirección inmovilizados en la misma en forma de una configuración que sigue un patrón; b) una pluralidad de conjugados multiligando, cada conjugado mult i-ligando comprende un núcleo que tiene colocado al mismo: (i) una o más moléculas de un primer dominio de enlace de ligando, que comprende un ligando seleccionado para enlazarse de una forma específica con un ligando particular de dirección de la configuración maestra, (ii) una o más moléculas de un segundo dominio de enlace de ligando, que comprende un ligando seleccionado para enlazarse de una forma específica con un ligando objetivo, y (iii) una o más moléculas de un tercer ligando, seleccionado del grupo que consiste de ligandos de enlace y grupos polimerizables; y c) un soporte de la configuración de ensayo que comprende una superficie de soporte para la configuración replicada.
2. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los ligandos de dirección, el primer dominio de enlace de ligando, y el segundo dominio de enlace de ligando cada uno, independientemente, comprenden un ácido nucleico.
3. El sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ácido nucleico comprende secuencias sintéticas de oligonucleótidos.
4. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además un agente de enlace, el agente de enlace acopla al ligando de dirección con la superficie de soporte de la configuración maestra.
5. El sistema de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el agente de enlace comprende una micro-perla.
6. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer dominio de enlace de ligando, el segundo dominio de enlace de ligando y el tercer ligando se colocan cada uno independientemente al núcleo del conjugado multi-ligando .
7. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando de enlace comprende un derivado de biotina.
8. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los grupos polimeri ables se seleccionan del grupo que consiste de grupos acrílico y vinilo.
9. El sistema de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el soporte de la configuración de ensayo se recubre con sitios de colocación para el tercer ligando.
10. El sistema de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el tercer ligando comprende un ligando de enlace, y los sitios de colocación comprenden moléculas de una pareja específica de enlace para el ligando.
11. Un método para replicar una configuración de sonda específica de ligandos de enlace, el método caracterizado porque comprende: a) suministrar una configuración maestra que comprende un soporte que tiene una pluralidad de ligandos de dirección inmovilizados en la misma; b) suministrar una pluralidad de conjugados multi-ligando, cada conjugado multi-ligando comprende un núcleo que tiene colocado al mismo: (i) una o más moléculas de un primer dominio de enlace de ligando, que comprende un ligando seleccionado para enlazar de una forma específica con un ligando particular de dirección de la configuración maestra, (ii) una o más moléculas de un segundo dominio de enlace de ligando, que comprende un ligando seleccionado para enlazar de una forma específica con un ligando objetivo, y (iii) una o más moléculas de un tercer ligando, seleccionado del grupo que consiste de ligandos de enlace y grupos polimerizables; c) colocar los conjugados multi-ligando a la configuración maestra al permitir a los primeros dominios de enlace de ligando enlazarse de una forma específica con los ligandos complementarios de dirección; d) suministrar un soporte de configuración de ensayo; e) traer el soporte de la configuración de ensayo en suficiente proximidad con la configuración maestra, bajo condiciones apropiadas para permitir que los conjugados multi-ligando colocados se coloquen a la superficie de la configuración de ensayo; y f) desasociar el ligando complementario de dirección enlazado y el primer dominio de enlace de ligando bajo condiciones apropiadas para permitir que el soporte de la configuración de ensayo se recupere y se use.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el tercer ligando comprende un grupo polimerizable.
13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los ligandos de dirección, el primero y segundo ligandos de enlace cada uno, independientemente, comprenden un ácido nucleico.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el ácido nucleico comprende secuencias sintéticas de oligonucleótido.
15. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la etapa de suministrar una configuración maestra comprende suministrar una configuración maestra que tiene una pluralidad de agentes de enlace inmovilizados sobre la misma, en donde los agentes de enlace se acoplan con uno o más ligandos de dirección.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el agente de enlace comprende una micro-perla.
17. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el primer dominio de enlace de ligando, el segundo dominio de enlace de ligando y el tercer ligando se colocan independientemente al núcleo del conjugado multi-ligando .
18. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los ligandos de enlace comprenden derivados de biotina .
19. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los grupos polimerizables se seleccionan del grupo que consiste de grupos acrílico y vinilo.
20. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la etapa de suministrar un soporte de la configuración de ensayo comprende suministrar un soporte de la configuración de ensayo recubierto con sitios de colocación para el tercer ligando.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el tercer ligando comprende un ligando de enlace, y los sitios de colocación comprenden una pareja específica de enlace para el tercer ligando. ^ -„„-,-