WO1998037231A2 - Markierung von nukleinsäuren mit speziellen probengemischen - Google Patents

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WO1998037231A2
WO1998037231A2 PCT/DE1998/000491 DE9800491W WO9837231A2 WO 1998037231 A2 WO1998037231 A2 WO 1998037231A2 DE 9800491 W DE9800491 W DE 9800491W WO 9837231 A2 WO9837231 A2 WO 9837231A2
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Christoph Cremer
Michael Hausmann
Thomas Cremer
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Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6839—Triple helix formation or other higher order conformations in hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the invention relates to special DNA sample mixtures for the specific labeling of nucleic acids, in particular double-stranded DNA, a method for labeling double-stranded DNA by means of in situ hybridization under non-denaturing conditions using the special DNA sample mixtures, and a method for producing such special DNA sample mixtures .
  • This method allows the construction of specific DNA samples for the fluorescence in situ hybridization of DNA targets with a diameter typically shorter than the minimum half-width of the main maximum of the effective point image function of the optical system used (for example a far-field microscope or a slit -Scan flow fluorometers) without thermally, chemically or enzymatically induced denaturation of the target DNA.
  • Reporter molecules that have a high affinity for corresponding fluorochrome complexes are usually integrated into these samples.
  • certain fluorochrome complexes can also be built directly into the markers, if necessary via a linker of suitable length.
  • both fluorescent labeling methods according to the invention are also referred to as labeling.
  • the available color spectrum of the fluorochromes extends from the visible spectrum to the infrared.
  • the lifetime of the fluorescence emission can also be used as a parameter for the detection of the marker.
  • the properties of the absorption spectrum, emission spectrum and fluorescence lifetime are referred to below as the spectral signature.
  • the detection according to the invention of the target regions marked by such fluorescent markers is carried out, for example, by far field microscopy (eg epifluorescence microscopy, confocal laser scanning) Microscopy, wave field microscopy, fluorescence correlation microscopy, with or without additional axial tomography techniques). High-resolution precision microscopy techniques can be used in particular for the acquisition of 3D genome microstructures.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • Nucleic acids have been found that single-stranded nucleic acid sequences with double-stranded duplex nucleic acid sequences can form a three-stranded triple formation, the bases being able to bind in a triplex structure in the case of polypyrimidine or polypurine nucleic acid sequences. Certain mixed sequences of purine bases or pyrimidine bases are also permissible in the triple formation.
  • PNA-FISH FISH
  • the thermally denatured, single-stranded DNA sample can also be applied to the undenatured target at temperatures binds below 40 ° C; this can be interpreted in such a way that three-stranded formations of single-stranded sample DNA and double-stranded target DNA form in the marking area.
  • Another possibility for the formation of triple formations from sample and target DNA consists in the frequent binding of double-stranded sample DNA to single-stranded target DNA in the vicinity of naturally occurring triple formations of the chromosomal DNA.
  • Such hybridization conditions in particular the specific attachment of labeled, modified, single-stranded DNA sequences under physiological temperature and buffer conditions for the visualization of the
  • Attachment sites are the prerequisite for FISH with nucleic acid samples in vital cells or microtargets carrying undenatured DNA sequences (Vital FISH).
  • RNA-FISH fluorescence in situ hybridization of RNA samples
  • GFP Green Fluoresceing Protein
  • HSR homogeneous staining regions
  • FISH Hybridization method
  • FISH fluorescent markers
  • the object of the invention is to provide special DNA sample mixtures which are suitable for in situ hybridization under non-denaturing conditions, and a method for in situ hybridization under non-denaturing conditions using the special DNA sample mixtures. Furthermore, the task is to establish a method for producing special DNA sample mixtures for specific in situ hybridization.
  • Corresponding sample mixtures can be obtained by polypurine and / or polypyrimidine from the DNA sequence of the DNA targets to be labeled by means of computer analysis or experimentally with the aid of suitably produced DNA chips
  • Subsequences determined, each covering a minimum number of nucleotides (example for the nuclear genome: Fig. 1).
  • a DNA sample mixture is produced from these sub-sequences, which binds preferentially, ie with a high fluorescence signal and / or with spectral colocalization, in the region of the target DNA region to be labeled (FIG. 2) with the formation of triple strands.
  • This method can be used, for example, for vital labeling or for in vivo labeling of microgenome structures in cell nuclei for the analysis of 3D genome organization and 3D genome pathology using multispectral precision microscopy.
  • the method is not only important for basic research in biology and medicine, but in particular also for diverse aspects of clinical research and routine diagnostics.
  • the method is suitable for obtaining specific oligonucleotides and has the above-mentioned application examples
  • various other areas of application in particular in the field of microsensor technology, for example to test DNA solutions for the presence of certain double-stranded DNA sequences (FIG. 3).
  • these DNA-sample mixtures can be used, for example, in fluorescence microscopy, in slit-scan flow fluorometry, and in the sensor technology of individual microtargets.
  • DNA sample mixtures established according to the invention can also be suitable for in vivo in situ hybridization.
  • the DNA sample mixtures established according to the invention should enable the specific labeling of naturally occurring double-stranded DNA target sequences and thus also make individual small sections of the genome accessible for optical analysis, for example by high-resolution and ultra-high-resolution fluorescence microscopy or by means of a DNA chip.
  • the in situ hybridization process with these sample mixtures is preferably carried out at temperatures between 0 ° C. and 50 ° C., particularly preferably between 20 ° C. and 37 ° C.
  • the sequences of the target nucleic acids complementary to the samples must not be spaced apart exceed that are defined by the resolution of the detection system used.
  • a coherent DNA sequence of the total length L is selected, for example, in a DNA sequence library.
  • this length L can correspond to a chromosomal sub-region whose mean diameter d ⁇ is less than or equal to the half-value width of the main maximum of the effective point image function
  • DNA sequences from DNA sequence libraries more often contain small sequence gaps up to a length of about lkbp. Such gaps are harmless to the method according to the invention and can be disregarded.
  • the DNA sequence of length L is searched for connected homopurin and / or homopyrimidine partial sequences of N> 15 nucleotides. These partial sequences are synthesized and / or amplified. During this process or afterwards, these partial sequences are fluorochromized with any fluorescent dyes having a suitable spectral signature. In the current state of the art, at least 10 fluorochromes with different spectral signatures are known, which can be coupled to DNA sequences in the manner according to the invention. All partial sequences with the same spectral signature or individual or several partial sequences with a different spectral signature can be marked.
  • a mixture of single-stranded DNA samples is produced from all or a suitable subset (for example only repetitive or only singular) of the partial sequences of the total labeling region T of length L prepared in this way, it being possible for all the partial sequences occurring therein to be present in a defined mixing ratio.
  • the different partial sequences of the sample mixture can be provided with the same or with different spectral signatures.
  • the sample mixture is then brought together with the cell target to be marked or the DNA sequence to be analyzed.
  • the sample mixture can be introduced into the cells by known methods, for example by microinjection or by membrane-permeable transport methods.
  • the sample mixture is left under defined, for example physiological or almost physiological, reaction conditions on the DNA target sequence to be labeled tie along the length L (Fig. 1). Since the length L or any connected parts of L, which are covered, for example, with DNA partial sequences that are labeled with dyes of different spectral signatures, their mean diameter d ⁇ in the genome is smaller than the full width at half maximum of the main maximum of the resolution-equivalent point image function of the optical analysis system used , for example a microscope (hereinafter abbreviated as FWHM), the marking with the sample mixture described above leads to an apparently optically coherent, "punctiform" marking (FIG. 2), ie all those spectral from the individual, fluorochrome-labeled nucleotide sequences Signature intensities emitted in the signature add up to an overall intensity of this spectral signature in the center of the diffraction image.
  • FOG. 2 optically coherent, "punctiform" marking
  • the mixing ratio of the partial sequences involved in the labeling sample mixture can be, for example, 1: 1; other mixing ratios are expressly permitted.
  • the partial sequences can be labeled with fluorochromes of the same spectral signature or with fluorochromes of different spectral signature.
  • a specific target sequence T of length L can be detected by a) marking all partial sequences with fluorochromes of the same spectral signature S; or that b) some of the sequences are marked with a spectral signature S and another part with a spectral signature S 2j or other parts with spectral signatures S n ; or that c) a combination of a) and b) is carried out.
  • the binding site is discriminated against the target sequence of non-specifically bound partial sequences by the increased intensity of the fluorescence signal: Since the diameter d ⁇ of the target region is smaller than the FWHM, the intensity contributions of the fluorescence emission of the specifically bound partial sequences add up, while the non-specifically bound partial sequences are subject to a random spatial distribution in the object, the mean distance of which, under suitable conditions, is larger than the FWHM. As a consequence, the intensity of these isolated fluorescence signals ("background”) is considerably lower. If, for example, 10 partial sequences are specifically bound to the target and the remaining partial sequences in the preparation are randomly distributed, the location of the target can be identified on the basis of its approximately 10 times as large a fluorescence signal .
  • the specific binding site to the target T is identified on the basis of the colocalization of fluorescence signals of different spectral values
  • the target contains only 3 binding sites for partial sequences t ,, t 2 , t 3 , which were each marked with the spectral signatures Si, S 2 and S 3 .
  • the intensity of each of tt 2 and t 3 will be detected Do not distinguish fluorescence signals at the location of the target from the intensity of the "background signals" of unbound sample molecules.
  • the location of the target is determined by the simultaneous occurrence of fluorescence signals with the spectral signatures Si, S 2 and S 3 at the target location after correction of any that may occur chromatic shifts ("spectral colocalization").
  • Case c) is a combination of the two process examples a) and b):
  • the detection of the location of T due to the increased fluorescence signal from fluorochromes of a certain spectral signature and due to spectral colocalization of two or more spectral signatures is also an object of the invention.
  • the certainty of the unambiguous detection of the desired target location becomes particularly high.
  • Such increased reliability of the assignment can be of great importance, for example, in the detection of tumor-relevant target sequences in clinical pathology.
  • Two different target sequences T ,, T 2 with the respective lengths L ] 5 L 2 can be distinguished, for example, as follows:
  • the DNA sample sequences specific for the target T ] are all labeled with the same spectral signature S j ; the sample sequences specific for the target T 2 are all marked with a spectral signature S 2 .
  • the location of Tj is detected on the basis of the increased fluorescence signal of the spectral signature S,; the location of T 2 is detected on the basis of the increased fluorescence signal of the spectral signature S 2 .
  • the DNA sample sequences specific for the target T are marked with fluorochromes of the spectral signatures SS 2 , S 3 ; the DNA sample sequences specific for the target T 2 are marked with fluorochromes of the spectral signatures S 4 , S 5 , S 6 .
  • the location of T is detected in this case by the spectral colocalization of Si, S 2 , S 3 ; the location of T 2 is detected by the spectral colocalization of S 4 , S 5 , S 6 .
  • a suitable combination of methods a) and b) is also according to the invention, it also being possible to suitably vary the number and combination of the spectral signatures. Likewise, an expansion to more than 2 targets with the aid of a corresponding expansion of the number of spectral signatures is in accordance with the invention.
  • the targets can also be detected in this case using a specific spectral signature combination, regardless of the presence of the other targets become.
  • T by spectral colocalization of Si, S 2 , S 3 ; T 2 by spectral colocalization of S 4 , S 5 , S 6 ; T 3 detected by spectral colocalization of S 7 , S 8 , S 9 etc. (see above).
  • target Tj can be combined by the combination S 1 5 S 2 , S 3 ; Target T 2 by the combination SS 3 , S 4 ; Target T 3 by S ,, S 3 , S 5 ; Target T 4 by S ,, S 3 , S 6 ; Target T 5 can be characterized by S 2 , S 3 , S 4 , etc.
  • the determination of suitable oligonucleotide sequences from which suitable mixtures of DNA samples are produced is necessary can be.
  • One possibility described above consists in the selection of suitable oligonucleotide sequences from sequence databases of the target regions to be analyzed.
  • the following procedure can be used.
  • the number of theoretically possible oligonucleotides with a certain length that can form triple structures with the target DNA is limited. With a length of 15 bp, for example, there are 2 options; with a length of 20 bp, for example, there are 2 possibilities for an oligonucleotide sequence which consists only of purines or only of pyrimidines; in total this results in around 32,000 or 1 million possibilities.
  • These 15mers or 20mers can be synthesized on a DNA chip using known methods (eg GeneChip Probe Array from Affymetrix). In the current state of the art, several hundred thousand sequences have already been accommodated on a chip.
  • the total amount of one million features on a gene chip area can be at a distance of the individual features of also 1 ⁇ m of a few square millimeters.
  • the level achieved is already sufficient for the implementation of the invention described here using 15mer homopurine or homopyrimidine sequences.
  • Each place on the chip (“feature") is made up of a large number of identical oligonucleotides of a certain sequence, either only from purine bases (homopurine sequence) or only from pyrimidine bases
  • a chip with 32000 or 1 million different features can be designed in such a way that it contains all naturally occurring DNA 15mers or DNA 20mers, which can form triple structures when combined with double-stranded DNA sequences. If one then hybridizes total genomic DNA of a species or partial fractions of this DNA, e.g. the DNA of an individual chromosome, an individual chromosome arm, a chromosome band or a gene on this DNA chip, then it is possible to identify all sections with a length of (for example) 15 or 20 base pairs in these genomic DNA samples, the triple helical Can form structures. This hybridization can be carried out under both denaturing and non-denaturing conditions.
  • This approach allows the oligonucleotides required for the formation of triple structures (and thus the in vivo or vital labeling of chromosomal DNA targets) to be made available as a pool for the optical detection of a selected genomic section.
  • genomic DNA fractions which represent the DNA of the section of interest
  • DNA fractions which represent the rest of the genomic DNA
  • sequences found here by chip are suitable for in vivo or vital labeling and can be used, for example, in precision microscopy.
  • An important advantage of the invention is the systematic construction of DNA sample mixtures which cover one or more given labeling regions in the genome.
  • a particular advantage of this procedure is that, unless suitable computer DNA sequence libraries are available, the oligonucleotides of interest with triple-forming properties with a chip of the type described above Genomic DNA species of any species can be identified without DNA sequence information must already be available. This is of particular interest for the rapid identification of relevant oligonucleotide sequences with triple-forming properties in genomes which have not yet been sequenced, such as, for example, most pathogens of infectious diseases.
  • the average diameter d ⁇ of the marking region is presumably smaller than the FWHM. This means that the fluorescence signals of the single, short three-stranded labeling sites and the single-stranded sections in the immediate vicinity (distance of the single-stranded sections ⁇ 100 base pairs from the nearest base triplet of a triple-strand configuration) overlap constructively in the target region and / or for spectral colocalization can be used; a significant improvement in the signal-to-noise ratio or target identification can be achieved, which enables fluorescence detection of targets labeled in this way under in vivo, physiological or almost physiological conditions.
  • An automatic computer analysis of existing DNA sequence libraries or the use according to the invention of a DNA chip for oligonucleotide extraction enables the search for generalized homopurine or homopyrimidine sequences with 15 or more nucleotides from a specific longer DNA sequence.
  • These natural partial sequences which are suitable for the formation of triple formations, can cover an entire sequence with a target diameter d ⁇ ⁇ FWHM with a fluorochrome of a certain spectral signature in the case of natural chromatin folding, as is present in the cell nucleus, in such a way that it is possible to cover these in one image segment Accumulate so strongly that the location of the target can be discriminated against possible background fluorescence.
  • This background fluorescence can arise, for example, if individual partial sequences from the entire mixture of all partial sequences also bind non-specifically.
  • suitable fluorochromes and image recording and Processing techniques can be improved so decisively with a sample mixture constructed in accordance with the invention that the specific marking signal compared to the non-specific background signal is such that a clear one
  • DNA sample mixtures according to the invention contain in aqueous solution at least two labeled oligonucleotides, each of which is either a homopurin or
  • the aqueous solution preferably additionally contains salts such as sodium and / or magnesium chloride in concentrations between 0.1 and 100 mM. Furthermore, the aqueous solution can punch buffer, preferably contain phosphate buffer.
  • a marking kit can thus be produced which makes it possible to carry out the treatment without extensive target treatment, i.e. in particular without chemical, enzymatic and / or thermal target denaturation, to carry out a specific FISH.
  • target treatment i.e. in particular without chemical, enzymatic and / or thermal target denaturation
  • physiologically relevant conditions such as are generally present when the patient material is obtained, no longer need to be changed. This is a decisive advantage also considering the gentle treatment of the cell material to be analyzed in order to preserve relevant structural information.
  • test material e.g. human cells or chromosome preparations
  • sample mixture according to the invention added.
  • the sample mixture is preferably heated immediately before the ISH to a temperature between 85 ° C. and 95 ° C. and then to
  • Hybridization temperature cooled. If the test material contains DNA sequences that are complementary to the oligonucleotide sequences of the sample mixture, the oligonucleotides of the sample mixture hybridize with the complementary double-stranded DNA sequences of the test material, triplex strands being formed. After an incubation period of between 1 minute and 1 hour, preferably between 2 and 10 minutes, washing can be carried out once or twice. The detection is then carried out using common techniques, for example digital fluorescence microscopy.
  • sample mixtures produced according to the invention open up the advantage of a specific in vivo marking of genome structures in the cell nucleus for a multispectral analysis of the genome organization and its functional importance.
  • the DNA sample mixture can be handled with the same simplicity as, for example, established DNA stains of clinical cytogenetics: the sample mixture is added to the preparation; to A suitable exposure time, e.g. at room temperature and a possibly short washing step, also at room temperature, can start the fluorescence microscopic evaluation.
  • corresponding DNA chips can be constructed in the sensor system, which recognize DNA sequences when attached to given samples, without the chip or the test material additionally requiring chemical and / or thermal treatment.
  • the requirements for the optical system used for detection can be considerably reduced. For example, it is possible to use microscope optics of lower numerical aperture (i.e. lower FWHM) if the dimensions of the chip are adjusted accordingly (Fig. 3). Since today very complex systems for optical analysis of DNA chips, e.g. confocal laser scanning microscopes are used, the method can be made much more economical.
  • Fig. 2a Amplification of the identified (Pu ... Pu) / (Py ... Py) sequences on the target T: Labeling with suitable fluorochromes (label F)
  • Fig. 2b Fluorescence in situ hybridization with a mixture of t] ... t M or some of these sequences.
  • Fig. 3 DNA chip of suitable dimensions with 2 "features 1.1, 1.2, ..., ln, 2.1, 2.2, ..., nn Each feature has dimensions and distances from the neighboring features that are dependent on the detection system. 1: Distance between the features> 2 half widths; 2: feature; d ⁇ : diameter of the target.
  • the following exemplary embodiments explain the invention on the basis of its use in precision microscopy for genome research, the use of the sample mixtures produced according to the invention being explained on the basis of research into the pathology of the three-dimensional genome structure. It is important to research the changes in native microstructures of the genome in the cell nucleus that are correlated or causally responsible for pathological changes in cells. Sample mixtures which are suitable for answering such fundamental questions of modern human genetics and cellular pathology are to be expected that they can also be suitable as markers with regard to clinical diagnostics for such genome changes.
  • the human genome is not randomly distributed in the cell nucleus; numerous research results indicate that, depending on the cell type and status, it is subject to a three-dimensional compartmentalization, which has functional importance.
  • the prerequisite for deciphering the ordered three-dimensional genome structure is specific DNA labeling methods, which do not change the existing native chromatin structure in the cell nucleus and may also be suitable for making dynamic processes visible in vivo.
  • highly sensitive microscopy methods are currently being developed which allow quantitative distance analyzes of labeled short DNA sequences, proteins etc. in the intact cell nucleus down to a few tens of nanometers.
  • new types of fluorescent dye complexes are used, which, thanks to a high fluorescence quantum yield and a high signal / noise ratio, already allow the detection of individual or fewer molecules that can be coupled with DNA sequences.
  • Sample mixtures as they can be constructed and produced according to the invention, enable FISH under non-denaturing, physiological conditions and can also be injected into living cells or introduced in other ways. Since a natural attachment, ie without further external influence, to the target sequence to be labeled in the genome can subsequently take place as a result of diffusion processes, the above-mentioned, essential gap in future high-precision genome research can thus be closed.
  • the extraction of a sample mixture for two selected target regions on the human X chromosome and its detection are to be outlined below.
  • oligonucleotide sequences 1) Determination of the oligonucleotide sequences: a) The DNA sequence data files of locus 1 and locus 2 known from databases are checked for the presence of homopurin or homopyrimidine sequences of oligonucleotide length 15, obviously repetitive sequences (eg aaaaaaa., Or tttttt .. .) are not taken into account here.
  • the 15mers agg aag aaa aga aaa were found for locus 1; gaa ggg aga gag ggg; aag gag aag aa gag; aag gag aag aa gag; ggg gaa agg gga gag; etc.; tcc ctc ttc cct tcc; ctt ctc ctt ctctctctctctc;
  • locus 1 and locus 2 are obtained from existing gene banks, e.g. of the German Human Genome Project, obtained, amplified, labeled with fluorochromes, cleaved into oligonucleotides with a minimum size of 15 base pairs, and then hybridized in a stringent manner on DNA chips according to the invention.
  • DNA chips contain in a specific order all combinations of complementary purine 15mers or pyrimidine 15mers or a subset of them relevant here (e.g. only the purine / pyrimidine 15mers specific for the human X chromosome).
  • Sequence positions that occur in both locus 1 and locus 2 are eliminated for the preparation of the sample mixtures. If necessary, comparison hybridizations are carried out with the remaining genomic DNA, i.e. genomic DNA without the DNA sequences of locus 1 and locus 2; Instead of the remaining genomic DNA, suitable sub-fractions can also be used if necessary. All sequence positions that are found in the genome (possibly in a sub-fraction of the genome) apart from locus 1 or locus 2 are not taken into account when establishing the sample mixtures.
  • the oligonucleotide sequences for locus 1 and locus 2 found in 1) are synthesized by known methods and, for example, linked to terminal fluorochromes.
  • the oligonucleotide sequences specific for locus 1 are included Fluorochromes of a spectral signature S, marked at the 5 'end of the sequence, while the oligonucleotide sequences specific for locus 2 at the 5' end of the sequence are marked with fluorochromes of a spectral signature S 2 .
  • Signal amplification can be achieved by additionally marking the 3 'end with corresponding fluorochromes.
  • An experimental verification of specificity can e.g. by hybridization under suitable buffer, temperature and washing conditions on prepared metaphase chromosomes. For example, when a sample mixture of Locus 1 according to the invention is present, a FISH signal is only observed in the region Xq27.3 - q.28.
  • the sample mixtures established in 2) are micro-injected into integral cells.
  • methods of electroporation or vesicle-mediated incoporation can also be used.
  • washing steps the In Vivo-FISH can reduce the background signals through diffusion and cellular elimination processes.
  • Methods of ultra-high resolution digital fluorescence microscopy may be mentioned as an example for the detection of the binding sites.
  • 10 specific partial sequences for locus 1 and 10 specific partial sequences for locus 2 are assumed.
  • approximately 10-1000 fluorochrome molecules of the spectral signatures S j or S 2 are then to be detected at the binding sites of locus 1 or locus 2.
  • Targets with approx. 1000 fluorochrome molecules in total can still be specifically detected using the methods of conventional digital epifluorescence microscopy (e.g. using a highly sensitive, cooled CCD camera) or using established methods of confocal (1 photon) microscopy.
  • the location of the target can be discriminated against by non-bound, randomly distributed sample sequences with a sufficient signal-to-noise ratio (SNR) from non-specific binding sites.
  • SNR signal-to-noise ratio
  • other microscopic detection methods are indicated. In the current state of the art, for example, time-resolved microscopic fluorescence methods or confocal 2-photon microscopy or a combination of these methods can be used. With such techniques it is already possible today to detect single to a few fluorochromolecules suitable for DNA sample labeling.
  • the spectral colocalization method can be used here.
  • the location of locus 1 is indicated in situ by the colocalized detection of fewer fluorochrome molecules of the spectral signatures S 19 S 2 , S 3
  • the location of locus 2 by the colocalized detection of fewer fluorochrome molecules of the spectral signatures S 4 , S 5 , S 6 is specified.
  • one embodiment consists in that all or part of the triple strand-forming oligonucleotide sequences of a genome, chromosome, chromosome section, gene or gene section to be analyzed are applied to the chip in which Way that each feature contains single-stranded oligonucleotides of a certain sequence.
  • feature is understood to mean a single field on a chip to which oligonucleotides of the same sequence and length are applied.
  • the diameter of the features is less than / equal to the FWHM. However, the distance between the features can be chosen larger than this half-value width.
  • the (target) DNA to be analyzed is fluorescence-labeled after being broken down into fragments of suitable length (for example a few hundred base pairs) and can be present in a non-denatured (usually double-stranded) state in a solution by known methods under non-denaturing conditions hybridize the DNA chip. After a washing step, one is only in those feature locations Fluorescence intensity of a certain size was detected, in which double-stranded target DNA and single-stranded feature DNA formed a triple structure.
  • a specific application example is a DNA chip that is specific for the detection of locus 1 and locus 2 on the human X chromosome:
  • oligonucleotide sequences specific for locus 1 or locus 2 are synthesized / amplified separately from one another. Fluorochromation can be avoided here.
  • the oligonucleotide sequences are then deposited in a suitable amount individually at specific locations on a DNA chip. Possibly. further sequences can be stored in a control area of the DNA chip, e.g. allow testing of hybridization efficiency.
  • Fluorescent labeling hybridized to the DNA chip.
  • the position distribution of the fluorescence signals after detection with an optical system whose half-width FWHM is less than / equal to the diameter of the DNA features used gives the desired information about the existence of the relevant homopurin / homopyrimidine sequences in the patient's DNA. This information can e.g. can be used as markers for other, adjacent sequences.
  • oligonucleotide sequences on the DNA chip are marked with a fluorochrome A, the sample DNA with a fluorochrome B, in such a way that when sample DNA sequences are bound to oligonucleotide sequences on the DNA chip with suitable excitation an energy transfer takes place, which can be used for optical detection of the binding site.
  • the oligonucleotide sequences on the DNA chip are marked with a fluorochrome, such that when a sequence from the DNA to be examined is bound, a decrease (quenching) or an increase (enhancement) of the fluorescence signal occurs.
  • a fluorochrome such that when a sequence from the DNA to be examined is bound, a decrease (quenching) or an increase (enhancement) of the fluorescence signal occurs.

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Abstract

Die Erfindung betrifft spezielle DNA-Probengemische für die spezifische Markierung von Nucleinsäuren, insbesondere doppelsträngiger DNA, ein Verfahren zur Markierung von doppelsträngiger DNA mittels in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen unter Einsatz der speziellen DNA-Probengemische sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger spezieller DNA-Probengemische. Diese DNA-Probengemische bestehen aus mindestens zwei Oligonukleotiden, die entweder nur Purin oder nur Pyrimidinnukleotide enthalten. Hiermit sind beispielsweise in situ Hybridisierungen an nativen Zellkernen möglich.

Description

Markierung von Nukleinsäuren mit speziellen Probengemischen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft spezielle DNA-Probengemische für die spezifische Markierung von Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngiger DNA, ein Verfahren zur Markierung von doppelsträngiger DNA mittels in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen unter Einsatz der speziellen DNA-Probengemische sowie ein Verfahren zur Herstellung derartiger spezieller DNA-Probengemische. Dieses Verfahren erlaubt für jede beliebige Spezies die Konstruktion spezifischer DNA-Proben für die Fluoreszenz in situ Hybridisierung von DNA-Targets mit einem Durchmesser typischerweise kürzer als die minimale Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion des verwendeten optischen Systems (z.B. eines Fernfeld-Mikroskops oder eines Slit-Scan Flußfluorometers) ohne thermisch, chemisch oder enzymatisch induzierte Denaturierung der Target-DNA.
Durch den Einsatz von spezifischen DNA-Proben, RNA-Proben oder PNA-Proben, d.h. von Einzelstrangmolekülketten, die entsprechende komplementäre Targetsequenzen im Genom besitzen, ist es möglich, in Zellkernen und auf Chromosomen kleine (Sub)strukturen (=Targets) zu markieren bzw. DNA-Sequenzen auf DNA-Chips (Genchips) zu erkennen. Üblicherweise werden in diese Proben Reportermoleküle eingebunden, die eine hohe Affinität zu entsprechenden Fluorochromkomplexen besitzen. Es können aber auch bestimmte Fluorochromkomplexe direkt in die Marker eingebaut werden, ggf. über einen Linker geeigneter Länge. Im folgenden werden beide erfindungsgemäßen Fluroreszenz-Markierungsverfahren auch als Markierung bezeichnet. Das zur Verfügung stehende Farbspektrum der Fluorochrome reicht über das sichtbare Spektrum bis ins infrarote. Neben dem Emissions-Spektrum kann auch die Lebensdauer der Fluoreszenzemission als Parameter zur Detektion des Markers genutzt werden. Die Eigenschaften Absoφtionsspektrum, Emissionsspektrum und Fluoreszenzlebensdauer werden im folgenden als spektrale Signatur bezeichnet. Die erfindungsgemäße Detektion der durch solche Fluoreszenzmarker markierten Target-Regionen erfolgt beispielsweise durch Fernfeld-Mikroskopie (z.B. Epifluoreszenzmikroskopie, konfokale Laser- Scanning Mikroskopie, Wellenfeldmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsmikroskopie, mit oder ohne axialtomographische Ergänzungstechniken). Insbesondere zur Erfassung von 3D-Genom- Mikrostrukturen können höchstauflösende Präzisionsmikroskopietechniken eingesetzt werden.
Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit komplementären fluoreszenzmarkierten Nukleotidsequenzen werden in der Literatur als Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) bezeichnet. Die meisten bei FISH bisher eingesetzten Hybridisierungsprotokolle gehen davon aus, daß als Voraussetzung zu diesem Prozeß nicht nur die Proben-DNA, sondern auch die Target-DNA, die üblicherweise in Duplex Form vorliegt, in eine einzelsträngige Form überfuhrt werden muß (Denaturierung). Diese Denaturierung kann entweder chemisch (z.B. durch Verwendung einer entsprechend hohen Konzentration des Lösungsmittels Formamid oder anderer chaotroper Substanzen), enzymatisch und/oder thermisch (z.B. durch Aufheizen auf Temperaturen über 70°C) erfolgen. Die anschließende Renaturierung führt dann zur Bildung hybrider Doppelstränge aus Proben- und Target-DNA (Standard-FISH).
Diese Betrachtung des Hybridisierungsmechanismus geht davon aus, daß natürliche, in der Target-DNA vorhandene einzelsträngige Abschnitte für die in situ Hybridisierung nicht ausreichend sind. Dies kann für eine Reihe von DNA-Proben als Ganzes zutreffen. So wurde z.B. festgestellt, daß bestimmte DNA-Proben nur dann an chromosomale Targets hybridisieren, wenn eine Denaturierung des Targets und der Probe vorgenommen wurde.
Es ist jedoch bekannt, daß die Bindungsfähigkeit einzelsträngiger DNA-Proben stark von der DNA-Sequenz abhängt. Aufgrund von Untersuchungen an synthetischen
Nukleinsäuren konnte festgestellt werden, daß einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen mit doppelsträngigen Duplex-Nukleinsäuresequenzen eine dreisträngige Tripel-Formation bilden können, wobei im Falle von Polypyrimidin- bzw. Polypurinnukleinsäuresequenzen sich die Basen in einer Triplex-Struktur binden können. Auch gewisse gemischte Sequenzen aus Purinbasen oder Pyrimidinbasen sind bei der Tripel-Bildung zulässig.
Ferner ist bekannt, daß einzelsträngige Proben, in denen das Zucker-Phosphat-Rückgrat durch eine Polyamidkette (PNA) ersetzt wurde, sich in einer sequenzspezifischen Weise mit doppelsträngiger DNA zu einer neuen dreisträngigen Formation verbinden können (PNA-DNA). Dies wurde jüngst zur Visualisierung bestimmter repetitiver Sequenzen durch FISH experimentell realisiert (PNA-FISH). Wegen der in diesem Falle erfolgten Elimination der elekrostatischen Abstoßungskräfte zwischen der Target-DNA und der Proben-PNA ist dieses Verfahren mit weitgehend beliebigen Basensequenzen sowie sogar in Gegenwart hoher Konzentrationen an Formamid durchführbar; es hat jedoch den Nachteil eines erheblichen Aufwandes bei der Synthese der PNA-Proben.
Auf der Basis nicht-enzymatischer in situ Hybridisierungsverfahren, die zusätzlich auf denaturierende chemische Agenzien verzichten (Fast-FISH), konnte gezeigt werden, daß für bestimmte hochrepetitive DNA-Proben die thermisch denaturierte, einzelsträngige DNA-Probe auch an das nicht denaturierte Target bei Temperaturen unter 40°C bindet; dies kann so interpretiert werden, daß sich im Markierungsbereich dreisträngige Formationen aus einzelsträngiger Proben-DNA und doppelsträngiger Target-DNA bilden. Eine andere Möglichkeit der Ausbildung von Tripelformationen aus Proben- und Target- DNA besteht in der gehäuften Bindung doppelsträngiger Proben-DNA an einzelsträngige Target-DNA in der Nachbarschaft natürlich vorkommender Tripel-Formationen der chromosomalen DNA. Derartige Hybridisierungsbedingungen, insbesondere die spezifische Anlagerung markierter, modifizierter, einzelsträngiger DNA-Sequenzen unter physiologischen Temperatur- und Pufferbedingungen zur Visualisierung der
Anlagerungsorte, stellen die Voraussetzung für FISH mit Nukleinsäureproben in vitalen Zellen bzw. von nicht denaturierten DNA-Sequenzen tragenden Mikrotargets dar (Vital- FISH).
Die in vivo Fluoreszenz-Markierung entsprechender Loci im Zellkern ist bisher gelungen für: Nukleoli mithilfe einer Fluoreszenz in situ Hybridisierung von RNA-Proben (RNA- FISH); für Zentromerregionen mit einem Zentromerspezifischen Protein, das mit Hilfe eines gekoppelten "Green Fluoresceing Protein" (GFP) visualisiert wurde; für gewisse "Homogeneously Staining Regions" (HSR) mit einem Lac Operon-spezifischen GFP- gekoppelten Protein; und für ganze Chromosomenterritorien unter Ausnutzung von
Replikationsmechanismen. Nachteil dieser Verfahren ist, daß sie relativ auffwendig sind und damit für Routineanwendungen nicht in Frage kommen.
Wesentlich einfachere und schnellere Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von Nukleinsäuresequenzen stellen die verschiedenen Fluoreszenz-in-situ
Hybridisierungsverfahren (FISH) dar. Keines der bekannten FISH-V erfahren (Standard- FISH, Fast-FISH, PNA-FISH, RNA-FISH) erlaubte jedoch, mithilfe von DNA-Proben außerhalb von chromosomalen Subregionen mit hochrepetitiver DNA vital, in vivo bzw. unter physiologischen Bedingungen (= Verzicht auf Denaturierung) eine Fluoreszenzmarkierung durchzuführen, und gleichzeitig kleine und kleinste Genomabschnitte spezifisch zu markieren. Analog ist bisher in der Mikrosensorik kein DNA-in situ Hybridisierungsverfahren bekannt, das auf eine der Targetdenaturierung vergleichbare Prozedur verzichtet.
Die derzeit verfügbaren Techniken zur Visualisierung, insbesondere durch Fluoreszenzmarker (FISH), von Target DNA Sequenzen auf Chromosomen, in Zellkernen und auf DNA-Chips erfordern besonders dann, wenn eine hohe Spezifität (Stringenz) der Markierung gefordert ist, eine umfangreiche Behandlung des Targets. Bei den meisten heute angewandten FISH-Techniken ist dies insbesondere die Denaturierung und die daraus folgenden notwendigen nachfolgenden präparativen Schritte. So erfordert der Einsatz chaotroper chemischer Agenzien, wie z.B. das üblicherweise in den meisten in situ Hybridisierungsprotokollen verwendete Lösungsmittel Formamid, meist relativ arbeitsaufwendige Waschprozeduren nach erfolgter in situ Hybridisierung, um eine stringente Probenbindung zu gewährleisten. Aber auch eine rein physikalische, d.h. thermische, Denaturierung des Targets, bei der auf derartige extensive Waschprozeduren verzichtet werden kann, erfordert immer noch mehrere Behandlungsschritte des Targets. Die verwendeten Temperaturen führen aufgrund der Denaturierung von chromosomalen Proteinen zu einer Veränderung der Tertiärstruktur des Chromatins und beeinflussen die Konformation der chromosomalen DNA, teilweise in erheblicher Weise. Bei hochempfindlichem Untersuchungsmaterial für die klinische Diagnostik in der Genompathologie und für die Erforschung der dreidimensionalen (3D) Genomstruktur ist jedoch größte Materialschonung erforderlich, um nicht etwa für die Untersuchung relevante 3D-Strukturen zu verändern oder zu zerstören. Insgesamt ist selbst bei Verwendung der mittlerweile kommerziell erhältlichen "Ready to use" Probenkits ein erheblicher Arbeitsaufwand sowie eine, insbesondere in der klinischen Diagnostik, lange Erfahrung mit FISH-Methoden erforderlich, um die korrekte FISH-Markierung von Patientenmaterial zu ermöglichen.
Aus diesen Gründen ist es sowohl für die Grundlagenforschung (= Erforschung nativer 3D-Strukturen des Genoms und ihrer funktionalen Bedeutung, z.B. in der Genompathologie) als auch für die klinische Diagnostik von großer Bedeutung, daß das Targetmaterial möglichst ohne oder mit nur geringer Vorbehandlung markierbar und analysierbar ist. Dies bedeutet, das Target in vivo oder in einem dem in vivo Zustand nahe kommenden (vitalen) Zustand zu halten. Alle bisher bekannten in situ Hybridisierungsverfahren, bei denen von einem vital konservierten Target gesprochen werden kann, erlauben jedoch keine DNA-DNA FISH beliebiger spezifischer, kleiner Genomabschnitte, wie z.B. einzelner Gene oder tumorrelevanter Genomloci (genannt seien hier als ein Beispiel die im Zusammenhang mit bestimmten Leukämien relevanten Loci abl-bcr auf den Chromosomen 9 und 22). Wie in der Mikroskopie ist auch in der Sensorik die online Detektion von spezifischen doppelsträngigen DNA-Sequenzen mithilfe von DNA-Proben bisher ohne eine Vorbehandlung, wie z.B. einer Denaturierung, nicht möglich. Der Einsatz entsprechender Chemikalien und/oder die thermische Behandlung können jedoch den Sensor übermäßig belasten und beispielsweise die Empfindlichkeit im Routinebetrieb negativ beeinflussen. Auch bei denjenigen Anwendungen in der Sensorik, wo eine Denaturierung keine negativen Auswirkungen auf Belastbarkeit und Empfindlichkeit hat, ist der mit einer Denaturierung verbundene Aufwand zu berücksichtigen. Gleiches gilt auch für Untersuchungen an FISH-markierten Zellpräparaten, in denen die DNA durch spezielle Verfahren, wie z.B. Halopräparation oder Comet-Assay, freigelegt wurde.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, spezielle DNA-Probengemische, die geeignet sind zu einer in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen, sowie ein Verfahren zur in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen unter Verwendung der speziellen DNA-Probengemische zur Verfügung zu stellen. Weiterhin besteht die Aufgabe in der Etablierung eines Verfahrens zur Herstellung von speziellen DNA-Probengemischen für die spezifische in situ Hybridisierung.
Diese Aufgabe wird gelöst durch Probengemische gemäß Anspruch 1 , sowie durch Verfahren gemäß der Ansprüche 3 und 10.
Entsprechende Probengemische kann man dadurch gewinnen, daß man aus der DNA- Sequenz der zu markierenden DNA-Targets mittels Computeranalyse oder experimentell mithilfe geeignet hergestellter DNA-Chips Polypurin und/oder Polypyrimidin
Subsequenzen bestimmt, die jeweils eine Mindestzahl an Nukleotiden abdecken (Beispiel für das Zellkerngenom: Fig. 1). Von diesen Subsequenzen wird ein DNA-Probengemisch hergestellt, das bevorzugt, d.h. mit hohem Fluoreszenzsignal und/oder mit spektraler Kolokalisation, im Bereich der zu markierenden Target-DNA Region bindet (Fig. 2) unter Bildung von Tripelsträngen. Eingesetzt werden kann dieses Verfahren beispielsweise zur Vital-Markierung oder zur in vivo Markierung von Mikrogenomstrukturen in Zellkernen für die Analyse der 3D-Genomorganisation und 3D-Genompathologie mittels multispektraler Präzisionsmikroskopie. Aufgrund dessen, daß auf eine Target- Denaturierung sowie auf alle präparativen Sekundärschritte verzichtet werden kann, ist das Verfahren nicht nur für die Grundlagenforschung in Biologie und Medizin, sondern insbesondere auch für vielfältige Aspekte der klinischen Forschung und der Routinediagnostik von Bedeutung. Das Verfahren eignet sich für die Gewinnung spezifischer Oligonukleotide und besitzt über die oben genannten Anwendungsbeispiele hinaus verschiedene weitere Einsatzgebiete, insbesondere im Bereich der Mikrosensorik, um z.B. DNA-Lösungen auf das Vorhandensein bestimmter doppelsträngiger DNA- Seqenzen zu testen (Fig. 3). Weiterhin sind diese DNA -Probengemische beispielsweise anwendbar in der Fluoreszenzmikroskopie, in der Slit-Scan Flußfluorometrie, sowie in der Sensorik einzelner Mikrotargets. Dabei kann auf die übliche Vorbehandlung des Targets, d.h. insbesondere auf eine chemische, enzymatische und/oder thermische Denaturierung, verzichtet werden. Das bedeutet, daß erfindungsgemäß etablierte DNA-Probengemische auch für eine in vivo in situ Hybridisierung geeignet sein können. Insbesondere sollen die erfmdungsgemäß etablierten DNA-Probengemische die spezifische Markierung natürlich vorkommender, doppelsträngiger DNA-Targetsequenzen ermöglichen und so auch einzelne kleine Abschnitte des Genoms einer optischen Analyse, z.B. durch hoch- und höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie oder mittels eines DNA-Chips, zugänglich machen.
Durch die Erforschung der DNA-Sequenz des menschlichen Genoms stehen heute umfangreiche DNA-Sequenzbibliotheken auf entsprechenden Computern zur Verfügung. Da sich solche Bibliotheken auch für andere Spezies im Aufbau befinden, ist eine grundsätzliche Beschränkung auf das Humangenom nicht erforderlich. Dies ist von erheblichem, auch klinischem Interesse, z.B. für die vereinfachte Mikrosensorik von DNA-Sequenzen von Krankheitserregern.
Eigene Untersuchungen haben gezeigt, daß Homo-Purin bzw. Homo-Pyrimidinsequenzen wesentlich häufiger auftreten als bisher angenommen. Dies macht derartige Sequenzen für die Nukleinsäurediagnostik interessant, zumal derartige Sequenzen besonders zur Bildung von Triple Strukturen geeignet sind, das heißt, daß sich entsprechende einzelsträngige Proben-Nukleinsäuren an doppelsträngige Target-Nukleinsäuren sequenzspezifisch anlagern. Allerdings sind einzelne Oligonukleotide mit Längen zwischen 15 und 30 Basenpaaren für die spezifische Markierung von Targetnukleinsäuren wenig geeignet, da sehr ausgeprägte Hintergrundsignale die Detektion erschweren. Erfindungsgemäß werden daher für die in situ Hybridisierung unter nicht denaturierenden Bedingungen
Probengemische verwendet, die mindestens zwei Homopurin- und/oder Homopyridin - Oligonukleotide enthalten. Diese Proben-Oligonukleotide sind mit gleichen oder unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern versehen. Das in situ Hybridisierungsverfahren mit diesen Probengemischen wird bevorzugt bei Temperaturen zwischen 0°C und 50°C, besonders bevorzugt zwischen 20°C und 37°C, durchgeführt. Um mit zwei oder mehreren Proben-Oligonukleotiden ein einzelnes Signal zu erhalten, dürfen die zu den Proben komplementären Sequenzen der Targetnukleinsäuren bestimmte Abstände nicht überschreiten, die definiert sind durch das Auflösungsvermögen des verwendeten Detektionssystems.
Zur Herstellung erfindungsgemäßer Proben-Oligonukleotide wird beispielsweise in einer DNA-Sequenzbibliothek eine zu markierende, zusammenhängende DNA-Sequenz der Gesamtlänge L ausgewählt. L bedeutet hierbei eine lineare geometrische Länge eines DNA-Fadens der gesamten Basensequenz (1 kbp läßt sich zu ca. L = 350 nm abschätzen). Diese Länge L kann im unbehandelten (ggf. vitalen) Zellkern einer chromosomalen Subregion entsprechen, deren mittlerer Durchmesser dτ kleiner oder gleich der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion
(auflösungsäquivalente Größe) des für die anschließende Analyse der Markierungsregion bzw. Zelle verwendeten Optischen Systems ist. DNA-Sequenzen aus DNA- Sequenzbibliotheken enthalten häufiger kleine Sequenzlücken bis zu einer Länge von etwa lkbp. Derartige Lücken sind für das erfindungsgemäße Verfahren unschädlich und können außer Betracht bleiben.
Die DNA-Sequenz der Länge L wird nach zusammenhängenden Homopurin und/oder Homopyrimidin Teilsequenzen von N > 15 Nukleotiden abgesucht. Diese Teilsequenzen werden synthetisiert und/oder amplifiziert. Während dieses Prozesses oder danach werden diese Teilsequenzen mit beliebigen Fluoreszenzfarbstoffen geeigneter spektraler Signatur fluorochromiert. Beim gegenwärtigen Stand der Technik sind mindestens 10 Fluorochrome mit verschiedener spektraler Signatur bekannt, die in erfindungsgemäßer Weise an DNA-Sequenzen gekoppelt werden können. Es können alle Teilsequenzen mit gleicher spektraler Signatur oder einzelne oder mehrere Teilsequenzen mit unterschiedlicher spektraler Signatur markiert werden.
Aus allen oder einer geeigneten Teilmenge (z.B. nur repetitive oder nur singuläre) der so vorbereiteten Teilseqenzen der Gesamtmarkierungsregion T der Länge L stellt man ein Gemisch einzelsträngiger DNA-Proben her, wobei alle darin vorkommenden Teilsequenzen in einem definierten Mischungsverhältnis vorliegen können. Die verschiedenen Teilsequenzen des Probengemisches können mit derselben oder mit verschiedenen spektralen Signaturen versehen sein. Anschließend wird das Probengemisch mit dem zu markierenden Zelltarget bzw. der zu analysierenden DNA-Sequenz zusammengebracht. Im Falle der in vivo Markierung kann das Probengemisch mittels bekannter Verfahren, z.B. durch Mikroinjektion oder durch membranpermeable Transportverfahren, in die Zellen eingebracht werden. Schließlich läßt man das Probengemisch unter definierten, beispielsweise physiologischen oder nahezu physiologischen Reaktionsbedingungen an die zu markierenden DNA-Targetsequenz längs der Länge L binden (Fig. 1). Da die Länge L oder beliebige zusammenhängende Teile von L, die beispielsweise mit DNA-Teilsequenzen abgedeckt werden, die mit Farbstoffen verschiedener spektraler Signatur markiert sind, in ihrem mittleren Durchmesser dτ im Genom kleiner als die Halbwertsbreite des Hauptmaximums der auflösungsäquivalenten Punktbildfunktion des verwendeten optischen Analysesystems, z.B eines Mikroskops (im Folgenden abgekürzt als FWHM) sind, führt die Markierung mit dem oben beschriebenen Probengemisch zu einer scheinbar optisch zusammenhängenden, „punktförmigen" Markierung (Fig. 2); d.h. alle die von den einzelnen, Fluorochrom-markierten Nukleotidsequenzen derselben spektralen Signatur emittierten Einzelintensitäten addieren sich im Zentrum des Beugungsbildes zu einer Gesamtintensität dieser spektralen Signatur.
Das Mischungsverhältnis der am Markierungsprobengemisch beteiligten Teilsequenzen kann z.B. 1:1 betragen; andere Mischungsverhältnisse sind ausdrücklich zugelassen. Ferner können die Teilsequenzen mit Fluorochromen derselben spektralen Signatur oder mit Fluorochromen verschiedener spektraler Signatur markiert sein. Beispielsweise kann die Detektion einer bestimmten Targetsequenz T der Länge L dadurch erfolgen, daß a) alle Teilsequenzen mit Fluorochromen derselben spektralen Signatur S, markiert werden; oder daß b) ein Teil der Sequenzen mit einer spektralen Signatur S, und ein anderer Teil mit einer spektralen Signatur S2j bzw. weitere Teile mit spektralen Signaturen Sn markiert werden; oder daß c) eine Kombination von a) und b) durchgeführt wird. In Fall a) erfolgt die Diskriminierung der Bindungsstelle an die Targetsequenz von nicht spezifisch gebundenen Teilsequenzen durch die erhöhte Intensität des Fluoreszenzsignals: Da laut Voraussetzung der Durchmesser dτ der Targetregion kleiner ist als die FWHM, addieren sich die Intensitätsbeiträge der Fluoreszenzemission der spezifisch gebundenen Teilsequenzen, während die nicht spezifisch gebundenen Teilsequenzen einer zufälligen räumlichen Verteilung im Objekt unterliegen, deren mittlerer Abstand bei geeigneten Bedingungen größer ist als die FWHM. Als Konsequenz ist die Intensität dieser vereinzelten Fluoreszenzsignale („Hintergrund") erheblich geringer. Sind beispielsweise 10 Teilsequenzen spezifisch an das Target gebunden und die übrigen Teilsequenzen im Präparat zufällig verteilt, dann kann der Ort des Targets aufgrund seines ca. lOmal so großen Fluoreszenzsignals identifiziert werden.
In Fall b) erfolgt die Identifizierung der spezifischen Bindungsstelle an das Target T aufgrund der Kolokalisation von Fluoreszenzsignalen unterschiedlicher spektraler
Signatur. Beispielsweise enthalte das Target lediglich 3 Bindungsstellen für Teilsequenzen t,, t2, t3, die jeweils mit den spektralen Signaturen Si, S2 und S3 markiert wurden. In diesem Falle wird sich die Intensität der einzelnen von t t2 und t3 detektierten Fluoreszenzsignale am Ort des Targets nicht von der Intensität der „Hintergrundssignale" nichtgebundener Probenmoleküle unterscheiden. Der Ort des Targets ist jedoch bestimmt durch das gleichzeitige Auftreten von Fluoreszenzsignalen mit den spektralen Signaturen Si, S2 und S3 an dem Targetort nach Korrektur der ggf. auftretenden chromatischen Verschiebungen ( „spektrale Kolokalisation").
Fall c) ist eine Kombination der beiden Verfahrensbeispiele a) und b): Die Detektion des Ortes von T aufgrund erhöhten Fluoreszenzsignals von Fluorochromen einer bestimmten spektralen Signatur und aufgrund von spektraler Kolokalisation von zwei oder mehr spektralen Signaturen ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. In diesem Falle wird die Sicherheit der eindeutigen Detektion des gewünschten Targetortes besonders groß. Eine derartige erhöhte Sicherheit der Zuordung kann beispielsweise bei der Detektion von tumorrelevanten Targetsequenzen in der klinischen Pathologie von großer Bedeutung sein.
Zwei verschiedene Targetsequenzen T,, T2 mit den jeweiligen Längen L] 5 L2 können beispielsweise wie folgt unterschieden werden:
a) Die für das Target T] spezifischen DNA-Probensequenzen werden alle mit derselben spektralen Signatur Sj markiert; die für das Target T2 spezifischen Probensequenzen werden alle mit einer spektralen Signatur S2 markiert. Der Ort von Tj wird aufgrund des erhöhten Fluoreszenzsignals der spektralen Signatur S, detektiert; der Ort von T2 wird aufgrund des erhöhten Fluoreszenzsignals der spektralen Signatur S2 detektiert.
b) Die für das Target T, spezifischen DNA-Probensequenzen werden mit Fluorochromen der spektralen Signaturen S S2, S3 markiert; die für das Target T2 spezifischen DNA- Probensequenzen werden mit Fluorochromen der spektralen Signaturen S4, S5, S6 markiert. Der Ort von T, wird in diesem Falle durch die spektrale Kolokalisation von Si, S2, S3 detektiert; der Ort von T2 wird durch die spektrale Kolokalisation von S4, S5, S6 detektiert.
Erfindungsgemäß ist auch eine geeignete Kombination der Verfahren a) und b), wobei auch die Anzahl und Kombination der spektralen Signaturen geeignet variiert werden kann. Ebenso ist eine Erweiterung auf mehr als 2 Targets mithilfe einer entsprechenden Erweiterung der Anzahl der spektralen Signaturen erfindungsgemäß.
Ist der Abstand der Schweφunkte der Targets Tb T2, T3... voneinander kleiner als die FWHM, so können die Targets auch in diesem Falle mithilfe einer spezifischen spektralen Signaturkombination unabhängig von der Gegenwart der anderen Targets detektiert werden. Beispielsweise wird T, durch spektrale Kolokalisation von Si, S2, S3; T2 durch spektrale Kolokalisation von S4, S5, S6; T3 durch spektrale Kolokalisation von S7, S8, S9 usw. detektiert (s.o.). Im Falle der höchstauflösenden Präzisionsmikroskopie, bei der es auch möglich ist, Distanzen unterhalb der Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion des verwendeten optischen Systems zu messen, kann es, abhängig vom jeweils verwendeten Fluorochrom und seiner Inkoφorationshäufigkeit in die jeweiligen Teilsequenzen, notwendig sein, auch andere Mischungsverhältnisse als 1:1 einzusetzen.
Ist der Abstand der Schweφunkte der Targets T,, T2, T3... voneinander jeweils größer als die FWHM, so können zusätzliche Kombinationen verwendet werden. Beispielsweise kann in diesem Falle Target Tj durch die Kombination Sl 5 S2, S3; Target T2 durch die Kombination S S3, S4; Target T3 durch S,, S3, S5; Target T4 durch S,, S3, S6; Target T5 durch S2, S3, S4, usw. charakterisiert werden.
Lösung mit experimentell ermittelten Oligonukleotidsequenzen
Für das vorliegende in vivo-FISH bzw. vital-FISH Verfahren von DNA-enthaltenden Targets mit einem Durchmesser kleiner als die Halbwertsbreite der Punktbildfunktion des zur Detektion verwendeten optischen Systems ist die Bestimmung von geeigneten Oligonukleotidsequenzen erforderlich, aus denen geeignete Mischungen von DNA-Proben hergestellt werden können. Eine oben beschriebene Möglichkeit besteht in der Auswahl passender Oligonukleotidsequenzen aus Sequenzdatenbanken der zu analysierenden Targetregionen.
Zusätzlich oder an Stelle dieser Lösung kann das folgende Verfahren herangezogen werden. Die Zahl theoretisch möglicher Oligonukleotide mit einer bestimmten Länge, die mit der Target-DNA Tripel-Strukturen bilden können, ist begrenzt. Bei einer Länge von 15 bp beispielsweise gibt es 2 Möglichkeiten; bei einer Länge von 20 bp beispielsweise gibt es 2 Möglichkeiten für eine Oligonukleotidsequenz, die nur aus Purinen bzw. nur aus Pyrimidinen besteht; insgesamt ergibt dies also rund 32000 bzw. 1 Million Möglichkeiten. Diese 15mers bzw. 20mers können nach bekannten Verfahren (z.B GeneChip Probe Array der Firma Affymetrix) auf einem DNA-Chip synthetisiert werden. Beim gegenwärtigen Stand der Technik wurden bereits mehrere hunderttausend Sequenzen auf einem Chip untergebracht. Geht man entsprechend dem genannten Beispiel von einem feature Durchmesser von 1 μm x 1 μm aus, so kann bei einem Abstand der einzelnen features von ebenfalls 1 μm die Gesamtmenge von einer Million features auf einem Gen-Chip Areal von wenigen Quadratmillimetern untergebracht werden. Für die Realisierung der hier beschriebenen Erfindung mithilfe von 15mer Homopurin bzw. Homopyrimidinsequenzen ist bereits der erreichte Stand ausreichend. Jeder Platz auf dem Chip („feature") wird mit einer großen Zahl identischer Oligonukleotide einer bestimmten Sequenz, entweder nur aus Purinbasen (Homopurinsequenz), oder nur aus Pyrimidinbasen
(Homopyrimidinsequenz) besetzt. Beispielsweise kann ein Chip mit 32000 bzw. 1 Million verschiedener features so gestaltet werden, daß er alle in der Natur natürlicherweise vorkommenden DNA-15mers bzw. DNA-20mers enthält, die durch Verbindung mit doppelsträngigen DNA-Sequenzen Tripelstrukturen bilden können. Hybridisiert man anschließend gesamtgenomische DNA einer Spezies bzw. Teilfraktionen dieser DNA, z.B. die DNA eines individuellen Chromosoms, eines individuellen Chromosomenarms, einer Chromosomenbande oder eines Gens auf diesen DNA-Chip, dann ist es möglich, alle Abschnitte mit einer Länge von (z.B.) 15 oder von 20 Basenpaaren in diesen genomischen DNA Proben zu identifizieren, die tripelhelikale Strukturen bilden können. Diese Hybridisierung kann sowohl unter denaturierenden Bedingungen als auch nicht denaturierenden Bedingungen durchgeführt werden.
Dieser Ansatz erlaubt es, die für die Bildung von Tripel-Strukturen (und damit die in vivo bzw. vital Markierung chromosomaler DNA-Targets) benötigten Oligonukleotide als Pool für die optische Detektion eines ausgewählten genomischen Abschnittes bereitzustellen. Durch vergleichende Hybridisierung von DNA-Chips der beschriebenen Konfiguration mit genomischen DNA Fraktionen, die die DNA des interessierenden Abschnitts repräsentieren, und von DNA Fraktionen, die die übrige genomische DNA repräsentieren, kann festgestellt werden, welche der beispielsweise 20mers mit tripel-bildenden Eigenschaften ausschließlich in einem interessierenden genomischen DNA Abschnitt (z.B. einem bestimmten Chromosom, Chromosomenabschnitt, oder einem bestimmten Gen) vorkommen.
Anschließend erfolgt die weitere Synthese bzw. Amplifikation der interessierenden DNA Sequenzen wie oben beschrieben. Ebenso wie die aus den Computerdaten ermittelten Sequenzen sind die hier per Chip gefundenen Sequenzen für die in vivo oder vital Markierung geeignet und beispielsweise in der Präzionsmikroskopie einsetzbar.
Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht in der systematischen Konstruktion von DNA-Probengemischen, die eine oder mehrere gegebene Markierungsregionen im Genom abdecken. Ein besonderer Vorzug dieser Verfahrensweise besteht darin, daß, sofern keine geeigneten Computer-DNA-Sequenzbibliotheken vorliegen, die interessierenden Oligonukleotide mit Tripel-bildenden Eigenschaften mit einem Chip der oben beschriebenen Art in genomischer DNA jeder beliebigen Spezies identifiziert werden können, ohne daß DNA Sequenzinformation bereits vorliegen muß. Dies ist insbesondere von Interesse für die rasche Identifizierung relevanter Oligonukleotidsequenzen mit Tripel-bildenden Eigenschaften in noch nicht sequenzierten Genomen, wie z.B. der meisten Erreger von Infektionskrankheiten.
Der mittlere Durchmesser dτ der Markierungsregion ist voraussetzungsgemäß geringer als die FWHM. Dies bedeutet, daß die Fluoreszenzsignale der einzelnen, kurzen dreisträngigen Markierungsorte und der einzelsträngigen Abschnitte in der nächsten Umgebung (Abstand der einzelsträngigen Abschnitte < 100 Basenpaare von dem nächstgelegenen Basentripel einer Dreifachstrangkonfiguration) in der Target-Region sich konstruktiv überlagern und/oder für eine spektrale Kolokalisation herangezogen werden können; so kann eine wesentliche Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses bzw. der Target-Identifikation erreicht werden, die eine Fluoreszenzdetektion so markierter Targets unter in vivo, physiologischen oder nahezu physiologischen Bedingungen ermöglicht. Eine automatische Computeranalyse vorhandener DNA-Sequenzbibliotheken bzw. der erfindungsgemäße Einsatz eines DNA-Chips zur Oligonukleotid-Gewinnung ermöglicht die Suche nach generalisierten Homopurin- oder Homopyrimidinsequenzen mit 15 oder mehr Nukleotiden aus einer spezifischen längeren DNA-Sequenz. Diese natürlichen, für die Ausbildung von Tripelformationen geeigneten Teilsequenzen können bei der natürlichen Chromatinfaltung, wie sie im Zellkern vorliegt, eine Gesamtsequenz mit einem Targetdurchmesser dτ < FWHM so mit einem Fluorochrom einer bestimmten spektralen Signatur abdecken, daß es möglich ist, diese in einem Bildsegment („Bildpunkt") so stark zu akkumulieren, daß der Ort des Targets von eventueller Hintergrundsfluoreszenz diskriminierbar wird. Diese Hintergrundfluoreszenz kann dadurch z.B. entstehen, daß einzelne Teilsequenzen aus dem gesamten Gemisch aller Teilsequenzen auch unspezifisch binden. Bei Verwendung geeigneter Fluorochrome und Bildaufnahme- und -Verarbeitungstechniken läßt sich mit einem erfmdungsgemäß konstruierten Probengemisch das spezifische Markierungssignal im Vergleich zu dem unspezifischem Hintergrundsignal so entscheidend verbessern, daß eine eindeutige
Identifizierung einer gesuchten chromosomalen DNA-Region oder DNA-Sequenz möglich wird.
Erfindungsgemäße DNA-Probengemische enthalten in wässriger Lösung mindestens zwei markierte Oligonukleotide, von denen jedes entweder eine Homopurin- oder
Homopyrimidinsequenz aufweist. Vorzugsweise enthält die wässrige Lösung zusätzlich Salze wie Natrium- und/oder Magnesiumchlorid in Konzentrationen zwischen 0,1 und 100 mM. Weiterhin kann die wässrige Lösung Puff ersub stanzen, bevorzugt Phosphatpuffer enthalten.
Da die erfmdungsgemäßen Probengemische durch Synthese und/oder Amplifikation gewonnen werden können, läßt sich somit ein Markierungskit herstellen, der es ermöglicht, ohne umfangreichere Targetbehandlung, d.h. insbesondere ohne chemische, enzymatische und/oder thermische Targetdenaturierung, eine spezifische FISH durchzuführen. Dies vereinfacht in der klinischen Diagnostik den Umgang mit Patientenmaterial als Target ganz erheblich. Insbesondere brauchen physiologisch relevante Bedingungen, wie sie bei der Gewinnung des Patientenmaterials im allgemeinen vorliegen, nicht mehr geändert werden. Dies ist ein entscheidender Vorteil auch in Anbetracht einer schonenden Behandlung des zu analysierenden Zellmaterials, um relevante Strukturinformationen zu konservieren.
Zur Durchführung des Hybridisierungsverfahrens mit den erfindungsgemäßen Probengemischen wird zu fixiertem oder unfixiertem Untersuchungsmaterial, z.B. menschliche Zellen oder Chromosomenpräparationen, bei Temperaturen zwischen 0°C und 50°C, bevorzugt zwischen 20°C und 37°C, erfmdungsgemäßes Probengemisch zugegeben. Vorzugsweise wird das Probengemisch unmittelbar vor der ISH erhitzt auf eine Temperatur zwischen 85°C und 95°C und anschließend auf die
Hybridisierungstemperatur abgekühlt. Enthält das Untersuchungsmaterial DNA- Sequenzen, die komplementär zu Oligonukleotid-Sequenzen des Probengemisches sind, so hybridisieren die Oligonukleotide des Probengemisches mit den komplementären doppelsträngigen DNA-Sequenzen des Untersuchungsmaterials, wobei Triplex-Stränge gebildet werden. Nach einer Inkubationszeit zwischen 1 Minute und 1 Stunde, bevorzugt zwischen 2 und 10 Minuten, kann einmal oder zweimal gewaschen werden. Anschließend erfolgt die Detektion mittels gängiger Techniken, beispielsweise digitaler Fluoreszenzmikroskopie.
Für die allgemeine und klinische Genomforschung bzw. Genompathologie eröffnen solche erfindungsgemäß hergestellten Probengemische den Vorteil einer spezifischen in vivo Markierung von Genomstrukturen im Zellkern für eine multispektrale Analyse der Genomorganisation und ihrer funktionalen Bedeutung.
Ein weiterer erfmdungsgemäßer Vorteil besteht auch bei beliebig fixiertem Untersuchungsmaterial darin, daß der Denaturierungsschritt entfällt: Das DNA-Probengemisch kann mit derselben Einfachheit gehandhabt werden wie z.B. etablierte DNA-Färbungen der klinischen Cytogenetik: Das Probengemisch wird auf das Präparat gegeben; nach geeigneter Einwirkungszeit z.B. bei Zimmertemperatur und einem evtl. erfolgenden kurzen Waschschritt, ebenfalls bei Zimmertemperatur, kann die fluoreszenzmikroskopische Auswertung beginnen.
Ein weiterer Vorteil gegenüber bekannten FISH-V erfahren bei Raumtemperatur besteht auch bei beliebig fixiertem zellulärem Untersuchungsmaterial darin, daß das Probengemisch keine toxisch wirkenden chaotropen chemischen Agenzien enthält. Hier können z.B. die bei längerem Umgang mit chaotropen Substanzen möglichen Allergiereaktionen eliminiert werden.
Ebenso können in der Sensorik entsprechende DNA-Chips konstruiert werden, die DNA- Sequenzen bei Anlagerung an gegebene Proben erkennen, ohne daß der Chip oder das Untersuchungsmaterial zusätzlich eine chemische und/oder thermische Behandlung benötigen. Ferner können die Anforderungen an das zur Detektion verwendete optische System erheblich reduziert werden. Zum Beispiel ist es möglich, Mikroskopoptiken von geringerer numerischer Apertur (d.h. geringerer FWHM) einzusetzen, wenn die Dimensionen des Chips entsprechend angepaßt werden (Fig. 3). Da heute zur optischen Analyse von DNA-Chips sehr komplexe Systeme, z.B. konfokale Laserscanning- Mikroskope, eingesetzt werden, kann hierdurch das Verfahren wesentlich ökonomischer gestaltet werden.
Die Figuren 1-3 erläutern die Erfindung näher. Es zeigen:
Fig. 1 : Identifizierung von DNA- Abschnitten 3 bis 8 innerhalb des chromosomalen DNA- Targets T mit einer Basenabfolge (Pu....Pu)N oder (Py....Py)N , N > N0 ; N0 > 15
1: Zu markierendes chromosomales DNA-Target T; 2: Zellkern; dτ: Durchmesser des Targets.
Fig. 2a: Amplifikation der identifizierten (Pu ... Pu) / (Py ... Py) Sequenzen an das Target T: Markierung mit geeigneten Fluorochromen (Label F)
Fig. 2b: Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung mit einem Gemisch aus t] ... tM oder einigen von diesen Sequenzen.
Fig. 3: DNA-Chip geeigneter Dimension mit 2" features 1.1, 1.2, ..., l.n, 2.1, 2.2, ..., n.n. Jedes feature hat vom Detektionssystem abhängige Dimensionen und Abstände zu den Nachbarfeatures. 1: Abstand zwischen den features > 2 Halbwertsbreiten; 2: feature; dτ: Durchmesser des Targets. Die folgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung anhand ihres Einsatzes in der Präzisionsmikroskopie für die Genomforschung, wobei der Einsatz der erfmdungsgemäß hergestellten Probengemische an Hand der Erforschung der Pathologie der dreidimensionalen Genomstruktur erläutert wird. Wichtig dabei ist die Erforschung der Veränderung nativer MikroStrukturen des Genoms im Zellkern, die mit pathologischen Veränderungen von Zellen korreliert oder kausal dafür verantwortlich sind. Von Probengemischen, die geeignet sind, um derartige fundamentale Fragen der modernen Humangenetik und Zellular-Pathologie zu beantworten, ist zu erwarten, daß sie auch geeignet sein können, als Marker hinsichtlich der klinischen Diagnostik auf derartige Genomveränderungen zu dienen.
Das menschliche Genom ist im Zellkern nicht zufällig verteilt; zahlreiche Forschungsergebnisse weisen daraufhin, daß es abhängig von Zelltyp und -Status, einer dreidimensionalen Kompartmentalisierung unterworfen ist, die f nktionelle Bedeutung hat. Voraussetzung für die Entschlüsselung der geordneten dreidimensinalen Genomstruktur sind spezifische DNA-Markierungsverfahren, die die jeweils vorliegende native Chromatinstrukur im Zellkern nicht verändern und ggf. sich auch dazu eignen, dynamische Vorgänge in vivo sichtbar zu machen. Dazu werden gegenwärtig hochsensitive Mikroskopieverfahren entwickelt, die quantitative Distanz- Analysen von markierten kurzen DNA- Sequenzen, Proteinen etc. im intakten Zellkern bis hinunter zu wenigen zehn Nanometern erlauben. Für einen hochsensitiven Nachweis werden neuartige Fluoreszenz-Farbstoffkomplexe eingesetzt, die dank einer hohen Fluoreszenz- Quantenausbeute und einem hohen Signal/Rausch-Verhältnisses bereits den Nachweis einzelner oder weniger, mit DNA-Sequenzen koppelbarer Moleküle erlauben. Solche
Techniken ermöglichen es im Prinzip erstmals, die „Hyperfeinstruktur" des menschlichen Genoms zu untersuchen sowie pathologisch relevante Veränderungen der SD- Genomorganisation zu erforschen.
Eine erhebliche Einschränkung der hier möglichen Forschung stellen hierbei noch die derzeit vorhandenen DNA-Proben dar, die für eine spezifische in situ Hybridisierung unphysiologische, häufig komplexe Markierungsprozeduren erfordern. Dadurch kann nicht mehr gewährleistet werden, daß die nativen Targetstrukturen auch nach Anwendung der Hybridisierungsprotokolle noch so erhalten sind, daß sie den Vitalzustand in einer für die Kenntnis der Funktion relevanten Weise widerspiegeln.
Probengemische, wie sie erfmdungsgemäß konstruiert und produziert werden können, ermöglichen eine FISH unter nichtdenaturierenden, physiologischen Bedingungen und können darüberhinaus sogar in lebende Zellen injiziert oder andersweitig eingebracht werden. Da anschließend infolge von Diffusionsvorgängen eine natürliche Anlagerung, d.h. ohne weitere äußere Einwirkung, an die zu markierende Targetsequenz im Genom stattfmdeten kann, kann somit die oben genannte, wesentliche Lücke in einer zukünftigen Hochpräzisionsgenomforschung geschlossen werden.
Als konkretes Ausführungsbeispiel soll im Folgenden die Gewinnung eines Probengemisches für zwei ausgewählte Targetregionen auf dem menschlichen X- Chromosom und ihre Detektion skizziert werden.
Die konkrete Aufgabe dieses Beispieles bestand zunächst darin, erfindungsgemäße Probengemische für den Locus HSU66082_1 in Xq27.3-q28 (=Locus 1) des menschlichen Genoms, sowie für den Locus HUMPFLNG6PD-1 (=Locus 2) auf demselben Chromosom des menschlichen Genoms zu konstruieren.
1) Ermittlung der Oligonukleotidsequenzen: a) Es werden die aus Datenbanken bekannten DNA- Sequenzdatenfiles von Locus 1 und Locus 2 auf das Vorhandensein von Homopurin- bzw. Homopyrimidinsequenzen der Oligonukleotidlänge 15 gepüft, wobei offensichtlich repetitive Sequenzen (z.B. aaaaaaaa., oder tttttt...) hier nicht berücksichtigt werden.
Gefunden wurden für Locus 1 die 15mers agg aag aaa aga aaa; gaa ggg aga gag ggg; aag gag aag aaa gag; aag gag aag aaa gag; ggg gaa agg gga gag; usw.; tcc ctc ttc cct tcc; ctt ctc ctt cct ccc; ccc tct ccc tct ctc; ctc tcc tct cct ttc; tct ctc cct ctc cct; usw.
Für Locus 2 die 15mers: gga aag aag gaa aaa; aga aaa gga aag aaa; gaa gga aag aaa gga; aag ggg gaa gga ggg; agg gag gag gaa ggg; usw.; ctt cct tcc ctc tcc; ttc ctt tct ttc ctt; tct ttt ttc ttt ttt; cct ctt tcc tct ttt; ttc ctt ccc tcc ttc; usw.
b) Die DNA-Sequenzen aus Locus 1 bzw. Locus 2 werden aus bestehenden Genbanken, z.B. des Deutschen Humangenomprojektes, erhalten, amplifiziert, mit Fluorochromen markiert, in Oligonukleotide einer Mindestgröße von 15 Basenpaare gespalten, und anschließend auf erfindungsgemäßen DNA-Chips in stringenter Weise hybridisiert. Diese DNA-Chips enthalten in spezifischer Reihenfolge alle Kombinationen komplementärer Purin 15mers bzw. Pyrimidin 15mers oder eine hier relevante Teilmenge davon (z.B. nur die für das menschliche X-Chromosom spezifischen Purin/Pyrimidin 15mers). Nach der Hybridisierung der DNA-Proben aus Locus 1 werden Fluoreszenzsignale bei den Positionen (1 (Reihe), 167 (Spalte)); (2, 34); (67, 98); (73, 28); (95, 3) usw. gefunden; nach der Hybridisierung der DNA-Proben aus Locus 2 werden Fluoreszenzsignale bei den Positionen (1, 23); (2, 46); (66, 81); (95, 3) usw. beobachtet. Aufgrund der bekannten Zuordnung von Sequenzposition und Oligonukleotidsequenz ergeben sich die aus der DNA-Sequenzbank bekannten, oben genannten Sequenzen.
Sequenzpositionen, die sowohl in Locus 1 als auch in Locus 2 vorkommen (hier (95, 3)) werden für die Herstellung der Probengemische eliminiert. Gegebenenfalls werden Vergleichshybridisierungen mit der verbleibenden genomischen DNA durchgeführt, d.h. genomischer DNA ohne die DNA-Sequenzen von Locus 1 und Locus 2; statt der verbleibenden genomischen DNA können ggf. auch geeignete Teilfraktionen verwandt werden. Alle Sequenzpositionen, die außer an Locus 1 bzw. Locus 2 noch im Genom (ggf. in einer Teilfraktion des Genoms) vorkommen, werden bei der Etablierung der Probengemische nicht berücksichtigt.
2) Etablierung der Probengemische:
Die in 1) gefundenen Oligonukleotidsequenzen für Locus 1 und Locus 2 werden nach bekannten Verfahren synthetisiert und beispielsweise mit endständigen Fluorochromen verbunden. Z.B. werden die für Locus 1 spezifischen Oligonukleotidsequenzen mit Fluorochromen einer spektralen Signatur S, am 5'-Ende der Sequenz markiert, während die für Locus 2 spezifischen Oligonukleotidsequenzen am 5 '-Ende der Sequenz mit Fluorochromen einer spektralen Signatur S2 markiert werden. Eine Signalverstärkung kann durch zusätzliche Markierung des 3'-Endes mit entsprechend gleichen Fluorochromen erzielt werden.
3) Prüfung der Spezifität durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung:
Eine experimentelle Übeφriifung der Spezifität kann z.B. durch Hybridisierung unter geeigneten Puffer-, Temperatur-, und Waschbedingungen an präparierte Metaphase- Chromosomen erfolgen. Beipielsweise wird bei Vorliegen eines erfindungsgemäßen Probengemisches von Locus 1 ein FISH-Signal nur in der Region Xq27.3 - q.28 beobachtet.
4) Fluoreszenzhybridisierung an dreidimensional konservierten Zellkernen: Zur möglichst schonenden Hybridisierung (Vital -FISH) werden die zu untersuchenden Zellkerne, ggf. nach Fixierung, einer in situ Hybridisierung unter nicht-denaturierenden Bedingungen unterzogen: Das Hybridisierungsgemisch enthält lediglich die in 2) etablierten Probengemische in einem physiologischen Puffer, wobei die Behandlungstemperatur zu keinem Zeitpunkt über 40°C erhöht wird. Zur Beseitigung von nichtgebundenen Probensequenzen wird ein Waschschritt mit physiologischem Puffer bei Temperaturen nicht über 40°C durchgeführt.
5) Fluoreszenzhybridisierung an kernhaltige Zellen in vivo:
Die in 2) etablierten Probengemische werden in Inteφhasezellen mikroinjiziert. Alternativ können auch Verfahren der Elektroporation oder der Vesikelvermittelten Inkoφoration verwandt werden. Anstelle von Waschschritten kann bei der In Vivo-FISH eine Verminderung der Hintergrundssignale durch Diffusion und zelluläre Eliminationsprozesse erreicht werden.
6) Optischer Nachweis der Bindungsorte:
Als Beispiel für den Nachweis der Bindungsorte seien Verfahren der höchstauflösenden digitalen Fluoreszenzmikroskopie genannt. In dem genannten Anwendungsbeispiel werde von 10 spezifischen Teilsequenzen für Locus 1 und 10 spezifischen Teilsequenzen für Locus 2 ausgegangen. Je nach Fluorochromierungsgrad sind dann an den Bindungsorten von Locus 1 bzw. Locus 2 ca. 10 - 1000 Fluorochrommoleküle der spektralen Signaturen Sj bzw. S2 zu detektieren. Targets mit ca. 1000 Fluorochrommolekülen insgesamt können noch mit den Verfahren der konventionellen digitalen Epifluoreszenzmikroskopie (z.B. Verwendung einer hochempfindlichen, gekühlten CCD-Kamera) oder mithilfe etablierter Methoden der konfokalen (1 Photonen) Mikroskopie spezifisch detektiert werden. Da sich die Intensitätssignale an einem Bindungsort mit einem Durchmesser kleiner/gleich der FWHM überlagern, kann der Ort des Targets von nicht gebundenen, zufällig verteilten Probensequenzen mit ausreichendem Signal zu Rausch-Verhältnis (SNR) von unspezifischen Bindungsorten diskriminiert werden. Sind jedoch beispielsweise nur 10 Fluorochrommoleküle am Targetort zu detektieren, so sind andere mikroskopische Nachweisverfahren indiziert. Beim gegenwärtigen Stand der Technik können hier z.B. zeitaufgelöste mikroskopische Fluoreszenzverfahren oder konfokale 2-Photonen-Mikroskopie oder eine Kombination dieser Methoden verwendet werden. Mit derartigen Techniken ist es heute bereits möglich, einzelne bis wenige, zur DNA-Probenmarkierung geeignete Fluorochromoleküle nachzuweisen. Um eine bessere Unterscheidung des Targetortes von zufällig verteilten fluorochromierten Oligonukleotidsequenzen zu ermöglichen, kann hier die Methode der spektralen Kolokalisation (s.o.) angewandt werden. Beispielsweise wird der Ort von Locus 1 in situ durch die kolokalisierte Detektion weniger Fluorochrommoleküle der spektralen Signaturen Sl9 S2, S3 angezeigt, während der Ort von Locus 2 durch die kolokalisierte Detektion weniger Fluorochrommoleküle der spektralen Signaturen S4, S5, S6 angegeben wird.
Einsatz als Verfahren in der Chip-Sensorik
Für die erfmdungsgemäße Anwendung des Verfahrens in der Sensorik von DNA-Chips besteht eine Ausführungsform darin, daß auf dem Chip alle oder ein Teil der Tripel-Strang bildenden Oligonukleotidsequenzen eines zu analysierenden Genoms, Chromosoms, Chromosomenabschnittes, Gens, oder Genabschnittes aufgebracht werden, in der Weise, daß jedes feature einzelsträngige Oligonukleotide einer bestimmten Sequenz enthält. Unter feature wird hier ein einzelnes Feld auf einem Chip verstanden, auf das Oligonukleotide gleicher Sequenz und Länge aufgebracht werden. Der Durchmesser der features ist erfindungsgemäß kleiner/gleich der FWHM. Der Abstand zwischen den features kann jedoch größer als diese Halbwertsbreite gewählt werden. Bei einer erfindungsgemäßen Sensorik- Applikation wird die zu analysierende (Target)DNA nach Zerlegung in Fragmente geeigneter Länge (z.B. einige hundert Basenpaare) fluoreszenzmarkiert und kann in nicht-denaturiertem (meist doppelsträngigen) Zustand in einer Lösung nach bekannten Verfahren unter nicht-denaturierenden Bedingungen an den DNA-Chip hybridisiert werden. Nach einem Waschschritt wird nur an denjenigen feature-Orten eine Fluoreszenzintensität bestimmter Größe detektiert, bei denen doppelsträngige Target-DNA und einzelsträngige feature-DNA eine Tripel-Struktur gebildet haben. Als ein konkretes Anwendungsbeispiel sei ein DNA-Chip genannt, der spezifisch ist für den Nachweis der oben genannten Locus 1 und Locus 2 auf dem menschlichen X- Chromosom:
a) Zunächst werden nach den o.a. Verfahren die einzelnen, für Locus 1 bzw. Locus 2 spezifischen Oligonukleotidsequenzen getrennt voneinander synthetisiert/amplifiziert. Eine Fluorochromierung kann hier unterbleiben. Anschließend werden die Oligonukleotid- sequenzen in einer geeigneten Menge jeweils einzeln an bestimmten Stellen eines DNA- Chips niedergelegt. Ggf. können in einem Kontrollbereich des DNA-Chips noch weitere Sequenzen niedergelegt werden, um z.B. eine Prüfung der Hybridisierungseffizienz zu gestatten.
b) Die zu untersuchende DNA, z.B. genomische Patienten-DNA, wird nach
Fluoreszenzmarkierung an den DNA-Chip hybridisiert. Die Positionsverteilung der Fluoreszenzsignale nach Detektion mit einem optischen System, dessen Halbwertsbreite FWHM kleiner/gleich dem Durchmesser der verwendeten DNA- features ist, gibt die gewünschte Information über die Existenz der betreffenden Homopurin/Homopyrimidin- Sequenzen in der Patienten-DNA. Diese Information kann z.B. als Marker für andere, benachbarte Sequenzen verwendet werden.
c) In einem modifizierten Verfahren Ml werden die Oligonukleotidsequenzen auf dem DNA-Chip mit einem Fluorochrom A markiert, die Proben-DNA mit einem Fluorochrom B, dergestalt daß bei Bindung von Proben-DNA-Sequenzen an Oligonukleotidsequenzen auf dem DNA-Chip bei geeigneter Anregung ein Energietransfer stattfindet, der zum optischen Nachweis des Bindungsortes verwandt werden kann.
d) In einem modifizierten Verfahren M2 werden die Oligonukleotidsequenzen auf dem DNA-Chip mit einem Fluorochrom markiert, dergestalt daß bei Bindung einer Sequenz aus der zu untersuchenden DNA eine Verminderung (Quenching) oder eine Erhöhung (Enhancement) des Fluoreszenzsignals eintrifft. Der Vorteil eines derartigen Verfahrens ist, daß die zu untersuchende DNA nicht fluoreszenzmarkiert werden muß.

Claims

P atentansprüche
1) DNA-Probengemische für die spezifische Markierung von Target-Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngigen DNA-Bereichen, enthaltend mindestens zwei Oligonukleotide, von denen jedes entweder nur aus Purinnukleotiden oder nur aus
Pyrimidinnukleotiden besteht und die jeweils mit mindestens einem Marker versehen sind.
2) DNA-Probengemische nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Oligonukleotid aus 15 bis 30 Nukleotiden besteht.
3) Verfahren zur Markierung von Target-Nukleinsäuren, insbesondere doppelsträngigen DNA-Bereichen, mittels markierter DNA-Probengemische, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Probengemische unter nicht denaturierenden Bedingungen mit den Target-Nukleinsäuren zum Zwecke der in situ Hybridisierung zusammengebracht werden und anschließend die Markierung mittels Standardverfahren detektiert wird.
4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Probengemische mittels eines Fluoreszenzmarkers markiert sind.
5) Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Probengemische vor der in situ Hybridisierung auf eine Temperatur zwischen 85°C und 95°C erhitzt und anschließend auf Hybridisierungstemperatur abgekühlt werden.
6) Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die in situ Hybridisierung bei Temperaturen zwischen 0°C und 50°C, bevorzugt zwischen 20°C und 37°C stattfindet.
7) Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Probengemische für eine in vivo Markierung der Target-DNA durch Mikroinjektion oder andere, membranpermeable Transportverfahren und -Stoffe in die Zelle eingebracht und einer natürlichen Anlagerungsreaktion überlassen werden.
8) Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Probengemische neben den markierten Oligonukleotiden in einer physiologischen
Pufferlösung keine weiteren chemischen Agenzien oder Nukleinsäuregemische enthalten. 9) Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben- Oligonukleotide als Mikrotargets auf Chips aufgebracht sind und als Rezeptoren in der Sensorik dienen, wobei der Durchmesser der features kleiner oder gleich der auflösungsrelevanten Halbwertsbreite der Punktbildfunktion des zur Analyse verwendeten optischen Systems ist.
10) Verfahren zur Herstellung von DNA-Probengemischen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in DNA-Sequenzbibliotheken die spezifisch zu markierende, zusammenhängende DNA-Sequenz des genomischen Targets der linearen Länge L festgelegt wird, wobei die Länge L oder vollständig zusammenhängende Teilbereiche der Länge L so gewählt werden, daß der Durchmesser dτ der entsprechenden, gefalteten Chromosomenregion kleiner oder gleich der minimalen Halbwertsbreite des Hauptmaximums der auflösungsbestimmenden Punktbildfunktion des für die Analyse verwendeten optischen Systems ist.
11) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Sequenz der Länge L alle Homopurin- und/oder Homopyrimidinsequenzen einer definierten Länge bestimmt werden.
12) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß auf einem Chip features eingerichtet werden, die alle potentiell möglichen Oligonukleotidsequenzen aus Homopurin- und/oder Homopyrimidinsequenzen einer gegebenen Zahl größer oder gleich 15 Nukleotide von einer zu markierenden, zusammenhängenden DNA-Sequenz des Genoms der linearen Länge L enthält, wobei die Länge L oder vollständig zusammen- hängende Teilbereiche der Länge L so gewählt werden, daß der Durchmesser der entsprechenden, gefalteten Chromosomenregion kleiner oder gleich der minimalen Halbwertsbreite des Hauptmaximums der effektiven Punktbildfunktion des für die Analyse verwendeten optischen Systems ist.
13) Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß durch in situ
Hybridisierung der fragmentierten DNA eines zu markierenden Genoms, Chromosoms oder Chromosomenabschnittes mit den Nukleotidsequenzen auf dem Chip die in dieser DNA vorkommenden Teilsequenzen aus Homopurin- und/oder Homopyrimidinsequenzen einer gegebenen Zahl größer oder gleich 15 Nukleotide gewonnen werden.
14) Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die so bestimmten Teilsequenzen oder ein Teil davon synthetisiert und/oder amplifiziert werden. 15) Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die gewonnenen Teilsequenzen mit je einem oder mehreren Fluorochromen gleicher oder verschiedener spektraler Signatur markiert und anschließend alle oder ein für L repräsentativer Teil in einem definierten Mischungsverhältnis gemischt werden.
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