DE69226510T2

DE69226510T2 - Sondezusammensetzungen fuer genomanalyse und methoden

Info

Publication number: DE69226510T2
Application number: DE69226510T
Authority: DE
Inventors: Michael Louis Naperville Il 60563 Bittner; Mona Stein Chicago Il 60645 Legator; Larry Edward Glen Ellyn Il 60137 Morrison
Original assignee: Vysis Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1992-09-18
Publication date: 1999-05-06
Anticipated expiration: 2012-09-19
Also published as: EP0558740A1; DE69226510D1; JPH06502079A; EP0558740B1; ATE169342T1; WO1993006245A1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Sonden-Zusammensetzungen zur Genomidentifizierung, Verfahren zur Herstellung derselben und Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung derselben.

Hintergrund der Erfindung

Die herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie von Chromosomenmischungen kann die Verwendung von chemischen Nukleotid- Gegenfärbemitteln, welche Farbstoffgruppe-haltige Verbindungen umfassen, welche entweder zwischen den Basen der DNA interkalieren oder an die Außenseite der DNA-Helix binden, umfassen. Solche Gegenfärbemittel sind z. B. bei in situ-DNA- Hybridisierungen erwünscht, um das Sichtbarmachen von nichtspezifischen chromosomalen Bereichen wie z. B. von Bereichen, die nicht mit einer besonderen Fluorophor-markierten Sonde spezifisch hybridisiert sind, zu verstärken. Die Farbe des Gegenfärbemittels sollte mit dem Farbstoff, der mit der Sonde verbunden ist, bevorzugt in Kontrast stehen. Bei fluoreszierenden Sonden ist das Gegenfärbemittel bevorzugt fluoreszierend. Beispiele von chemischen fluoreszierenden Gegenfärbemitteln, die zur Zeit Verwendung finden, umfassen 4',6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid-hydrat (DAPI), Propidiumjodid (PI), Chinacrin Mustard u. ä.. Typischerweise zeigen solche Färbemittel Abweichungen in der Farbintensität von einem Chromosomenbereich zum nächsten.
Solche chemischen Gegenfärbemittel weisen verschiedenartige Nachteile auf. Auf der einen Seite sind nur einige solcher fluoreszierenden Gegenfärbemittel erhältlich, wodurch die ver fügbare Auswahl an spektralen Eigenschaften, einschließlich der Anregungs- und Emissionswellenlängen, und der spektralen Breiten der Absorptions- und Emissionsbänder eingeschränkt ist.
Auf der anderen Seite erzeugen solche Gegenfärbemittel bei der zytologischen Verwendung üblicherweise eine Färbungsintensität, die nicht mit der Fähigkeit oder der Eignung eines Zellkerns oder eines Chromosoms korreliert oder entsprechend korrespondiert, eine Hybridisierung durchzumachen oder dafür zugänglich zu sein. Zum Beispiel könnte ein niedriger Level an Gegenfärbung als ein Kriterium zum Verwerfen bestimmter Kerne verwendet werden, wodurch man das unvollständige Zählen von Chromosomen oder chromosomalen Bereichen vermeidet. Eine solche Korrelation ist wichtig für die Zwecke eines "Bewertens" von Kernen im Hinblick auf das Vorhandensein, Nichtvorhandensein oder die Anzahl von spezifischen Chromosomen oder chromosomalen Bereichen pro Kern. Eine schlechte Zugänglichkeit eines Kernes für Hybridisierungssonden, die typischerweise teuer sind, würde zur Verschwendung und zur Ungenauigkeit führen, die durch das unvollständige Zählen der Chromosomen oder chromosomalen Bereiche und einer nachfolgenden Fehldiagnose verursacht wird.
Ein weiterer Punkt ist, daß solche chemischen Gegenfärbemittel aus dem Stand der Technik, was offenbar auf deren Assoziierungsverfahren mit der DNA (wie oben angegeben) zurückzuführen ist, manchmal mit der Fähigkeit der Sonden, mit der Target-DNA zu hybridisieren, interferieren können, wie bei einem zweiten Hybridisierungsdurchgang oder eventuell bei einem nachfolgenden Banding-Verfahren nach einer ersten Hybridisierung.
Wiegant et al. lehren in Nucleic Acids Research, Bd. 19, Nr. 12, 3237, die Verwendung von Fluorescein, um fluoreszierende, humane Nucleinsonden herzustellen. Jedoch sind keine der offenbarten Sonden Zusammensetzungen zur gesamten humanen genomischen Direkt-Markierungs-Gegenfärbung.
Die WO-A-92/05185, die am 20/09/1990 eingereicht und am 2/4/1992 veröffentlicht wurde, beschreibt Direkt-Markierungs- Sonden-Zusammensetzungen, welche nur die DNA eines vorausgewählten einzelnen Chromosomes oder eines bestimmten Bereiches eines Chromosomes färben.
In Nucleic Acids Research 12 (1984) 989-1002 und in Biochemistry 19 (1980) 1774-1781 wird ein Verfahren beschrieben zum Binden einer Fluoreszenzmarkierung an eine Nukleinsäure über eine Bisulfit-katalysierte Transaminierung eines Cytidins zum Binden eines Fluoreszenzfarbstoffes, Nitrobenzofurazan, daran.
Eine Indirekt-Markierungs-Sonden-Zusammensetzung, wobei eine gesamte humane DNA unter Verwendung von Quecksilberacetat markiert wurde, wurde von Hopman et al. in Histochemistry 85, 1-4 (1986) und in Experimental Cell Research 169, 357-386 (1987) aufgezeigt. Hopman et al. verwenden jedoch nicht bzw. schlagen nicht vor, solche Sonden als allgemeine Gegenfärbemittel zu verwenden. Auch mußten die nach einer in situ-Hybridisierung damit gebildeten Hybride weiter bearbeitet werden, um sie nachweisbar zu machen. So wurden in einem Fall Thiol-haltige Markierungen mit einem markierten Antikörper nachgewiesen, während in einem anderen Fall thioliertes Fluorescein mit den Hybriden nach einer in situ-Hybridisierung inkubiert wurde. Ein sekundäres Bearbeiten mit Reagenzien, wie beispielsweise thioliertem Fluorescein, könnte mit weiteren Hybridisierungssonden interferieren, und/oder ein weiteres sekundäres Bearbeiten verkompliziert und verlängert den Test. Ein einstufiges Hybridisierungsverfahren zum Erhalten einer genomischer DNA-Gegenfärbung ohne zusätzliche Bearbeitungen wird nicht von Hopman et al. aufgezeigt oder vorgeschlagen.
Der Stand der Technik der in situ-Hybridisierung erfordert eine neue und verbesserte Klasse an Zusammensetzungen zur genomischen Gegenfärbung, die solche Nachteile vermeiden.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung stellt bereit (a) eine neue und sehr brauchbare Klasse an DNA-Sonden-Zusammensetzungen, die als direkt nachweisbare genomische DNA-Hybridisierung und ähnliches, wobei insbesondere das humane Genom umfaßt ist, sehr brauchbar sind, und (b) Verfahren zur Herstellung und Verwendung solcher Sonden.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Direkt-Markierungs-DNA-Sonden-Zusammensetzung zum Gegenfärben genomischer DNA, welche in einer Probe aus einem multichromosomalen Organismus vorhanden ist, und zum Färben wenigstens eines Bereiches eines Chromosoms, das in der genomischen DNA der Probe vorhanden ist, worin die Zusammensetzung umfaßt:
(a) eine Mischung von DNA-Segmenten, welche über Verbindungsgruppen kovalent an fluoreszierende Gruppen gebunden sind, wobei die DNA-Segmente (i) entnommen worden sind von der gesamten genomischen DNA eines Organismus desselben Typs wie derjenige der Probe und (ii) in der Lage sind, mit komplementären Teilabschnitten der DNA in allen der Chromosomen des Organismus zu hybridisieren, um ein im wesentlichen vollständiges Gegenfärben aller der Chromosomen zu erreichen; und
(b) wenigstens eine andere DNA-Sonden-Zusammensetzung zum Färben wenigstens eines einzelnen Bereichs eines Chromosoms oder eines einzelnen Chromosoms des Organismus, bereitgestellt.
Diese neuartigen Direkt-Markierungs-genomische DNA- Gegenfärbungs-Sonden-Zusammensetzungen verwenden Nukleotidsegmente, die bestehen aus oder die abgeleitet sind von der gesamten genomischen DNA eines Genoms, insbesondere eines Genoms, das eine in situ-Hybridisierung oder ein anderes Verfahren durchmachen soll oder durchmacht. Solche Bereiche in einer solchen Sonden-Zusammensetzung sind mit chemisch gebundenen Fluo rophoren unter Verwendung eines Herstellungsverfahrens, so wie es hiermit bereitgestellt wird, markiert.
Ein vorliegend bevorzugtes Genom für die Verwendung bei der Durchführung dieser Erfindung ist das humane Genom.
Eine vorliegend bevorzugte Fluoreszenzmarkierung zur Verwendung in einer beliebigen gegebenen erfinderischen Sonden- Zusammensetzung ist eine, welche spektral verschieden ist von der Fluoreszenzmarkierung, die in einer beliebigen anderen Direkt- oder Indirekt-Markierungs-Sonde oder Sonden- Zusammensetzung verwendet wird, die entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend mit einer solchen Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung verwendet wird zu den Zwecken eine bestimmte in situ-Hybridisierung unter Beteiligung der genomischen DNA durchzuführen.
In einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung liegt die DNA davon in der Form von gemischten Segmenten vor, die aus fragmentierten DNA-Sequenzen stammen, die einzeln an verschiedenartigen Loci über das gesamte Genom, das untersucht wird, auftreten. Solche Sequenzen werden entweder von der genomischen DNA selbst oder von einer Kopie davon erhalten. Eine solche Kopie kann, was die Fachleute wissen, unter Verwendung eines Verfahrens wie beispielsweise Klonierung, enzymatische Amplifizierung, einer Kombination davon oder ähnliches, wie es gewünscht wird, hergestellt werden.
Soweit es bekannt ist, hat bislang noch niemand eine Sonden- Zusammensetzung von DNA-Segmenten, die mit einer fluoreszierenden Gruppe direkt markiert sind, die fragmentierte DNA- Sequenzen, die zusammengenommen die gesamte genomische DNA eines gegebenen Genoms einschließen, umfassen, bereitgestellt. Solche DNA-Segmente liegen typischerweise in dem durchschnittlichen Größenbereich von etwa 150 bis 600 Basenpaaren (bp), obwohl größere und kleinere dieser fragmentierten Segmente verwendet werden können, wenn es gewünscht ist. Bevorzugter liegen solche fragmentierten DNA-Segmente in dem durchschnittlichen Größenbereich von etwa 200 bis 400 bp und haben noch bevorzugter eine Durchschnittsgröße von 300 Basenpaaren. Solche Segmente werden leicht aus den gesamten genomischen Ausgangs-DNA- Sequenzen über ein herkömmliches Sequenz-Fragmentierungs- Verfahren erhalten, und ein vorliegend bevorzugtes Verfahren umfaßt die Beschallung.
Diese Erfindung stellt weiterhin Verfahren zur Herstellung von solchen Sonden-Zusammensetzungen bereit. Um somit die Ausgangs- DNA-Segmente zu markieren und dadurch die gewünschten Direkt- Markierungs-Sonden-Zusammensetzungen herzustellen, werden zuerst Verbindungsgruppen mit reaktiven Endgruppen darin eingebracht, und dann werden fluoreszierende Gruppen an diese Endgruppen kovalent gebunden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren genomischer DNA und DNA-Sequenzen wenigstens eines Bereiches eines Chromosoms, das in einer Probe vorhanden ist, die aus einem multichromosomalen Organismus gewonnen wurde, umfassend die Schritte von nacheinander:
(a) Kontaktieren der Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, um Hybride zwischen jeder der genomischen DNA und DNA-Sequenzen des Bereichs mit den Sonden-DNA-Segmenten zu erzeugen, welche in der Sonden-Zusammensetzung vorhanden sind;
(b) Abtrennen restlicher Anteile der Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 von der resultierenden Probe; und
(c) Untersuchen der resultierenden Probe durch Bestrahlen derselben mit Energie, die wenigstens ausreicht, um die in den Hybriden vorhandenen fluoreszierenden Gruppen zum Fluoreszieren zu bringen, während gleichzeitig die so erzeugte resultierende Fluoreszenz-Energie detektiert wird, wodurch die in der Probe vorhandene genomische DNA und der Bereich identifiziert werden.
Eine Produkt-Direkt-Markierungs-Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung kann mit dem Gesamten oder irgendeinem Abschnitt (d. h. Anteil) des untersuchten Genoms, das in einer Target-Zusammensetzung vorliegt, hybridisieren. Die Hybridisierung wird unter Hybridisierungsbedingungen bei einer in situ- Hybridisierung oder ähnlichem mit einer Probe durchgeführt und bewirkt, daß der oder die einzelne(n) Körper einer solchen Target-DNA die optische Erscheinung haben, im wesentlichen vollständig gefärbt zu sein, wenn diese bei einer Fluorophor- Anregungsstrahlung unter einem Fluoreszenzmikroskop oder ähnlichem untersucht werden oder wenn diese mittels Durchflußzytometrieanalyse oder ähnlichem untersucht werden.
Hybride, die über eine solche Produkt-Direkt-Markierungs- Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung hergestellt werden, können nach ihrer Bildung mit der Target-DNA nach einem solchen Hybridisierungsverfahren direkt nachgewiesen werden. Somit kann eine Produkt-Sonden-Zusammensetzung als ein vollständiges oder allgemeines Genom-Gegenfärbemittel bei jeder in situ-Hybridisierung, die als Target das Genom oder einen Anteil davon umfaßt, verwendet werden. Die Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung kann somit verwendet werden, um nichtspezifische Chromosomenbereiche in einer zytologischen oder histologischen Probe nachzuweisen, zu identifizieren, (einschließlich nachzuweisen, sichtbar zu machen und/oder zu quantifizieren). Eine solche Sichtbarmachung kann durch Verwenden von fluoreszierenden Einheiten, deren Farbe geeignet ist, mit der Farbe von weiteren fluoreszierenden Einheiten, die in der Probe zum Zwecke weiterer DNA-Identifizierungen vorhanden sein können, einen Kontrast zu ergeben, verstärkt werden.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Sonden-Zusammensetzungen ist, daß eine relativ große Anzahl von Fluoreszenzgruppehaltigen Verbindungen bekannt ist, die mit den genomischen Ausgangs-DNA-Sequenzfragmenten verbunden werden können, wie hier gezeigt wird. Somit kann eine größere Auswahl an spektralen Eigenschaften innerhalb einer gegebenen Sonden-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung erreicht werden, als es mit den chemischen Gegenfärbemitteln aus dem Stand der Technik möglich ist. Die Wahl der Fluoreszenzgruppenfarbe des Gegenfärbemittels, die in einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung verwendet wird, kann genau angepaßt werden, um eine durchdachte Verwendung einer Sonden-Zusammensetzung mit einer oder mehreren weiteren chromosomalen targetspezifischen Nukleinsäuresonden zu optimieren.
Ein weiterer Vorteil der Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung ist, daß die Komponentensonden nicht interkalieren, so daß zweite Hybridisierungen, Banding-Verfahren oder ähnliches bei Verwendung derselben auf einem oder in einem gegebenen DNA-haltigen zytologischen Präparat anschließend oder sogar gleichzeitig durchgeführt werden können.
Ein weiterer Vorteil dieser Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung ist, daß sie als Indikatoren für die Zugänglichkeit von zytologischen Nukleinsäuren, insbesondere von genomischer DNA, für Nukleinsäure-Sonden fungieren können. Wenn die DNA einer Zelle nicht für ein solches Gegenfärbemittel zugängig ist, dann wird deren DNA nicht sichtbar werden und somit nicht fälschlicherweise dafür gehalten werden, spezifisch hybridisierbare Target-DNA aufzuweisen.
Ein weiterer Vorteil der Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung ist, daß diese mit weiteren direkt markierten Sonden- Zusammensetzungen, insbesondere mit Fluorophor-markierten Sonden, zusammengemischt werden können, und die resultierenden gemischten Sonden können bei einer in situ-Hybridisierung verwendet werden, um sowohl eine Gegenfärbung genomischer DNA als auch eine Färbung von spezifischen genomischen DNA-Bereichen oder Anteilen gleichzeitig zu erhalten, ohne daß es zu irgendwelchen unerwünschten Störungen oder Wechselwirkungen kommt, die aus einer solchen Zumischung resultieren. Dadurch wird die Zeit und die Arbeit für die Durchführung einer Reihe von Hybri disierungsschritte einschließlich getrennter Inkubationsschritte, die ansonsten notwendig wären, vollständig eingespart.
Ein wichtiges Merkmal, das mit den Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung verbunden ist, ist, daß diese Direkt- Markierungs-Sonden enthalten. Somit ist, nach Hybridisierung derselben mit genomischer DNA in einer Probe und nachfolgendem Waschen, die Gegenfärbung vollendet. Es ist kein weiteres nachfolgendes reaktives Umsetzen mit weiteren Reagenzien erforderlich, um die Nachweisfähigkeit zu entwickeln, wie dies mit Indirekt-Markierungs-Sonden notwendig ist. Auch haben Indirekt- Markierungs-Sonden gewöhnlicherweise Kompatibilitätsbeschränkungen; diese können z. B. nicht mit anderen Sonden verwendet werden, welche Komponenten enthalten könnten, die bei einer notwendigen Post-Hybridisierungsreaktion, die benötigt wird, um die nachweisbaren Einheiten zu entwickeln, stören. Weiterhin ist die Anzahl von bekannten Reaktionspaaren, die bei der Verwendung von Indirekt-Markierungs-Sonden benötigt werden, beschränkt, so daß die Mischzusammensetzungen aus verschiedenen Sonden, die für die nachfolgenden in situ- Hybridisierungsverfahren hergestellt werden können, beschränkt sind.
Ein weiteres wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, daß die Verwendung von Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung zu gegengefärbter DNA führt, die unter in situ- Hybridisierungsbedingungen oder ähnlichen weiter bearbeitet werden können, ohne daß es zu einer wesentlichen Abtrennung der hybridisierten Gegenfärbung von der gegengefärbten DNA kommt. Im Gegenteil dazu kann bei chemischen Gegenfärbemitteln aus dem Stand der Technik eine nachfolgende Exponierung der gefärbten Probe gegenüber Bearbeitungsflüssigkeiten zu wenigstens einer teilweisen Abtrennung des Färbemittels führen. Es wird angenommen, daß ein prinzipieller Grund für diesen Unterschied bei der Färbungsstabilität mit den charakteristisch höheren Bindungskonstanten verbunden ist, die mit den Hybriden unter ihrer Schmelztemperatur (Tm) verbunden sind, verglichen mit den Bin dungskonstanten, die mit den interkalierten Agentien verbunden sind.
Die erfindungsgemäßen Direkt-Markierungs-Sonden- Zusammensetzungen zum Gegenfärben der gesamten genomischen DNA sind auch ohne weiteres unterscheidbar von abschnittsspezifischen Direkt-Markierungs-Sonden, wie beispielsweise einzelnen Chromosomen-DNA-Farbsonden-Zusammensetzungen, die nicht verwendet werden können, um eine genomische DNA, die von der besonderen Genomfraktion, gegen die eine solche Farbsonden- Zusammensetzung durch sorgfältige Designauswahl gerichtet ist, verschieden ist, nachzuweisen, aufgrund der komplementären Beschränkungen der darin enthaltenen DNA-Sequenzen.
Die Fähigkeit der Fluorophor-markierten Sonden- Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung, klare, scharfe, direkt nachweisbare genomische chromosomale Hybride während eines Chromosomtests durch in situ-Hybridisierung zu erzeugen, führt nicht nur zu neuen und sehr verwendbaren in situ Hybridisierungsverfahren, die solche Sonden verwenden, sondern auch zu neuen und sehr verwendbaren Produkten, wie beispielsweise genomischen Target-DNA-Körperchen, die mit einer Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung im wesentlichen vollständig gegengefärbt wurden, oder Hybriden, welche durch in situ-Hybridisierung mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung mit einer Target-DNA erzeugt wurden.
Andere und weitere Merkmale, Aufgaben, Ziele, Zwecke, Vorteile, Anwendungen, Ausführungsformen und ähnliches werden für den Fachmann aus den Lehren der vorliegenden Beschreibung zusammen mit den beiliegenden Zeichnungen ersichtlich sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Zeichnungen:
Fig. 1 ist eine schematische, mikroskopische Ansicht eines einzelnen Metaphasenchromosoms, das mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung gegengefärbt wurde;
Fig. 2 ist eine schematische, stark vergrößerte theoretische Ansicht eines Bereiches des Chromosoms aus Fig. 1;
Fig. 3 ist eine schematische, mikroskopische Ansicht, die ein einzelnes Chromosom vom Säugetiertyp veranschaulicht;
Fig. 4 ist eine fragmentarische, stark vergrößerte, schematische Ansicht eines Bereiches, der als II des Chromosoms aus Fig. 1 identifiziert wurde, nachdem dieses Chromosom durch ein interkalierendes, genomisches, chemisches DNA-Gegenfärbemittel aus dem Stand der Technik gegengefärbt wurde;
Fig. 5 ist eine Ansicht, die ähnlich zu der aus Fig. 4 ist, aber diese Region II zeigt, nachdem ein dieses Chromosom durch eine genomische DNA-Sonden- Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung gegengefärbt wurde;
Fig. 6 ist eine mikroskopische, schematische Ansicht einer auf einem Objektträger aufgebrachten Probe eines einzelnen humanen Zellkerns, der mittels eines DNA- Gegenfärbemittels gegengefärbt wurde; und
Fig. 7-15 sind Mikrofotografien von Proben von humaner Metaphasen und Interphasen-DNA, die mit Sonden- Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung gegengefärbt wurden.

Genaue Beschreibung

(A) Definitionen

Der Begriff "Gegenfärbung", wie er hier verwendet wird, nimmt allgemein und herkömmlich Bezug auf eine Ergänzungs- oder Hintergrundfarbe, die über ein Färbeverfahren oder ähnliches erzeugt ist, deren Farbe auf sämtliche oder eine ausgewählte Gruppe von Komponenten (oder aufbauenden Körperchen) eines zytologischen oder histologischen Päparats wirkt. Typischerweise sollen solche Komponenten einer mikroskopischen Untersuchung oder ähnlichem unterworfen werden, und typischerweise können/kann eine weitere oder andere Haupt- oder Primärfarbe(n), die durch weitere oder andere Färbemittel, die selektiv sind, erzeugt werden, bei der Untersuchung verwendet werden. Der Hauptzweck oder die Funktion einer solchen Gegenfärbungsfarbe ist es gewöhnlicherweise, eine solche Untersuchung zu verbessern oder zu optimieren.
Der Begriff "Sequenz" bezieht sich auf eine Kette oder auf miteinander verbundene Abfolgen von DNA-Nukleotiden.
Der Begriff "Fragment", "Segment" oder "DNA-Segment" steht allgemein nur für einen Bereich eines größeren DNA-Polynukleotids oder für eine Sequenz, wie diese in einem Chromosom oder einem Bereich eines Chromosoms auftritt. Ein Polynukleotid kann z. B. in eine Mehrheit von Segmenten oder Fragmenten aufgebrochen oder fragmentiert werden. Wie es bekannt ist, enthält ein Chromosom in charakteristischer Weise Bereiche, die DNA-Sequenzen aufweisen, die sich wiederholende DNA-Segmente enthalten. Der Begriff "wiederholend" nimmt Bezug auf die Tatsache, daß ein besonderes DNA-Segment mehrfach (d. h., wenigstens zweifach) als dieselbe DNA-Sequenz oder als eine Mehrheit von DNA-Sequenzen auftritt. Die einzelne DNA-Segmentgröße und/oder die Segmentgröße der sich wiederholenden DNA kann stark variieren. Z. B. nimmt man nun im Fall des humanen Genoms an, daß jedes sich wiederholende DNA-Segment typischerweise in dem Bereich einer geschätzten Größe von etwa 5 bis etwa 3000 bp liegt. Beispielsweise kann ein einzelnes Chromosom einer alphoiden DNA-Sequenz wenigstens etwa 5 verschiedene, sich wiederholende DNA-Segmente umfassen.
Der Begriff "Genom" bezeichnet oder bedeutet den vollständigen Einzelkopiensatz der genetischen Anweisungen für einen Organismus, wie dieser in der DNA des Organismus kodiert ist. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ist das besondere Genom, das untersucht wird, typischerweise multichromosomal, so daß diese DNA auf eine Vielzahl von einzelnen Chromosomen (deren Anzahl beispielsweise beim Menschen 22 Paare sowie ein Geschlechtsassoziiertes XX Paar oder XY Paar umfaßt) zellulär verteilt ist.
Bei der Durchführung dieser Erfindung stammt das in einem gegebenen Fall verwendete Genom bevorzugt von einem Primaten, und die DNA-Sequenzen eines vorausgewählten Chromosoms eines solchen Genoms enthalten sich wiederholende DNA-Segmente, die entweder alphoide DNA einschließen oder mit dem Zentromer des vorausgewählten Chromosom verbunden sind. Wie hier verwendet, nimmt der Begriff "alphoid" oder "alpha-Satellit" im Hinblick auf die DNA Bezug auf die komplexe Familie von sich tandemartig wiederholenden DNA-Segmenten, die in Primatengenomen gefunden werden. Lange Tandemanordnungen von alpha-Satellit-DNA, die auf einer Monomer-Wiederholungslänge von etwa 171 Basenpaaren beruhen, sind prinzipiell bei den Zentromeren der Primatenchromosomen angeordnet.
Der Begriff "Chromosom" bezieht sich auf einen Erbgut-tragenden Genträger einer lebenden Zelle, welcher vom Chromatin abgeleitet ist und welcher DNA und Proteinkomponenten (insbesondere Histone) umfaßt. Das herkömmliche, international anerkannte individuelle humane Genom-Chromosomen-Numerierungs- Identifikationssystem wird hier verwendet. Die Größe eines individuellen Chromosoms kann von einem Typ zum nächsten bei einem gegebenen multichromosomalen Genom und von einem Genom zum nächsten variieren. Im Fall des (bevorzugten) humanen Genoms beträgt die gesamte DNA-Masse eines gegebenen Chromosoms gewöhnlicherweise mehr als etwa 100.000.000 bp. Beispielsweise beträgt die Größe des gesamten humanen Genoms etwa 3 · 10&sup9; bp. Das größte Chromosom, Chromosm Nr. 1, enthält etwa 2,4 · 10&sup8; bp, während das kleinste Chromosom, Chromosm Nr. 22, etwa 5,3 · 10&sup7; bp enthält(Yunis, J. J. Science 191: 1268-1270 (1976) und Kavenoff, R., et al. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 38: 1-8(1973)).
Der Begriff "Bereich" zeigt einen Bereich eines Chromosoms an, der sich wiederholende DNA-Segmente enthält, die bevorzugt alphoid sind oder mit dem Zentromer verbunden sind. Die tatsächliche physikalische Größe oder der Umfang eines solchen individuellen Bereiches kann stark variieren. Eine genaue Quantifizierung eines solchen Bereiches kann nun nicht für alle möglichen Bereiche angegeben werden. Gewöhnlicherweise ist ein Bereich wenigstens groß genug, um wenigstens eine DNA-Sequenz zu umfassen, die (a) eine Vielzahl von Kopien von wenigstens einem sich wiederholenden DNA-Segment umfaßt, und die(b) identifizierbar ist und durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchung nach Bildung der Fluorophor-markierten Hybride in diesem Bereich nach einem in situ-Hybridisierungsverfahren mit einer Direkt-Markierungs-Sonde oder einer Sonden-Zusammensetzung bevorzugt optisch zählbar ist. Die gegenwärtig verfügbaren Informationen legen nahe, daß ein Bereich mehr als eine einzelne DNA- Sequenz enthalten kann, wobei jede DNA-Sequenz ein oder mehrere sich wiederholende(s) DNA-Segment(e) enthält.
Der Begriff "Bereich" ist typischerweise und charakteristischerweise ein Chromosomenfragment, das eine geringere DNA- Masse oder Größe als die gesamte DNA-Masse oder Größe eines gegebenen Chromosoms umfaßt. Wie es bekannt ist, ist nicht die gesamte DNA eines gegebenen Chromosoms oder eines Chromosomenbereichs in Form von DNA-Sequenzen, die sich wiederholende DNA- Segmente umfassen oder enthalten, angeordnet. Ein Bereich kann z. B. eine Größe haben, der etwa 2 · 10&sup6; bis etwa 40 · 10&sup6; DNA bp umfaßt, wobei dieser Größenbereich z. B. die Zentromere der humanen Chromosome umfaßt. Diese Größe ist somit ein wesentlicher Anteil von der Größe eines einzelnen humanen Chromosomes. Dieser Größenbereich ist vorwiegend bevorzugt als ein Größenbereich bei der Durchführung dieser Erfindung, obwohl größerer und kleinere Größenbereiche verwendet werden können. Sogar ein zentromerischer Bereich eines kleinen humanen Chromosoms ist ein mikroskopisch sichtbarer großer Bereich des Chromosoms, und ein Bereich, der sich wiederholende DNA-Segmente (nicht alphoide oder zentromerische) auf dem Y-Chromosom umfaßt, belegt den Hauptteil des Chromosomes und ist mikroskopisch sichtbar. Im allgemeinen ist der Begriff "Bereich" nicht für ein bestimmtes (oder mehrere) Gen(e) definitiert, da ein "Bereich" nicht die besonderen codierenden Segmente (Exons) eines einzelnen Genes speziell berücksichtigt. Vielmehr ist ein "Bereich", wie er hier in bezug auf ein Chromosom verwendet wird, einzigartig für ein gegebenes Chromosom aufgrund der besonderen Kombination von DNA-Segmenten darin für die vorliegende(n) Sonden- Zusammensetzungs-Bildung und Verwendungszwecke.
Der Begriff "Zentromer" betrifft einen heterochromatischen Bereich des eukaryotischen Chromosoms, welches die chromosomale Befestigungsstelle des Kinetochors ist. Das Zentromer teilt sich unmittelbar bevor sich die replizierenden Chromosomen trennen und hält so die gepaarten Chromatide zusammen.
Der Begriff "Gen" bezeichnet oder bedeutet eine DNA-Sequenz entlang eines Chromosomes, die für ein funktionales Produkt (entweder RNA oder deren Translationsprodukt, ein Polypeptid) codiert. Ein Gen enthält einen codierenden Bereich und umfaßt Bereiche, die dem codierenden Bereich vorweggehen und nachfolgen (die man entsprechend "Leader" und "Trailer" nennt). Der codierende Bereich umfaßt eine Mehrzahl von codierenden Segmenten ("Exons") und dazwischengeschaltete Sequenzen ("Introns") zwischen den einzelnen codierenden Segmenten.
Der Begriff "Sonde" oder "Sonden-Zusammensetzung" betrifft ein Polynukleotid oder eine Mischung aus Polynukleotiden wie beispielsweise (eine) DNA-Sequenz(en) oder (ein) DNA-Segment(en), welche(s) mit den einzelnen Markierungs-haltigen Einheiten chemisch kombiniert (d. h. verbunden) wurde(n). Jedes Polynukleotid einer Sonde ist typischerweise einzelsträngig zum Zeitpunkt der Hybridisierung an ein Target.
Der Begriff "Markierung" oder "Markierungs-haltige Einheit" betrifft in einem allgemeinen Sinn eine Einheit, wie beispielsweise ein radioaktives Isotop oder eine dasselbe enthaltene Gruppe, und nichtisotopische Markierungen, wie beispielsweise Enzyme, Biotin, Avidin, Streptavidin, Digoxygenin, lumineszierende Agentien, Farbstoffe, Haptene und ähnliches. Lumineszierende Agentien können, was von der Quelle der Anregungsenergie abhängt, als radiolumineszierend, chemilumineszierend, biolumineszierend und photolumineszierend (einschließlich fluoreszierend und phosphoreszierend) klassifiziert werden.
Die Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung enthalten DNA-Segmente, die an Markierungs-haltige Einheiten chemisch gebunden sind. Jede Markierungs-haltige Einheit enthält wenigstens eine Fluorophor- (fluoreszierende) Gruppe, und jede Markierungshaltige Einheit ist von einer monofunktionellen, reaktiven Substituent-haltigen und auch Fluorophorsubstituenthaltigen Ausgangs-Fluoreszenzverbindung, wie sie nachfolgend genauer beschrieben wird, abgeleitet.
Der Begriff "Direkt-Markierungs-Sonde" (oder "Direkt- Markierungssonden-Zusammensetzung) bezeichnet oder bedeutet eine Nukleinsäurensonde, deren Markierung nach einer Hybridbildung mit einem Target ohne weiteres reaktive Bearbeiten des Hybrides nachweisbar ist. Die Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung sind vom Typ der Direkt-Markierung.
Der Begriff "Indirekt-Markierungs-Sonde" (oder "Indirekt- Markierungs-Sonden-Zusammensetzung") bzeichnet oder bedeutet eine Nukleinsäurensonde, deren Markierung nach der Hybridbildung mit einem Target bei einem nachfolgenden Bearbeitungsschritt mit einem oder mehreren Reagenzien weiter umgesetzt werden muß, um damit eine oder mehrere Einheiten, die schließlich zu einem nachweisbaren Gebilde führen, zu verbinden.
Der Begriff "Target", "DNA-Target" oder "DNA-Targetbereich" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, welche an einem spezifischen chromosomalen Locus auftritt. Jede Sequenz oder jeder Bereich ist typischerweise und bevorzugt wenigstens teilweise einzelsträngig (d. h. denaturiert) zum Zeitpunkt der Hybridisierung. Wenn die Target-Nukleotidsequenzen mir in einem einzelnen Bereich oder einem Anteil eines gegebenen Chromosoms angeordnet sind, wird der Begriff "Targetbereich" manchmal verwendet. Targets für die Hybridisierung können aus Proben gewonnen werden, die umfassen, aber nicht beschränkt sind auf Chromosomen oder Bereichen von Chromosomen in normalen, kranken oder malignen, humanen oder anderen tierischen oder pflanzlichen Zellen, entweder in der Interphase oder in einem Stadium der Meiose oder Mitose, und die entweder extrahiert sind oder gewonnen wurden aus lebenden oder postmortem Geweben, Organen oder Flüssigkeiten; Keimzellen einschließlich Sperma und Eizellen, Samen, Pollen oder Zygoten, Embryos, Chorion- oder Amnionzellen, oder Zellen aus einem anderen keimenden Körper; in vitro gezogenen Zellen, entweder aus einer Langzeit- oder einer Kurzzeitkultur, und entweder normal, immortalisiert oder transformiert; inter- oder intraspezifischen Hybriden von verschiedenen Zelltypen oder Differenzierungsstadien dieser Zellen; einzelnen Chromosomen oder Bereichen von Chromosomen, oder translozierte, deletierte oder anderen geschädigten Chromosomen, die über eines der zahlreichen, dem Fachmann bekannten Mittel isoliert wurden, einschließlich Bibliotheken von solchen Chromosomen, die in prokaryotischen oder anderen Klonierungsvektoren kloniert und vermehrt sind, oder in vitro durch Mittel amplifiziert sind, die dem Fachmann wohlbekannt sind; oder jegliches forensische Material, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Samen, Blut, Haaren oder anderen Proben.
Der Begriff "Hybrid" bezieht sich auf das Produkt eines Hybridisierungsverfahrens zwischen einer Sonde und einem Target. Typischerweise ist ein Hybrid ein Molekül, das einen doppelsträngigen, helikal konfigurierten Bereich umfaßt, der komplementär gepaarte einzelsträngige Moleküle wie zwei DNA-Moleküle umfaßt, wobei eines von diesen eine Target-DNA-Nukleotidsequenz ist und das andere von diesen die markierte DNA-Nukleotidsequenz einer Sonde ist.
Der Begriff "Farbe", "selektive Farbe", "selektiv gefärbt" bzw. ein Äquivalent davon bezieht sich allgemein auf einen lokalisierten Farbbereich, der durch ein Färbeverfahren oder ähnliches erzielt wird, dessen Farbe auf eine ausgewählte Gruppe von Komponenten (oder Bestandteilen) eines zytologischen oder histologischen Präparats wirkt. Typischerweise sollen solche gefärbten Komponenten einer mikroskopischen Untersuchung oder ähnlichem unterworfen werden. Gewöhnlicherweise kann eine andere oder weitere Ergänzungs- oder Hintergrundfarbe, (d. h. Farbe) verwendet werden als sogenannte Gegenfärbung, die auf sämtliche Komponenten einer größeren Klasse wirkt, innerhalb derer eine selektiv gefärbte Gruppe von Komponenten fällt. Der Hauptzweck einer Färbung ist es, die Identifizierung von Komponenten während einer solchen Untersuchung zu verstärken oder möglich zu machen. Eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung erzeugt unter Hybridisierungbedingungen Hybride, welche in der Tat ein Target-Chromosom oder einen Target-chromosomalen Bereich mit einer fluoreszierenden Gruppe färben.
Der Begriff "fluoreszierend" (und äquivalente Begriffe) nimmt allgemein Bezug auf die Eigenschaft eines Stoffes (wie beispielsweise eines Fluorophors) Licht zu erzeugen, während auf diesen mittels Strahlungsenergie, wie beispielsweise ultraviolettem Licht oder Röntgenstrahlen, eingewirkt wird.
Der Begriff "fluoreszierende Verbindung" oder "Fluorophor- Gruppe" bezieht sich allgemein auf eine organische Einheit. Ei ne fluoreszierende Gruppe ist in der Lage, mit einer Verbindungsgruppe umgesetzt zu werden, und eine Fluorophor-Gruppe kann bereits schon umgesetzt sein. Eine fluoreszierende Verbindung kann einen organischen Chelator, der ein lumineszierendes anorganisches Ion wie beispielsweise ein seltenes Erdmetall wie Terbium, Europium, Ruthenium oder ähnliches bindet, umfassen.
Der Begriff "Verbindungsverbindung" ("linking compound") oder "Verbindungsgruppe" ("linking group"), wie hier verwendet, bezieht sich allgemein auf eine Kohlenwasserstoff-haltige Einheit. Eine Verbindungsverbindung ist in der Lage, mit einer Nukleotidsequenz (oder einem Nukleotidsegment) zu reagieren, und eine Verbindungsgruppe kann bereits reagiert haben. Eine Verbindungsverbindung ist auch in der Lage mit einer fluoreszierenden Verbindung zu reagieren, und eine Verbindungsgruppe kann bereits reagiert haben.
Der Begriff "in situ" bedeutet, daß die Chromosomen aus dem Zellkern ohne wesentliche Zerstörung oder Umordnung der Chromosomen, jeweils bezogen auf die anderen, exponiert werden und die Chromosomen für die fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden zugänglich sind.
Der Begriff "Denaturierung" oder "denaturieren" nimmt Bezug auf die wenigstens teilweise vollständige Umwandlung eines Polynukleotids aus einem mehrfachsträngigen (oder doppelsträngigen) Zustand in einen einzelsträngigen Zustand. Das Vorhandensein eines Agens oder von Agentien, welche die Temperatur, die für die Denaturierung und für die nachfolgenden Hybridisierungsbedingungen zwischen Sonde (oder Sonden-Zusammensetzung) und Target benötigt wird, wirksam erniedrigt, ist allgemein wünschenswert, und ein vorliegend am meisten bevorzugtes Agens ist Formamid. Wenn man z. B. eine Mischung aus Wasser und Formamid in einem Volumenverhältnis von etwa 50 : 50 verwendet, liegt eine beispielhafte Temperatur für die thermische Denaturierung in dem Bereich von etwa 70 bis etwa 80ºC, die für Zeiten angelegt wird, die beispielhaft im Bereich von etwa einer bis etwa zehn Minuten liegen.
Der Begriff "in situ-Hybridisierung" nimmt Bezug auf die Hybridisierung einer Sonde an ein Target, das innerhalb eines zytologischen oder histologischen Präparats oder einer Probe vorliegt. Als ein Ergebnis eines in situ-Hybridisierungsverfahrens werden Hybride zwischen einer Sonde und einem Target erzeugt. Dieser Begriff "in situ-Hybridisierung" kann die Denaturierung einschließen und kann auch ein Hybrid oder ein Sondennachweisverfahren einschließen, welches nach der in situ Hybridisierung einer Sonde an ein Target durchgeführt wird. Eine Probe kann als eine Schicht auf einer Objektträgeroberfläche angebracht werden, und eine Probe kann z. B. einzelne Chromosomen oder Chromosomenbereiche umfassen oder beinhalten, welche behandelt wurden, um deren Morphologie unter z. B. denaturierenden Bedingungen oder Bedingungen wie sie beispielsweise typischerweise während einer Durchfluß-Zytometrieanalyse in einem Sondennachweisverfahren vorliegen, zu erhalten. Der Begriff "in situ- Hybridisierung" kann die Verwendung einer Gegenfärbung umfassen. Im Fall der erfindungsgemäßen Fluorophor-markierten Sonden oder Sonden-Zusammensetzungen kann das Nachweisverfahren die Fluoreszenzmikroskopie, die Durchfluß-Zytrometrie oder ähnliches umfassen.
Der Begriff "Hybridisierungsbedingungen" nimmt allgemein Bezug auf die Kombinationen von Bedingungen, die in einem gegebenen Hybridisierungsverfahren anwendbar sind, um Hybride zu erzeugen, solche Bedingungen umfassen typischerweise eine kontrollierte Temperatur, Flüssigphase und ein Inkontaktbringen von einer Sonde (oder Sonden-Zusammensetzung) mit einem Target. Geeigneterweise und bevorzugt geht wenigstens ein Denaturierungsschritt einem Schritt voraus, worin eine Sonde oder Sonden- Zusammensetzung mit einem Target in Kontakt gebracht wird. Alternativ kann eine Sonde mit einer Probe, die einen DNA- Targetbereich umfaßt, in Kontakt gebracht werden und beide zusammen denaturierenden Bedingungen unterworfen werden, wie dies von Bhatt et al. (1988) in Nucleic Acids Research 16: 3951-3961 beschrieben wurde. Zum Beispiel unter Verwendung eines Volumenverhältnisses von annähernd 50 : 50 von Wasser und Formamid liegt eine beispielhafte Temperatur für das Inkontaktbringen und die Hybridisierung von Sonde (oder Sonden-Zusammensetzung) und Target in dem Bereich von etwa 35 bis etwa 55ºC, die für eine Zeit angelegt werden, die beispielsweise in dem Bereich von etwa 1 bis etwa 18 Stunden liegt. Andere Hybridisierungsbedingungen können verwendet werden. Das Verhältnis der Anzahl von Sonden zur Anzahl von Targetsequenzen oder Segmenten kann stark variieren, aber allgemein gilt, je größer dieses Verhältnis ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit einer Hybridbildung unter den Hybridisierungsbedingungen innerhalb der Grenzen.
Der Begriff "vollständig" oder "im wesentlichen vollständig" bezieht sich auf die Fähigkeit einer Direkt-Markierungs-Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung, mit einem Target zu hybridisieren, so daß das Targetkörperchen oder die Targetkörperchen (über ein Fluoreszenzmikroskop, ein Durchflußzytometer oder ähnliches) nach der Hybridisierung damit in einem Ausmaß, das wenigstens ausreichend ist, die vollständige Ausdehnung (Morphologie) des Targets zu zeigen (d. h., zu färben oder zu identifizieren), hervorgehoben werden und identifizierbar sind. Somit können manchmal Abweichungen in der Fluoreszenfärbungsintensität in einem einzelnen hybridisierten chromosomalen Targetkörperchen vorliegen (d. h., beobachtet werden), aber das Targetkörperchen als ganzes ist im wesentlichen hervorgehoben.
Der Begriff "geringer" bezieht sich auf eine einzelne Verbindung, Gruppe oder Rest und bedeutet, daß diese Verbindung, Gruppe oder der Rest weniger als 6 Kohlenstoffatome enthält.
Der Begriff "Farbsonde" oder "färbende Sonde", (oder "Farbsonden-Zusammensetzung" oder "färbende Sonden-Zusammensetzung) bezieht sich auf eine Sonde oder Sonden-Zusammensetzung wie eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung, welche geeignet ist, unter Hybridisierungsbedingungen mit einem Target, welches ein vorherbestimmtes (d. h. vorausgewähltes) Chromosom eines multichromosomalen Genoms umfaßt, zu hybridisieren. Wenn nur ein Bruchteil eines solchen Chromosoms in einer Probe vorhanden zu sein scheint, die eine solche Hybridisierung mit dieser Sonden-Zusammensetzung durchmacht, dann hybridisiert dieser Bruchteil und ist identifiziert. Typischerweise kann eine Farbsonde gemäß dieser Erfindung mit einer zweiten gemischt werden, um so die gleichzeitige Färbung und den Nachweis von zwei vorherbestimmten Chromosomen möglich zu machen.
Der Begriff "Klon", "Klonieren" bzw. ein Äquivalent dazu bezieht sich auf das Verfahren, worin ein besonderes Nukleotidsegment oder eine Nukleotidsequenz in einen geeigneten Vektor eingefügt wird, der Vektor dann in eine Wirtzelle überführt wird, und der Vektor innerhalb der Wirtzelle dann veranlaßt wird, sich selbst bei einem Kultivierungsverfahren zu reproduzieren, wodurch man zahlreiche Kopien von jedem Vektor und der diesbezüglichen Nukleotidsequenz, die dieser trägt, erzeugt. Das Klonieren führt zu der Bildung einer Kolonie oder einem Klon (d. h. einer Gruppe) von identischen Wirtzellen, wobei jeder eine oder mehrere Kopien eines Vektors, der ein besonderes Nukleotidsegment oder eine Nukleotidsequenz trägt, enthält. Von dem Nukleotidsegment oder der Sequenz wird nun gesagt, daß diese "kloniert" ist, und das Produkt der Nukleotidsegmente oder Sequenzen kann "Klone" genannt werden.
Der Begriff "Blocking-DNA" oder "Blocking-DNA-Zusammensetzung" bezieht sich auf eine DNA, welche die Fähigkeit hat, unter hybridisierenden Bedingungen mit nichtspezifischer bindender DNA, die in einer Sonde vorhanden ist, zu hybridisieren. Eine Blocking-DNA-Zusammensetzung besteht aus einer Mischung aus DNA- Segmenten, die gewonnen werden, einschließen und bevorzugt repräsentativ sind für die gesamte genomische DNA eines multichromosomalen Genoms, das untersucht wird und das ein Target enthält. Solche Segmente können z. B. durch Fragmentieren (wie es hier gelehrt wird) von DNA-Sequenzen hergestellt werden, die eine solche gesamte genomische DNA umfassen oder dafür re presentativ sind, und diese so hergestellten DNA-Segmente sind komplementär zu den DNA-Segmentbereichen, die bei den Chromosomen (einschließlich der Bereiche) von diesem Genom auftreten, diese Segmente können z. B. auch hergestellt werden aus einer gesamten genomischen DNA über weitere Verfahren wie z. B. über ein Verfahren, das die vorhergehenden Stufen des Denaturierens, des teilweisen Reannealings oder Rehybridisierens umfaßt, und Behandeln mit Enzymen, wodurch man die Menge an sich nicht wiederholenden Segmenten darin verringert. Die Blocking-DNA liegt zum Zeitpunkt der Verwendung mit einer Sonden-Zusammensetzung bevorzugt in der Form von Segmenten mit Durchschnittsgrößen im Bereich von etwa 150 bis 600 Basenpaaren vor.
Der Begriff "Bibliothek" wird hier in seinem herkömmlichen Sinne verwendet, um auf einen Satz klonierter DNA-Fragmente, die zusammen ein vollständiges Genom oder ein spezifiziertes Fragment davon, wie beispielsweise von einem einzelnen Chromosom, repräsentieren, Bezug zu nehmen. Verschiedenartige Bibliotheken sind im Stand der Technik bekannt und sind von verschiedenartigen Hinterlegungsstellen erhältlich, und die Techniken für die Genom- und die Genomfragmentpräparierung und für das Klonieren von Bibliotheken daraus sind wohlbekannt. Eine vorliegende verfahrensmäßige Bevorzugung ist es, ein ausgewähltes Chromosom, das mittels Durchfluß-Sortierung oder ähnlichem abgetrennt wurde, zu fragmentieren. Die Fragmentierung vor der Klonierung wird bevorzugt durch Verdauung mit Restriktions-Endonukleasen oder ählichem erreicht. Dieses Verfahren erzeugt Fragmentenden, welche besonders zugänglich für einen Einbau in Vektoren sind. Jedoch wissen die Fachleute, daß jede herkömmliche oder geeignete Technik für die Fragmentierung verwendet werden kann. Die Fragmente werden dann herkömmlicherweise kloniert, um eine Chromosomen-Bibliothek herzustellen.**
Der Begriff "blockierte Sonden-Zusammensetzung" betrifft eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung, welche in Mischung mit einer Blocking-DNA-Zusammensetzung vorliegt.
Der Begriff "verdünnte DNA" oder ein Aquivalent dazu bezieht sich auf eine DNA, welche gleich ist oder ähnlich ist zu der DNA, die in einer besonderen Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung enthalten ist. Die verdünnte DNA wirkt, wenn sie mit transaminierten Polynukleotiden, die ein Zwischenprodukt bei der Herstellung einer Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung darstellen, gemischt werden oder wenn sie mit einer Produkt-Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung gemischt werden, indem sie die gesamte Anzahl an markierten DNA- Segmenten, die in einem gegebenen Volumen oder einem Gewicht einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung vorhanden sind, verdünnen.
Wie die Fachleute wissen, kann eine verdünnte DNA manchmal auch als eine blockierende DNA wirken und vice versa.
Der Begriff "Träger-DNA" betrifft eine DNA, welche wirkt, indem sie die Menge an Sonden-DNA verringert, welche von Natur aus aufgrund solcher Effekte wie der Absorption der Sonden-DNA an die benachbarten Oberflächenbereiche verloren geht, wie beispielsweise den Oberflächenbereichen eines Aufbewahrungsgefäßes, worin eine Sonde aufbewahrt wird, den Oberflächenbereichen eines Objektträgers, worauf eine Probe, die einer in situ- Hybridisierung unterworfen wird, oder den Oberflächenbereichen von zellulären Trümmern, die in einer Probe, die einer in situ- Hybridisierung unterworfen wird, vorhanden sind oder ähnliches. Die Träger-DNA besteht aus DNA, die aus nichtverwandten genomischen Spezien gewonnen wird, wie beispielsweise Lachssperma in Zumischung mit DNA-Segmenten, die aus dem humanen Genom gewonnen wurden. Eine Träger-DNA kann wahlweise zu einer Hybridisierungslösung, die eine Sonde gemäß dieser Erfindung umfaßt, zugegeben werden.
Der Begriff "nichtspezifische bindende DNA" bezieht sich auf DNA, welche komplementär zu DNA-Segmenten einer Sonde ist und deren DNA in wenigstens einer weiteren Position in einem Genom auftritt, deren weitere Position außerhalb eines ausgewählten chromosomalen Targetbereiches innerhalb des Genomes liegt. Ein Beispiel für nichtspezifische bindende DNA umfaßt eine Klasse von sich wiederholenden DNA-Segmenten, deren Mitglieder gewöhnlicherweise in mehr als einem Chromosom oder Chromosomenbereich auftreten. Diese gewöhnlicherweise repetitiven Segmente neigen dazu, in einem größeren Umfang als andere DNA-Segmente, die in einer Sonden-Zusammensetzung vorhanden sind, zu hybridisieren.

(B) Ausgangsmaterialien

(1) Die gesamte genomische Ausgangs-DNA

Die gesamte genomische Ausgangs-DNA, die bei der Durchführung dieser Erfindung verwendet wird, liegt typischerweise in der Form einer Vielzahl von DNA-Sequenzen vor, die zusammengenommen eine Vielfalt von DNA-Segmenten enthalten, die einzeln an verschiedenartigen Loci in und über die einzelnen Chromosomen in einem gegebenen multichromosomalen Genom auftreten. Somit können solche DNA-Segmente einzelne oder können nicht sich wiederholende Segmente sein. Bevorzugt umfassen die Ausgangskomponenten Segmente eine gesamte genomische DNA. Obwohl in ihrem natürlicherweise auftretenden Zustand die Ausgangs-DNA-Sequenzen typischerweise eine Größe aufweisen, die jeweils viel größer als etwa eine Million Basenpaare ist, zum Zeitpunkt der Verfügbarkeit für die Verwendung als Ausgangsmaterial bei der Durchführung dieser Erfindung, kann die gesamte genomische DNA bereits etwas fragmentiert sein, was von solchen Faktoren abhängt, wie von den Verfahren, die bei der Abtrennung, Isolierung und ähnlichem verwendet werden.
Für die Zwecke zum Herstellen einer gegebenen Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung kann die gesamte genomische Ausgangs-DNA eines Genoms über verschiedenartige Techniken erhalten werden. Diese kann somit aus zellulärer DNA, die von dem intrazellulären Komponentenmaterial eines Organismusses abgetrennt ist (einschließlich Reinigung), gewonnen oder erhalten werden. Die Abtrennungsverfahren sind wohlbekannt, und jedes geeignete Abtrennungsverfahren kann verwendet werden; siehe z. B. J. Sambrook, E. F. Fritsch, und T. Maniatis (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Kapitel 9, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York und den darin zitierten Literaturstellen. Obwohl jede geeignete Gewebequelle oder Zelle verwendet werden kann, wird es vorliegend bevorzugt, Gewebe auszuwählen, das charakteristischerweise einen relativ hohen gesamten genomischen DNA-Gehalt aufweist und aus dem die gesamte genomische DNA für ein gegebenes Genom effizient abgetrennt werden kann.
Wenn man eine Direkt-Markierungs-Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung herstellt, wird es vorliegend bevorzugt, eine gesamte genomische Ausgangs-DNA zu verwenden, die für eine ausgewählte genomische DNA eines Organismus repräsentativ ist. Die vorliegende Erfindung kann durchgeführt werden, in dem man eine gesamte genomische Ausgangs-DNA verwendet, die aus dem Genom des Organgismus gewonnen ist, worin aber die Komponentenvielfalt der DNA-Segmente nicht die gleiche Verteilung oder Ereignisfrequenz aufweist, die für das natürliche (oder normale) Vorkommen in dem Genom des Organismus kennzeichnend ist. Bei der Verwendung einer gesamten genomischen Ausgangs-DNA, wobei das Vorkommen oder die Verteilung der DNA-Segmente schief ist, ist die Fähigkeit einer Produkt-Sonden-Zusammensetzung, genomische DNA vollständig gegenzufärben und dadurch die gesamte genomische DNA nachzuweisen, nicht zerstört, sondern sie ist vielmehr verändert. Das Ergebnis ist, daß die resultierenden hybridisierten genomischen Target-DNA-Körperchen, die in einer Probe vorhanden sind, dazu neigen, durch eine Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung ungleichmäßig, aber dennoch im wesentlichen vollständig gegengefärbt zu werden. Von den Bereichen, die die größte Anfärbungsintensität zeigen, wenn sie nachfolgend unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden, nimmt man an, daß diese den chromosomalen Bereichen entsprechen, worin die relative Häufigkeit des Vorkommens von DNA-Segmenten, die in der Sonden-Zusammensetzung vorkommen, größer ist als an Loci, wo die Anfärbung am schwächsten ist. Eine gesamte genomische Ausgangs-DNA mit einer schiefen Vertei lung von DNA Segmenten, verglichen mit einer normalen oder natürlicherweise auftretenden Verteilung von DNA-Segmenten in einer gesamten genomischen DNA kann verwendet werden, um Sonden- Zusammensetzungen gemäß der Erfindung herzustellen, die für spezielle diagnostische Zwecke verwendet werden sollen, oder für Test- oder Bewertungszwecke, wenn es gewünscht ist.
Für die Zwecke des Erreichens des Gegenfärbens gemäß dieser Erfindung des humanen Genoms über ein in situ-Hybridisierungsverfahren wird es vorliegend bevorzugt, daß die gesamte genomische Ausgangs-DNA humane Plazenta-DNA umfaßt. Eine solche DNA erzeugt, wenn sie fragmentiert und markiert ist, wie es hier gelehrt wird, um Sonden-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung zu ergeben, und dann unter Hybridisierungsbedingungen verwendet wird, um ein Target genomisch gegenzufärben, gefärbte Targetkörperchen, die im wesentlichen vollständig identifiziert sind mit minimalen Abweichungen bei den Färbungsintensitäten. Die Plazenta-DNA ist erhältlich aus gewerblichen Quellen, wie beispielsweise Sigma Chemical Company (St. Louis, MO).
Ein Beispiel für eine verwendbare gesamte genomische Ausgangs- DNA mit einer ersichtlich schiefen Verteilung des Sequenzvorkommens bzgl. deren Vielfalt von DNA-Segmenten, bezogen auf die normale Sequenzverteilung, die in dem humanen Genom gefunden wird, umfaßt eine DNA-Zusammensetzung, welche für das gesamte humane Genom repräsentativ ist, welche aber in ihrem Gehalt an den gewöhnlicherweise auftretenden sich wiederholenden DNA- Sequenzen, die in dem humanen Genom auftreten, angereichert ist. Eine Produkt-Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung, die eine solche DNA-Segmentmischung enthält und darauf basiert, ist kennzeichnenderweise noch im wesentlichen vollständig hybridisierbar mit dem humanen Genom. Eine solche gesamte genomische Ausgangs-DNA wird durch die Cot-1-DNA exemplifiziert, welche unter der Katalog #52795A von Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, erhältlich ist. Cot-1-DNA wird durch das folgende Verfahren bekanntermaßen hergestellt: Mechanisch gescherte gesamte humane genomische DNA wird zu einer durchschnittlichen Sequenzgröße von weniger als 400 bp fragmentiert. Dieses Material wird denaturiert und dann für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um größere Anteile der sich häufig wiederholenden DNA-Sequenzen davon doppelsträngig zu halten, hybridisiert. Die Mischung der doppel- und einzelsträngigen DNA-Spezies wird dann mit Nuklease S1 behandelt (verdaut), einer Nuklease, die spezifisch einzelsträngige DNA zu Mono- und Oligo-Nukleotiden abbaut. Nicht verdaute doppelsträngige Cot-1- DNA wird aus dieser Mischung zurückgewonnen. Cot-1-DNA liegt bekanntermaßen in der Form von Segmenten mit einer Durchschnittsgröße von etwa 191 bp vor.
Somit wird eine verwendbare gesamte genomische Ausgangs-DNA- Klasse aus einer gesamten genomischen DNA gewonnen, denaturiert, teilweise reannealed oder rehybridisiert und mit Enzymen behandelt, um die Menge an sich nicht wiederholenden Segmenten darin zu verringern, durch im Stand der Technik bekannte Verfahren.
Ein weiteres Beispiel einer geeigneten gesamten genomischen Ausgangs-DNA ist eine klonierte Bibliothek aus gesamter humaner genomischer DNA oder einem Satz von klonierten DNA-Fragmenten, welche zusammengenommen vernünftigerweise das gesamte humane Genom repräsentieren. Bibliotheken des humanen Genoms sind erhältlich von einer Vielzahl von Quellen. Z. B. können solche Bibliotheken von Stratagene, Inc. (La Jolla, CA) entweder in Lambda-DNA oder Cosmidvektoren erhalten werden. Die Quelle der gesamten genomischen DNA kann im Fall von vorgefertigten humanen DNA-Bibliotheken zirkulierende Lymphozyten-, Lungenfibroblasten-, Plazenta-DNA oder ähnliches sein. Vorgefertigte Bibliotheken, die aus Genomen von nicht humanen tierischen Spezies hergestellt sind, sind auch von diesem Unternehmen erhältlich, wie individuelle Herstellungen von gesamten genomischen DNA-Bibliotheken, die aus Geweben und Organismen gewonnen sind. Die Fachleute wissen, daß die gesamte genomische Ausgangs-DNA und die Produkt-Sonden-Zusammensetzung, die damit hergestellt wird, in verschiedenartigen analytischen Verfahren, die einem Hybridisierungsverfahren folgen, einschließlich nachfolgender mikroskopischer Untersuchung, Durchflußzytometrie oder ähnlichem verwendet werden kann.
Sowohl die Cot-1-DNA (und ähnlich hergestellte Materialien) als auch humane Bibliothek-DNA führen typischerweise zu Direkt- Markierungs-Sonden-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung, die, wenn sie mit dem humanen Genom hybridisiert werden (das heißt mit den einzelnen Chromosomen), Hybride erzeugen, die den Eindruck einer im wesentlichen vollständigen Färbung des Targets ergeben, obwohl die hybridisierten Targetkörperchen individuell relativ starke Abweichungen in der Fluoreszenzfarbintensität zeigen körnen.
Die Natur, Struktur und Größe der einzelnen Ausgangs-DNA- Sequenzen, die Anzahl der verschiedenen verwendeten Sequenzen und ähnliche Variablen, die mit einer gesamten genomischen Ausgangs-DNA verbunden sind, können nicht absoluten Begriffen angegeben werden, wegen den im Genom von einem Organismus zum anderen innewohnenden Abweichungen und weil die Zusammensetzung einer Ausgangs-DNA-Sequenz oder Segmentpopulation für ein gegebenes Genom von einer Quelle zur nächsten variieren kann und, sogar von einem Ansatz einer gesamten genomischen DNA, die derselben Quelle entnommen wurde, zum nächsten. Nach der Fragmentierung einer Ausgangs-DNA-Sequenz, die wie nachfolgend beschrieben erhalten wird, sollte die gesamte genomische Ausgangs-DNA jedoch eine Mischung aus DNA-Segmenten ergeben, welche etwa und vernünftigerweise für das gesamte verwendete Genom repräsentativ ist und worin einzelne Semente vorliegen, welche zu segmentierten Bereichen, die vorkommen oder in sämtlichen Bereichen des Genoms allgemein angeordnet sind, komplementär sind.
Die charakteristische Komplexität der gesamten genomischen Ausgangs-DNA aus einem gegebenen Genom wird jedoch vorliegend vom Standpunkt der vorliegenden Erfindung aus als wünschenswert betrachtet, da eine solche Komplexität dazu führt, Direkt-Markie rungs-Sonden-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung zu ermöglichen, die, wie hier gelehrt wird, aus verschiedenen gesamten genomischen DNA-Ansätzen, die aus der gleichen Organismusspezies erhalten werden, hergestellt werden, verhalten sich in einer im wesentlichen identischen Art und Weise hinsichtlich der Gegenfärbungsfähigkeiten. Die große Komplexität einer gesamten genomischen DNA unterscheidet diese z. B. von einer weniger komplexen DNA, wie diese beispielsweise in einer Sonden- Zusammensetzung vorhanden ist, die (wegen ihres DNA-Gehaltes) geeignet ist, nur mit einem Teil eines multichromosomalen Genoms zu hybridisieren, wie beispielsweise einem einzelnen Chromosom (d. h. einer Farbsonde) oder einem einzelnen Bereich eines einzelnen Chromosoms wie beispielsweise dem Zentromerbereich. Kennzeichnenderweise und wie es für eine genomische DNA im allgemeinen zutreffend ist, wird von einer gesamten genomischen Ausgangs-DNA charakteristischerweise angenommen, daß diese etwa 25 Molprozent an Desoxycytidin-Nukleotiden, bezogen auf die gesamte Anzahl an darin vorhandenen Desoxynukleotiden, enthalten.

(2) Die Ausgangs-Verbindungsverbindungen (linking compounds)

Eine Ausgangs-Verbindungsverbindung, die bei der Durchführung dieser Erfindung verwendet wird, ist eine difunktionelle organische Verbindung, d. h., diese enthält zwei ergänzende funktionelle (d. h. reaktive) Substituenten pro Ausgangs- Verbindungsverbindung-Molekül.
Wenigstens einer dieser funktionellen Substituenten pro Verbindendungsverbindung-Molekül ist reaktiv mit Desoxycytidin-Nukleotiden in einem Polynukleotid unter Bisulfit-katalysierten wässrigen Transaminierungsbedingungen (wie sie hier z. B. vorgesehen sind). Beispiele für solche Substituenten umfassen Alkylamino (primär und sekundär) Hydazid, Semicarbazid, Thiosemicarbazid und ähnliches. Aminogruppen werden vorliegen am meisten bevorzugt.
Wenn die Aminogruppe sekundär ist, dann ist der sekundäre substituent bevorzugt eine Niederalkylgruppe, es können aber andere nicht blockierende sekundäre Substituenten verwendet werden, wenn es gewünscht ist.
Die zweite von diesen zwei funktionellen Substituenten pro Verbindungsverbindung-Molekül ist reaktiv mit einem dritten funktionellen Substituenten, der selbst in einer fluoreszierenden Ausgangsverbindung (wie hier beschrieben) enthalten ist. Ein solcher zweiter funktioneller Substituent kann selbst entweder blockiert oder nicht blockiert sein. Wenn der zweite Substituent nicht blockiert ist, dann ist er im allgemeinen nicht reaktiv mit weiteren Stoffen, die in dem Transaminierungsmedium während der Transaminierung vorhanden sind (insbesondere Polynukleotiden). Wenn der zweite Substituent blockiert ist, dann ist er im wesentlichen nicht reaktiv mit den weiteren Stoffen, die in dem Transaminierungsmedium während der Transaminierung vorhanden sind (insbesondere Polynukleotiden).
Beispiele einer geeigneten, nicht blockierten, zweiten funktionellen Substituentengruppe umfassen Amino, Carboxyl, Phosphat, Sulfonat, Hydroxyl, Hydrazid, Semicarbazid, Thiosemicarbazid und ähnliches. Vorliegend umfassen am bevorzugtesten nicht blockierte zweite funktionelle Substituenten Amino- (primär oder sekundär) und Carboxylgruppen.
Die Carboxylgruppe liegt bevorzugt entweder in der Salzform oder in der Säureform vor, kann aber manchmal in der Esterform vorliegen. Wenn sie in der Salzform vorliegt, sind die vorliegend bevorzugten Kationen Alkalimetalle wie Natrium und Kalium.
Beispiele einer geeigneten blockierten zweiten funktionellen Substituentengruppe umfassen blockiertes Sulfonat, blockiertes Phosphat, blockiertes Sulfhydryl und ähnliches.
Beispiele von geigneten blockierenden Substituenten umfassen Niederalkylgruppen wie Methyl, Ethyl, Propyl, etc. Die ersten und die zweiten funktionellen Substituenten sind über eine Verbindungs- (oder verbindende) Einheit miteinander verbunden. Diese Verbindungseinheit kann jede geeignete Struktur aufweisen, wobei diese aber gegenüber anderen Stoffen, die in dem Transaminierungsmedium während der Transaminierung vorhanden sind, nicht reaktiv ist. Vorliegend ist bevorzugt, daß die Verbindungseinheit eine divalente kohlenwasserstoffhaltige Gruppe ist, welche azyklisch oder zyklisch ist und welche wahlweise weitere Atome enthalten kann.
Die zwei funktionellen Substituenten, die in einer solchen difunktionellen Verbindungsverbindung vorhanden sind, können entsprechend Substituenten der Verbindungseinheit sein. Solche Substituenten können an benachbarten Kohlenstoffatomen relativ zueinander angeordnet sein, oder sie können voneinander in einem Verbindungsverbindung-Molekül über eine Vielzahl dazwischenliegender, miteinander verbundener Atome (bevorzugt Kohlenstoffatome) beabstandet sein. Bevorzugt sind diese funktionellen Gruppen in einer alpha-, omega-Beziehung zueinander (d. h. jede ist an einem unterschiedlichen gegenüberliegenden Endbereich angeordnet) in einem gegebenen Verbindungsverbindung-Molekül angeordnet.
Somit sind die zwei funktionellen Gruppen in einer Verbindungsverbindung jeweils an eine organische Verbindungsgruppeneinheit gebunden, welche entweder vollständig kohlenwasserstoffhaltig ist (d. h. diese besteht nur aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen) oder welche besteht aus Kohlenwasserstoff- und Wasserstoffatomen sowie wenigstens einem zusätzlichen Atom oder einer Gruppe, das/die wenigsten ein Atom enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Sauerstoff, Schwefel, Stickstoff, Phosphor oder ähnlichem besteht. Bevorzugt sind solche zusätzlichen Atom(e) so mit der organischen Einheit verbunden, so daß diese im wesentlichen weniger reaktiv sind als jede der oben angegebenen zwei funktionellen Gruppen, die in einer gegebenen Ausgangs-Verbindungsverbindung enthalten sind. Kohlenwasserstoff haltige organische Einheiten, die gesattigte Aliphate sind, werden vorliegend bevorzugt, und noch bevorzugter ist eine solche Einheit eine divalente Alkylengruppe, die zwei bis zwölf Kohlenstoffatome einschließlich enthält. Wenn es erwünscht ist, kann jedoch eine gesättigte aliphatische Gruppe wenigstens eine Ethergruppe (-O-) oder wenigstens eine Thioethergruppe (-S-) enthalten, es wird aber vorwiegend mehr bevorzugt, daß nur eine dieser Ether- oder Thioethergruppen vorhanden ist. Es wird vorliegend bevorzugt, daß eine Verbindungsverbindung eine organische Gruppe umfaßt, die wenigstens zwei und nicht mehr als eine Summe von etwa 20 Kohlenstoffatomen enthält, obwohl mehr Kohlenstoffatome pro Molekül vorhanden sein können, wenn es gewünscht ist.
Vorliegend werden Verbindungsverbindungen bevorzugt, bei denen jede dieser funktionellen Gruppen eine Aminogruppe ist. Sowohl azyklische als auch zyklische Diamino-Verbindungen können verwendet werden.
Beispiele von geeigneten von geeigneten aliphatischen primären Diaminen umfassen primäre Alkylenamine, wobei die Alkylen- Gruppe, Propylen, Butylen, Pentylen, Hexylen, Nonylen und ähnliches ist.
Beispiele für geeignete aliphatische sekundäre Diamine umfassen CH&sub3;NH(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2;, CH&sub3;NH(CH&sub2;)&sub2;NHCH&sub3;, und ähnliches.
Diaminoverbindungen, die hydroxylierte Kohlenwasserstoffe umfassen, können verwendet werden. Beispiele für solche azyklischen Verbindungen umfassen 1,3-Diamino-2-hydroxypropan; 1,4- Diamino-2, 3 dihydroxybutan; 1,5-Diamino-2,3,4-trihydroxypentan; 1,6-Diamino-1,6-didesoxy-D-mannitol (oder D-Glucit oder D- Galactitol), 1,6-Diamino-2,3,4,5-tetrahydroxyhexan und ähnliches.
Beispiele von geeigneten polyhydroxylierten zyklischen Abmessungen umfassen zyklische cis oder trans Diaminoverbindungen, wobei die Diamine in einem Ring eingefaßt sind, wie beispielsweise 1,4-Diamino-2,3,5,6-tetrahydroxycyclohexan, cis und trans 1,2-Diaminocyclohexan, cis und trans 1,2-Diaminocyclopentan, und hydroxylierte Derivate davon, wie 1,2-Diamino-3,4,5,6- tetrahydroxycyclohexan, 1,2-Diamino-3,4,5- trihoydroxycyclopentan, 3,6-Diamino-3,6-didesoxy-Derivate von myo-Inositol, wie beispielseweise
und ähnliches.
Beispiele von geeigneten heterozyklischen Diaminen umfassen Piperazin, N,N'bis(3-Aminopropyl)piperazin, Derivate davon und ähnliches.
Beispiele von geeigneten Ethergruppe-haltigen Diaminen umfassen 3-Oxo-1,5-Pentandiamin, 3,6-Dioxo-1,8-Diaminooktan und ähnliches.
Beispiele von geeigneten Verbindungsverbindungen, die sowohl eine Aminogruppe als auch eine Carboxylgruppe enthalten, umfassen Aminosäuren wie Sarcosin (N-Methylglycin), und alpha- Aminosäuren wie Glycin, Alanin, Glutarsäure, Asparaginsäure, Prolin, Pipecolinsäure (Piperidin-2-carbonsäure), Isopipecolinsäure (Piperidin-4-carbonsäure), Glucosaminsäure, und Derivate davon und ähnliches.
Beispiele von alpha-, omega-Aminocarbonsäuren (zusätzlich zu den oben angegebenen Aminosäuren) umfassen 4-Aminobuttersäure, 6-Aminohexansäure, 8-Aminooktansäure und ähnliches. Beispiele von Phosphor-haltigen difunktionellen Verbindungsverbindungen umfassen alpha-, omega-Aminoalkylphosphorsäure, Monoester, wie O-(2-Aminoethyl)phosphat-Dinatriumsalz und ähnliches.
Beispiele von geeigneten schwefelhaltigen difunktionellen Verbindungsverbindungen umfassen alpha-, omega- Aminoalkylsulfonsäuren, wie Taurin (2-Aminoethylsulfonsäure) und ähnliches.
Eine vorliegend sehr bevorzugte Klasse von difunktionellen Verbindungsverbindungen wird durch die folgende allgemeine Formel wiedergegeben:
worin:
X eine divalente Gruppe ist, die aus der Klasse ausgewählt wird, die besteht aus:
worin:
R eine Alkylengruppe ist, die 2 bis 12 Kohlenstoffatome einschließlich oder pro hydroxylierten carbozyklischen Ring enthält, und
R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Klasse, welche aus Wasserstoff und Niederalkyl besteht.
Bevorzugt enthält in Formel (1) R nicht mehr als 7 Kohlenstoffatome, ist
und R&sub1; und R&sub2; sind jeweils Wasserstoff, und R enthält weniger als 7 Kohlenstoffatome.
Mischungen von verschiedenen Verbindungsverbindungen (linking compounds) können verwendet werden wie Verbindungsverbindungen, die eine Mischung aus Mono- und/oder Diaminen enthalten, aber solche Mischungen sind nicht bevorzugt, wegen der damit verbundenen Probleme bei der Steuerung der Transaminierung und der Verwendung.
Diamine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie einen großen Anteil davon aufweisen, die als freie unprotonierte Spezies bei pH-Werten von etwa 7 vorliegen, scheinen die vorliegende Transaminierungsreaktion zu beschleunigen. Ethylendiamin (pK von etwa 7,6) wird vorliegend für die Verwendung als das reaktive difunktionelle Amin aufgrund dieser Eigenschaft am meisten bevorzugt.
Wenn z. B. eine solche Verbindungsverbindung an eine DNA-Sequenz unter Verwendung einer Transaminierungsreaktion, wie nachfolgend hier beschrieben, gebunden wird, wird die Transaminierungsreaktion so durchgeführt, daß eine Aminogruppe in der Verbindungsverbindung an die Sequenz oder das Segment bindet.
Dann bleibt in der resultierenden Verbindungsgruppe eine funktionelle Gruppe frei erhalten, um eine weitere Reaktion einzugehen. Somit verbleibt, wenn die zweite funktionelle Gruppe eine Aminogruppe ist, diese Gruppe danach frei, um eine weitere Reaktion mit der fluoreszierenden Verbindung, wie nachfolgend beschrieben, einzugehen. Wenn die zweite funktionelle Gruppe eine Carboxylgruppe ist, bleibt eine solche Gruppe danach frei, um eine weitere Reaktion mit der fluoreszierenden Verbindung, wie nachfolgend beschrieben, einzugehen.

(3) Die fluoreszierende Ausgangsverbindung

Die fluoreszierenden Ausgangsverbindungen, die bei der Durchführung dieser Erfindung verwendet werden, umfassen jeweils wenigstens einen Fluorophor-Substituenten (oder eine Gruppe) pro Molekül und auch einen funktionellen (d. h. reaktiven) Substituenten (oder Gruppe) pro Molekül.
Der funktionelle Substituent wird so ausgewählt, daß er mit dem zweiten funktionellen Substituenten, der in einer Verbindungsgruppe in einem transaminierten Polynukleotid (das so hergestellt wird, wie es hier beschrieben ist) enthalten bleibt, reaktiv ist. Die Verbindungsgruppe wird aus einer Verbindungsverbindung (wie oben beschrieben) erhalten.
Zum Beispiel kann in einer fluoreszierenden Ausgangsverbindung der reaktive Substituent ausgewählt werden, mit einem Aminosubstituenten (wie oben definiert) oder mit einem Carboxylsubstituenten, der in der Säure- oder Salzform vorliegt (wie oben definiert) reaktiv zu sein.
Für die Zwecke der Reaktivität mit einem solchen Aminosubstituenten in einer Verbindungsgruppe (unter Verwendung einer Reaktion wie sie nachfolgend hier beschrieben wird) kann der reaktive Substituent der fluoreszierenden Verbindung eine geeignete aminoreaktive Funktionalität, wie beispielsweise einen Carboxylsubstituenten, der in der Säure- oder Salzform vorliegt (wie oben definiert), eine Aldehydgruppe oder ähnliches, aufweisen. Ein vorliegend bevorzugter reaktiver Substituent wird ausgewählt aus und exemplifiziert durch die Gruppe, die aus Isothiocyanaten, N-Hydroxysuccinimidestern, Sulfonylchloriden, Carbonsäureaziden und ähnlichem besteht.
Für die Zwecke der Reaktivität mit einem solchen Carboxylsubstituenten in einer Verbindungsgruppe kann der reaktive Substituent der fluroeszierenden Verbindung eine geeignete carboxylreaktive Funktionalität aufweisen, wie beispielsweise einen Aminosubstituenten, der in einer primären oder sekundären Form (wie oben definiert) vorliegt, oder ähnliches. Ein vorliegend bevorzugter reaktiver Substituent ist ein primärer Aminosubstituent.
Der reaktive Substituent kann z. B. auch manchmal ein Thiol, ein Phosphatester oder ähnliches sein, wobei die Wahl von der Art des Reaktionssubstituenten, der in der Verbindungsgruppe vorliegt, abhängt.
Im allgemeinen kann jeder fluoreszierende Substituent oder jede Gruppe in einer fluoreszierenden Ausgangsverbindung verwendet werden. Wenn mehr als ein fluoreszierender Substituent pro fluoreszierender Verbindung verwendet wird, dann wird es vorliegend bevorzugt, daß jeder fluoreszierender Substituent ähnlich oder identisch in der Struktur verglichen mit den anderen davon in einer einzelnen fluoreszierenden Verbindung ist. Vorliegend wird es bevorzugt, fluoreszierende Verbindungen zu verwenden, die etwa 1 bis etwa 3 fluoreszierende Substituenten pro fluoreszierendem Verbindungsmolekül enthalten, und am meisten bevorzugt enthält eine fluoreszierende Verbindung nur einen fluoreszierenden Substituenten pro fluoreszierendem Verbindungsmolekül.
Bevorzugt hat eine fluoreszierende Ausgangsverbindung ein Molekulargewicht, das nicht mehr als etwa 5000 und bevorzugter nicht mehr als 1000 beträgt, da größere Moekulargewichte möglicherweise eine nachteilige Wirkung auf die Hybridisierungsfähigkeit einer Produkt-Sonde mit einer komplementären Targetsequenz hat.
Aus Gründen der Nachweisbarkeit wird es vorliegend bevorzugt, daß eine fluoreszierende Ausgangsverbindung und die fluoreszierenden Gruppen darin einen Extinktionskoeffizienten von wenigstens etwa 6000 M-¹ cm-¹ (und bevorzugt von wenigstens etwa 10000 M-¹ cm-¹) in dem Wellenlängenbereich des auf eine gegebene Probe einfallenden Anregungslichtes aufweisen und auch eine Quantenausbeute von wenigstens etwa 0.02 aufweisen. Der Begriff "Extinktionskoeffizient" wird hier in seinem herkömmlichen Sinne verwendet, um die Absorption einer 1 molaren (M) Lösung der fluoreszierenden Verbindung, die in einer Cuvette mit einer Weglänge von 1 Zentimeter (cm) enthalten ist, zu bedeuten.
Ebenso wird der Begriff "Quantenausbeute" hier in seinem herkömmlichen Sinne verwendet, um die Anzahl von Photonen, die von einem Fluorophor emittiert werden, bezogen auf die Anzahl von Photonen, die von dem Fluorophor absorbiert werden, zu bedeuten. Beispielhaft und vorliegend bevorzugt werden die fluoreszierenden Ausgangsverbindungen, die in der Tabelle I unten gezeigt sind.

TABELLE I

Beispielhafte fluoreszierende Ausgangsverbindungen

1. 7-Amino-4-methylcumann-3-essigsäure-succinimidylester (AMCA).
2. Schwefelhodamin-101-sulfonylchlorid; auch bekannt unter dem Namen Texas RedTM oder Texas RedTM-sulfonylchlorid (Tx Rd)
3. 5-(und-6)-Carboxyrhodamin-101-succinimidylester; auch bekannt unter dem Namen 5-(und-6)-Carboxy-X-rhodamin- succinimidylester (CXR)².
4. Lissaminrhodamin-B-sulfonylchlorid (LisR).
5. 5-(und-6)-Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFI)²
6. Fluorescein-6-isothiocyanat (FITC)²
7. 7-Diethylaminocumarin-3-carbonsäure-succinimidylester (DECCA).
8. Tetramethylrhodamin-5-(und-6)-isothiocyanat (TRITC)²
9. 5-(und-6)-Carboxytetramethylrhodamin-succinimidylester (CMR)²
10. 7-Hydroxycumann-3-carbonsäure-succinimidylester (HCCA)
11. 6-[Fluorescein-5-(und-6)-carboxamido]-hexansäure (FCHA)²
12. N-(4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-3- indacenpropionsäure-succinimidylester; auch bekannt unter dem Namen 5,7-DimethylBODIPYTM -propionsäure- succinimidylester (DMBP).
13. "Aktiviertes Fluoresceinderivat" (FAP); diese Verbindung besteht aus einem Fluorescein-Kern, der über eine Abstandsgruppe an eine reaktive Gruppe eines N- Hydroxysuccinimidesters gebunden ist und von dem Hersteller, Molecular Probes, Inc., als "FAP" bezeichnet wird.
14. Eosin-5-isothiocyanat (EITC)²
15. Erythrosin-5-isothiocyanat (ErITC)²
16. CascadeTM Blue-acetylazid (CBAA); welches das O- Acetylazidderivat von 1-Hydroxy-3,6,8-pyrentrisulfonsäure ist.
1. Die Abkürzungen, die verwendet werden, um diese Verbindungen zu bezeichnen, sind in Klammern angegeben. Für dieselben Verbindungen werden alternative Namen, einschließlich Handelsmarkennamen angegeben. TM bezieht sich auf Handelsmarken von Molecular Probes, Inc. Der Begriff "Succinimidyl-ester" bezieht sich auf den Ester, der zwischen einem Carbonsäuresubstituenten des Fluorophors und N-Hydroxysuccinimid gebildet wird, und dieser wird auch als ein "N- Hydroxysuccinimidester" oder als ein "N- Hydroxysuccinimidylester" oder als ein "NHS-Ester" bezeichnet.
2. Bestimmte Fluorescein- und Rhodaminderivate enthalten reaktive Substituenten (Carboxy oder Isothiocyanat), die entweder in den 5- oder 6-Positionen angebracht sind. Diese Verbindungen können als Mischungen von diesen zwei Isomeren, die als "5-(und 6)-" bezeichnet werden, oder in einigen Fällen als die gereinigten Isomere erhalten werden. Von den Markierungs- und Fluoreszenz-Eigenschaften wird nicht erwartet, daß diese zwischen den Isomeren oder zwischen einem spezifischen Isomer und der Mischung stark variieren. Die oben bezeichneten Isomeren oder Mischungen waren diese, die in den Markierungsexperimenten (siehe Beispiele) verwendet wurden.
Sämtliche fluoreszierenden Verbindungen in Tabelle 1 wurden von Moleculare Probes, Inc. Eugene, OR, bezogen.
Die Fachleute wissen ohne weiteres, daß eine fluoreszierende Ausgangsverbindung bevorzugt ausgewählt wird für die Verwendung beim Herstellen einer gegebenen Produkt-Sonden-Zusammensetzung, die unter den Bedingungen einer Fluorophoranregung in einer einzelnen Probe emittiertes Licht mit einer Farbe erzeugen wird, das mit der Farbe des Lichtes in Kontrast steht, das von dem Fluoreszenzgruppen-haltigen Markierungsbereich einer gleichzeitig oder nacheinander verwendeten weiteren Sonde oder Sonden-Zusammensetzung, die gegen den gleichen oder verwandten Karyotyp, wie beispielsweise ein Genom, ein spezifisches Chromosom oder ein spezifischer Bereich eines Chromosoms oder ähnliches, was von dem verwendeten Genom umfaßt ist, gerichtet ist, emittiert wird.

(C) Sondenherstellung

(1) Allgemeines

Primär neigen anscheinend, aufgrund ihrer charakteristischen, relativ großen typischen Größe, wie sie oben hier angegeben wurde, die gesamten genomischen Ausgangs-DNA-Sequenzen dazu, eine relativ geringe Hybridbildungsfähigkeit (nachdem sie markiert sind) zu zeigen.
Auch neigen bislang im Stand der Technik bekannte chemische Syntheseverfahren zum Binden von Markierungseinheiten an eine Nukleotidsequenz, insbesondere einer Fluorophor-haltigen Markierungseinheit, dazu, zu Problemen bei der Steuerung der Anordnung und der Anzahl von Markierungseinheiten pro Sequenz zu führen und auch zu Problemen hinsichtlich einer Sequenzveränderung. Diese Probleme können die Hybridisierungsfähigkeit der erhaltenen Sonde mit den gewünschten genomischen Targetmaterialien und schließlich auch den Nachweis durch Gegenfärben der gesamten genomischen DNA, die in einer Probe vorhanden ist, nachteilig beeinflussen.
Es wurde nun entdeckt, daß diese Probleme gelöst werden können und daß eine Direkt-Markierungs-Sonden-Zusammensetzung mit hervorragender Hybrid-bildender Fähigkeit und Sonden- Leistungseigenschaften für die Zwecke einer genomischen Gegenfärbung bei einer in situ-Hybridisierung vorliegt, wenn eine Sonden-Zusammensetzung eine Mischung von genomisch gewonnenen DNA-Segmenten, wie sie hier beschrieben sind, umfaßt, wobei die Segmente an die fluoreszierenden Gruppen über Verbindungsgruppen chemisch gebunden sind.
Verschiedenartige Verfahren können verwendet werden, um eine solche Sonden-Zusammensetzung herzustellen. Ein vorliegend bevorzugtes und beispielhaftes Herstellungsverfahren wird nun beschrieben, wobei die folgenden Verfahrensstufen durchgeführt werden:
a) Fragmentieren (d. h. Zerreißen) von DNA-Sequenzen, die eine gesamte genomische DNA umfassen, in DNA-Fragmente (oder Segmente);
b) Transaminieren von Desoxycytidin-Nukleotiden, die in den Sequenzen vorliegen (und folglicherweise auch in den erhaltenen Segmenten), mit einer Verbindungsverbindung (wie oben beschrieben; und
c) kovalentes Binden restlicher Gruppen von den so erzeugten transaminierten Verbindungsgruppen an eine fluoreszierende Verbindung (wie oben beschrieben).
Während Schritt b), oder Schritt b) und c), dem Schritt a) vorausgehen können, wird es bei dem Schritt a) vorliegend bevorzugt, daß dieser dem Schritt b) vorausgeht. In der nachfolgenden Beschreibung wird die vorstehende Abfolge der Schritt a), b), c) für die vorliegenden Zwecke des Aufbaus verwendet.
Andere Kombinationen und Variationen dieser Schrittabfolgen sind auch bei der Verwendung zur Herstellung einer Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung möglich. Zum Beispiel kann man die fluoreszierende Verbindung an die Verbindungsverbindung kovalent binden, dann transaminieren und schließlich die DNA-Sequenzen fragmentieren (unter Verwendung von Bedingungen bei den Stufen, die denen ähnlich sind, die hier angegeben sind); jedoch neigt dieses Verfahren dazu, geringere Ausbeuten aufgrund der geringeren Löslichkeit der Fluorophorgruppe bei der Transaminierungsreaktion zu ergeben.

(2) Fragmentieren

Die DNA-Segmente werden aus einer gesamten genomischen Ausgangs-DNA (wie oben angegeben) gewonnen. Vor dem Fragmentieren hat die Ausgangs-DNA bevorzugt Durchschnittsgrößen von wenigstens etwa 150 bp. Nach dem Fragmentieren weisen die DNA- Segmente bevorzugt eine Durchschnittsgröße auf, die innerhalb eines Bereiches von etwa 150 bis etwa 600 bp liegt, wobei eine vorliegend bevorzugtere Durchschnittsgröße bei etwa 180 bis etwa 400 bp liegt, und vorliegend die am meisten bevorzugte durchschnittliche Segmentgröße etwa 300 bp beträgt. Von jedem dieser Segmentfragmente wird angenommen, daß diese zu einem Segmentbereich, der in einer oder mehreren DNA-Sequenzen vorhanden ist, welche in einem oder mehreren Chromosomen des Genoms, aus dem diese Segmentfragmente gewonnen wurden, vorkommen, komplementär sind.
Die Anzahl von Fragmenten, die aus genomischen Ausgangs-DNA- Sequenzen in einem gegebenen Fall gewonnen werden, ist unbekannt, wahrscheinlich von einem Ansatz zum nächsten variabel und groß. Auch ist die Struktur der Nukleotidsequenzen der einzenen Fragmente unbekannt und wahrscheinlich von einem Ansatz zum nächsten variabel. Es wird vorliegend geschätzt, daß die Anzahl von Ausgangsfragmenten, die aus gegebenen gesamten genomischen Ausgangs-DNA-Sequenzen in einem gegebenen Fall gebildet werden, minimal in den Tausenden liegt. Aus Gründen, die mit der Fähigkeit einer Produkt-Sonden-Zusammensetzung, genomische DNA gegenzufärben, und der Leuchtstärke der Fluoreszenz in den damit gebildeten Hybriden verbunden sind, wird vorliegend angenommen, daß es wünschenswert ist, DNA-Fragmente mit einer relativ gleichmäßigen Durchschnittsgröße in den oben angegebenen Bereichen zu verwenden.
Wie den Fachleuten selbstverständlich bekannt ist, können diese DNA-Fragmente aus genomischen Ausgangssequenzen über verschiedenartige bekannte Techniken hergestellt werden, einschließlich z. B. Enzymbehandlung, wie mit Restriktionsenzymen oder Polymerasen, oder ähnlichem; begrenzter DNase I-Verdau; begrenzter Mung-Bohnen Nuklease Verdau; Beschallung; DNA-Scherung in einer French press; Scheren der DNA durch eine enge Gauge-Nadel; und ähnliches.
Es wird jedoch vorliegend stark bevorzugt, solche DNA-Fragmente durch Beschallung einer gesamten genomischen Ausgangs-DNA herzustellen. Die Beschallung kann mit jedem geeigneten Verfahren durchgeführt werden. Die vorliegend bevorzugten Beschallungsbedingungen verwenden eine wässrige Dispersion aus einer gesamten genomischen Ausgangs-DNA, die bevorzugt in einen Bereich von etwa 0,05 bis etwa 4 mg pro ml liegt, obwohl kleinere und größere Konzentrationen verwendet werden können. Die angelegte Ultraschallfrequenz liegt bevorzugt im Bereich von etwa 20000 Zyklen pro Sekunde und wird für eine Gesamtzeit im Bereich von etwa einer bis etwa zehn Minuten an das Röhrchen, das die Probe enthält, das bevorzugt in einem Kühlbad eingetaucht ist, um das Aufheizen der Probe zu verringern, angelegt. Geeignete Kühlbäder umfassen Eisbäder und Bäder, die Trockeneis und Ethanol enthalten. Die Energiedichte, die an das DNA-Sequenzmaterial angelegt wird, das einem Ultraschallverfahren unterworfen wird, ist variabel. Zum Beispiel liegt im Fall eines Branson Sonifier Model 450 (Danbury, Connecticut), wobei die Mikrospitze etwa 2 bis etwa 5 mm von dem Boden des Röhrchens in einer wässrigen Lösung angeordnet ist, eine geeignete Ausgangsleistung im Bereich von etwa 25 bis etwa 30 Watt. Bevorzugt wird die Ultraschallenergie unter Verwendung von ca. 80% On-Zeit und entsprechend etwa 20% Off-Zeit für eine Gesamtzeit von etwa 5 Minuten, wie dies unten beispielhaft hier dargelegt wird, angelegt.
Bevorzugt wird die genomische Ausgangs-DNA fragmentiert, bevor die Sequenzen einer Transaminierung unterworfen werden.
Ungeachtet des Verfahrens der Fragmentierung soll das Ergebnis der Fragmentierung der Vielzahl von Sequenzen, die eine gesamte genomische Ausgangs-DNA umfassen, sein, eine große Anzahl von Fragmenten aus den Ausgangs-DNA-Sequenzen herzustellen. Diese große Anzahl umfaßt DNA-Segmente, die jeweils in einer Vielzahl an verschiedenen Loci oder Bereichen in jedem der einzelnen Chromosomen, die von dem verwendeten Genom umfaßt werden, einzeln auftreten.
Von den Ausgangs-DNA-Sequenzen (und demzufolge auch von den fragmentierten Segmenten, die daraus gewonnen werden) wird nun charakteristischerweise angenommen, daß sie durchschnittlich wenigstens etwa 25 Mol-Prozent Desoxcytidin-Nukleotide, bezogen auf 100 Mol-Prozent Gesamtnukleotidbasis, enthalten.
Offensichtlich ist, wenn die gesamte genomische Ausgangs-DNA in einem bereits fragmentierten Zustand käuflich erworben wird, wie dies z. B. bei Cot-1-DNA der Fall ist, dann ein separater Fragmentierungsschritt nicht notwendig, bevor ein nachfolgender Schritt, wie beispielsweise eine Transaminierung, durchgeführt wird.
Die fragmentierten DNA-Segmente sind somit Mischungen, die aus der gesamten genomischen DNA eines gegebenen Genoms gewonnen werden und annähernd repräsentativ für die Segmente sind, die in dieser gesamten genomischen DNA vorhanden sind. Die Segmentgrößen liegen in den oben angegebenen Bereichen. Eine solche DNA-Segmentmischung kann durch ein geeignetes Verfahren aus DNA-Sequenzen, die die gesamte genomische DNA umfassen, hergestellt werden. Das humane Genom wird vorliegend bevorzugt.
Vorliegend umfassen bevorzugte einzelne Ausgangsmischungen zur Herstellung einer Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung, welche als eine direkt nachweisbare genomische DNA-Gegenfärbung zum Chromosomennachweis verwendbar ist:
(a) humane Plazenta-DNA, welche beschallt wurde und dadurch in durchschnittliche DNA-Segmentgrößen von etwa 150 bis etwa 600 bp (bevorzugt etwa 200 bis etwa 400 bp) fragmentiert wurde.
(b) Gesamte humane genomische DNA, welche beschallt wurde und/oder verdaut wurde in Segmentgrößen von etwa 150 bis etwa 600 bp (bevorzugt sind etwa 200 bis etwa 400 bp) und deren DNA-Segmente beispielsweise weiter unterworfen wurden einer Denaturierung, selektiven Rehybridisierung und enzymatischem Verdau unter Verwendung von beispielsweise einer Technik wie sie hier oder im Stand der Technik gelehrt wird, wodurch man eine DNA-Segmentmischung erzeugt, welche angereichert ist an repititiven (d. h. sich wiederholenden) DNA-Segmenten, verglichen mit dem Level dieser sich wiederholender DNA-Segmente, welche natürlicherweise im Genom auftreten, welche aber wohlgleich in einem geringeren als natürlicherweise auftretenden Umfang DNA-Segmente enthalten, die spezifisch für repräsentative Bereiche von DNA- Segmentbereichen, die über das gesamte Genom verteilt auftreten, sind; und
(c) gesamte humane genomische DNA, welche durch Beschallung fragmentiert wurde in Segmentgrößen von etwa 150 bis 600 bp (bevorzugt sind 200 bis etwa 400 bp) und deren DNA als klonierte Genombibliothek aus Bakterien oder ähnlichem hergestellt wurde.

(3) Transaminierung

Bei der Transaminierung wird ein Anteil der gesamten Desoxycytidinbasen, die in den genomischen Ausgangs-DNA-Sequenzen und Segmenten davon enthalten sind, transaminiert mit einer Aminogruppe einer difunktionellen Verbindungsverbindung (wie oben beschrieben) in der Kohlenstoffatom-Position 4 (C-4) der Aminogruppe der Desoxycytidin-Nukleotide. Der Umfang einer solchen Transaminierung ist so, daß etwa 1 bis etwa 70% sämtlicher Desoxycytidin-Nukleotide, die in einer Ausgangsmischung von DNA- Segmenten vorhanden sind, die repräsentativ für die gesamte genomische DNA eines gegebenen Genoms ist, somit durch eine Verbindungsgruppe substituiert werden. Bevorzugt etwa 2 bis etwa 24 Mol-Prozent sämtlicher Desoxycytidin-Nukleotide, die in einer solchen Mischung von Ausgangs-DNA-Sequenzen oder DNA- Fragmenten enthalten sind, werden somit transaminiert. Alternativ ausgedrückt, werden etwa 0,2 bis etwa 18 Mol-Prozent und bevorzugt etwa 0,5 bis etwa 6 Mol-Prozent der gesamten Nukleotide, die in den DNA-Fragmenten oder Sequenzen vorhanden sind, transaminiert. Sämtliche dieser Transaminierungen betreffen im wesentlichen nur Desoxycytidin-Nukleotide. Am meisten bevorzugt werden somit nur etwa 1 bis etwa 5 Mol-Prozent der gesamten vorhandenen Nukleotide transaminiert.
Der effektivste Prozentsatz der Transaminierung in einem gegebenen Fall wird durch die verwendete besondere Fluoreszenzmarkierungseinheit typischerweise beeinflußt. Da die Durchschnittsanzahl an Basenpaaren, die in einer Sequenz vorhanden sind, bevorzugt wenigstens etwa 150 beträgt, wie oben angegeben, wird somit jede Sequenz durch wenigstens etwa eine dieser Verbindungsgruppen während des Transaminierungsverfahrens bevorzugt substituiert, wie es gewünscht ist. Eine Transaminierung in einem größeren Umfang scheint die Möglichkeit, die Spezifität der Produkt-Sonden, die beispielsweise (nachträglich) mit einigen Fluorophoren, wie beispielsweise mit FITC und TXRd, markiert wurden, nachteilig zu beeinflussen, zu vergrößern. Ein hoher Aminierungslevel beeinflußt die Spezifität von CTMR- und DECCA-markierten Sonden beispielsweise nicht so stark. Eine Transaminierung in einem geringeren Umfang scheint die Leuchtstärke des Fluoreszenzlichtes, das beim Nachweisen des Produkthybrides erzeugt wird, nachteilig zu beeinflussen.
Die Transaminierung wird geeigneterweise unter Bedingungen einer wässrigen Flüssigkeitsphase in der Gegenwart eines Bisultfitkatalysators durchgeführt. Die Konzentration der DNA- Sequenzen (oder Segmentfragmente) liegt geeigneterweise in dem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1 mg pro ml, die Konzentration der Bisulfitanionen liegt geeigneterweise in dem Bereich von etwa 0,5 bis etwa 1,4 Mol pro 1 (wobei "1" Liter bedeutet), die Konzentration der Verbindungsverbindung liegt geeigneterweise in dem Bereich von etwa 1 bis etwa 5 Mol pro 1, der pH liegt geeigneterweise in dem Bereich von etwa 4,5 bis etwa 8,0, die Temperatur liegt geeigneterweise in dem Bereich von etwa 20 bis etw 45ºC, und die Kontaktzeit liegt typischerweise und bei spielhaft in dem Bereich von etwa 3 bis etwa 72 Stunden (was von dem gewünschten Aminierungslevel abhängt).
Bei dem vorliegenden Transaminierungsverfahren wird das Bisulfit geeigneterweise in der Form eines Alkalimetallsalzes eingebracht, wobei Natrium und Kalium bevorzugte Alkalimetalle sind.
Zum Zeitpunkt der Transaminierung wird die Verbindungsverbindung in dem wässrigen Transaminierungsmedium aufgelöst.
Während der Transaminierung werden die DNA-Sequenzen oder Segmente bevorzugt denaturiert, z. B. durch Ausführen der Transaminierung in Gegenwart eines Chaotrops oder durch vorheriges Kochen der DNA-Sequenzen oder -Segmente in Wasser, wie z. B. für eine Zeit von etwa 1 bis etwa 10 Minuten, gefolgt durch Abkühlen auf eine Temperatur von etwa unter 4ºC (vorliegend bevorzugt), oder durch eine Kombination von beiden Verfahren.
Die Technik und die Vorteile des Verwendens eines Chaotrops bei der Transaminierung werden von Bittner et al. in der anhängigen US-Patentanmeldung, Aktenzeichen Nr. 07/762,912, eingereicht an dem gleichen Tag hiermit, veröffentlicht als US-A-5 506 350 bzw. WO-A-93/06246 gelehrt.
Die Komplexität der DNA-Fragmentmischung wird veranschaulicht und exemplifiziert durch den Umfang der erreichten Transaminierung nach dem Denaturieren der DNA-Fragmente durch Kochen. Da die Transaminierung nur mit einer nennenswerten Geschwindigkeit an einzelsträngiger DNA erfolgt und da die Rückbildungsgeschwindigkeit im Verhältnis zu der Komplexität der DNA abfällt, hat man gefunden, daß die gesamte genomische DNA in einem größeren Umfang, als es für etwas einfachere DNA-Mischungen relativ betrachtet kennzeichnend ist, transaminiert wird, wie beispielsweise eine DNA-Mischung, welche aminiert wird, um eine Farbsonde unter den gleichen Bedingungen, wie diese in der oben angegebenen, gleichzeitig eingereichten anhängigen Bittner et al.-Anmeldung gelehrt wird, herzustellen. In der Tat wird bei der vorliegenden Transaminierung die Verwendung von milden Transaminierungsbedingungen bevorzugt, um eine Überaminierung über den oben angegebenen Bereich hinaus zu vermeiden. Eine nachteilige Wirkung der Überaminierung ist es, den komplementären Charakter der transaminierten Sequenzen und Segmente und die resultierende Fähigkeit derselben, mit der gewünschten komplementären Target-DNA zu hybridisieren, zu verringern.
Während der Transaminierung mit dem Bisulfitkatalysator können die Reaktionsvariablen, wie oben angegeben, innerhalb der angegebenen Bereiche variiert werden, um einen gewünschten Grad der Transaminierung mit einem gegebenen Verbindungsverbindung- Reaktanten zu erreichen.
Die vorliegende Transaminierungsreaktion wird durchgeführt oder weitergeführt, bis ein gewünschter Umfang an Transaminierung der Ausgangs-DNA-Sequenz oder Segmentmischung erhalten wird. Im allgemeinen wird der maximale Umfang der Transaminierung durch den Level der Transaminierung bestimmt, der verursacht oder beginnt zu verursachen entweder eine nachteilige Wirkung auf den komplementären Charakter der verwendeten Nukleotidsequenzen oder Segmente oder einen Anstieg in dem Ausmaß einer unspezifischen Assoziation der nachfolgend markierten Sonde mit der Target-DNA oder weiteren Bestandteilen einer Target-DNA, wie diese in einer Probe, einem Objektträgerpräparat oder ähnlichem während einer in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung vorliegen. Sogar bei den relativ niedrigen Leveln der Transaminierung, die bei der Durchführung dieser Erfindung verwendet werden, sind offensichtlich typischerweise und bevorzugt in einem transaminierten Produkt nur ein geringer Mol-Prozentsatz von vollständig nichtmarkierten DNA-Sequenzen vorhanden. Der minimale Level an Transaminierung, der in einem gegebenen Fall erreicht wird, wird durch das Ziel bestimmt, eine gleichmäßige Färbung von möglichst sämtlichen Chromosomen des Genoms, sollten solche in einer gegebenen Probe vorhanden sein, zu erreichen. Jedoch liefern auch niedrigere Aminierungslevel diese Gleichförmigkeit.
Ein weiterer Faktor, der niedrige Transaminierungslevel begünstigt, ist, daß es bei der Durchführung oft wünschenswert ist, den Targetbereich der gesamten genomischen DNA, der in einer gegebenen Probe oder einem Testmaterial vorhanden ist, nur relativ leicht gegenzufärben, um so nicht ein bereichsmäßiges oder spezifisches Anfärben, das beispielweise durch weitere Sonden-Zusammensetzungen, die in Verbindung mit einer gegenfärbenden Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung verwendet werden, erzielt wird, zu verdecken.
Die Intensität der genomischen Gegenfärbung, die in einer Probe mit einer gegenfärbenden Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung erreichbar ist, kann ohne weiteres reguliert oder verringert werden, wenn es gewünscht ist, um so eine gewünschte Farbintensität einer Hintergrundgegenfärbung in einer gegebenen Probe oder ähnlichem zu erreichen. Eine solche Verringerung kann durch verschiedenartige Techniken erreicht werden, wie beispielsweise durch Verringern des Umfangs der Transaminierung von Verbindungsgruppen, wobei man schließlich die Menge der markierten genomischen DNA-Segmente, die in einer gegenfärbenden Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung vorhanden sind, verdünnt, indem man eine transaminierte Mischung mit einer Ausgangs-DNA-Segmentmischung oder ähnlichem verdünnt. Die Fluoreszenzintensität einer markierten Sonden-Zusammensetzung kann verringert werden durch die Zugabe von nichtmarkierter gesamter genomischer Ausgangs-DNA dazu vor dem Zeitpunkt, zu dem das Binden der Fluoreszenzverbindung durchgeführt wird (wie nachfolgend beschrieben).
Der minimale Transaminierungslevel, der in einem gegebenen Fall durchgeführt wird, wird geeigneterweise durch den Wunsch bestimmt, wenigstens einen vorherbestimmten Mol-Prozentsatz der gesamten Desoxycytidin-Nukleotide, die in der Ausgangs-DNA, wie beispielsweise einer fragmentierten DNA-Segmentmischung, vorhanden sind, zu transaminieren.
Eine Mischung, die aus einem Transaminierungsverfahren resultiert, das sich in Übereinstimmung mit der Lehre der vorliegenden Erfindung befindet, kann herkömmlicherweise weiter bearbeitet werden. Vorliegend ist es bevorzugt, eine solche Produktmischung gegen einen verdünnten wässrigen Puffer, wie beispielsweise Natriumborat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS), oder etwas ähnliches bei einem pH von etwa 8 unter Verwendung einer herkömmlichen Dialysemembran und Umgebungstemperatur zu dialysieren.
Die resultierende Mischung transaminierter Nukleotidsequenzen oder Segmente wird dann aus der so dialysierten Mischung geeigneterweise präzipitiert, und die Sequenz wird dann aus dem Überstand durch Filtration, Zentrifugation oder ähnliches abgetrennt.

(4) Binden der fluoreszierenden Verbindung

Ein resultierendes transaminiertes und Amin-substituiertes Nukleotidderivat steht dann zur Verfügung für das kovalente Binden an eine reaktive Fluorophorsubstituent-haltige fluoreszierende Verbindung, wie oben beschrieben, wobei diese Verbindung mit einem terminalen, funktionellen Substituenten umgesetzt wird, der mit dem Rest der Verbindungsverbindung (d. h. mit der Verbindungsgruppe) verbunden ist, welche nun in eine Desoxycytidineinheit transaminiert wurde, wie oben beschrieben. Die Anzahl von Fluorophorsubsituent-haltigen fluoreszierenden Verbindungen, die somit pro Sequenz oder Segmentmolekül umgesetzt werden, wird leicht gesteuert. Bevorzugt werden die Ausgangs- DNA-Sequenzen fragmentiert, bevor diese an die Fluorophorgruppen gebunden werden. Folglich ist in einer Produkt-Sonden- Zusammensetzung die Anzahl von Markierungsgruppen pro DNA- Molekül einstellbar, wie es gewünscht ist. Von der Nukleotidsequenz von jedem Segment in der resultierenden Produkt-Sonden- Zusammensetzung nimmt man an, daß diese im wesentlichen identisch zu denen sind, die in einer Ausgangs-DNA-Mischung vorliegen, mit Ausnahme des zusätzlichen Vorhandenseins der transami nierten Verbindungsgruppen und der kovalent gebundenen Fluorophorgruppen.
Die kovalente Bindung oder das Binden einer fluoreszierenden Verbindung an eine Endgruppe einer Verbindungsgruppe zum Beispiel bei transaminierten DNA-Segmenten wird geeigneterweise durchgeführt unter Bedingungen einer wässrigen Flüssigkeitsphase unter Verwendung einer Temperatur in dem Bereich von etwa 4 bis etwa 50ºC, einer Konzentration an transaminierter DNA in dem Bereich von etwa 10 bis etwa 500 ug pro ml, ein nahezu neutraler pH für die Reaktionen von N-Hydroxysuccinimidestern (z. B. ein pH von etwa 6 bis 8) und einen alkalischen pH für Reaktionen von Isothiocyanaten und Sulfonsäurechloriden (z. B. pH 8,5 bis 9,5) und eine Zeit, welche typischerweise und beispielhaft in dem Bereich von etwa 2 bis etwa 18 Stunden liegt.
Typischerweise und bevorzugt ist die Menge der vorhandenen fluoreszierenden Ausgangsverbindung ausreichend, um einen wesentlichen molaren Überschuß bezogen auf die Gesamtmenge an Verbindungsgruppen, von denen geschätzt wird, daß diese in den transaminierten DNA-Sequenzen vorhanden sind, zu ergeben. In jeder gegebenen Situation kann ein optimierter molarer Überschuß bezogen auf die Konzentration der aminierten Desoxycytidin-Nukleotidreste, die in den Fragmenten vorhanden sind, geeignet bestimmt werden.
Während theoretisch die Menge an fluoreszierender Markierungsverbindung nur gleich der Menge an aminiertem Desoxycytidin in der Sonden-DNA zu sein braucht, wird üblicherweise ein Überschuß besonders bevorzugt, da einige der fluoreszierenden Verbindungsmoleküle auf anderen Wegen abreagieren, welche nicht zu einer Anbringung der Markierung an die DNA führen, wie beispielsweise eine Reaktion mit Wasser (Hydrolyse), wodurch man eine Markierungsverbindung gegenüber aliphatischen Amingruppen reaktionsunfähig macht. Ein Überschuß der Markierungsverbindung wird auch verwendet, um die Reaktionsgeschwindigkeit mit dem aminierten Desoxycytidin zu steigern, so daß die Reaktion in einem kürzeren Zeitraum vollständig abläuft. Ein großer Überschuß wird bei Markierungsverbindungen benötigt, die gegenüber einer Hydrolyse empfindlicher sind, wie beispielsweise N- Hydroxysuccinimidester und Sulfonsäurechloride, verglichen mit Verbindungen, die weniger empfindlich gegenüber Hydrolyse sind, wie beispielsweise Isothiocyanate. Während ein geringer Überschuß an Markierungsverbindung bezogen auf aminierte Desoxycytidine zu einem niedrigen Prozentsatz an Sondenmarkierung führen kann, kann ein großer Überschuß an Markierungsverbindung vorteilhaft sein, indem man hohe Markierungsprozentsätze erreicht. Ein Überschuß von den Mengen an Markierungsverbindung zu dem, was benötigt wird, um eine vollständige Markierung zu erreichen, ist nicht nachteilig für die Markierungsreaktion. Sehr große Mengen an Markierungsverbindung können jedoch zu Reinigungsproblemen nach der Reaktion führen, da im wesentlichen sämtliche der nichtabreagierten fluoreszierenden Verbindung entfernt werden müssen, bevor man die Produkt-Sonden- Zusammensetzung bei einer in-situ-Hybridisierung oder ähnlichem verwendet. Deshalb sollen sehr große Überschüsse an fluoreszierender Verbindung vermieden werden, wie beispielsweise Überschüsse, die größer als ein etwa 250-facher molarer Überschuß sind.
Wenn z. B. die fluoreszierende Markierungsverbindung ein Succinimidylderivat (d. h. ein N-Hydroxysuccinimidester eines Carboxyl-substituierten Fluorophors oder ähnliches ist) oder ein entsprechendes Sulfonsäurechloridderivat ist, dann werden die transaminierten DNA-Sequenzen, die die restlichen Verbindungsverbindungen enthalten, mit einem etwa 100- bis etwa 200-fachen molaren Überschuß von der fluoreszierenden Markierungsverbindung geeigneterweise umgesetzt, wobei ein etwa 150-facher molarer Überschuß vorliegend bevorzugt wird.
Wenn z. B. die fluoreszierende Markierungsverbindung ein Isothiocyanatderivat ist, dann werden die transaminierten DNA- Sequenzen mit einem etwa 50-fachen molaren Überschuß von der fluoreszierenden Markierungsverbindung geeigneterweise umgesetzt.
Bei der Reaktion, die auftritt, nimmt man an, daß die kovalente Bindung zwischen der reaktiven Gruppe einer fluoreszierenden Ausgangsverbindung und der terminalen Gruppe einer transaminierten Verbindungsgruppe (die aus einer Verbindungsverbindung gewonnen wird), die mit einer DNA-Sequenz verbunden ist, erfolgt. Bevorzugt wird wenigstens eine terminale Gruppe einer Verbindungsgruppe pro Molekül mit der verwendeten fluoreszierenden Verbindung umgesetzt. Typischerweise werden etwa 10 bis etwa 100 Molprozent der terminalen Stellen der Verbindungsgruppen umgesetzt und somit fluoreszenzmarkiert. Bevorzugt werden aus Wirksamkeitsgründen wenigstens etwa 70 Molprozent davon so markiert und am meisten bevorzugt etwa 90 Molprozent davon so markiert.
Die restliche Markierungsverbindung, die am Ende der Reaktionszeit nicht an die Sonden kovalent gebunden ist, kann über eine Vielzahl von Verfahren abgetrennt werden, wie beispielsweise durch Präzipitation der DNA, Gelpermeationschromatografie, Affinitätschromatografie, Dialyse, Gelelektrophorese und Kombinationen von diesen Verfahren. Die Anzahl und die Arten von Verfahren, die kombiniert werden, um markierte Sonden zu reinigen, hängt ab von der Größe der Markierungsverbindung, einschließlich der Größe von Aggregaten von diesen Markierungsverbindungen, und von deren Fähigkeit nichtkovalent an die markierte DNA zu binden wie beispielsweise durch ionische und hydrophobe Wechselwirkungen. Ein Verfahren, welches eine angemessene Abtrennung von nichtabreagierter Markierungsverbindung bewirkt, umfaßt einen Ethanol-Präzipitationsschritt, gefolgt von einem Gelpermeationschromatografieschritt, gefolgt von einem zweiten Ethanolpräzipitationsschritt. Die resultierende präzipitierte markierte Sonde kann in Wasser aufgelöst werden, um eine Sonden-Stammlösung zu ergeben, die direkt bei in situ- Hybridierungsreaktionen verwendet werden kann, wenn diese mit den weiteren Hybridisierungskomponenten (z. B. Formamid, Dex transulfat, Puffer und spezifische Sonden-Zusammensetzungen) kombiniert wird. Das resultierende Reaktionsprodukt der transaminierten DNA-Sequenzen und der selektierten Fluoreszenzverbindungen umfaßt eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung.

(5) Direkt-Markierungs-Sonden-Zusammensetzung

Somit wird eine Direkt-Markierungs-Sonden-Zusammensetzung bereitgestellt, wobei die DNA-Segmente an die fluoreszierenden Gruppen gebunden sind. Diese Sonden-Zusammensetzung ist geeignet für die Verwendung bei der genomischen DNA-Gegenfärbung und bei der in situ-Hybridisierung oder ähnlichem zum Nachweisen des Vorhandenseins in einer Probe, die die genomische Target- DNA eines ausgewählten multichromosomalen Genoms enthält. Eine solche Sonden-Zusammensetzung enthält eine Vielzahl von verschiedenen DNA-Segmenten, die auf jedem der Chromosomenbestandteile des Genomes vorkommen, die einzeln jeweils an einer Vielzahl von Loci vorkommen. Diese DNA-Segmente sind an etwa 1 bis etwa 70 Molprozent der gesamten Desoxycytidin-Nukleotide davon mit einer Verbindungsgruppenstruktur substituiert, die eine terminale funktionelle (oder reaktive) Gruppe behält. Wenigstens etwa 10 Molprozent sämtlicher der beibehaltenen terminalen funktionellen Gruppen sind jeweils an eine einzelne Gruppe, die einen fluoreszierenden Substituenten umfaßt, kovalent gebunden. Einzelne von dieser so markierten Mehrzahl von DNA- Segmenten, die somit eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung umfassen, sind hybridisierbar an komplementäre DNA- Segmente, die in Bereichen gefunden werden, die in jeder einer Mehrzahl von Loci, die überall auf der DNA des ausgewählten Genoms vorhanden sind, vorkommen.
Bevorzugt ist in einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung diese difunktionale Verbindungsgruppe gekennzeichnet durch die Formel:
worin:
X ausgewählt ist aus der divalenten Gruppe, welche besteht aus:
R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, die besteht aus Wasserstoff und Niederalkyl;
m und n jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Zahl von 1 bis einschließlich 6; und
p eine Zahl von 0 oder 1 ist, und worin die Gruppe:
transaminiert ist mit einem Desoxycytidin-Nukleotid von einer DNA-Sequenz und die Gruppe -X- an eine der Markierungseinheiten kovalent gebunden ist.
Somit umfaßt eine Direkt-Markierungs-Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung eine Mischung von DNA-Segmenten, welche gewonnen sind aus und die annähernd eine Repräsentierung sind der gesamten genomischen DNA eines gegebenen Genoms. Ein vorliegend bevorzugtes Genom ist das humane Genom. Diese DNA- Segmente sind über die dazwischen angeordneten Verbindungsgruppen mit den fluoreszierenden Gruppen chemisch verbunden. Die Eigenschaften der Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung sind zur Erleichterung in der Tabelle II unten zusammengestellt. TABELLE II Charakteristische Merkmale der Sonden-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
Die Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung können verwendet werden, d. h. hergestellt, verkauft und verwendet in verschiedenartigen. Formen einschließlich in trockener, fester (insbesondere partikulärer) Form, wässrigen Lösungen, und wässrigen Formulierungen, die für die direkte Verwendung bei einem Hybridisierungsverfahren geeignet sind.
In wässrigen Medien liegt eine Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung bevorzugt in einer im wesentlichen vollständig aufgelösten Form vor. Wie die Fachleute wissen, kann der Gehalt einer wässrigen Formulierung einer Sonden-Zusammensetzung (einschließlich einer Hybridisierungslösung) stark variieren, was von vielen Variablen und Aufgaben abhängt. Als ein veran schaulichendes Beispiel weist eine geeignete Klasse von Hybridisierungslösungen eine Zusammensetzung auf, wie sie in Tabelle III unten angegeben ist: TABELLE III Beispielhafte Klasse einer Sonden-Zusammensetzung, die für die Verwendung bei einer in situ-Hybridisierung geeignet ist
In einer solchen Sonden-Zusammensetzung gemäß Tabelle III hat das Denaturierungsmittel die Aufgabe, die Denaturierung der DNA-Segmente, die in einer Sonden-Zusammensetzung vorliegen, zu fördern. Diese geförderte Denaturierung ist wünschenswert, da diese die angelegte Temperatur für die Denaturierung und für die Hybridisierung erniedrigt. Während die verschiedenartigen Denaturierungsmittel, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden können, ist ein vorliegend am meisten bevorzugtes Denaturierungsmittel Formamid.
Ebenso können die verschiedenartigen Hybridisierungsgeschwindigkeitsbeschleuniger, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Ein vorliegend am meisten bevorzugter Hybridisierungsgeschwindigkeitsbeschleuniger ist ein Dextransulfat.
Ebenso können die verschiedenartigen wasserlöslichen Puffersubstanzen, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Vorliegend ist es bevorzugt, den pH einer Lösung einer Sonden-Zusammensetzung bei einem Wert, der in dem Bereich von etwa 5,5 bis etwa 8,5 liegt, zu halten. Die Puffersubstanzen, die geeignet sind, einen solchen pH zu halten, umfassen beispielsweise Zitronensäure, Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Phosphorsäure und ähnliches. Eine vorliegend bevorzugte Puffersubstanzzusammensetzung kann Zitronensäure (oder Natriumzitrat) umfassen.
Ebenso ist ein Hybridstabilisierungssalz, welches die Stabilisierung der während eines Hybridisierungsverfahrens gebildeten Hybride unterstützt, wünschenswert. Die Hybridstabilisierungssalze, die im Stand der Technik bekannt sind, können verwendet werden, wie beispielsweise NaCl, KCl, MgCl&sub2;, und ähnliche. Das vorliegend am meisten bevorzugte Salz ist jedoch Natriumchlorid.
Das verwendete Wasser ist bevorzugt zuvor destilliert oder deionisiert worden.
Eine wahlweise aber bevorzugte Komponente einer Sonden-Zusammensetzung gemäß Tabelle III ist eine blockierende DNA-Zusammensetzung.
Die Verwendung einer Verdünnungs-DNA bei der Herstellung einer Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung, wurde oben diskutiert (siehe den obigen Unterabschnitt bezüglich Transaminierung), als ein Mittel zur Regulation der Fluoreszenzintensität in einem hybridisierten Target. Eine Verdünnungs-DNA kann auch als eine blockierende DNA-Zusammensetzung und als ein Mittel zur Regulation der Fluoreszenzintensität und Hybridisierungsspezifität wirken. Vorliegend umfaßt eine bevorzugte blockie rende DNA-Zusammensetzung für blockierte Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung, welche auf das humane Genom oder Chromosomen davon gerichtet sind, fragmentierte humane Plazenta-DNA und Cot-1.
Eine blockierende DNA-Zusammensetzung ist vorteilhaft, wenn spezifische Sondenpräparationen in Verbindung mit den markierten genomischen Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung verwendet werden, da repetitive Sequenzen in der spezifischen Sonde-Präparation daran gehindert werden, daß diese mit der gleichen repetitiven Sequenz von nicht zu treffenden Chromosomen hybridisieren. Eine solche Hybridisierung erfolgt auch, wenn die blockierende DNA-Zusammensetzung zu dem Zeitpunkt vorliegt, wenn eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung unter hybridisierenden Bedingungen mit einem Target hybridisiert wird. Die Hybridisierung von DNA-Segmenten einer blockierenden DNA-Zusammensetzung an komplementäre Segmentbereiche eines Targets erfolgt auch. Die Wirkung dieser Hybridisierungen ist es, die Intensität der Fluoreszenz, die von einer gegebenen Sonden-Zusammensetzung nach der Hybridisierung an eine Targetzusammensetzung erzeugt wird, zu regulieren. Von der Menge an blockierender DNA-Zusammensetzungen nimmt man vorliegend nun an, daß diese mit der Hybridintensität, die nach der Hybridisierung beobachtet wird, invers korreliert ist; jedoch scheint es viele Variablen zu geben, die diese Beziehung beeinflussen. Eine resultierende Mischung einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung und eine blockierende DNA-Zusammensetzung können wahlweise hybridisierenden Bedingungen für einen längeren Zeitraum unterworfen werden, bevor man diese anschließend für eine Hybridisierung mit einem Target verwendet. Alternativ kann man eine denaturierte blockierte Sonden-Zusammensetzung für die Hybridisierung mit einem Target unter hybridisierenden Bedingungen verwenden.
Die Zusammensetzungen gemäß Tabelle III können aus zuvor hergestellten Vorläuferzusammensetzungen hergestellt werden, welche zum Zeitpunkt der Verwendung bei einem Hybridisierungsverfah ren zusammengemischt werden. Solche Vorläuferzusammensetzungen können als ein "Kit" bezeichnet werden.
Eine Analyse wie und warum eine Sonden-Zusammensetzung in der Lage ist, als ein genomisches Gegenfärbemittel zu wirken, wird nun in einer Theorie erläutert, und es gibt keine Absicht hier, dadurch gebunden zu werden:
Licht, das von verschiedenen Punkten innerhalb einer Probe emittiert wird, das unter Verwendung eines Lichtmikroskopes beobachtet wird, muß besser als die Diffraktionsgrenze aufgelöst werden, damit die Punkte voneinander unterschieden werden. Die Diffraktionsgrenze beträgt etwa 0,4 um für sichtbares Licht mit einer Wellenlänge von 500 nm. Wenn die Punkte der Fluoreszenzemission näher zusammen sind, werden sie als ein einzelner Punkt erscheinen. Diese Information kann verwendet werden, um den Anteil von den gesamten genomischen DNA-Sondensegmenten abzuschätzen, welche an Chromosomen hybridisieren müssen, um das zu ergeben, was bei der mikroskopischen Untersuchung eine im wesentlichen vollständige Abdeckung zu sein scheint. Die vollständige Abdeckung oder Färbung kann somit als eine theoretische Bedingung betrachtet werden, gemäß der die Sonden an eine Target-DNA auf so eine Weise hybridisiert haben, daß die fluoreszierende Gruppe von jedem resultierenden Hybrid von einer weiteren benachbarten Gruppe nicht weiter weg als etwa 0,4 um angeordnet ist.
Diese Anordnung ist theoretisch, schematisch und veranschaulichend in Fig. 1 für ein einzelnes Metaphasenchromosom 30, das die Schwesterchromatiden 31 und 32 enthält, gezeigt, wobei jede einzelne hybridisierte Sonde (oder Hybridstelle) durch einen Punkt 33 wiedergegeben ist. Der Einfachheit halber wird angenommen, daß die Tiefe des Gebietes groß genug ist, daß gesamte Tiefe des Chromosoms 30 für den Beobachter sichtbar ist, und das Chromosom 30 kann als zweidimensional angesehen werden. Die theoretische Anzahl von hybridisierten Sonden, die für eine im wesentlichen vollständige Abdeckung des Chromosoms 30 benötigt werden, beträgt etwa 7,2 Sonden um².
Diese Anordnung wird in Fig. 2 weiter veranschaulicht, welche einen theoretisch ausgedehnten Bereich von Chromosom 30 und den Punkten 33 zeigt. Jeder Punkt 33 ist von den anderen durch 0.4 um getrennt, und ein Unterbereich, der vier Punkte 33 (oder Sonden) enthält, ist mittels eines gepunkteten Quadrats 34 umrissen, wobei das Quadrat 34 die Abmessungen 0,692 um · 0,800 um aufweist, wodurch man 4 Punkte pro 0,554 um² oder 7,2 Punkte/um² erhält. ·
Der Dichte von Basenpaaren innerhalb einzelner Chromosomen kann aus dem abgeschätzten Durchschnitt der zweidimensionalen Größe eines Chromatids abgeschätzt werden, wenn man die Metaphasenchromosomen unter dem Mikroskop untersucht. Eine durchschnittliche Chromatidlänge wird hier mit etwa 3 um angenommen, und die durchschnittliche Breite wird hier mit etwa 0,5 um angenommen, was eine Fläche von etwa 1,5 um²/Chromatid ergibt. Da es 92 Chromatide (4 pro Chromosomenpaar) in einem normalen Satz von humanen Metaphasenchromosomen gibt), beträgt die gesamte chromosomale Fläche 138 um². Da es etwa 3 · 10&sup9; Basenpaaren pro haploidem humanen Genom gibt und da es etwa 4 mal soviel in einem Metaphasenkern gibt, beträgt die Basenpaardichte etwa 8,7 · 10&sup7; Basenpaaren pro um². Unter der Annahme einer minimalen Sondendichte von 7,2 Sonden/um² für eine im wesentlichen vollständige Abdeckung der Chromosomen und einer Durchschnittsgröße von etwa 300 Basenpaaren pro Sonde, muß minimal 1 Sonden-Basenpaar pro 40000 Basenpaaren des Chromosoms hybridisiert werden. Wenn eine Sonden-Zusammensetzung aus gesamter genomischer DNA hergestellt wird, wie der gesamten DNA, die aus humanem Gewebe (z. B. humaner Plazenta) isoliert ist, dann müssen nur etwa 0,0025% der Segmente, die in einer Sonden-Zusammensetzung enthalten sind, an die Chromosomen hybridisieren, um eine im wesentlichen vollständige Abdeckung (was äquivalent ist zu etwa 0,0025% von sämtlichen der humanen Chromosomen, die an eine Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung hybridisiert sind) zu bewirken, unter der Annahme, daß sämtliche Bereiche der Chromosomen in etwa für die Hybridisierung gleich zugänglich sind.
Der visuelle Nachweis eines einzelnen fluoreszierenden Punktes, der z. B. auf einem Chromosom unter dem Mikroskop beobachtet wird, erfordert das Vorhandensein einer Mehrzahl von fluoreszierenden Gruppen oder Markierungen. Diese Anzahl wird nun theoretisch geschätzt auf etwa 300 bis etwa 3000 fluoreszierende Markierungen (d. h. fluoreszierende Gruppen). Die Sichtbarkeit wird beeinflußt durch die Geräte, die bei der Targethybriduntersuchung verwendet wird, und die Empfindlichkeit des Sensors wie beispielsweise dem humanen Auge oder einem lichtempfindlichen Detektor. Unter Verwendung von DNA-Sonden mit einer Durchschnittslänge von etwa 300 Basenpaaren, die aminiert und mit Fluorophoren mit einem Level von etwa 1% (d. h. 1 direkt angebrachte fluoreszierende Gruppe an etwa 1 aus 100 Basen oder etwa 3 fluoreszierende Gruppen pro Sonde) markiert sind, wie es hier gelehrt wird, sollte ein mikroskopisch sichtbarer fluoreszierender Punkt etwa 100 bis etwa 1000 hybridisierte Sonden enthalten. Für eine im wesentlichen vollständige Abdeckung) wie dies in dem vorhergehenden Absatz beschrieben wurde, entspricht diese Annahme etwa 720 bis etwa 7200 Sonden/um² oder etwa 1 Sondenbasenpaar pro 400 bis 40 Basenpaaren eines Chromosomes. Das bedeutet, daß etwa 0,25% bis etwa 2,5% der Gesamtzahl an verschiedenen Segmentbereichen, die innerhalb einer humanen gesamten genomischen Sondenbereitstellung vorliegen, an die humanen Chromosomen hybridisieren müssen, um die Möglichkeit zur visuellen Detektion eines vollständig gefärbten Chromosomes (was äquivalent ist zu etwa 0,25 bis etwa 2,5% der chromosomalen DNA, die an eine Sonden-Zusammensetzung hybridisiert sind) zu ergeben.
Die vorstehenden theoretischen Berechnungen veranschaulichen und unterstützen die praktisch beobachteten Ergebnisse, daß nur ein überraschend geringer Anteil von sämtlichen humanen Chromo somen mit einer Sonden-Zusammensetzung hybridisiert zu werden braucht, um eine im wesentlichen vollständige und visuell nachweisbare Anfärbung davon zu ergeben.
Auch veranschaulichen diese Berechnungen eine mögliche Basis für die beobachteten Ergebnisse, um sowohl eine im wesentlichen vollständige Gegenfärbung einer gegebenen gesamten genomischen DNA durch eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung als auch eine koexistierende Anfärbung von z. B. spezifischen Chromosomenbereichen, die in einer solchen gegebenen genomischen DNA vorhanden sind, durch eine chromosomal bereichspezifische Sonden-Zusammensetzung, zu erreichen. Somit können sowohl sämtliche der humanen Chromosomen als auch spezifische Teilabschnitte oder Bereiche davon in einer gegebenen Targetprobe gleichzeitig und unabhängig voneinander gefärbt werden.
In der Tat und z. B. wird eine im wesentlichen vollständige Anfärbung von sämtlichen humanen Chromosomen in einer Targetprobe erreicht, wenn eine Direkt-Fluorophor-markierte Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung aus der gesamten DNA, die aus humanem Plazentagewebe extrahiert wird, hergestellt wird. Somit wurde z. B. eine Direkt-Fluorophor-markierte Sonden- Zusammensetzung hergestellt aus z. B. einer Cosmid-Bibliothek, die aus gesamter humaner DNA, die aus humanem Plazentagewebe extrahiert wurde, konstruiert wurde wie beispielsweise eine pWE15 Cosmid-Bibliothek (die von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA erhältlich ist), und es wurde ein im wesentlichen vollständiges Anfärben (Hybridisierung) von sämtlichen humanen Chromosomen damit erreicht. Die Bibliothekskonstruktion stellt jedoch nicht sicher, daß sämtliche der DNA-Segmente, die in der ursprünglichen Plazenta-DNA enthalten sind, in die Cosmidvektoren eingebaut werden. Die Metaphasenchromosomen, die mit einer Sonden-Zusammensetzung, die aus der Cosmidbibliothek hergestellt wurde, gefärbt sind, zeigen typischerweise eine im wesentlichen vollständige Färbung, die in einzelnen Chromosomen in der Intensität von einer Hybrid- (oder Fluorophor) Anordnung zur nächsten nicht gleich ist. Es werden Banden von hellerer und schwächerer Anfärbung, die über die Langen der einzelnen Chromosomen alternierend angeordnet sind, beobachtet. Die Sonden-Zusammensetzung ist jedoch auch verwendbar als eine genomische Gegenfärbung, da sämtliche der Chromosomen im wesentlichen vollständig gefärbt werden. Eine gesprenkelt erscheinende Anfärbung der einzelnen Chromosomen ist ausreichend, um im wesentlichen vollständig den Körper eines jeden Chromosomes zu identifizieren.
Direkt-Fluorophor-markierte Sonden-Zusammensetzungen gemäß der Erfindung, wobei die DNA-Segmente aus einer Behandlung gesamter genomischer DNA mit Enzymen, um die nichtrepetitiven Sequenzen (wie z. B. Cot-1 DNA von Life Technologies, Inc., Bethesda, MD) zu entfernen, resultieren, sind auch für die Gegenfärbung verwendbar. Obwohl bei der mit Enzymen behandelten gesamten genomischen DNA der Gehalt an einigen genomischen Sequenzen abnimmt, zeigen trotzdem Metaphasenchromosomen, die mit einer Sonden-Zusammensetzung, die aus einer solchen gesamten genomischen DNA hergestellt ist, gefärbt sind (d. h. hybridisiert sind) sowohl eine Anfärbung über die Länge von sämtlichen Chromosomen als auch hell gefärbte Bereiche von Chromosomen und leicht gefärbte Bereiche von Chromosomen. Sämtliche der so hybridisierten Chromosomen wurden jedoch bis zu einem gewissen Umfang gegegengefärbt, wobei man die erhaltene Farbe in der Wirkung im wesentlichen vollständig macht.
Die Fähigkeit der genomischen Gegenfärbung einer Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die Fig. 3-6 veranschaulicht. Das theoretische Auftreten eines einzelnen Chromosoms 30 eines multichromosomalen Genoms, wie dem humanen Chromosom, in stark vergrößerter Form wird in Fig. 3 gezeigt. Von diesem Chromosom wird für die vorliegenden Zwecke angenommen, daß es entweder durch eine Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung oder durch ein chemisches Färbemittel aus dem Stand der Technik gegengefärbt wurde.
Wenn das genomische Gegenfärbemittel eine Nukleotid-farbendes chemisches Gegenfärbemittel aus dem Stand der Technik ist, das verwendet wurde, wie es im Stand der Technik gelehrt wird, und das als ein Ergebnis zwischen benachbarten Nukleotiden interkaliert oder an die äußere Oberfläche oder Spalte der DNA-Helix bindet, wird von der erhaltenen gegengefärbten DNA, wie sie in Fig. 3 unter sogar im wesentlichen stärkerer Vergrößerung zu sehen ist, angenommen, daß es eine Erscheinung hat, wie dies in Fig. 4 veranschaulicht ist. Die einzelnen Nukleotide und Basenpaare zwischen den beiden Strängen werden durch die dünnen Linien wiedergegeben, die die längeren Linien verbinden, welche das Rückgrat des DNA-Sequenzstranges, der in den Chromosomen vorliegt, wiedergeben. Es werden viel weniger Nukleotide und Basenpaare hier aus darstellerischen Zwecken gezeigt, als tatsächlich vorliegen, und die helikale Struktur ist aus den gegebenen veranschaulichenden Zwecken verringert oder weggelassen. Somit sind die Moleküle dieses chemischen Gegenfärbemittels jeweils an einer Vielzahl von bestimmten Positionen 11 entlang der Stränge 12 der Helices, die die DNA des Chromosoms 10 umfassen, angeordnet. Diese Positionen 11 sind im wesentlichen zufällig entlang der DNA-Helixstränge 12 angeordnet und können innerhalb mehrerer Basenpaare vorliegen, bei weiteren bei hohen Konzentrationen des Gegenfärbemittels aus dem Stand der Technik. Obwohl sogar Abweichungen in der Intensität auftreten können und beobachtbar sind, wegen der engen Abstände zwischen den Molekülen des chemischen Gegenfärbemittels, erscheinen die Chromosomen 10 bei der mikroskopischen Untersuchung im wesentlichen vollständig gefärbt zu sein.
Wenn alternativ das genomische Gegenfärbemittel eine Sonden- Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist, welche bei einem in situ-Hybridisierungsverfahren unter Hybridisierungsbedingungen, wie diese hier beschrieben wurden, verwendet wurden, um Hybride mit genomischer DNA zu bilden, wird von der erhaltenen gegengefärbten DNA, wie diese in Fig. 3 zu sehen ist, unter einer im wesentlichen stärkeren Vergrößerung angenommen, daß diese eine Erscheinung aufweist, wie sie in Fig. 5 veranschaulicht ist. Somit haben einzelne der DNA-Segmente 13, die in der Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung vorliegen, an bestimmte einzelsträngige (denaturierte) Bereiche 14, von denen angenommen wird, daß diese in Target-DNA-Strängen oder Sequenzen 12 als ein Ergebnis von Denaturierungs- (und bevorzugt auch Entwässerungs-) Verfahren vorliegen, hybridisiert. Es wird überlegt und angenommen, daß nicht sämtliche dieser denaturierten Bereiche mit jedem einzelnen DNA-Segment, das in der Sonden-Zusammensetzung vorliegt, hybridisiert, wie dies durch den nicht hybridisierten Bereich 14, der in Fig. 5 gezeigt wird, veranschaulicht wird. Somit sind diese einzelnen hybridisierten DNA-Segmente der Sonden-Zusammensetzung an einer Vielzahl von bestimmten Loci oder Positionen oder Bereichen 14 entlang der Stränge 12 der Helices, die die DNA des Chromosoms 10 umfassen, angeordnet. Von diesen Positionen 14 wird angenommen, daß diese entlang der DNA-Helixstränge 12 mit bedeutenden Bereichen, die typischerweise zwischen benachbarten Positionen 14 entlang eines einzelnen DNA-Stranges 12 vorliegen und auch zwischen benachbarten Positionen 14, die zwischen benachbarten Bereichen des Stranges 12 vorliegen, angeordnet sind. Da jede der so hybridisierten DNA-Segmente der Sonden-Zusammensetzung hier mit wenigstens einer fluoreszierenden Gruppe markiert ist, erscheint das Chromosom 10 bei einer fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung im wesentlichen vollständig gefärbt zu sein, sogar obwohl da in der Tat ein Abstand zwischen den benachbarten markierten Sondensegmenten relativ zu den DNA-Sequenzen des Chromosomes 10 aufgrund der oben angegebenen beschränkten Auflösungseigenschaften des herkömmlichen Lichtmikroskopes vorliegt.
Wie in Fig. 6 veranschaulicht ist, kann ein resultierendes genomisch gegengefärbtes Chromosom oder eine Gruppe von Chromosomen, ob die Gegenfärbung nun unter Verwendung eines interkalierenden chemischen Gegenfärbemittels aus dem Stand der Technik oder durch eine genomisch hybridisierende Sonden- Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung erzielt wird, dieselbe oder eine ähnliche Erscheinung haben, insbesondere wenn die diesbezüglichen Gegenfärbemittel jeweils dieselbe oder ähnliche Fluoreszenzfarbe haben. Die Vorteile einer genomischen Gegenfärbung, die mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung erreicht werden, werden hier woanders erklärt.
Die Eigenschaften und Verwendbarkeiten der Erfindung werden weiter veranschaulicht unter Bezugnahme auf die Mikrofotografien der Fig. 7 bis 15. Jede der Mikrofotografien der Fig. 7 bis 15 zeigt auf Objektträgern aufgebrachte Proben, die Verteilungen von Metaphasenchromosomen und Interphasenkerne, die aus humanen Blutzellen stammen, enthalten. Diese Proben wurden sämtlichst einer in situ-Hybridisierung unter hybridisierenden Bedingungen mit genomischen Gegenfärbungszusammensetzungen unterworfen. Sämtliche der Mikrofotografien haben die gleiche Vergrößerung, wie dies durch die 10 Mikron-Abstandslinie, die auf jeder dieser Mikrofotografien angebracht ist, gezeigt wird, und sämtliche Mikrofotografien wurden unter Verwendung des gleichen Fluoreszenzmikroskopes, wobei jede Probe mit Licht aus einer 100 Watt Quecksilberlicht-Bogenlampe beleuchtet wurde, hergestellt. Die verwendeten Fluoreszenzfarben sind natürlich in den beigefügten schwarzweißen Mikrofotografien nicht zu sehen.
Fig. 7 zeigt eine Probe mit einem einzelnen Interphasenkern (links von der Mitte) und einer einzelnen Verteilung von Metaphasenchromosomen (rechts von der Mitte). Die Proben wurden unter Verwendung von 600 ng 0,95% DECCA-markierter, fragmentierter humaner Plazenta-DNA, wie sie in Beispiel 6 unten hergestellt wurde (unter Verwendung der Zubereitung Nr. 2, die unten in Tabelle IV aufgelistet ist und unter Verwenden der 10 ul Hybridisierungslösung, die in Beispiel 15(a) unten beschrieben wird) gegengefärbt. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie in Beispiel 15(a) unten beschrieben, und die genomisch hybridisierte und gegengefärbte Probe wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops, das mit Filter Nr. 13, der unten in Tabelle IV angegeben ist, ausgestattet ist, beobachtet und fotografiert.
Fig. 8 zeigt eine Probe mit drei Interphasenkernen und zwei Metaphasenverteilungen, die auf die gleiche Weise wie in Fig. 7 gegengefärbt wurden, mit der Ausnahme, daß 1 ug Cot-1 in der Hybridisierungslösung als blockierende DNA enthalten war. Die Intensität der DECCA-Fluoreszenz (die identisch wie in Fig. 7 beobachtet und fotografiert wurde) bei den hybridisierten genomisch gegengefärbten Chromosomen war etwas verringert, aber die Färbung war noch sehr genau und im wesentlichen vollständig.
Fig. 9 zeigt eine Probe mit einem Interphasenkern und einer einzelnen Metaphasenverteilung, die auf die gleiche Weise wie in Fig. 7 gegengefärbt wurden, mit der Ausnahme, daß 2 ug humaner Plazenta-DNA in der Hybridisierungslösung als blockierende DNA (anstelle von Cot-1-DNA) enthalten waren. Die Intensität der DECCA-Fluoreszenz (die wie in Fig. 7 identisch beobachtet und fotografiert wurde), war etwas verringert, aber die Färbung war noch sehr genau und im wesentlichen vollständig.
Die in Fig. 7 bis 9 gezeigten Ergebnisse zeigen somit und veranschaulichen, daß die genomischen DNA-Gegenfärbungs-Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung entweder alleine oder in Verbindung mit weiterer blockierender DNA aus demselben Genom, die sich dieselben Targetbereiche teilen, verwendet werden können, während man noch eine visuel nachweisbare vollständige Identifizierung eines Genoms, hier des humanen Genoms, erhält. Diese Ergebnisse zeigen auch, daß blockierende DNA desselben Genoms, hier veranschaulichenderweise von humaner Plazenta-DNA und Cot-1-DNA, mit einer genomischen Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung verwendet werden können, wenn es durch eine besondere Verwendung erforderlich oder gewünscht ist.
Fig. 10 zeigt eine Probe mit mehreren Interphasenkernen und einer einzelnen Metaphasenverteilung. Die Probe wurde mit 100 ng 3,6% CTMR-markierter Cot-1-DNA, die wie in Beispiel 4 unten beschrieben (unter Verwendung der Zubereitung Nr. 6, die in Tabelle II aufgelistet ist) hergestellt wurde, und unter Verwendung derselben 10 ul Hybridisierungslösung gegengefärbt. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie im Beispiel 15(a) unten beschrieben, und die Probe wurde unter Verwendung des Fluoreszenzmikroskopes, das mit dem Filter Nr. 16, der für die CTMR- Fluoreszenz spezifisch ist, wie dies in Tabelle III unten gezeigt ist, ausgestattet ist, fotografiert.
Die hell gefärbten und weniger hell gefärbten Bereiche, die in Tabelle VI (unten) beschrieben sind, die für die markierte Cot- 1-DNA basierende Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung kennzeichnend sind, sind klar erkennbar in Fig. 10, obwohl das Probenmaterial vollständig gefärbt ist.
Fig. 11 zeigt die gleiche Probe wie in Fig. 10, welche mit einem (herkömmlichen) chemischen Gegenfärbemittel DAPI aus dem Stand der Technik gefärbt wurde durch Zugabe des DAPI zu der Antiausbleichlösung, wie dies in Beispiel 15(a) beschrieben ist. Die DAPI-Fluoreszenz bei der resultierenden Probe wurde unter Verwendung des Fluoreszenzmikroskopes, das mit dem Filter Nr. 1, der für die DAPI-Anregung und Emission (siehe Tab. IV unten) spezifisch ist, ausgestattet ist, beobachtet und fotografiert.
Ein Vergleich von Fig. 11 zu Fig. 10 zeigt, daß die Cot-1 basierende Sonden-Zusammensetzung in Fig. 10 das gesamte Chromosomenmaterial in der Probe ähnlich wie DAPI vollständig hervorhebt.
Ein ähnlicher Vergleich wird mit den Mikrofotografien aus Fig. 12 und 13, welche die gleiche Probe verwenden, erreicht. Die Probe zeigt eine einzelne Metaphasenverteilung von Chromosomen. Fig. 12 resultiert aus dem Unterwerfen dieser Probe einem in situ-Hybridisierungsverfahren, das wie für die Proben von Fig. 10 oben beschrieben durchgeführt wurde, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungslösung 100 ng 1,8% CTMR-markierte Cosmid- Bibliotheks fragmentierte DNA, die, wie in Beispiel 4.3 unten (unter Verwendung der Zubereitung Nr. 9, die in Tabelle IV unten aufgelistet ist) beschrieben, hergestellt wurde, enthält.
Die resultierende hybridisierte Probe wurde über das gleiche Verfahren, das in Fig. 10 oben verwendet wurde, beobachtet und mikrofotografiert.
In Fig. 13 wurde die Probe mit DAPI über das gleiche Verfahren, das oben für Fig. 11 beschrieben wurde, gefärbt und wurde dann, wie oben für Fig. 11 beschrieben, beobachtet und mikrofotografiert.
Ein Vergleich von Fig. 12 zu Fig. 13 zeigt, daß, während Abweichungen bei der CTMR-Fluoreszenzintensität entlang der Länge von jedem gegengefärbten Chromosom beobachtet werden, die Gegenfärbung, die durch die CTMR-Sonden-Zusammensetzung hier erzielt wird, noch für jedes Chromosom vollständig ist, wenn man diese mit der Fluoreszenz, die mit dem DAPI-Gegenfärbemittel aus dem Stand der Technik erreicht, vergleicht.
Fig. 14 und 15 zeigen Mikrofotografien der gleichen Probe, die zwei Interphasenkerne und eine Metaphasenverteilung enthält. Die in situ-Hybridisierung wurde mit dem Verfahren, das in Beispiel 15(a) unten beschrieben ist, unter Verwendung in Zumischung (a) 600 ng 0,95% DECCA-markierter fragmentierter humaner Plazenta-DNA (die, wie in Beispiel 6 unten beschrieben, unter Verwendung der Zubereitung Nr. 2 aus Tabelle IV unten hergestellt wurde), (b) 100 ng 2,0% CTMR-markierter, für das ganze Chromosom Nr. 8 spezifische Sonden-Zusammensetzung (hergestellt, wie unten in Beispiel 10 beschrieben) und (c) 1 ug Cot-1 als blockierende DNA sämtlichst in den 10 ul Hybridisierungslösung. Die Mikrofotografie aus Fig. 14 wurde aufgenommen mit dem Mikroskop, das mit dem DECCA-spezifischen Filter Nr. 13 (siehe Tabelle III) ausgestattet war, während die Mikrofotografie aus Fig. 15 aufgenommen wurde mit dem Mikroskop, das mit dem CTMR-spezifischen Filter Nr. 16 (siehe Tabelle III) ausgestattet war.
Die Mikrofotografie aus Fig. 14 zeigt eine vollständige Färbung der Chromosomen in der Metaphasenverteilung und auch von den Interphasenkernen. Die Mikrofotografie aus Fig. 15 zeigt eindeutig und deutlich sowohl (a) ein hell gefärbtes Chromosomenpaar in der Metaphasenverteilung und auch (b) zwei hell gefärbte Bereiche in jedem der Interphasenkerne, die dem gleichen aber auseinandergezogenen Chromosomenpaar entsprechen. Somit zeigen und veranschaulichen Fig. 14 und 15, daß die Chromosomen-spezifischen Sonden-Zusammensetzungen, welche DNA-Segmente enthalten, wie die genomische Gegenfärbungs-Sonden- Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung, die mit Fluorophoren direkt markiert sind, mit den genomischen Sonden- Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung gemischt werden können. Auch zeigen die Fig. 14 und 15, daß solche Mischungen bei Hybridisierungsverfahren verwendet werden können, ohne daß man die nachfolgende Fähigkeit, sowohl die spezifisch gefärbten chromosomalen DNA-Bereiche als auch die gesamte genomisch gefärbte DNA in der gleichen Probe zu unterscheiden, verändert.

(D) In situ Hybridisierung und genomische Gegenfärbung

Die Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung sind gut geeignet für die Verwendung bei Hybridisierungsverfahren als genomische Gegenfärbemittel.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Identifizieren genomischer DNA, die in einer Probe, die aus einem Organismus, welcher ein multichromosomales Genom aufweist, gewonnen wurde, vorhanden ist, bereit. Das Verfahren umfaßt die aufeinanderfolgenden Schritte (a) Kontaktieren der Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung, um Hybride zwischen der genomischen Target-DNA, die in der Probe vorliegt, und den Sonden-DNA-Segmenten, die in der Sonden-Zusammensetzung vorliegen, zu erzeugen, (b) Abtrennen restlicher Anteile der Sonden-Zusammensetzung von der resultierenden Probe und (c) Untersuchen der resultierenden Probe.
Die Untersuchung der Probe kann verschiedenartig durchgeführt werden, z. B. mit einem Fluoreszenzmikroskop, einem Durchfluß zytometer oder ähnlichem. Die Untersuchung umfaßt das Bestrahlen der resultierenden Probe mit Energie, die wenigstens ausreichend ist, die fluoreszierenden Gruppen, die in den Hybriden vorhanden sind, zum Fluoreszieren zu bringen, während gleichzeitig die so erzeugte resultierende Fluoreszenzenergie detektiert wird. Wie die Fachleute wissen, kann, was von den besonderen Aufgaben und angelegten Bedingungen abhängig ist, dieses Untersuchungs- oder Identifizierungsverfahren ohne den Abtrennschritt durchgeführt werden, wenn der Gehalt der restlichen Sonden-Zusammensetzung so niedrig ist, daß er nicht bei der Untersuchung stört.
Vorteilhaft kann jedes geeignete oder besondere in situ-Hybridisierungsverfahren bei der Durchführung dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Ein in situ-Hybridisierungsverfahren kann eine besondere Probe umfassen, welche sämtliche oder nur einen Anteil der gesamten genomischen DNA des ursprünglichen Organismusses enthält.
Gegenwärtig ist es vorliegend bevorzugt, eine Sonden- Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung bei in situ- Hybridisierungsverfahren des Typs zu verwenden, der gewöhnlicherweise und geeigneterweise mit Proben, welche zuvor auf einem Objektträger präpariert und aufgebracht wurden, wie beispielsweise einen Objektträger, der Glas oder ähnliches umfaßt, durchgeführt wird. Für die Zwecke des Durchführens eines solchen in situ-Hybridisierungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Objektträger- Präparationsverfahren verwendet werden, wie sie beispielsweise von F. T. Bosman, M. Van der Ploeg, A. Schaberg, und P. Van Duijn (1975) Genetica, Bd. 5, S. 425-433, Galland Pardue (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 64, S. 600, gelehrt werden, und herkömmliche in-situ-Hybridisierungsverfahren können verwendet werden, wie sie beispielsweise von B. Bhatt, J. Burns, D. Flannery und J. O'D. McGee (1988) Nucleic Acids Research, Bd. 16, Seiten 3951-3961, und A. H. N. Hopman, J. Wiegart und P. Van Duijn (1987) Experimental Cell Research, Bd. 169, Seiten 357- 368 gelehrt werden.
Um die Gegenfärbung einer gesamten genomischen DNA und den Nachweis einer auf einem Objektträger aufgebrachten und bearbeiteten Probe unter Verwendung einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung zu erreichen, kann das folgende veranschaulichende Verfahren durchgeführt werden:
Bevorzugt wird eine auf einem Objektträger aufgebrachte Probe zuvor bearbeitet, um diese wenigstens teilweise zu entwässern und auch wenigstens teilweise die DNA, von der angenommen wird, daß sie darin vorliegt, zu denaturieren. Die herkömmlichen Denaturierungs- und Entwässerungsverfahren können verwendet werden. Beispielhafte Denaturierungslösungen und Verwendungsverfahren sind in den unten angegebenen Ausführungsformen beispielhaft angegeben, wie beispielhafte Hybridisierungslösung und Verwendungsverfahren. Bevorzugt führen diese Verfahren nicht zu einer nennenswerten Veränderung oder einem Verlust bei der DNA-Identität oder bei der Struktur von Chromosomen, die in der Probe vorhanden sind. Danach wird die folgende aufeinanderfolgende Hybridisierungsstufenabfolge mit der erhaltenen, so bearbeiteten Probe durchgeführt.
Zuerst wird die auf dem Objektträger aufgebrachte Probe mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung in Kontakt gebracht. Um diese Zusammensetzung zu konservieren, ist der Gehalt, der somit beim Inkontaktbringen verwendet wird, bevorzugt der minimale Gehalt, der benötigt wird, um eine vollständige Abdeckung der Probenoberfläche durch die Sonden-Zusammensetzung zu erreichen. Es gibt jedoch keine inhärente funktionelle oder Verfahrensbeschränkung bezüglich des maximalen oder minimalen Gehaltes einer gegebenen Sonden-Zusammensetzung, die auf einer gegebenen auf einem Objektträger aufgebrachten Probe verwendet werden kann. Das Volumen oder die Menge eines solchen minimalen Sondengehaltes wird durch das besondere Verfahren und die Geräte, die verwendet werden, beeinflußt. Zum Beispiel liegt in ei ner Anordnung, bei der der Oberflächenbereich der Probe in dem Bereich von etwa 500 mm² liegt, und die Probe auf einer inerten Objektträgeroberfläche, wie beispielsweise die Oberfläche eines herkömmlichen Glasobjektträgers, mit einer Beschichtungsdicke von etwa einem Mikron gleichmäßig abgeschieden ist, können etwa 10 ul eines Tropfens einer Sonden-Zusammensetzung (wie oben beschrieben) darauf aufgebracht und über die Probenoberfläche verteilt werden. Der verwendete Gehalt sollte ausreichend sein, um ein vollständiges Anfeuchten und Inkontaktbringen der Oberfläche mit der Sonden-Zusammensetzung zu erreichen. Danach kann ein herkömmliches Deckblättchen oder ähnliches auf die Oberfläche gelegt und gegen dieses gedrückt werden.
Es ist selbstverständlich, daß jedes herkömmliche Kontaktierungsverfahren und damit verbundenes Gerät verwendet werden kann. Zum Zeitpunkt des Inkontaktbringens sind die Sonden- Zusammensetzung und die Probe bereits bevorzugt bei einer gleichmäßigen Temperatur, die in dem Bereich von etwa 30 bis etwa 45ºC liegt, obgleich höhere und niedrigere Temperaturen verwendet werden können, wenn es gewünscht ist, was von der Salz- und der Denaturierungsmittelkonzentration in der Hybridisierungslösung abhängt. Die Probe wird mit der behandelnden Sonden-Zusammensetzung bevorzugt immer gleichmäßig in Kontakt gebracht.
Als nächstes wird die Kombination der Probe und der behandelnden Sonden-Zusammensetzung, die damit im Kontakt ist, einem Inkubationszeitraum unterworfen, welcher typisch und bevorzugt in dem Bereich von etwa 60 bis etwa 1000 Minuten liegt, obwohl längere und kürzere Inkubationszeiträume verwendet werden können, wenn es gewünscht ist. Während des Inkubationszeitraumes wird die Temperatur bevorzugt in den oben angegebenen Bereichen von etwa 30 bis etwa 45ºC gehalten.
Während dieses Inkubationszeitraumes durchläuft die behandelnde Sonden-Zusammensetzung eine Hybridisierung mit der genomischen DNA, die in der Probe vorhanden ist. Die Sonden-Zusammensetzung dringt in und durch die Probe ein und ist in der Lage, mit der so vorhandenen genomischen DNA zu hybridisieren, um Hybride zu bilden. Im Hinblick auf die Natur und die Zusammensetzung der gesamten genomischen DNA, die in die behandelnde Sonden- Zusammensetzung aufgenommen wird, wird von der behandelnden Sonden-Zusammensetzung charakteristischerweise beobachtet, mit der genomischen DNA, die in der Probe vorhanden ist, in einer kontinuierlichen und bevorzugt vollständigen Art und Weise zu hybridisieren, was mit den hier dargelegten Beobachtungen konsistent ist.
Als nächstes wird, nach dem Beendigung des Inkubationszeitraumes, die resultierende Probe einem Waschverfahren mit einer Flüssigkeit unterworfen, welches ausgelegt ist, um die nicht abreagierte, restliche behandelnde Sonden-Zusammensetzung daraus abzutrennen. Vorteilhaft können Waschverfahren, die ähnlich denen sind, die aus dem Stand der Technik bei in situ- Hybridisierungen bekannt sind, verwendet werden (siehe z. B. Bhatt et al (1988) Nucleic Acids Research 16, 3951-3961). Gewöhnlicherweise werden mehrere verschiedene Waschbäder verwendet, welche NaCl, Puffersubstanzen wie beispielsweise Natriumzitrat und ähnliches, und Formamid, in verschiedenartigen Konzentrationen enthalten. Höhere Formamidkonzentrationen und niedrigere NaCl-Konzentrationen werden für eine höher Stringenz (eine größere Eignung, um restliche Sonden-DNA zu entfernen) verwendet. Auch können Detergenzien verwendet werden, insbesondere im letzten Bad. Die Stringenz wird auch durch Erhöhen der Temperatur der Waschbäder über die Zimmertemperatur gesteigert. Während eine hohe Stringenz die Abtrennung von nichthybridisierter Sonde begünstigt, begünstigt diese auch die Abtrennung geringer Mengen hybridisierter Sonden, beispielsweise von kürzeren Sondensegmenten oder Sonden, die nur an teilweise zugängliche Bereiche der Chromosomen hybridisierten, so daß nicht sämtliche Nukleotide der einzelnen Sonde mit den benachbarten Chromosomennukleotiden Basenpaare ausbilden. Dieser Effekt verringert letztlich die Signalintensität, wodurch der angelegten Stringenz Grenzen gesetzt werden.
Zum Beispiel verwendet ein wirksames Verfahren nacheinander drei Bäder bei 45ºC, jedes enthält 50% Formamid und 2 X SSC (gelesen als zweifache Konzentration des Standard SCC-Puffers, wobei der Standard SSC-Puffer 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumzitrat bei pH 7 enthält, ein viertes Bad bei 45ºC, das 2 X SSC enthält, und ein fünftes Bad bei 45ºC, das 2 X SSC und 0,1% NP-40 (ein nichtionisches Detergens, das von Calbiochem, La Jolla, CA erhältlich ist) enthält. Die Zeit, die man einen Objektträger in jedes Bad eintauchen läßt, kann von Sekunden bis Minuten variiert werden, um verschiedenartige Grade der Abtrennung von nichthybridisierter Sonde zu erreichen, wobei Inkubationszeiten, die länger als 10 Minuten pro Bad sind, die Abtrennung von nichthybridisierter Sonde nicht verbessern. Die Anzahl an Bädern kann auch verringert werden, während man eine vernünftige Abtrennung von nichthybridisierter Sonde für die meisten Proben erreicht, während eine Erhöhung der Anzahl von Bädern eine Verbesserung erreicht, die als vernachlässigbar betrachtet werden kann. Nach dem Eintauchen in das letzte Bad, läßt man den Objektträger bevorzugt in einer nahezu vertikalen Position trocknen, und dieser soll vollständig oder teilweise luftgetrocknet sein, bevor man anschließend ein Beschichtungsmedium zugibt und mit einem Deckgläschen abdeckt. Das Beschichtungsmedium enthält gewöhnlicherweise und herkömmlicherweise Glyzerin, Puffersubstanzen und ein Antiausbleichmaterial, das die Geschwindigkeit der Lichtoxidation der fluoreszierenden Markierung verringert, was die Fachleute wissen.
Die Objektträger können unmittelbar nach dem Bearbeiten unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht werden, oder sie können bei Zimmertemperatur für mehrere Tage oder ähnliches vor der Untersuchung aufbewahrt werden. Die Aufbewahrung bei -20ºC bevorzugt in einer Schutzgas- (z. B. Stickstoff oder Argon) atmosphäre wird für längere Lagerungszeiträume vorliegend bevorzugt, um gegenüber Änderungen bei den hybridisierten Targets, Probenverschlechterungen oder ähnliches zu schützen.
Die resultierende auf dem Objektträger aufgebrachte Probe kann weiter mit weiteren Sondenzubereitungen hybridisiert werden. Zum Beispiel kann das Deckgläschen entfernt werden, und der Objektträger kann in einem der Waschbäder eingeweicht (eingetaucht) werden, um die Beschichtungslösung abzutrennen. Eine bevorzugt denaturierte zweite Sondenhybridisierungslösung wird dann auf den Objektträger (der Objektträger wird nicht ein zweites Mal denaturiert) aufgebracht (wie oben beschrieben), der resultierende Objektträger inkubiert, um eine Hybridisierung zu ermöglichen, und dann wird der Objektträger gewaschen, wie dies oben für das erste Hybridisierungsverfahren beschrieben ist.
Danach kann ein resultierendes so bearbeitetes und gegengefärbtes Produkt einer auf einem Objektträger aufgebrachte Probe einer mikroskopischen Untersuchung unter Verwendung eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopes und herkömmlicher Filter unterworfen werden. Im Fall einer Untersuchung einer genomisch gegengefärbten Probe, die mittels einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung hergestellt wurde, wissen die Fachleute, daß der besondere verwendete Filter bevorzugt einer ist, der mit den spektralen Ansprecheigenschaften, die mit dem besonderen Fluorophor, das als die Markierungseinheit in einer gegebenen Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung verwendet wird, verbunden ist, zusammenpaßt. Ein solcher Filter ist entweder käuflich erhältlich oder über die herkömmliche Filterherstellung oder Filter-Assembly-Technik ohne weiteres herstellbar. Die folgende Tabelle IV zeigt beispielhafte Spezifikationen für Filter, und diese Filter wurden mit den Fluorophoren, die von den hier dargestellten Beispielen umfaßt sind, verwendet. TABELLE IV Fluoreszenzmikroskop-Filtersatz, nominale Beschreibungen
x Die Wellenlängenwerte sind in Nanometereinheiten angegeben. Bandfilter sind mit "BP" gekennzeichnet, wobei das Zentrum des Transmissionsbandes des Filters zuerst angegeben ist und die volle Breite bei halbem Maximum in Klammern angegeben ist. Langfilter sind mit "LP" angegeben, wobei der Übergagsbereich zwischen niedriger und hoher Transmission angegeben ist.
xx Die Wellenlängenwerte sind in Nanometereinheiten angegeben und zeigen den Bereich des Übergangs des Filters zwischen hohem Reflektionsvermögen und hoher Transmission an.
* Der Filtersatz ist erhältlich von Zeiss
** Der Filtersatz ist erhältlich von Omega Optical.
Die Vollständigkeit, die Intensität und die Verteilung der Färbung, die mit der somit erreichten Gegenfärbung verbunden ist, kann verwendet werden, wenn es gewünscht ist, als eine Indikation für die Eignung der Produkt bearbeiteten Probe für weitere in situ-Hybridisierungsverarbeitungen. Zum Beispiel kann die Gegenfärbung als eine Indikation verwendet werden, ob oder ob nicht die Produktprobe für weitere aufeinanderfolgende in situ Hybridisierungsverfahren geeignet ist, wobei eine weitere oder andere Sonden oder Sonden-Zusammensetzungen darauf aufgebracht werden, welche an die spezifischen Targets, die in den vorherbestimmten Chromosomen oder Chromosomenbereichen oder ähnlichem vorhanden sind, hybridisierbar sind. Alternativ kann eine Genom- Gegenfärbungssonde gemäß dieser Erfindung mit weiteren spezifischen Sondenzubereitungen gemischt werden, so daß nach einer nachfolgenden Untersuchung hybridisierbare Bereiche der Probe von im wesentlichen nicht hybridisierbaren Bereichen der Probe unterschieden werden können.
Die Fachleute wissen, daß bei einer in situ-Hybridisierung einer auf einem Objektträger aufgebrachten Probe die Abfolge von (a) des in Kontaktbringens und (b) des Abtrennens (wie oben angegeben) vorteilhaft mehr als einmal ausgeführt werden kann, bevor der Schritt (c) (Untersuchen), wie oben angegeben, durchgeführt wird. Bei jeder dieser Wiederholung der Schritte (a) und (b) (wobei jeder von diesen geeigneterweise durchgeführt wird, wie dieses oben hier beschrieben ist) wird eine verschiedene Sonden- Zusammensetzung verwendet, wobei eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung bei einer Wiederholung verwendet wird, und wobei eine weitere (verschiedene) Sonden-Zusammensetzung bei jeder dieser weiteren Wiederholungen verwendet wird, wobei jede weitere Sonden-Zusammensetzung gegen einen verschiedenen vorherbestimmten anteiligen Bereich des Genoms gerichtet wird.
Die genomischen Gegenfärbungs-Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung können auch als ein weiteres Beispiel der Verwendung in einem Verfahren unter Verwendung von Fluoreszenzaktivierter Durchflußzytometrie verwendet werden. Zum Beispiel können anfänglich Chromosomen herkömmlicherweise isoliert werden, z. B. aus mitotischen Zellen einer Zellkultur; aber siehe z. B. Carrano et al. "Measurement and Purificatin of Human Chromosomes by Flow Cytometry and Sorting" Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., Bd. 76, Seiten 1382-1384 (1979).
Als nächstes wurde zu einer wässrigen Dispersion der so isolierten Chromosomen ein Vernetzungsmittel für das Protein (d. h. Histone und Nichthistone), das in dem chromosomalen Chromatin mit der DNA vorliegt, zugemischt. Geeigneterweise reagiert das Vernetzungsmittel mit einer polaren Gruppe von Aminosäuren, die eine oder mehrere polare Gruppen enthalten, die in einem solchen Protein vorhanden sind, wie beispielsweise Aspartat, Asparagin, Arginin, Glutamat, Glutamin, Histidin, Lysin, Serin, Tyrosin und Tryptophan. Die Sulfhydrylgruppe von Cystein kann auch manchmal vernetzen. Ein geeignetes Vernetzungsmittel und ein geeignetes in situ-Hybridisierungsverfahren wird beispielsweise in Van den Engh, U. S. Pat. Nr. 4,770,992 (1988) gelehrt.
Eine Sonden-Zusammensetzung gemäß der Erfindung wird mit den vernetzten und bevorzugt denaturierten Chromosomen gemischt.
Eine resultierende Mischung wird bevorzugt einem Abtrennverfahren unterworfen, um die nichthybridisierte restliche Sonden- Zusammensetzung zu isolieren. Die Fachleute wissen jedoch, daß, wenn die Konzentration der restlichen Sonden-Zusammensetzung ausreichend niedrig ist, so daß sie nicht stört oder übermäßig stört bei der besonderen beabsichtigten Durchflußzytometrie-Analyse, dann ein solches Abtrennverfahren vermieden werden kann.
Eine resultierende Suspension wird einer Durchflußzytrometrieanalyse unterworfen unter Verwendung von beispielsweise einem Zweistrahlzytometer, wie diese beispielsweise in der oben zitierten Literaturstelle beschrieben ist.
Die so gemessenen Ergebnisse können beispielsweise verwendet werden, um die Chromosomen, basierend auf der groben Probenmorphologie, zu identifizieren oder das Vorhandensein einer spezifischen Chromosomenfärbung mit dem Vorhandensein eines jeglichen Chromosomenmaterials zu korrelieren. Diese Korrelation wird gemacht, um gegenüber dem Hintergrund zu unterscheiden, welcher mit der spezifischen Färbung verwechselt werden könnte.
Eine weitere Technik, die den Nachweis mittels Durchflußzytometrie mit einer in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung kombiniert, verwendet die Interphasenkerne in einer Suspension in einer Art und Weise, wie dies beispielsweise von Trask et al. in Hum. Genet., 78: 251- 259 (1988) gelehrt wird.
Es ist ein wichtiges Merkmal und ein Vorteil der Sonden- Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung, daß diese mit weiteren Sonden-Zusammensetzungen gemischt werden können, ohne daß die chemische Struktur oder die funktionelle Fähigkeit derselben nachteilig beeinflußt wird. Zum Beispiel kann vor dem ersten oben angegebenen Verfahrensschritt eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung, die wie oben beschrieben wurde, hergestellt ist, mit einer weiteren Sonden-Zusammensetzung, wenn es gewünscht ist, gemischt werden, welche beispielsweise Sonden enthält, die an spezifische Targets, die in vorherbestimmten Chromosomen oder Chromosomenbereichen vorhanden sind, hybridisierbar sind. Diese weiteren Sonden-Zusammensetzungen sollten bevorzugt für die Verwendung bei einer in situ-Hybridisierung unter vergleichbaren Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Zeit und ähnlichem (bezogen auf eine Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung) geeignet sein.
Zum Beispiel kann eine solche weitere Sonden-Zusammensetzung eine direkt markierte oder eine indirekt markierte Sonden- Zusammensetzung sein, wie beispielsweise (a) eine direkt markierte Farbsonden-Zusammensetzung oder eine Direkt-Markierungs-, zentromerspezifische Sonden-Zusammensetzung; (b) eine Sonden- Zusammensetzung, die durch Nick-Translation der Sonden-DNA mit Fluoreszenz-markierten Nukleosidtriphosphaten markiert wurde, wie beschrieben bei Wiegant et al. (1991) Nucleic Acids Research 19, 3237-3241; (c), die indirekt markierte Sonden-Zusammensetzung, die durch Einbau von Biotin- oder Digoxygenin-haltigen Desoxynucleotidtriphosphaten in die Sonden-DNA hergestellt wird, wie dies in einer Anzahl von Veröffentlichungen beschrieben ist, einschließlich Wiegant et al. (bereits zitiert) und Bhatt et al. (1988) Nucleic Acids Research 16, 3951-3961; (d) die indirekt markierten Sonden-Zusammensetzungen, welche chemische Gruppen enthalten, die in einer Post-Hybridisierungsreaktion mit chemischen Gruppen auf modifizierten Fluorophoren reagieren, um eine Bindung zwischen hybridisierter Sonde und Fluoreszenzmarkierung zu bilden, wie dies beschrieben ist bei Hopman et al. (1987) Experimental Cell Research 169, 357-368; und ähnliche.
Eine solche resultierende gemischte Sonden-Zusammensetzung wird dann bei einem in situ-Hybridisierungsverfahren bei einer auf einem Objektträger aufgebrachten Probe verwendet. Bei diesem Verfahren wird/werden das/die genomische(n) DNA-Target-Körperchen, das/die in der Probe vorhanden ist/sind, mit wenigstens einer DNA-Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung gegengefärbt und das/die spezifische(n) Target(s) wird/werden in dem Umfang, wenn überhaupt welche(s) in der Probe vorhanden ist/sind, auch gleichzeitig mit der einzelnen und/oder gemischten Sonden- Zusammensetzung(en) gefärbt. Die restlichen Sonden werden nach folgend von der resultierenden Probe bei dem gleichen Waschstufenverfahren abgetrennt.
Ein weiteres Merkmal und ein Vorteil der Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung ist, daß sie auch für Gegenfärbungen verwendet werden können, sogar nach der Vollendung eines vorhergehenden spezifischen Hybridisierungsverfahrens, so wie beispielsweise eines in situ-Hybridisierungsverfahrens, worin ein besonderes Chromosom oder ein besonderer Bereich eines besonderen Chromosoms das Target einer besonderen Sonden-Zusammensetzung war oder ähnliches.
Die vorliegend bevorzugten Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung sind gekennzeichnet durch die Fähigkeit, genomische DNA vollständig und im wesentlichen gleichmäßig gegenzufärben, um die einzelnen Chromosomen oder Chromosomenfragmente, die in einer Probe vorhanden sind, wirksam zu umreißen, so daß diese Körperchen unter einem Fluoreszenzmikroskop oder ähnlichem nachweisbar sind.
Eine Gegenfärbung, die durch die Hybridisierung eines Targets mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung erzeugt wurde, kann von einem chemischen Gegenfärbemittel aus dem Stand der Technik z. B. durch Verdünnung der resultierenden gefärbten Proben unterschieden werden. Ein chemisches Gegenfärbemittel dissoziiert kennzeichnenderweise von der chromosomalen DNA sehr viel leichter, als es eine hybridisierte Sonde tut. Dies ist so, weil die Gleichgewichts-Bindungskonstante für zwei komplementäre DNA- Stränge in dem Größenbereich von etwa 150 bis etwa 600 Basenpaaren, wie diese in dieser Anmeldung verwendet werden, extrem groß ist, wenn die Temperatur mehrerer Grade oder mehr unter der Schmelztemperatur der komplementären Stränge (Tm) liegt. Zum Beispiel hat ein komplementäres 20 Nukleotid-langes Paar von Oligomeren eine Assoziationskonstante von etwa 2 · 10²&sup4; M-¹ bei 25ºC (berechnet aus deren freien Standardenergie). Die chemischen Gegenfärbemittel haben Assoziationskonstanten gewöhnlicherweise weit unter 10¹&sup0; M-¹. Die Verdünnung der Gegenfärbung kann in der Form von Waschstufen erfolgen, genau wie dies, wie oben beschrieben, für das Waschen der auf Objektträger aufgebrachten Proben erfolgt, um nichthybridisierte DNA abzutrennen. In der Tat dient das Eintauchen einer Probe, die entweder mit DAPI oder Propidiumjodid gefärbt ist, zwei der üblichsten chemischen Gegenfärbemittel für Chromosomen, nacheinander in drei Bäder bei 45ºC, wobei jedes 50% Formamid und 2 X SSC enthält, ein viertes Bad bei 45ºC, das 2 X SSC enthält, und ein fünftes Bad bei 45ºC, das 2 X- SSC und 0,1% NP-40 enthält, dazu, um die Intensität der chemischen Gegenfärbung stark zu verringern, wie dies durch die visuelle Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop bestimmt wird, bis zu einem Punkt, bei dem die einzelnen Interphasenkerne und Metaphasenverteilungen nicht mehr erkennbar oder nur noch kaum sichtbar sind. Das gleiche Waschverfahren trennt im wesentlichen nur die nichthybridisierte Sonde ab und daher nicht das an das Target-hybridisierte Gegenfärbemittel, wenn das Gegenfärbemittel eine direkt markierte gesamtgenomische DNA-Segmentzusammensetzung ist, wie diese hier bereitgestellt wird.
Die Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung sind im allgemeinen kompatibel mit weiteren in situ-Hybridisierungsreagenzien. Im Fall von zwei oder mehr indirekt markierten Sonden in Kombination muß jedoch aufgepaßt werden, daß keine Komponenten vorhanden sind, die jeweils mit den anderen, wenn diese in der Mischung vorliegen, kreuzreagieren.
Die Sonden-Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung führen kennzeichnenderweise zu gegengefärbter DNA in einer behandelten Probe, wie beispielsweise einer auf einem Objektträger aufgebrachten Probe, welche eine stabile Fluoreszenzfärbung aufweist. Somit kann z. B. eine solche Probe unter weiteren in situ- Hybridisierungsbedingungen weiterhin bearbeitet werden, ohne wesentliche Abtrennung oder Abschwächung der Gegenfärbungsintensität, die durch Auflösung des Gegenfärbemittels in den Prozeßflüssigkeiten verursacht wird, solange wie die Hybridisierungsbedingungen beibehalten werden.

Ausführungsformen

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Die Fluoreszenzmikroskopie wurde unter Verwendung eines oder mehrerer der folgenden Fluoreszenzmikroskope durchgeführt; Zeiss Axioskop, Axioplan oder Axiophot. Die verwendeten Filter sind in Tabelle IV oben gezeigt.

Beispiel 1. Herstellung von aminierter humaner gesamter genomischer DNA

Die aminierte DNA wurde aus gesamter humaner genomischer DNA aus drei Quellen hergestellt. Humane Plazenta-DNA (extrahiert aus humanem Gewebe) wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Typ XIII) bezogen. Cot-1-DNA wurde von Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD, Kat. # 5279SA) bezogen. Die Cosmid-Bibliothek (pWE15) von humaner Plazenta-DNA wurde von Stratagene (La Jolla, CA) bezogen. Die Bibliothek wurde kultiviert und die DNA wurde aus der Bibliothek extrahiert, wie dies in Beispiel 10, Bittner et al., US-Patent-Aktenzeichen Nr. 07/762,912, eingereicht an dem gleichen Tage hiermit, veröffentlicht als US-A-5506350 bzw. WO-A 93/06246, beschrieben ist. Jede DNA wurde in 2 ml Wasser aufgelöst und unter Verwendung eines Branson Sonifier Modell 450, ausgestattet mit einer Mikrospitzensonde, beschallt. Die Beschallung wurde unter Verwendung von 2 2-1/2 Minuten-Zeiträumen, die jeweils voneinander durch einen Off-Zeitraum von etwa einer Minute getrennt waren, unter Verwendung einer Leistungseinstellung von 3 durchgeführt. Der Betriebszyklus war zu 80% On, was etwa 25 bis 30 Watt entspricht, und zu 20% Off. Die beschallte DNA wurde mit einem gleichen Volumen an 1 : 1 Phenol:Chloroform extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol präzipitiert durch Zugabe einer Lösung von 2,6 M Natriumacetat bei pH 5,4 in einer Menge, die gleich 1/10 des Volumens der DNA-Lösung ist (0,2 ml in diesem Beispiel) und von Ethanol in einer Menge, die gleich dem 2-2,5-fachen des Volumens der vereinigten DNA- und Natriumacetatlösung ist (4,4 bis 5,5 ml in diesem Beispiel), und Lagern der resultierenden Mischung in einem -20ºC Gefrierschrank über Nacht. Diese Mischung wurde dann bei 8000 xg für 10-15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und das DNA-Pellet in einem Zentrifugen-Evaporator getrocknet (Savant Instruments, Farmingdale, NY).
Die Aminierungsreaktion wurde durchgeführt durch Auflösen der gereinigten beschallten DNA in Wasser, um eine Konzentration von 4 mg DNA pro ml Wasser zu ergeben, und Verdünnen der DNA-Lösung 10- fach mit 9 Volumina der Ethylendiamin/Bisulfit-Lösung. Die Ethylendiamin/Bisulfit-Lösung wurde kurz vor der Umsetzung durch Zugabe von 4 ml Wasser, 7 ml konzentrierter HCl, 4 ml Ethylendiamin, 1,9 g NaHSO&sub3;, konzentrierter HCl bis zu einem von pH 7,0, und Wasser auf ein Endvolumen von 20 ml in dieser Reihenfolge hergestellt. Man ließ die Reaktion entweder bei 25,0 oder 37,0ºC zwischen 6 Stunden und 2 Tagen ablaufen, um den gewünschten Umfang an Aminierung zu erhalten. Nach dem Inkubationszeitraum wurde die Reaktionslösung nacheinander in drei 1-2 Liter Volumina 5 mM Natriumborat bei pH 8,0 dialysiert, und das dialysierte Produkt wurde mit Ethanol präzipitiert. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung verschiedener Reaktionsbedingungen wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V unten zusammengestellt.

Beispiel 2. Analyse von aminierter gesamter humaner genomischer DNA

Der Umfang der Transaminierung von Desoxycytidin (dC) wurde durch enzymatischen Verdau der aminierten DNA mit den Enzymen Desoxyribonuclease I (DNase I), Phosphodiesterase I (PDI) und alkalischer Phosphatase (Alk. Phos.), gefolgt von einer Auftrennung der resultierenden Nukleoside auf einem FPLC Chromotographie-System (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ) bestimmt. 5-10 ug aminierter DNA wurde mit Wasser auf 50 ul verdünnt und die DNA wurde über eine Zentrifugationssäule (spin column), die SephadexTM G-25 (5Prime 3Prime, Inc., Paoli, PA) enthält, gereinigt. Die DNA wurde danach getrocknet und 12,5 ul 2X DNase I Puffer (20mM TRIS, 10 mM MgCl&sub2;, pH 7,5), 12,0 ul Wasser und 0,5 ul DNase I (BRL, 2 mg/474 ul, > 10000 Einheiten/mg) zu der DNA zugegeben und die Lösung in einem 37ºC Wasserbad für 1 Stunde inkubiert. 50 ul des 2X PDI/Alk. Phos.-Puffers (100 mM TRIS, 200 mM NaCl, 28 mM MgCl&sub2;, 2 mM ZnCl&sub2;, pH 9,0), 1,0-5,0 Einheiten PDI (Pharmacia LKB, 1000 Einheiten aufgelöst in 1 ml 1X PDI/Alk. Phos.-Puffer), 5-10 Einheiten an Kälberdarm Alk. Phos. (Promega 1000-10000 Einheiten/ml) und Wasser bis zu einem Endvolumen von 100 ul wurden dann zugegeben, und die Lösung wurde für weitere 1-2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die verdaute Probe wurde entweder auf eine MinoRPC oder eine Pep S-Säule (Pharmacia, LKB) aufgetragen und ein linearer Gradient zwischen Puffer A (97,5 : 2,5 Ionen-paarender Puffer:Methanol, Ionen-paarender Puffer = 50 mM KH&sub2;PO&sub4;, 0,02 bis 0.05% Hexansulfonsäure, pH 7,0) und Puffer B (50 : 50 Ionen-paarender Puffer:Methanol) angelegt, um die Probe zu eluieren (0,8%-Anstieg in Puffer B/min bei einer Flußrate von 0,37 ml/min bis 40% Puffer B erreicht wurden, gefolgt von einem 3%-Anstieg in Puffer B/min auf 100% Puffer B bei einer Flußrate von 0,3 ml/min), während man das DNA-Elutionsprofil über die Absorption aufnimmt. Jedes der vier natürlichen Desoxynucleoside und das Transaminie rungsprodukt von Desoxycytidin wurden getrennt eluiert, und die Menge an transaminiertem Desoxycytidin wurde aus den relativen Flächen unter den Desoxycytidin- und transaminierten Desoxycytidin-Peaks in dem Elutionsprofil bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V unten für neun Herstellungen von aminierter gesamter humaner genomischer DNA aufgelistet. TABELLE V Transaminierungs-Reaktionsbedingungen und Modifikation von dC in Prozent
(a) Der Prozentsatz von den gesamten aminierten Nukleotiden ist 0,25 mal der %-aminierter dC, unter der Annahme, daß jedes der vier verschiedenen Nukleotide in gleichen Mengen vorhanden ist.
(b) N. D. bedeutet, daß die %-Aminierung aufgrund einer Verunreinigung, die mit den aminierten dC von der Pep S-Säule eluierte, nicht bestimmt wurde. Die %-Aminierung sollten zwischen drei und vier liegen, im Vergleich zu der humanen Plazenta-DNA und der Cosmidbibliotheks-DNA, die unter Verwendung der gleichen Reaktionsbedingungen aminiert wurden.

Beispiel 3. Herstellung von FITC-markierter humaner Plazenta-DNA.

Jeweils 40 ug der aminierten DNA-Herstellung Nr. 3 und Nr. 4 wurden in 235 ul eines Puffers, der aus 0,05 M Natriumborat mit einem pH 9,3 besteht, getrennt aufgelöst. Zu jeder von diesen wurden 15,2 ul 20mM FITC in Dimethylsulfoxid zugegeben, und die erhaltenen Lösungen wurden über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurden die Reaktionsprodukte mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde, präzipitiert. Die getrockneten Produkte wurden jeweils in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösungen wurden auf 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo- Säulen gegeben, die mit Sephadex G-25 befüllt sind, und mit Wasser eluiert. Die markierten Materialien, die mit den Säulen- Leervolumina eluieren, wurden gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu ergeben. Stammlösungen von der gereinigten markierten DNA wurden hergestellt, indem man die getrockneten Produkte in einem kleinen Wasservolumen auflöst.
Die DNA-Konzentration und der Grad der Markierung wurden wie folgt bestimmt: 10 ul einer markierten DNA-Stammlösung wurden auf 1 ml mit 10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan bei pH 8.0 verdünnt, und das Absorptionsspektrum dieser Lösung wurde gemessen, um die Absorption bei 260 nm, A&sub2;&sub6;&sub0;, und die Absorption bei dem langen Wellenlängenabsorptionsmaximum der Markierung, Amax, Markie rung, zu liefern. Die Konzentration der Markierung wurde berechnet, indem man Amax,Markierung durch den Extinktionskoeffizienten der Markierung bei dem langen Wellenlängenabsorptionsmaximum, aufgelistet in dem Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Autor Richard Haugland, Molecular Probes, Inc., 1989), dividiert. Die Nukleotidkonzentration wurde berechnet, indem man A&sub2;&sub6;&sub0; durch den durchschnittlichen Nukleotid- Extinktioskoeffizienten bei 10000 M-¹ cm-¹ bei 260 nm dividiert, nachdem der Beitrag zur Absorption bei 260 nm aufgrund der Markierung alleine, A&sub2;&sub6;&sub0;,Markierung, von A&sub2;&sub6;&sub0; subtrahiert wurde. A&sub2;&sub6;&sub0;,Markierung wurde abgeschätzt, indem man A&sub2;&sub6;&sub0;,Markierung/Amax, Markierung für eine Lösung mit einer reinen, nichtkonjungierten Markierung bestimmt und diesen Wert mit Amax, Markierung, der für die Lösung der markierten Nukleotide gemessen wurde, multipliziert. Der Anteil an markierten Nukleotiden wird berechnet, indem man die Markierungskonzentration durch die Nukleotidkonzentration dividiert. Die DNA- Konzentration in ug/ml wird berechnet aus der molaren Konzentration der Nukleotide unter Verwendung eines durchschnittlichen Nukleotidmolekulargewichtes von 350 Dalton.

Beispiel 4. Herstellung von CTMR-markierter humaner Plazenta-DNA

4.1 Jeweils 40 ug aminierter humaner Plazenta-DNA-Zubereitung #2 und aminierter Cot-1-DNA-Zubereitung #6 wurden in 370 ul Puffer, der aus 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 besteht, getrennt aufgelöst. Zu jeder von diesen wurden 30,3 ul 30mN CTMR in Dimethylformamid zugegeben, und die Lösungen wurden über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde, präzipitiert. Die getrockneten Produkte wurden jeweils in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösungen auf 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo-Säulen, die mit Sephadex G-25 befüllt sind, gegeben und mit Wasser eluiert. Die markierten Materialien, die mit den Säulenleervolumina eluieren, wurden gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Stammlösungen der gereinigten markierten DNA wurden hergestellt, indem man jedes der getrockneten Produkte in einem kleinen Wasservolumen auflöst. Die DNA-Konzentration und der Grad der Markierung wurden bestimmt, wie dies im Beispiel 3 beschrieben ist.
4.2 In einem weiteren Verfahren wurden 100 ug aminierter humaner Plazenta-DNA-Zubereitung #4 mit CTMR markiert, indem man die DNA in 888 ul 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 auflöst und 114 ul 20 mM CTMR in Dimethylformamid zugibt. Die Reaktionen und Reinigungen wurden durchgeführt, wie dies für die anderen CTMR-Reaktionen beschrieben wurde.
4.3 In weiteren Verfahren wurden 50 ug aminierter Cot-1-DNA- Zubereitung #5, #6 und #7, aminierte humane Plazenta-DNA- Zubereitung #1 und aminierte Cosmidbibliothek-DNA-Zubereitungen #8 und #9 mit CTMR markiert, indem man diese jeweils in 444 ul 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 getrennt auflöst und 57 ul 20 mM CTMR in Dimethylformamid zugibt. Die Reaktionen und Reinigungen wurden durchgeführt, wie dies für die anderen CTMR-Reaktionen beschrieben ist. 100 ug aminierter humaner Plazenta-DNA-Zubereitung #4 wurden durch eine Reaktion in 888 ul 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 und 111 ul 20 mM CTMR in Dimethylformamid ähnlich markiert.

Beispiel 5. Herstellung von Tx Rd-markierter humaner Plazenta-DNA

100 ug aminierter humaner Plazenta-DNA-Zubereitung #4 wurden in 888 ul-Puffer, der aus 50 mM Natriumborat pH 9,3 besteht, aufgelöst. Zu diesem wurden 114 ul 20 mM Tx Rd in Dimethylformamid zu gegeben, und die Lösung wurde über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Die getrocknete DNA wurde in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösung wurde auf eine 1 cm I. D, · 30 cm hohe Econo-Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material. das mit dem Leervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut in Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Eine Stammlösung der gereinigten markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöste. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 6. Herstellung von DECCA-markierter humaner Plazenta-DNA

50 ug aminierter humaner Plazenta-DNA-Zubereitung #2 wurden in 444 ul Puffer, der aus 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 besteht, aufgelöst. Zu diesem wurden 57 ul 20 mM DECCA in Dimethylformamid zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösung auf eine 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo- Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Eine Stammlösung der gereinigten markierten DNA wurde hergestellt, indem man die getrockneten Produkte in einem kleinen Wasservolumen auflöst. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 7. Herstellung von AMCA-markierter humaner Plazenta-DNA

50 ug aminierter humaner Plazenta-DNA-Zubereitung #2 wurden in 444 ul Puffer, der aus 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 besteht, aufgelöst. Zu diesem wurden 57 ul 20 mM AMCA in Dimethylsulfoxid gegeben, und die Lösung wurde über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösung auf eine 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo- Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Eine Stammlösung der gereinigten markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöst. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 8. Herstellung einer FITC-markierten Farbsonde aus dem vollständigen Chromosom #4

DNA, die für das vollständige Chromosom #4 spezifisch ist, wurde erhalten, gereinigt und beschallt, um DNA-Fragmente mit einer Durchschnittslänge von 300 bp zu ergeben. Die fragmentierte DNA wurde aminiert gemäß Beispiel 1 der vorliegenden Anmeldung unter Verwendung der fragmentierten Chromosom-#4-DNA anstelle der humanen gesamten genomischen DNA, und man ließ die Reaktion für 15 Stunden bei 25ºC ablaufen, um DNA mit etwa 4 Molprozent an transaminierten Desoxycytidin-Nukleotiden davon zu erhalten. Nach der Dialyse, Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation wurden 40 ug der transaminierten DNA in 244 ul 50 mM Natriumborat pH 9,3 aufgelöst und 6,1 ul 50 mM FITC in Dimethylsulfoxid zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösung auf eine 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo-Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Eine Stammlösung der gereinigten markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöste. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies in Beispiel 3 (oben) beschrieben ist.

Beispiel 9. Herstellung von TxRd-markierter Farbsonde aus dem vollständigen Chromosom #4

DNA, die für das vollständige Chromosom #4 (durchschnittliche Fragmentlänge von 300 bp) spezifisch ist, wurde hergestellt und aminiert gemäß dem obigen Beispiel 8, um DNA mit 4,6 Molprozent an transaminierten Desoxycytidinen zu erhalten. Nach der Dialyse und Ethanolpräzipitation wurden 40 ug von dieser DNA in 270 ul 50 mM Natriumborat pH 9,3 aufgelöst und 30 ul 30 mM Tx Rd in Dimethylformamid zugegeben. Die resultierenden Lösungen wurden über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies im obigen Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösung auf eine 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo-Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Eine Stammlösung der gereinigten, markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöste. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 10. Herstellung von CTMR-markierter Sonden- Zusammensetzung, welche für das Zentromer des humanen Chromosoms # 8 spezifisch ist.

Transaminierte DNA, die für das Zentromer das Chromosoms #8 spezifisch ist, bezeichnet als # 10-4 (durchschnittliche Fragmentlänge von 300 bp, 14 Molprozent der Desoxycytidine sind transaminiert), wurde erhalten, wie dies bei Bittner et al., anhängige Anmeldung, US-Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 07/762,912, eingereicht an demselben Tag hiermit, veröffentlicht als US-A-550 6350 bzw. Wo-A-93/06246. 40 ug dieser DNA wurden in 362 ul 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 aufgelöst und 38 ul 30 mM CTMR in Dimethylformamid zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde das DNA-Produkt mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösung auf eine 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo-Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Eine Stammlösung der gereinigten markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöste. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies im Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 11. Herstellung einer CTMR-markierten Farbsonde aus dem vollständigen Chromosom #8

DNA, die für das vollständige Chromosom #8 (durchschnittliche Fragmentlänge von 300 bp) spezifisch ist, wurde hergestellt und transaminiert gemäß dem obigen Beispiel 8, um DNA mit etwa 4 Molprozent an transaminierten Desoxycytidinen zu ergeben. Nach der Dialyse und Ethanolpräzipitation wurden 750 ug von der DNA in 6,66 ml 0,2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 aufgelöst, 852 ul 20 mM CTMR in Dimethylformamid zugegeben, und die Lösung über Nacht (annähernd 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 2 ml Wasser aufgelöst und die Lösung auf eine 1,5 cm I. D. · 48 cm hohe Econo- Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu ergeben. Eine Stammlösung der gereinigten markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöste. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies im Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 12. Herstellung von vollständigem Chromosom #7 CTMRmarkierter Farbe

DNA, die für das vollständige Chromosom #7 (durchschnittliche Fragmentlänge von 300 bp) spezifisch ist, wurde hergestellt und aminiert gemäß dem obigen Beispiel 8, mit der Ausnahme, daß die Reaktionszeit auf 48 Stunden verlängert wurde, um DNA mit etwa 12 Molprozent an transaminierten Desoxycytidinen zu erhalten. Nach der Dialyse und Ethanolpräzipitation wurden 1 mg der DNA in 8,88 ml 0.2 M 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 aufgelöst, 1,14 ml 20 mM CTMR in Dimethylformamid wurden zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht (etwa 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 2 ml Wasser aufgelöst und die Lösung wurde auf eine 2,5 cm I. D. · 48 cm hohe Econo-Säule, die mit Sepahdex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu ergeben. Eine Stammlösung der gereinigten markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöste. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies im obigen Beispiel 3 beschrieben ist.

Beispiel 13. Herstellung von Biotin-markierter Farbsonde aus vollständigem Chromosom #4

DNA, die für das vollständige Chromosom #4 spezifisch ist, wurde erhalten, gereinigt und beschallt, um DNA-Fragmente mit einer durchschnittlichen Länge von 300 bp zu erhalten. Die DNA wurde gemäß dem Beispiel 2 der gleichen anhängigen Anmeldung unter Verwendung einer Reaktionszeit von 48 Stunden und einer Reaktionszeit von 37ºC transaminiert, um DNA mit etwa 20% an transaminierten Desoxycytidinen zu erhalten. Nach der Dialyse und Ethanolpräzipitation wurde die aminierte DNA in 0,2 M 3-[N- Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 aufgelöst und ein 100-facher molarer Überschuß an NHS-LC-Biotin (Succinimidylester; Pierce Kat. # 21335) zugegeben. Der Überschuß wurde relativ zur Anzahl der aminierten Desoxycytidine bestimmt, und das NHS-LC-Biotin wurde zunächst mit 0,2 M in DMSO aufgelöst, bevor man es zu der DNA-Lösung zugab. Man ließ die Reaktion über Nacht (annähernd 18 Stunden) bei Zimmertemperatur ablaufen. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol dreimal präzipitiert, um die gereinigte biotinylierte Sonde zu ergeben.

Beispiel 14. Herstellung von HCCA-markierter humaner Plazenta-DNA

50 ug transaminierter DNA-Zubereitung #2 (12% transaminierter dC) wurden in 444 ul Puffer, der aus 0,2 M 3- [Morpholino]propansulfonsäure pH 7,4 besteht, aufgelöst, zu diesem wurden 57 ul 20 mM HCCA in Dimethylformamid zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht (etwa 18 Stunden) im Dunkeln bei Zimmertemperatur kontinuierlich invertiert. Nach der Reaktion wurde die DNA mit Ethanol auf die gleiche Weise, wie dies im Beispiel 1 beschrieben ist, präzipitiert. Das getrocknete Produkt wurde in 300 ul Wasser aufgelöst und die Lösung auf eine 1 cm I. D. · 30 cm hohe Econo-Säule, die mit Sephadex G-25 befüllt ist, gegeben und mit Wasser eluiert. Das markierte Material, das mit dem Säulenleervolumen eluiert, wurde gesammelt und erneut mit Ethanol präzipitiert, um die gereinigte markierte DNA zu liefern. Eine Stammlösung der gereinigten, markierten DNA wurde hergestellt, indem man das getrocknete Produkt in einem kleinen Wasservolumen auflöste. Die DNA-Konzentration und der Markierungsgrad wurden bestimmt, wie dies oben im Beispiel 3 beschrieben ist.
Die Tabelle VI unten stellt die Molprozent an Fluorophoren bezogen auf die gesamten Nukleotide in den Sonden-Zusammensetzungen, die oben hergestellt wurden, zusammen: TABELLE VI Prozentsatz der Markierung von Nukleotiden mit Fluophoren

Beispiel 15. In situ-Hybridisierungen

Jede der Sonden-Zusammensetzungen aus den Beispielen 3 bis 7 wurde hinsichtlich der Gegenfärbungsfähigkeit bei der in situ- Hybridisierung bewertet. Die Target-DNA bestand aus kultivierten normalen humanen weißen Blutzellen, die behandelt wurden, um die Zellen in der Metaphase anzuhalten. Man ließ diese Zellen jeweils auf mehrere Mikroskop-Objektträger aus Glas aus etwa drei Fuß tropfen, um die Kerne aufzubrechen.
Man ließ die Objektträger dann an der Luft trocknen, und diese wurden dann bei Zimmertemperatur gelagert. Die entsprechenden Reagenzien und ein Verfahren zum Durchführen des Kultivierens und der Objektträgerpräparation ist in dem TC Chromosome Culture Kit (DIFCO Laboratories, Detroit, MI) enthalten.

(a) Genom-Gegenfärbung

Jede der Sonden-Zusammensetzungen aus den Beispielen 3 bis 7 und Beispiel 14 wurden hinsichtlich der Genomgegenfärbungsfähigkeit unter Verwendung des folgenden Verfahrens bewertet:
Unter Verwendung von Glas-Objektträgern mit Probenschichten, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurde kurz vor der Hybridisierung jeder Objektträger denaturiert, indem man den Objektträger für 3 bis 10 Minuten in einer 70ºC wässrigen Denaturierungslösung, die 70% Formamid und 2 X SCC pH 7,0 enthält, anordnet. Der Objektträger wurde dann entwässert, indem man den Objektträger nacheinander in 70%, 85% und 100% Ethanolbäder eintaucht, wobei man den Objektträger in jedem Bad für 2 Minuten beläßt, und den Objektträger an der Luft trocknen läßt.
Das gewünschte Volumen an Stammlösung der markierten gesamten genomischen Sonden-DNA, (die typischerweise 25 bis 600 ug Sonde enthält) wurde mit einer Pipette in ein kleines Plastikröhrchen überführt, und die Sonde wurde in einem Zentrifugen-Evaporator getrocknet (das Trocknen konnte weggelassen werden, wenn das Volumen 3 ul oder weniger betrug). Zu der Sonde wurden zugegeben 7,0 ul einer Lösung, die in 71,4% (v/v) Formamid, 14,3% (w/v) Dextransulfat, 2,86 X SSC pH 7,0 enthält, nichtmarkierte Cot-1 oder humane Plazenta-DNA in 3 ul oder weniger, wenn es gewünscht ist, und Wasser bis auf ein Endvolumen von 10 ul (Endkonzentrationen: 50% Formamid, 10% -Dextransulfat, 2 X SSC). Das Röhrchen, das die Lösung enthält, wurde dann in einem 70ºC-Wasserbad für 3-10 Minuten zur Denaturierung angeordnet und dann die 10 ul der Hybridisierungslösung direkt auf den denaturierten Objektträger gegeben. Dieser resultierende Objektträger wurde dann mit einem Deckblättchen abgedeckt und der Objektträger in einer Feuchtkammer bei 37ºC über Nacht angeordnet. Um die Verdampfung oder die Aufnahme von Feuchtigkeit zu verhindern, wurden die Kanten des Deckblättchen zu dem Objektträger unter Verwendung von Kautschukkit routinemäßig abgedichtet, bevor man den Objektträger in der Feuchtkammer anordnete.
Am nächsten Tag wurde das Deckblättchen abgenommen und der Objektträger unter Verwendung von zwei Verfahren gewaschen. Bei dem Waschverfahren #1 wurde der Objektträger in eine Reihe von wässrigen Bädern eingetaucht wie folgt: Jeweils 15 Minuten in die Bäder 1-3, die 50% Formamid und 2 X SSC pH 7 enthalten bei 45ºC, 15 Minuten in Bad 4, das 2 X SSC pH 7 enthält bei 45ºC, 15 Minuten in Bad 5, das 0.1 M Natriumphosphat pH 7,0 und 0,1% (v/v) NP-40 enthält bei 45ºC, und jeweils 2 Minuten in den Bädern 6 und 7, die 0.1 M Natriumphosphat pH 7,0 und 0,1% NP-40 enthalten, bei Zimmertemperatur. Bei dem Waschverfahren #2 wurde der Objektträger in einer Reihe von wässrigen Bädern eingetaucht wie folgt: Jeweils 10 Minuten in die Bäder 1-3, die 50% Formamid und 2 X SSC pH 7 enthalten bei 45ºC, 10 Minuten in Bad 4, das 2 X SSC pH 7 enthält bei 45ºC, und 5 Minuten in Bad 5, das 0,1 M Natriump hosphat pH 7,0 und 0,1% (v/v) NP-40 enthält bei 45ºC. Nach dem Waschen läßt man den Objektträger abtropfen und an der Luft trocknen. 7,5 ul einer Antiausbleichlösung (siehe unten) wurden direkt auf den Objektträger aufgebracht und ein Deckblättchen wurde auf dem Tropfen der Antiausbleichlösung angeordnet. Ein chemisches Gegenfärbemittel könnte auf die Probe aufgebracht werden, indem man 0.2 ug Popidiumjodid/ml oder 1.0 ug 4,6-Diamidino- 2-phenylindol-Hydrochlorid (DAPI)/ml Ausbleichlösung zugibt. Der Objektträger könnte dann gleich untersucht werden oder bei -20ºC unter Stickstoff oder Argon gelagert werden (wahlweise könnten die Objektträger bei Zimmertemperatur an der Luft im Dunkeln für Zeiträume von mehreren Tagen aufbewahrt werden). Die Antiausbleichlösung wurde gemäß J. Immuno. Methods 43, 349 (1981) hergestellt wie folgt: 100 Milligramm p-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurden in 10 ml Phosphatgepufferter Salzlösung aufgelöst. Der pH dieser Lösung wurde auf pH 8 mit einer Bicarbonat-Pufferlösung eingestellt, die durch Zugabe von 0,42 g NaHCO&sub3; auf 10 Milliliter Wasser und Einstellen des pH auf 9,0 durch die Zugabe von 50% (w/v) NaOH hergestellt wurde. Die pH-eingestellte Lösung von p-Phenylendiamin- Dihydrochlorid wurde zu 90 ml Glyzerin zugegeben, und die resultierende Lösung wurde durch eine 0,22 um Filtrationseinheit filtriert. Diese Lösung wurde im Dunkeln bei -20ºC gelagert.
Die Proben, die durch die gesamten genomischen DNA-Sonden gefärbt wurden, wurden auch mit einer der chemischen Gegenfärbemittel DA- PI oder PI gefärbt, und die Vollständigkeit der Färbung der gesamten genomischen DNA-Sonden und der chemischen Gegenfärbungen wurden bei den gleichen Metaphasenverteilungen verglichen. Sowohl von den gesamten genomischen DNA-Sonden als auch von den chemischen Gegenfärbemitteln fand man, daß diese das gleiche Material färben.
Die Ergebnisse sind unten in Tabelle VII zusammengefaßt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Sonden-Zusammensetzungen gemäß den Beispielen 3 bis Beispiel 14 zu einer vollständigen Gegenfärbung von sämtlichen Chromosomen, die in den einzelnen bewerteten Objektträgerproben vorhanden sind, führen.

(b) Genomgegenfärbung gleichzeitig mit einer Chromosomspezifischen Farbsonde

Die Fluorophor-markierte humane Plazenta-DNA und Fluorophormarkiertne Chromosomspezifischen Farbsonden wurden gleichzeitig bei in situ-Hybridisierungen verwendet, um ein Färben eines spezifischen Chromosomenpaares in einer Fluoreszenzfarbe und eine Gegenfärbung von sämtlichen Chromosomen in einer zweiten Farbe zu erhalten, gemäß dem folgenden Verfahren:
Unter Verwendung von Glasobjektträgern mit anhaftender Probe wurden die Proben denaturiert und entwässert kurz vor der Hybridisierung, wie es oben beschrieben ist. Das gewünschte Volumen an markierter humaner Plazenta-DNA-Stammlösung (die typischerweise 50 bis 640 ng Sonde enthält) wurde mit einer Pipette in ein kleines Plastikröhrchen zusammen mit dem gewünschten Volumen der markierten vollständigen Chromosomfarbsonde (die typischerweise 100 bis 640 ng Sonde enthält) überführt, und die Sonde wurde in einem Zentrifugen-Evaporator getrocknet. Zu der Sonde wurden 7,0 ul einer Lösung, die 71,4% (v/v) Formamid, 14,3% (w/v) Dextransulfat und 2,86 X SSC pH 7,0 enthält, ein Mikroliter an blockierender DNA, die, wenn sie verwendet wird, nichtmarkierte Cot-1-DNA (Stammkonzentration = 1 ug/lu1) umfaßt, und Wasser bis auf ein Endvolumen von 10 ul (Endkonzentrationen: 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 2 X SSC). Das Röhrchen, das die Lösung enthält, wurde dann in einem 70ºC-Wasserbad für 3-10 Minuten angeordnet, und dann wurden 10 ul der Hybridisierungslösung direkt auf den denaturierten Objektträger aufgebracht. Der Objektträger wurde dann wie oben in Teil (a) behandelt, um 1) über Nacht zu hybridisieren, 2) die nichthybridisierte Sonde durch Waschen abzutrennen, und 3) Anordnen des Objektträgers zur Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Die Tabellen VII bis X unten zeigen die Details der Hybridisierungsteste durch in situ-Hybridisierung und liefern eine Beschreibung für die Leistungsfähigkeit der humanen Plazenta- Gegenfärbungs-Sonden-Zusammensetzung. Es wurde für sämtliche Bedingungen gezeigt, daß das Chromosom, das von der Chromosomfarbsonde getroffen wurde, mit einer Fluoreszenzfärbe spezifisch und deutlich gefärbt wurde, die von der der Gegenfärbung verschieden ist. Diese Ergebnisse zeigen, daß die fluoreszierende humane Plazenta-DNA-Sonde eine visuell deutliche und vollständige Färbung sämtlicher Chromosomen bewirkt und nicht mit der Hybridisierung von fluoreszierenden Chromosomfarbsonden interferiert, wenn die zwei Sonden-Zusammensetzungen bei einer in situ- Hybridisierung gleichzeitig vorliegen. TABELLE VII Fluorophor-markierte genomische Sondengegenfärbung TABELLE VIII CTMR-humanes Plazenta-DNA Gegenfärbemittel verwendet mit einer FITC-markierten vollständigen Chromosom #4 Farbsonde. (Es wurde keine zusätzliche blockierende DNA verwendet).

Tabelle VIII Fußnoten:

(1) H. P. bedeutet humane Plazenta-DNA-Segmente
(2) C4 bedeutet humane Chromosom # 4 DNA-Segmente.
(3) Code für die visuelle Beschreibung, der in den folgenden Fußnoten (4) und (5) erläutert ist.
(4) Vollständigkeit - (-) ungleichmäßige Gegenfärbung, (+) gleichmäßige Gegenfärbung, aber sehr ungleichmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel, (++) gleichmäßige Abdeckung der Chromosomen, wobei einige Bereiche der Chromosomen beträchtlich heller gefärbt sind als andere Bereiche, (+++) gleichmäßige und regelmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel.
(5) Intensität - (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell. TABELLE IX FITC-humanes Plazenta-DNA-Gegenfärbemittel verwendet mit Texas- Rot-markierter vollständiger Chromosom # 4-Farbsonde (es wurde keine zusätzliche blockierende DNA verwendet).

Tabelle VIII Fußnoten:

(1) Der Code für die visuelle Beschreibung ist in den folgenden Fußnoten (2) und (3) erläutert.
(2) Vollständigkeit - (-) ungleichmäßige Gegenfärbung, (+) gleichmäßige Gegenfärbung, aber sehr ungleichmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel, (++) gleichmäßige Abdeckung der Chromosomen, wobei einige Bereiche der Chromosomen beträchtlich heller gefärbt sind als andere Bereiche, (+++) gleichmäßige und regelmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel.
(3) Intensität - (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.e
(4) H. P. bedeutet humane Plazenta-DNA-Segmente
(5) C4 bedeutet humane Chromosom # 4 DNA-Segmente. TABELLE X DECCA-Humanes Plazenta-DNA-Gegenfärbemittel verwendet mit einer CTMR-markierten vollständigen Chromosom #8-Farbsonde. (1 ug an Cot-1 blockierender DNA wurde jeweils in den 10 ul des Gegenfärbemittels verwendet)

Tabelle X Fußnoten:

(1) Der Code für die visuelle Beschreibung ist in den folgenden Fußnoten (2) und (3) erläutert.
(2) Vollständigkeit - (-) ungleichmäßige Gegenfärbung, (+) gleichmäßige Gegenfärbung, aber sehr ungleichmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel, (++) gleichmäßige Abdeckung der Chromosomen, wobei einige Bereiche der Chromosomen beträchtlich heller gefärbt sind als andere Bereiche, (+++) gleichmäßige und regelmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel.
(3) Intensität - (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.e
(4) H. P. bedeutet humane Plazenta-DNA-Segmente
(5) C4 bedeutet humane Chromosom # 8 DNA-Segmente.

(c) Genom Gegenfärbung gleichzeitig mit einer Chromosomenzentromer-spezifischen Sonde

Fluorophor-markierte humane Plazenta-DNA und Fluorophor-markierte Zentromer-spezifische Sonden wurden gleichzeitig bei in situ- Hybridisierungen verwendet, um ein Färben eines spezifischen Paares von Chromosomenzentromeren in einer Fluoreszenzfarbe und Gegenfärbung sämtlicher Chromosomen in einer zweiten Farbe zu erhalten gemäß dem folgenden Verfahren:
Unter Verwendung von Glasobjektträgern mit anhaftenden Proben wurden die Proben kurz vor der Hybridisierung denaturiert und entwässert, wie oben beschrieben. Das gewünschte Volumen einer 0,30% FITC-Zubereitung #4-Stammlösung wurde mit einer Pipette in ein kleines Platikröhrchen zusammen mit dem gewünschten Volumen einer 3% CTMR-Chromosom #8-Zentromer-spezifischen Sondenstammlösung überführt, und die Sonde wurde in einem Zentrifugen- Evaporator getrocknet. Zu der Sonde wurden 7,0 ul einer Lösung, die 78,6% (v/v) Formamid, 14,3% (w/v) Dextransulfat, 2,86 X SSC pH 7,0 enthält, 2-4 ug an nichtmarkierter beschallter humaner Plazenta-DNA, um als blockierende DNA zu dienen, und Wasser bis zu einem Endvolumen von 10 ul (Endkonzentrationen: 55% Formamid, 10% Dextransulfat, 2 X SSC) zugegeben. Das Röhrchen, das die Lösung enthält, wurde dann in einem 70ºC-Wasserbad für etwa 3 bis 10 Minuten angeordnet, und dann wurden die 10 ul Hybridisierungslösung direkt auf den denaturierten Objektträger aufgebracht. Dieser Objektträger wurde dann wie oben in Teil (a) behandelt um, 1) über Nacht zu hybridisieren, 2) die hybridisierte Sonde durch Waschen (Waschverfahren 1) abzutrennen, und 3) den Objektträger zur Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop anzuordnen, mit der einen Ausnahme, daß die Übernachthybridisierung bei 42ºC anstatt bei 37ºC durchgeführt wurde.
Tabelle XI unten zeigt die Details der Hybridisierungsteste bei der in situ-Hybridisierung zusammen mit einer Beschreibung der Leistungsfähigkeit des humanen Plazenta-Gegenfärbemittels. Bei sämtlichen der gezeigten Bedingungen wurde das Chromosom #8- Zentromer spezifisch und deutlich mit einer orangen Fluoreszenz, die von der grünen Fluoreszenz der Gegenfärbung verschieden ist, angefärbt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die fluoreszierenden humanen Plazenta-DNA-Sonden ein visuell deutliches und vollständiges Anfärben sämtlicher Chromosomen bewirken und nicht mit der Hybridisierung von fluoreszierenden Chromosomenzentromer-spezifischen Sonden interferieren, wenn die zwei Sonden- Zusammensetzungen gleichzeitig bei einer in situ-Hybridisierung vorhanden sind.
TABELLE XI
FITC-humanes Plazenta-Gegenfärbemittel verwendet mit CTMR- markierter Chromosomen #8-Zentromer-spezifischer Sonde

Tabelle XI Fußnoten:

(1) Der Code für die visuelle Beschreibung ist in den folgenden Fußnoten (2) und (3) erläutert.
(2) Vollständigkeit - (-) ungleichmäßige Gegenfärbung, (+) gleichmäßige Gegenfärbung, aber sehr ungleichmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel, (++) gleichmäßige Abdeckung der Chromosomen, wobei einige Bereiche der Chromosomen beträchtlich heller gefärbt sind als andere Bereiche, (+++) gleichmäßige und regelmäßige Abdeckung der Chromosomen mit dem Gegenfärbemittel.
(3) Intensität - (-) nicht sichtbar, (+) kaum sichtbar, (++) ziemlich sichtbar, (+++) hell, (++++) sehr hell.e
(4) H. P. bedeutet humane Plazenta-DNA-Segmente
(5) Cen #8 bedeutet DNA-Segmente, die nur zu dem humanem Chromosom #8-Zentromer komplementär sind.
(d) Aufeinanderfolgende Anfärbung: In situ-Hybridisierung mit markierter humaner Plazenta-DNA gefolgt von einer in situ- Hybridisierung mit markierter Chromosom-Farbsonde.
FITC-markierte humane Plazenta-DNA und CTMR-markierte Chromosom- Farbsonden wurden nacheinander verwendet bei in situ- Hybridisierungen, um eine Anfärbung eines spezifischen Chromosomenpaares in einer Fluoreszenzfarbe und Gegenfärbung sämtlicher Chromosomen in einer zweiten Farbe zu erreichen, gemäß dem folgenden Verfahren:
Unter Verwendung von Glasobjektträgern mit anhaftenden Proben des humanen Genoms wurden die Proben kurz vor der Hybridisierung denaturiert und entwässert, wie oben beschrieben. 2,23 ul einer 0,29% FITC-Zubereitung #4-Stammlösung (600 ng-Sonde) wurden mit einer Pipette in ein kleines Plastikröhrchen überführt und die Sonden-Zusammensetzung in einem Zentrifugen-Evaporator getrocknet. Zu der Sonde wurden 7,0 ul einer Lösung, die 71,4% (v/v) Formamid, 14,3% (w/v) Dextransulfat, und 2,86 X SSC pH 7,0 enthält, und Wasser bis auf ein Endvolumen von 10 ul zugegeben (Endkonzentrationen: 50% Formamid, 10% Dextransulfat und 2 X SSC). Das Röhrchen, das die Lösung enthält, wurde dann in einem 70ºC-Wasserbad = für 5 Minuten angeordnet, und die 10 ul Hybridisierungslösung wurden direkt auf den denaturierten Objektträger aufgebracht. Der Objektträger wurde dann wie oben in Teil (a) behandelt, um 1) über Nacht zu hybridisieren, 2) die nichthybridisierte Sonde durch Waschen (Waschverfahren 2) abzutrennen, und 3) den Objektträger zur Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop anzuordnen.
Nach dem Untersuchen der angefärbten Probe wurde die Probe für die zweite Hybridisierung präpariert durch Abnehmen des Deckplättchens und Waschen des Objektträgers für 30 Minuten in einem wässrigen Bad, das 2 X SSC und 0,1% NP40 pH 7,0 enthält, bei Zimmertemperatur, um das Auftragmedium zu entfernen. Man ließ den Objektträger dann abtropfen und an der Luft trocknen. 3,33 ul einer 2,0% Stammlösung von CTMR-vollständiger Chromosom #8 Farbsonden-Zusammensetzung, die wie oben beschrieben (100 ng) hergestellt wurde, wurden mit einer Pipette in ein kleines Plastikröhrchen überführt, und die Sonden-Zusammensetzung wurde in einem Zentrifugen-Evaporator getrocknet. Zu der Sonden- Zusammensetzung wurden 7,0 ul einer Lösung, die 71,4 (v/v) Formamid, 14,3% (w/v) Dextransulfat, 2,86 X SSC pH 7,0 enthält, 1 ul Cot-1-DNA (1 ug Cot-1-DNA/ul Stammlösung) zum Blockieren von DNA, und Wasser bis auf ein Endvolumen von 10 ul zugegeben (Endkonzentrationen: 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 2 X SSC). Das Röhrchen, das die Lösung enthält, wurde dann in einem 70ºC- Wasserbad für 5 Minuten angeordnet, und die 10 ul Hybridisierungslösung wurden direkt auf den Objektträger aufgebracht. Der Objektträger wurde dann wie oben in Teil (a) behandelt, um 1) über Nacht zu hybridisieren, 2) die nichthybridisiere Sonde durch Waschen (Waschverfahren 2) abzutrennen, und 3)den Objektträger für die Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop anzuordnen.
Nach der ersten Hybridisierung zeigte die Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop eine gleichmäßige FITC-Anfärbung (grüne Fluoreszenz) von sämtlichen Chromosomen mit guter Intensität. Nach der zweiten Hybridisierung war die Intensität der FITC- Anfärbung etwas verringert, war aber noch gleichmäßig und leicht wahrnehmbar. Des weiteren wurde eine helle und spezifische CTMR- Anfärbung (orange Fluoreszenz) eines einzelnen Chromosomenpaares beobachtet. Die Gegenfärbungs-Sonden-Zusammensetzung färbt somit vollständig genomische DNA in einem solchen aufeinanderfolgenden Färbeverfahren unter Verwendung von zwei verschiedenen Sonden- Zusammensetzungen bei der gleichen Probe.
(e) Aufeinanderfolgende DNA-Anfärbung: In-sitz Hybridisierung mit markierter Chromosom-Farbsonden-Zusammensetzung gefolgt von einer in situ-Hybridisierung mit markierter humaner Plazenta-DNA.
CTMR-markierte Chromosom-Färbungssonden und DECCA-markierte humane Plazenta-DNA wurden nacheinander bei Hybridisierungen verwendet, um ein Anfärben eines spezifischen Chromosomenpaares in einer fluoreszierenden Farbe und Gegenfärbung sämtlicher Chromosomen in einer zweiten Farbe zu bewirken, gemäß dem folgenden Verfahren:
Unter Verwendung von Glasobjektträgern mit anhaftenden Proben wurden die Proben vor der Hybridisierung denaturiert und entwässert, wie oben beschrieben. 3,33 ul einer 3,0% Stammlösung einer CTMR vollständiges Chromosom #7-Sonden-Zusammensetzung, die wie oben beschrieben (100 ng Sonde) hergestellt wurde, wurde mit einer Pipette in ein kleines Plastikröhrchen überführt und die Sonden-Zusammensetzung wurde in einem Zentrifugen-Evaporator getrocknet. Zu der getrockneten Sonden-Zusammensetzung wurden 7,0 ul einer Lösung, die 71,4% (v/v) Formamid, 14,3% (w/v) Dextransulfat und 2,86 X SSC pH 7,0 enthält, 1 ul Cot-1-DNA (1 ug Cot-1- DNA/1 ul-Stammlösung) zum Blockieren von DNA, und Wasser bis auf ein Endvolumen von 10 ul zugegeben (Endkonzentrationen: 50% Formamid, 10% Dextransulfat, 2 X SSC). Diese 10 ul Hybridisierungslösung wurden direkt auf den denaturierten Objektträgern aufgebracht, und der Objektträger wurde wie oben im Teil (a) behandelt, um 1) über Nacht zu hybridisieren, 2) nichthybridisierte Sonde durch Waschen (Waschverfahren 2) abzutrennen, und 3) den Objektträger zur Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop anzuordnen.
Nach dem Untersuchen der gefärbten Probe wurde die Probe für die zweite Hybridisierung präpariert durch Abnehmen des Deckplätt chens und waschen des Objektträgers für 30 Minuten in einem Bad, das 2 X SSC und 0,1% NP40 pH 7,0 enthält, bei Zimmertemperatur, um das Auftragsmedium zu entfernen. Der Objektträger wurde dann trockengelegt und an der Luft getrocknet. 2,68 ul einer 0,95% Stammlösung der DECCA-Zubereitung #2 (300 ng Sonde) wurde mit einer Pipette in ein kleines Plastikröhrchen überführt und die Sonde in einem Zentrifugen-Evaporator getrocknet. Zu der Sonde wurden 7,0 ul einer Lösung, die 71,4% (v/v) Formamid, 14,3% (w/v) Dextransulfat und 2,86 X SSC pH 7,0 enthält, und Wasser bis auf ein Endvolumen von 10 ul zugegeben (Endkonzentrationen: 50% Formamid, 10% Dextransulfat und 2 X SSC). Das Röhrchen, das die Lösung enthält, wurde dann in einem 70ºC-Wasserbad für 5 Minuten angeordnet, und die 10 ul-Hybridisierungslösung wurden direkt auf den Objektträger aufgebracht. Der Objektträger wurde dann wie in Teil behandelt a), um 1) über Nacht zu hybridisieren, 2) die nichthybridisierte Sonde durch Waschen (Waschverfahren 2) abzutrennen, und 3) den Objektträger für die Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop anzuordnen.
Nach der ersten Hybridisierung zeigte die Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop eine helle und spezifische CTMR-Anfärbung (orange Fluoreszenz) eines einzelnen Chromosomenpaares. Nach der zweiten Hybridisierung war die Intensität der CTMR-Anfärbung etwas verringert, aber diese war noch ziemlich hell und war leicht wahrnehmbar. Des weiteren wurde eine vollständige DECCA-Anfärbung (Aqua-Fluoreszenz) von sämtlichen Chromosomen mit guter Intensität beobachtet.

(f) Genom-Gegenfärbung gleichzeitig mit einer Biotin-markierten Chromosomenfarbsonde (direkt fluoreszenzmarkierte genomische Sonde) und indirekt markierter Chromosomenfarbsonde

Die Hybridisierung wurde im wessentlichen gleich wie in Beispiel 15 (a) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 100 ng Biotin markierte Sonde aus Beispiel 13 mit 100 ng 1,5% CMTR markierter Zubereitung #4 und 1 ug Cot-1-DNA in die 10 ul- Hybridisierungslösung zugegeben wurden. Zusätzlich wurden mehrere Posthybridisierungs-Inkubationen erforderlich, um die indirekt markierten Reagentien zu binden, wie folgt. Nach der Übernachthybridisierung wurden der Objektträger gewaschen (Waschverfahren #1) und dann in einer Lösung mit 5 ug Fluoresceinstreptavidin (das von Vector Labs, Burlingame, CA bezogen wurde) pro ml PMN- Puffer (PMN Puffer = 0,1 M Natriumphosphat mit einem pH = 7,0, 0,1% (w/v) NP-40, 0,2% Natriumazid, und 5% fettfreie Trockenmilch) für 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Der Objektträger wurde dann zweimal in PN-Puffer (PN-puffer = 0,1 M Natriumphosphat und 0,1% (w/v) NP-40 pH 7,0) jeweils für 2 Minuten bei Zimmertemperatur gewaschen und dann in einer Lösung mit 5 ug biotinyliertem anti-Streptavidin (das von Vector Labs bezogen wurde) pro ml PMN-Puffer für 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Der Objektträger wurde dann zweimal in PN-Puffer jeweils für 2 Minuten bei Zimmertemperatur gewaschen und in einer Lösung aus Fluorescein-Streptavidin (die gleiche wie oben) für 20 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert. Der Objektträger wurde dann ein letztes Mal zweimal in PN-Puffer für jeweils 2 Minuten gewaschen, und dann ließ man den Objektträger abtropfen und an der Luft trocknen, bevor man die Antiausbleichlösung aufbrachte, mit einem Deckplättchen abdeckte und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersuchte.
Die Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop zeigte eine helle und spezifische Grünfärbung eines einzelnen Metaphasen- Chromosomenpaares zusammen mit einer hellen und vollständigen Orangefärbung von sämtlichen Chromosomen. Dieses Ergebnis zeigt, daß die Direkt-Markierungs-humane-Plazenta-DNA-Sonde eine visuell deutliche genomische Gegenfärbung bewirkt, welche durch die Posthybridisierungs-Markierungsreaktionen, die bei der Indirekt- Markierungs-Sonde erforderlich sind, nicht nachteilig beeinflußt wird, und welche nicht mit den Hybridisierungs- und Posthybridisierungs-Reaktionen der Indirekt-Markierungs-Sonde interferiert.
Andere und weitere Ausführungsformen sind für den Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung und den Beispielen ersichtlich. Es sollen keine unbegründeten Beschränkungen oder ähnliches daraus gefolgert werden.

Claims

1. Direkt-Markierungs-DNA-Sonden-Zusammensetzung zum Gegenfärben genomischer DNA, welche in einer Probe aus einem multichromosomalen Organismus vorhanden ist, und zum Färben wenigstens eines Bereiches eines Chromosoms, das in der genomischen DNA der Probe vorhanden ist, worin die Zusammensetzung umfaßt:

(a) eine Mischung von DNA-Segmenten, welche über Verbindungsgruppen kovalent an fluoreszierende Gruppen gebunden sind, wobei die DNA-Segmente (i) entnommen worden sind von der gesamten genomischen DNA eines Organismus desselben Typs wie derjenige der Probe und (ii) in der Lage sind, mit komplementären Teilabschnitten der DNA in allen der Chromosomen des Organismus zu hybridisieren, um ein im wesentlichen vollständiges Gegenfärben aller der Chromosomen zu erreichen; und

(b) wenigstens eine andere DNA-Sonden-Zusammensetzung zum Färben wenigstens eines einzelnen Bereichs eines Chromosoms oder eines einzelnen Chromosoms des Organismus.

2. Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Segmente eine durchschnittliche Größe im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 Basen-Paaren besitzt und die Segmente an etwa 1 bis etwa 70 Mol-Prozent der gesamten Desoxycytidin-Nukleotide derselben mit den Verbindungsgruppen substituiert sind und wenigstens etwa 10 Mol-Prozent aller der Verbindungsgruppen ebenfalls derart kovalent an die fluoreszierenden Gruppen gebunden sind.

3. Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin die DNA-Segmente von einer fragmentierten Bibliothek der gesamten menschlichen genomischen DNA entnommen sind.

4. Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 3, welche gemischt ist mit einer blockierenden DNA-Zusammensetzung, welche eine Mischung von unterschiedlicher. DNA- Segmenten umfaßt, die gewonnen sind von gesamter genomischer DNA des Genoms und die komplementär sind zu den DNA- Teilabschnitten, welche in den Chromosomen vorkommen, wobei die Segmente eine durchschnittliche Größe im Bereich von etwa 150 bis etwa 600 Basen-Paaren besitzen.

5. Sonden-Zusammenensetzung gemäß Anspruch 1, worin die Verbindungsgruppe gekennzeichnet ist durch die Formel:

worin

X ausgewählt ist aus der Gruppe von Einheiten, welche besteht aus

worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, welche aus Wasserstoff und einer Alkyl-Gruppe mit weniger als sechs Kohlenstoffatomen besteht, m und n jeweils unabhängig ausgewählt sind aus einer Zahl von 1 bis einschließlich 6 und p eine Zahl von 0 oder 1 ist und worin jede Einheit -(NR&sub1;)- mit einem unterschiedlichen Desoxycytidin-Nukleotid verbunden ist und jede Einheit -X- kovalent an eine fluoreszierende Gruppe gebunden ist, die einen Substituenten enthält, der mit -X- umgesetzt wird und zu einer kovalenten Bindungsbildung führt.

6. Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, worin die fluoreszierende Gruppe ein Derivat einer Verbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche besteht aus 7-Amino-4-methylcumann-3-essigsäure-succinimidylester; Schwefelrhodamin-101-sulfonylchlorid; 5-(und -6)-Carboxyrhodamin-101-succinimidylester; Lissaminrhodamin-B-sulfonylchlorid; 5-(und -6)-Carboxyfluorescein-succinimidylester; Fluorescein-5-isothiocyanat; 7-Diethylaminocumann- 3-carbonsäure-succinimidylester; Tetramethylrhodamin-5- (und -6)-isothiocyanat; 5-(und -6)-Carboxytetramethylrhodamin-succinimidylester; 7-Hydroxycumann-3-carbonsäuresuccinimidylester; 6-[Fluorescein-S-(und -6)-carboxamido]- hexansäure-succinimidylester; N-(4,4-Difluor-5,7-dimethyl- 4-bora-3a,4a-diaza-3-indacenpropionsäure-succinimidylester; einem Fluorescein-Kern, der über eine Spacer-Gruppe gebunden ist an eine reaktive Gruppe eines N-Hydroxysuccinimidesters; Eosin-5-isothiocyanat; Erythrosin-5-isothiocyanat und dem O-Acetylazid-derviat von 1-Hydroxy-3, 6,8-pyrentrisulfonsäure.

7. Verfahren zum Identifizieren genomischer DNA und DNA- Sequenzen wenigstens eines Bereiches eines Chromosoms, das in einer Probe vorhanden ist, die aus einem multichromosomalen Organismus gewonnen wurde, umfassend die Schritte von nacheinander:

(a) Kontaktieren der Probe unter Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, um Hybride zwischen jeder der genomischen DNA und der DNA- Sequenzen des Bereichs mit den Sonden-DNA-Segmenten zu erzeugen, welche in der Sonden-Zusammensetzung vorhanden sind,

(b) Abtrennen restlicher Anteile der Sonden-Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 von der resultierenden Probe und (c) Untersuchen der resultierenden Probe durch Bestrahlen derselben mit Energie, die wenigstens ausreicht, um die in den Hybriden vorhandenen fluoreszierenden Gruppen zum Fluoreszieren zu bringen, während gleichzeitig die so erzeugte resultierende Fluoreszenz-Energie detektiert wird, wodurch die in der Probe vorhandene genomische DNA und der Bereich identifiziert werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin

(a) die Probe zytologisches Material umfaßt, welches als feste Haftschicht auf einer Oberfläche eines Objektträgers verteilt ist,

(b) das Inkontaktbringen durchgeführt wird durch Zugabe einer wässrigen Lösung der Sonden-Zusammensetzung zu der Probe unter Verwendung von Hybridisierungsbedingungen,

(c) die Separierung durchgeführt wird, indem die resultierende Probe mit einer wässrigen Flüssigkeit gewaschen wird, und

(d) die Untersuchung mit einem Fluoreszenz-Mikroskop durchgeführt wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin

(a) die Probe eine wässrige Suspension von Chromosomen umfaßt,

(b) das Inkontaktbringen ausgeführt wird, indem die Sonden-Zusammensetzung in der Suspension gelöst wird,

(c) die Separierung durchgeführt wird durch Zentrifugieren und

(d) die Untersuchung ausgeführt wird mit einem Durchfluß- Cytometer.

10. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin eine zusätzliche Sonden-Zusammensetzung auf diese Weise zugemischt wird und die zusätzliche Sonden-Zusammensetzung mit einem centromeren Bereich eines einzelnen, festgelegten besonderen Chromosom des Genoms während des Inkontaktbringens hybridisiert, falls der centromere Bereich in der Probe vorhanden ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin der Organismus menschlich ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 7, worin der Bereich ein einzelnes, bestimmtes und besonderes Chromosom des Organismus ist.