JPH06502079A

JPH06502079A - ゲノム識別用のプローブ組成物および方法

Info

Publication number: JPH06502079A
Application number: JP5501194A
Authority: JP
Inventors: モリソン，ラリー・エドワード; レガター，モナ・ステイン; ビットナー，マイケル・ルイス
Original assignee: ヴァイシス・インコーポレーテッド
Priority date: 1991-09-19
Filing date: 1992-09-18
Publication date: 1994-03-10
Also published as: EP0558740A1; DE69226510T2; EP0558740B1; ATE169342T1; DE69226510D1; WO1993006245A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ゲノム識別用のプローブ組成物および方法関連出願本出願は、Ｍ、　Ｌ、ビトナー（Ｂ　ｉ　ｔｎｅ　ｒ）　、Ｌ、　Ｅ、モリワン（Ｍａ　ｒ　１ｓ　ｓ　ｏｎ）およびＭ、Ｓ、リゲイタ−（Ｌｅｇａｔｏｒ）による１９９０年９月２０日出願の先の出願の米国特許出願第５８５，８７６号明細書の一部継続である。

発明の分野本発明は、ゲノム識別のためのプローブ組成物、それを製造する方法並びにそＮＡらせんの外側に結合する色基含有化合物から成る化学種ヌクレオチド対比染料の使用を必要とすることがある。このような対比染料は、例えば、１ｎｓｉｔｕ　ＤＮＡハイブリッド形成法において、非特異的染色体領域、例えば、特定の発蛍光団標識プローブと特異的にｉｚｄブリッド形成しない領域の可視化を増強することがのぞましい。対比染料の色は、好ましくは、プローブに関係した色と対照させる必要がある。蛍光プローブを用いる対比染料は蛍光性であるのが好ましい。現在用いられている化学蛍光対比染料の例としては、４′、６−ジアミンノー２−フエニルインドールニ塩酸塩水和物（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、キナクリンマスタード等がある。典型的には、このような染料は染色体の一つ一つの領域の色の強さの変化を示す。

このような化学対比染料には様々な欠点がある。一つには、このような蛍光対比染料の少数のみが利用可能であり、それによって、励起および発光波長を含むスペクトル特性の利用可能な選択並びに吸収および発光バンドのスペクトル幅が制限される。

もう一つには、細胞学的利用において典型的に、このような対比染料は、細胞核または染色体のハイブリダイゼーシヨンを受けるかまたはそれに接近しうる容量または能力に相互関係を示さないかまたは比例的に対応しない着色強さを生じる。例えば、低水準の対比染色は特定の核を排除するための判定基準として用いることかでき、それによって染色体または染色体領域の不十分な計数が避けられる。このような相互関係は、核ごとの特定の染色体または染色体領域の存在、不存在または数に関して核を「評点する」目的に重要である。典型的に高価であるハイブリダイゼーションプローブに対する核の不十分な接近容易性は、浪費および染色体または染色体領域の不十分な計数によって引き起こされる不正確さ並びに結果としての誤診をもたらすと考えられる。

もう一つには１、明らかにＤＮＡに関係した方法（前記に示したように）によるこのような先行技術の化学対比染料は、最初のハイブリダイゼーション後の第二回目のハイブリダイゼーションの場合または引き続きのバンディング（ｔ）ａｎｄｉｎｇ）操作の場合のように、標的ＤＮＡとハイブリッド形成するプローブの能力を妨げることが時々ある。

全部ｈＤＮＡに酢酸第二水銀を用いて標識した間接標識プローブ組成物は、ホブマン（Ｈｏｐｍａｎ）らによって、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８５，１〜４　（１９８６）およびＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌっていないしまたは提案していない。更に、ｉｎ　５ｊｔｕハイブリツド形成法の後に、そこで形成されたハイブリッドを更に処理してそれらを検出可能にする必要があった。例えば、ある場合においては、チオール含有標識を標識抗体で検出したが、別の場合においては、チオール化フルオレセインをｉｎ　５ｊｔｕハイブリツド形成法後のハイブリッドと一緒にインキュベートした。チオール化フルオレセインなどの試薬による第二の処理は、他のハイブリダイゼーションプローブおよび／または池のプローブを可視化するのに必要な他の第二の反応を妨げると考えられる。

更に、第二の処理は検定を複雑にし且つ長期化する。追加の操作を伴わずにゲノムＤＮＡの対比染色を達成するための一段型ハイブリッド形成法は、ホブマンらによって示されていないしまたは示唆されていない。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法の技術は、このような欠点を避ける新規のおよび改良された種類のゲノム対比染色用組成物を必要としている。

発明の概要本発明は、（ａ）特にヒトゲノムに関係するｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法等において、染色体検出等のための直接検出可能なゲノムＤＮＡ対比染料として有用である新規のおよび極めて有用な種類のＤＮＡプローブ組成物並びに（ｂ）そのようなプローブを製造し且つ用いる方法を提供する。

これらの新規の直接標識ゲノムＤＮＡ対比染色用プローブ組成物は、ゲノム、特に、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法または他の方法を行うためのまたは行っているゲノムの全ゲノムＤＮＡから成ったまたは由来したヌクレオチドセグメントを用いる。このようなプローブ組成物中のこのようなセグメントを、本明細書で提供するような製造方法を用いることによって化学的に結合した発蛍光団で標識する。

本発明の実施において用いるのに現在好ましいゲノムはヒトゲノムである。

与えられた発明のプローブ組成物のいずれにおいても用いるのに現在好ましい発蛍光団は、ゲノムＩ）ＮＡに関係する特定のｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法を実施する目的に関して本発明のこのようなプローブ組成物と一緒に同時にかまたは逐次的に用いられている任意の他の直接または間接標識プローブまたはプローブ組成物において用いられた発蛍光団標識とはスペクトルによって異なるものである。

本発明のプローブ組成物において、そのＤＮＡは、検討中の全ゲノムじゅうの様々な位置に個々に存在するフラグメント化ＤＮＡ配列に由来する混合セグメントの形である。このような配列は、ゲノムＤＮＡ自体かまたはそのコピーから得られる。このようなコピーは、当業者が理解するように、所望により、クローニング、酵素的増幅、それらの組合わせ等の方法を用いることによって製造することができる。

知られている限りにおいて、ある与えられたゲノムの全ゲノムＤＮＡを総合的に含むフラグメント化ＤＮＡ配７１１から成る、発蛍光団基を直接標識したＤＮＡセグメントのプローブ組成物をこれまでに提供した者はいなかった。このようなりＮＡ上セグメント平均寸法は、典型的に、約１５０〜約６００塩基対（ｂ　ｐ）の範囲であるが、所望ならば、更に大きいおよび更に小さいこのようなフラグメント化セグメント用いることができる。更に好ましくは、このようなフラグメント化ＤＮＡセグメントの平均寸法は約２００〜約４００ｂｐの範囲であり、そして最も好ましくは、平均寸法は約３００塩基対である。このようなセグメントは、便宜上、慣眉的な配列フラグメント化法および現在好ましい音波処理を含む方法によって出発全ゲノムＤＮＡ配列から製造される。

本発明は、更に、このようなプローブ組成物を製造する方法を提供する。例えば、出発ＤＮＡセグメントを標識し、それによって所望の直接標識プローブ組成物を製造するには、反応性末端を有する結合性基を最初にそこに導入した後に、発蛍光団基をこれらの末端に対して共有結合させる。

本発明の生成物である直接標識プローブ組成物は、標的組成物中に存在する検討中のゲノム全部またはいずれかの位置（すなわち、部分）とハイブリッド形成することができる。ハイブリッド形成は、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法等のハイブリッド形成条件下において、このような生成物プローブ組成物中で利用されるゲノム全部または一部分から成る標的ＤＮＡを含む標本を用いて達成される。製造されたハイブリッドは標本中に存在する標的ゲノムＤＮＡと結合し、そして個々のまたは複数のこのような標的ＤＮＡが、蛍光顕微鏡等下で放射を励起する発蛍光団を用いて観察した場合または流動血球計算分析等で検査した場合に実買的に完全に染色された可視的外観を有するようにさせる。

本発明のこのような生成物である直接標識プローブ組成物によって製造されたハイブリッドは、このようなハイブリッド形成法による標的ＤＮＡを用いるそれらの生成後に直接的に検出することかできる。したがって、生成物プローブ組成物は、標的、ゲノムまたはそれらの一部分として関係するいずれのｉｒｘ　５ｉｔＵハイブリツド形成法においても、全体のまたは一般的なゲノム対比染料として用いることができる。したがって、本発明のプローブ組成物を用いて細胞学的または組織学的標本中の非特異的染色体領域を検出し、同定（検出し、視覚化しおよび／または定量化することを含む）することかできる。このような視覚化は、他のＤＮ、Ａ識別用の標本中に存在することがある他の発蛍光団残基の色と対比するのに色が適応する発蛍光団残基を用いることによって増強することができる。

本プローブ組成物のもう一つの利点は、本明細書中に示したように出発ゲノムＤＮＡ配列フラグメントと結合することができる比較的多数の発蛍光団基自存化合物が知られていることである。例えば、スペクトル特性の選択は、先行技術技術の化学対比染料によって可能であるよりも大きく、本発明のある与えられたプローブ組成物中において達成することができる。本発明のプローブ組成物で用いられる対比染料発蛍光団基の色の選択は、１種類またはそれ以上の他の染色体の標的特異性核酸プローブを用いて考えられたプローブ組成物使用法を強化するように適応することができる。

本発明のプローブ組成物のもう一つの利点は、成分プローブが介在しない結果として、第二のハイブリダイゼーション、バンディング法または類似のものを、ある与えられたＤＮＡ含有細胞学的調製試料上または中でのそれらの使用法に引続いて、または同時にでも実施することができということである。

本発明のプローブ組成物のもう一つの利点は、それらが細胞学的核酸、特にゲノムＤＮＡの接近容易性を示すものとして機能して核酸をプローブすることができるということである。細胞のＤＮＡがこのような対比染色の影響を受けない場合、そのＤＮＡは全く目に見えないので、このようなものは特異的にハイブリッド形成しうる標的ＤＮＡを有すると誤解されることはない。

本発明のプローブ組成物のもう一つの利点は、それらが他の直接標識プローブ組成物、特に、発蛍光団で標識されたプローブと混合することができるし、そして得られた混合プローブをｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で用いて、このような混合の結果として生じる望ましくない干渉または相互作用を全く伴うことなくゲノムＤＮＡ対比染色も特異的ゲノムＤＮＡ領域の着色も同時に達成することができるということである。したがって、別の状況では必要であると考えられる別個のインキュベーション工程を含む→のハイブリッド形成工程を実施する時間および労力は完全に軽減される。

本発明のプローブ組成物に関係した重要な特徴は、それらが直接標識プローブを含むということである。例えば、標本中でゲノムＤＮＡとのそれらのハイブリダイゼーシヨンおよび引続きの洗浄後に対比染色は完了する。検出能力を発展させるのに、間接標識プローブに必要であるような池の試薬との引続きの反応性処理を更に必要としない。更に、間接標識プローブは、通常、適合性限界を有し、例えば、それらは、検出可能な残基を生じさせるのに必要な不可欠のハイブリダイゼーション後反応を妨げる成分を含んでいるかもしれない他のプローブと一緒に用いることはできない。更に、間接標識プローブと一緒に用いるのに必要な多数の既知の反応体対は制限されるので、引続きのｉｎ　５ｉｔｕハイブリｙト形成法のために製造することかできる種々のプローブの混合組成物は制限される。

本発明のもう一つの重要な特徴は、本発明のプローブ組成物の使用法の結果として対比染色されたＤＮＡが生じ、それはｉｎ　５ｉｔｕハイブリッド形成条件等下において対比染色されたＤＮＡからハイブリッド形成した対比染料を実質的に除去することなく更に処理することかできるということである。これに対して、先行技術の化学対比染色を用いると、染色された標本を処理用液体に引続き暴露することにより、少なくとも部分的には染料か除去されることがある。この染料安定性の差の主な理由は、それらの融解温度（Ｔｍ）未満のハイブリッドに関係した結合定数か、介在した薬剤に関係した結合定数と比較して特徴的に高いことに関係していると考えられる。

全ゲノムＤＮＡ対比染色用の本発明の直接標識プローブ組成物は、更に、直接標識の局所特異性プローブ、例えば、個々の染色体ＤＮＡペイントプローブ組成物が、そこに含まれたＤＮＡ配列の相補的制限のために、慎重な設計選択によって集中している特定のゲノム部分以外のゲノムＤＮＡを全て検出するのに用いることができないこのようなペイントプローブ組成物から容易に区別される。

ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法による染色体検定中に、明確で鋭敏な直接的に検出しうるゲノム染色体ハイブリッドを製造する本発明の発蛍光団で標識されたプローブ組成物の能力は、このようなプローブを用いる新規で且つ極めて有用なｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法のみならず、新規で且つ極めて有用な生成物、例えば、本発明のプローブ組成物によって実質的に完全に対比染色されたゲノム標的ＤＮＡ本体または標的ＤＮＡを用いる本発明のプローブ組成物とのｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法によって製造されたハイブリッドを結果として生じる。

池のおよび更に別の特徴、目標、目的、意図、利点、用途、実施態様等は、添付の図面に示された本明細嘗の内容から当業者に明らかである。

図面の簡単な説明又部において、図１は、本発明のプローブ組成物によって対比染色された崖−の中期染色体の微視的線図であり。

図２は、図１の染色体の領域の拡大した理論上の線図であり。

図３は、単一の哺乳動物種染色体を図示する微視的線図であり。

図４は、図１の該染色体を先行技術の介在性ゲノム化字種ＤＮＡ対比染料によって対比染色した後の該染色体の１丁と定義した一つの領域の部分拡大線図であり：図５は、該染色体を本発明のゲノムＤＮＡプローブ組成物によって対比染色した後の、該領域ＩＩを示している以外は図４と同様である図であり。

図６は、ＤＮＡ対比染色によって対比染色された単一のヒト細胞核のスライドに固定した標本の微視的線図であり：そして図７〜図１５は、本発明のプローブ組成物で対比染色されたヒト中期および間期ＤＮＡの標本の顕微鏡写真である。

本明細書中で用いられる「対比染料」という用語は、染色処理等によって生じた補色またはバックグラウンド色に対する一般的且つ慣用的な意味を有し、その色は、細胞学的若しくは組織学的調製試料の成分（または構成体）の全部若しくは選択された群に効果がある。典型的には、このような成分は顕微鏡検査等を行うためのものであり、典型的には、選択的である別のまたは他の染料によって生じた別のまたは他の主要なまたは基本的な１種類または複数の色が検査に関与することができる。このような対比染料の色の主要な目的または機能は、通常、このような検査を改良しまたは強化することである。

「配列」という用語は、ＤＮＡヌクレオチドの鎖または連続列を意味する。

「フラグメント」、「セグメント」またはｒＤＮＡセグメント」という用語は、概して、一つの染色体または染色体の一つの傾城に存在するような大型のＤＮＡポリヌクレオチドまたは配列の一部分のみを意味する。ポリヌクレオチドは、例えば、分解されるかまたは多数のセグメント若しくはフラグメントにフラグメント化されることができる。知られているように、染色体は、ＤＮＡ反復セグメントを含むＤ　Ｎ　Ａ配列を有する領域を特徴的に含んでいる。「反復」という用語は、特定のＤＮＡセグメントか同一のＤＮＡ配列の場合は複数倍（すなわち、少なくとも２倍）または多数のＤ　Ｎ　Ａ配列を生じるということを意味する。

個々のＤＮＡセグメント寸法および／またはＤＮＡ反復セグメント寸法は大きく変化することができる。例えば、ヒトゲノムの場合、各Ｄ　Ｎ　Ａ反復セグメントは、現在、約５〜約３．　ＱＯＯｂ、ｐ、のおよその寸法範囲にあると考えられている。例証的には、単一の染色体アルフすイドＤＮＡ配列は、少なくとも約５種類の異なるＤＮＡ反復セグメントを取り込むことができる。

「ゲノム」という用語は、生物のＤＮＡにコードされる生物の遺伝的命令の完全単コピーセントを称しまたは意味する。本発明の実施において、問題の特定のゲノムは典型的に多重染色体であるので、このようなりＮＡは多数の個々の染色体中で細胞に分布している（例えば、ヒトにおいて１＝２２対と性に関係したＸＸ対またはＸＹ対を加えた数になる）。

本発明の実施において、与えられたいずれの場合にも関係したゲノムは霊長類出来であるのか好ましく、このようなゲノムから予め選択された染色体のＤＮ、へ配列は、アルフオイドＤＮＡを含むかまたは予め選択された染色体の動原体に関係しているＤＮＡ反復セグメントを含む。本明細書中で用いられる、ＤＮＡに関するーアルフォイド」または：αサテライト」という用語は、霊長類ゲノムにおいて見出さｎた縦列反復Ｄ　Ｎ　Ａセグメントの複雑な系列を意味する。約１７１塩基対のモノマー反復長さに基つくαサテライトＤＮＡの長い縦列配置：よ、主としゲノム毎に変化することがある。（好ましい）ヒトゲノムの場合、ある与えられる染色体番号２２は約５．３ｘ１０７ｂｐを含む（ユニス（Ｙｕｎ　ｉ　ｓ）　、Ｊ。

Ｊ、５ｃｉｅｎｃｅ　１９１：１２６８〜１２７０（１９７６）および力ヴエノフ　（Ｋａｖｅｎｏ　ｆ　ｆ）、Ｒ，ら、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ　ＨａｒｂｏｒＳｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏ　ｙ　３８：１〜８（１９７３））。。

「領域」という用語は、好ましくはアルフオイドであるかまたは動原体に関係しているＤ　Ｎ　、Ａ、反復セグメントを含む一つの染色体の一部分を意味する。

このような個々の領域の実際の物理的寸法または程度は太き（変化することがある。このような領域の正確な定量化は、現在のところ全部の可能な領域に関して行うことができない。通常、領域は、（ａ）少なくとも１個のＤＮＡ反復セグメントの多数のコピーを組込み且つ（ｂ）直接標識プローブまたはプローブ組成物を用いるｉｎ　５ｊｔｕハイブリツド形成法によるこのような領域の発蛍光団標識ノ＼イブリッドの形成後の蛍光透視顕微鏡検査によって光学的に同定しうるし且つ好ましくは列挙しつる少なくとも１種頭のＤＮＡ配列を含むほど少なくとも十分に大きい。現在利用可能な情報は、領域が崖−のこのようなりＮＡ配列より多く含むことができ、それぞれのこのようなりＮＡ配列が１種類またはそれ以上のＤＮＡ反復セグメントを含むということを示唆する。

「領域」という用語は、典型的に且つ特徴的に；訳ある与えられた染色体の完全なりＮＡ質量または寸法より小さいＤＮＡ質量または寸法を含む染色体フラグメントである。知られているように、ある与えられた染色体または染色体領域の１０”ＤＮＡｂｐを含むことがあり、その寸法範囲は、例えば、ヒト染色体の動原体を含む。このような寸法は、したがって、里−のヒト染色体の寸法の実質的な部分である。このような領域寸法は、本発明の実施における領域寸法として現在好ましいが、一層大きいまたは一層小さい領域寸法を用いることができる。小− ブ組成物の生成および使用目的のためのそのＤＮＡセグメントの特定の組合ね体の異質染色体領域を意味する。動原体は複製された染色体領域の直前を分離し、１＼　て分類することができる。

性反応性置換基含有、そして更に発蛍光団置換基含有の出発蛍光化合物由来であン以上の残基とそれらを連結させる必要がある核酸プローブを称しまたは意味する。

は他のクローニングベクターにおいてクローン化し且つ増殖したまたはインビト輻射エスルギーによって作用する際に発光する物質（例えば、発蛍光団）の性質ルテニウム等のような舌上などの発光性無機イオンを結合する有機キレート化剤を挙げることができる。

る。本発明の発蛍光団標識プローブまたはプローブ組成物の場合、検出法は蛍光顕微鏡法、流動血球計算法等を含むことかできる。

「ハイブリッド形成条件」という用語は、ハイブリッドを製造するのにある与えられたハイブリッド形成法において用いることかできる条件、例えば、制御温度、液相およびプローブ（またはプローブ組成物）と標的との接触を典型的に必要とする条件の組合わせに対する一般的な意味を有する。便宜上および好ましくは、少なくとも一つの変性工程か、プローブまたはプローブ組成物を標的と接触させる工程に先立つ。或いは、バット（Ｂｈａｔｔ）ら（１９８８）によってＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６：３９５１〜３９６１に記載されたように、プローブを、ＤＮＡ標的領域を含む標本と接触させ、そして双方に一緒に変性条件を施すことかできる。例えば、水およびホルムアミドの約５０　＋　５０容量比混合物を用いると、プローブ（またはプローブ組成物）と標的との接触およびハイブリダイゼーションに例示的な温度は約３５〜約５５℃の範囲であり、例示的に約１〜約１８時間の範囲の時間で適用される。他のハイブリッド形成条件を用いることができる。プローブ数対標的配列またはセグメント数の比率は広範囲に変化することがあるが、概して、この比率が高いほど、ハイブリッド形成条件下における雇界内のハイブリッド生成の確率は高い。

「完全な」、「完全に」、「実質的に完全な」またｊ；「実質的に完全に」という用語は、本発明の直接標識プローブ組成物か標的とハイブリッド形成した結果として、１種項または複数の標的本体が、少なくともそれらとのハイブリダイゼーション後に標的の全域（形りを示す（すなわち、染色または同定する）のに十分な程度まで強調され且つ識別しつる能力を意味する。例えば、蛍光着色強さは個々のハイブリッド形成した染色体標的本体に存在する（観察される）ことが時々あるか、全体としての標的本体は実質的に強調される。

「低級」という用語は、６個未満の炭素原子を有する化合物、基またはランカルを意味する個々の化合物、基またはラジカルを意味する。

「ペイントプローブ］若しくは「ペイント用プローブ」、（または「ペイントプローブ組成物」若しくは「ペイント用プローブ組成物」）という用語は、ハイブリッド形成条件下において、多重染色体ゲノムの一つの予め決定された（すなわち、予め選択された）染色体を含む標的とハイブリッド形成するように適合さこのような一つの染色体の断片部分のみが、このようなプローブ組成物とのハイブリダイゼーションをうける標本中に偶然存在する場合、このような断片部分はそのようにハイブリッド形成し且つ識別される。典型的には、本発明の一つのペイントプローブを第二のものと混合して、２種類の予め決定された染色体の同時染色および検出を可能にするようにすることができる。

「クローン化」、「クローニング」または同等の用語は、特定のヌクレオチドセグメントまたは配列を適当なベクター中に挿入した後に、ベクターを宿主細胞中に輸送し、そして次に宿主細胞中のベクターに培養工程中にそれ自体を再生させ、それによって各ベクターおよびそれが有するそれぞれのヌクレオチド配列の多数のコピーを生じる工程を意味する。クローニングの結果として同一の宿主細胞のコロニーまたはクローン（すなわち、群）が生成し、そこにおいて、それぞれが特定のヌクレオチドセグメントまたは配列を取込んでいるベクターの１個またはそれ以上のコピーを含む。ここで、ヌクレオチドセグメントまたは配列は「クローン化」されるといわわ、そして生成物のヌクレオチドセグメントまたは配ｙりは「クローン」と称することができる。

「ブロッキングＤＮＡＪまたは「ブロッキングＤＮＡ組成物」という用語は、ハイブリッド形成条件下において、プローブ中に存在する非特異的結合性ＤＮＡとハイブリッド形成する能力を有するＤＮＡを意味する。ブロッキングＤＮＡ組成物は、検討中であり且つ標的を組込む多重染色体ゲノムの全ゲノムＤＮＡ由来であり、を含み、そして好ましくはそれを代表するものであるＤＮＡセグメントの混合物から成る。このようなセグメントは、例えば、このような全ゲノムＤＮＡを含むまたは代表するＤＮＡ配列をフラグメント化することによって（本明細書中に記載したように）製造することができるし、そのように製造されたこの種のＤＮＡセグメントは、このゲノムの染色体（領域を含む）中に存在するＤＮＡセグメント部分に対して相補的であり、そしてこのようなセグメントは、例えば、全ゲノムＤＮＡから他の方法によって、例えば、変性し、部分的に再生または再ハイブリッド形成し、そして酵素で処理することによってそこでの非反復セグメントの量を減少させるという手順工程を必要とする方法によっても製造することができる。ブロッキングＤＮＡは、プローブ組成物との使用時において、好ましくは、平均寸法が約１５０〜約６００塩基対の範囲であるセグメントの状態である。

「ライブラリー」という用語は、本明細書中においては、完全なゲノムまたはその規定された断片、例えば、単一の染色体を一緒に表わすクローン化ＤＮＡフラグメントのセットを意味する慣用的な意味で用いる。様々なライブリーか先行技術で知られており且つ様々な所から入手可能であり、そしてゲノムおよびゲノムフラグメント調製試料並びにそこからのライブラリーのクローン化に関する技術は周知である。本操作上好ましいのは、フロー選別等によって分離された選択された一つの染色体をフラグメント化することである。クローニングの前のフラグメント化は、制限エンドヌクレアーゼ等での消化によって達成されるのが好ましい。この方法は、ベクター中への挿入に対して特に従順であるフラグメント末端を生じる。しかしながら、当業者は、フラグメント化に関する慣用的なまたは好都合な技法をいずれも用いることができることを理解する。次に、フラグメントを慣用的にクローン化して染色体ライブラリーを生じる。。

［ブロックされたプローブ組成物」という用語は、ブロッキングＤＮＡ組成物との混合物である本発明のプローブ組成物を意味する。

璽希釈剤ＤＮＡ：または同等の用語は、本発明の特定のプローブ組成物中に組込まれるＤＮＡと同一であるまたは同様であるＤＮＡを意味する。希釈剤ＤＮＡは、本発明のプローブ組成物を製造する場合に中間体を構成するトランスアミノ化ポリヌクレオチドと混合した場合、または本発明の生成物であるプローブ組成物と混合した場合、ある与えられた容量または重量の本発明のプローブ組成物中に存在する標識ＤＮＡセグメントの全数を希釈するように作用する。

当業者か理解するように、希釈剤ＤＮＡはブロッキングＤＮＡとして作用することも時々あるし、逆もある。

「担体ＤＮＡＪという用語は、プローブが貯蔵されているコンテナ容器の表面部分、Ｉｎ５ＩｔＬｌハイブリツド形成法を行う標本が析出するスライドガラスの表面部分、またはｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法等を行う標本中に存在する細胞破片の表面部分などの隣接する表面部分に対するプローブＤＮＡの吸収などの作用のために本質的に失われれているプローブＤＮＡの量を減少させるように作用するＤＮＡを意味する。担体ＤＮＡは無関係のゲノム種由来のＤＮＡから成り、例えば、ヒトゲノム由来のＤＮＡセグメントとの混合物中のサケ精子である。担体ＤＮＡは、場合により、本発明のプローブを組込むハイブリダイゼーション溶液に加えることができる。

「非特異的結合性ＤＮＡＪという用語は、プローブのＤＮＡセグメントに相補的であり且つゲノム中の少なくとも１か所の他の位置にＤＮＡが存在し、そして他の位置はそのゲノム中の選択された染色体標的領域の外側であるＤＮＡを意味する。非特異的結合性ＤＮＡの例はＤＮＡ反復セグメントの種類を含み、そのメンバーは、一般的には１か所を越える染色体または染色体領域に存在する。このような共通の反復セグメントは、プローブ組成物中に存在する他のＤＮＡセグメントより大きい程度までハイブリッド形成しがちである。

（Ｂ）出発物質（１）出発全ゲノムＤＮＡ本発明の実施において用いられる出発全ゲノムＤＮＡは、典型的には、ある与えられた多重染色体ゲノムの個々の染色体中およびその至る所の様々な位置に別個に存在するＤＮＡセグメントの多様性を総合的に含む多数のＤＮＡ配列の形である。例えば、このようなりＮＡ上セグメント、セグメントを個々に反復してよいしまたは反復しなくてもよい。好ましくは、出発成分セグメントは全ゲノムＤＮＡを含む。それらの天然に存在する状態において、出発ＤＮＡ配列の寸法は、本発明の実施において出発物質として用いるための有効性の期間にそれぞれ約１００万塩基対よりはるかに大きいが、全ゲノムＤＮＡは、分離、単離等で用いた方法などの因子に応じて既にある程度フラグメント化されていてよい。

本発明のある与えられたプローブ組成物を製造する目的のために、ゲノムの出発全ゲノムＤＮＡを種々の技法によって得ることができる。例えば、それは、生物の成分である細胞内材料から分離される（精製を含む）細胞性ＤＮＡから由来するまたは得ることができる。分離方法は周知であり、いずれの好都合な分離方法も用いることができる；例えば、Ｊ、サムプルツク（Ｓａｍｂ’ｒｏｏｋ）　、Ｅ、Ｆ、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ、　マ＝アテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）（１９８９）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ノ１−バー、ニューヨークおよびそこに引用された参考文献を参照されたい。好都合な組織または細胞源をいずれも用いることができるが、全ゲノムＤＮＡ含量が比較的高いのが特徴的であり且つ全ゲノムＤＮＡをある与えられたゲノムに関して有効に分離す望ならば試験若しくは評価目的に用いるための本発明のプローブ組成物を製造することができる。

本発明にしたがって、ｉｎ　５ｉｔｕｚ＼イブリツド形成法によってヒトゲノムの対比染色を達成する目的に対して、現在好ましい出発全ゲノムＤＮＡの一つはヒト胎盤ＤＮＡを含む。このようなりＮＡは、本明細書中に示したように、フラグメント化され且つ標識されて本発明のプローブ組成物を生じた後、／％イブリット形成条件下で用いられて標的をゲノムによって対比染色した場合、着色強さの最小の変化によって実質的に完全に識別される染色された標的本体を生じる。

胎盤ＤＮＡは、ジグｖ−ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）（セント・ルイス、ＭＯ）などの販売元から入手可能である。

ヒトゲノムで見出される通常の配列分布に相対するＤＮＡセグメントの多様性において配列存在分布か明らかにゆがんでいる有用な出発全ゲノムＤＮＡの例は、全ヒトゲノムを代表するものであるが、ヒトゲノム中にある一般的に存在するＤＮＡ反復配列の含量が豊富であるＤＮＡ組成物を含む。このようなりＮＡ上セグメント合物を含み且つ基剤とする本発明の生成物のプローブ組成物は、更に、ヒトゲノムと実質的に完全にハイブリッド形成しうろことを特徴とする。このような出発全ゲノムＤＮＡは、ライフ・チクノロシーズ・インコーホレーテッド（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、）、ゲイサーズバーグ、ＭＤからカタログ：５２７９５Ａとして入手可能なＣｏｔ−ｌＤＮＡによって代表される。Ｃｏｔ−ｌＤＮＡは、報告により下記の方法で製造される。すなわち、機械的に撹拌された全ヒトゲノムＤＮＡを、平均配列寸法４００ｂｐ未満までフラ　− グメント化する。この材料を変性させた後、それらの高度に繰返したＤＮＡ配ダＩの大部分を二本鎖にするのに十分な時間ハイブリッド形成させる。次に、二本鎖および一末鎖ＤＮＡ種の混合物をヌクレアーゼＳ１で処理（消イυし、ヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡを七ノーおよびオリゴ−ヌクレオチドに特異的に分解する。

消化されない二本鎖のＣｏｔ−ｌＤＮＡをこの混合物から回収する。Ｃｏｔ−ｌＤＮＡは、報告によると、平射法が約１９１ｂｐのセグメントの形である。

したがって、このような有用な出発全ゲノムＤＮＡ種は、先行技術で知られている方法によって変性し、部分的に再生または再ハイブリッド形成し、そして酵素によって処理してその非反復セグメントの量を減少した全ゲノムＤＮＡ由来である。

適当な出発全ゲノムＤＮＡのもう一つの例は、完全なヒトゲノムを総合的に適当に表わす全ゲノムＤＮＡのクローン化ライブラリーまたはクローン化ＤＮＡのセントである。ヒトゲノムのライブラリーは多数の源から入手可能である。例えば、このようなライブラリーはラムダＤＮＡかまたはコスミドベクターで、ストラタンーン・インコーホレーテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ、）（う・ホーヤ、ＣＡ）から入手することかできる。全ゲノムＤ　Ｎ　Ａ源は、予備製造したヒトＤＮＡライブラリーの場合、リンパ球、肺線維芽細胞、胎盤Ｄ　Ｎ　Ａ等を循環することができる。非ヒト動物種のゲノムから製造された予備製造ライブリーは、更に、組織および器官由来である全ゲノムＤＮＡライブラリーの特注調製試料であるようにこの会社から入手可能である。当業者は、出発全ゲノムＤＮＡおよびそれによって製造された生成物のプローブ組成物を、ハイブリッド形成法を行い、引続きの顕微鏡検査、天動血球計算法等を含む各種分析方法で用いることができることを理解する。

Ｃｏｔ−ＩＤＮ、Ａ（および同様に製造された材料）およびヒトライブラリーＤＮＡ双方は、典型的に、ヒトゲノム（すなわち、個々の染色体）に対してハイブリッド形成した場合に標的の実質的に完全な染色の外観を与えるハイブリッドを生じる本発明の直接標識プローブ組成物を生成するが、ハイブリッド形成した標的本体は、蛍光染料強度の比較的強い変化を個々に示すことがある。

個々の出発ＤＮ　Ａ配列の性質、構造および寸法、用いた種々の配列の数並びに出発全ゲノムＤＮＡに関孫した類似の変数は、生物毎のゲノムの固有の変化ゆえに、およびある与えられたゲノムに関する出発ＤＮＡ配列またはセグメント集団の組成が原語に、そして同−源から得られた全ゲノムＤＮＡのバッチ毎にでさえも変化することがあるので、絶対的な用語で規定することはできない。しかしなから、以下に記載したように達成された出発ＤＮＡ配列のフラグメント化後に、出発全ゲノムＤ　Ｎ　Ａは、関与した完全なゲノムをほぼおよび適当に示すものであるＤＮＡセグメントの混合物を生じる必要があり、そこにおいて、ゲノムの全領域中に存在しまたは通常位置しているセグメント化した領域に対して相補性である個々のセグメントが存在する。

しかしながら、ある与えられたゲノムからの出発全ゲノムＤＮＡの特徴的な複雑さは、本発明の観点から望ましいと現在考えられており、というのは、このような複雑さか、同一生物種から得られた種々の出発全ゲノムＤＮＡバッチから本明細書中に示したように製造される本発明の可能な直接標識プローブ組成物を、対比染色能力に関して実質的に同一の様式で作用させる傾向があるという理由による。例えば、全ゲノムＤＮＡの高度な複雑さは、例えば、多重染色体ゲノムの一部分、例えば単一染色体（すなわち、ペイントプローブ）または単一染色体の単一領域、例えば動原体領域とのみハイブリッド形成するように適合されている（そのＤＮＡ含量ゆえに）プローブ組成物中に存在しているようなあまり複雑でないＤＮＡとそれとを区別する。特徴的に且つゲノムＤＮＡの一般的な事実として、出発全ゲノムＤＮＡは、そこに存在するチオキンヌクレオチドの全数の約２５モル％のデオキシシチジンヌクレオチドを含むことを特徴とすると考えられる。

（２）出発結合性化合物本発明の実施において用いられる出発結合性化合物は、二官能性有機化合物、すなわち、出発結合性化合物分子当り２個の置換基官能性（すなわち、反応性）置換基を有するものである。

結合性化合物分子当り少なくとも１個のこのような官能性置換基は、（例えば、本明細書中で提供されたような）重亜硫酸塩に触媒された水性トランスアミノ化条件下においてポリヌクレオチド中のデオキシシチジンヌクレオチドと反応性である。このような置換基の例としては、アルキルアミノ（第一級および第二級）ヒドラジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド等がある。現在のところアミノ基が最も好ましい。

アミノ基が第二級である場合、第二級置換基は低級アルキル基であるのが好ましいが、所望ならば、他の非ブロッキングのこの種の第二級置換基を用いることができる。

結合性化合物分子当りの第二の別のこのような２個の官能性置換基は、（本明細書中に記載の）出発蛍光性化合物中にそれ自体組込まれている第三の官能性置換基と反応性である。このような第二官能性置換基は、それ自体がブロックされるかまたはブロックされないことがある。第二置換基がブロックされていない場合、それは、トランスアミン化中のトランスアミン化媒質（特に、ポリヌクレオチド）中に存在する他の物質と実質的に非反応性である。第二置換基かブロックされている場合、それは、トランスアミノ化中のトランスアミノ化媒質（特に、ポリヌクレオチド）中に存在する他の物質と実質的に非反応性である。

適当な非ブロックの第二官能性置換基群の例としては、アミノ、カルボキシル・ホスフェート、スルホネート、ヒドロキシル、ヒドラジド、セミカルバジド、チオ−セミカルパント等かある。現在量も好ましい非ブロックの第二官能性置換基としては、アミン（第一級または第二級）Ｍおよびカルボキシル基かある。

カルボキシル基は塩の形かまたは酸の形であるのか好ましいが、エステルの形であることか時々ある。塩の形である場合、現在好ましい陽イオンは、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属である。

適当なブロックされた第二反応性置換基群の例としては、ブロックされたスルホネート、ブロックされたホスフェート、ブロックされたスルフヒドリル等かある。

適当なブロッキング置換基の例としては、低級アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル等がある。

第一および第二官能性置換基は、リンカ−（または結合性）残基によって互いに結合している。この結合性残基は何等かの好都合な構造を有することかできるが、このようなものは、トランスアミノ化中のトランスアミノ化媒賀中に存在する他の物質と非反応性である。ここで好ましいのは、非環状または環状であり且つ場合により他の原子を組込むことができる炭化水素性の二価の基であることである。

このような二官能性結合性化合物中に存在する２個の官能性置換基は、結合性残基のそれぞれの置換基でありうる。このような置換基は互いに関係する隣接する炭素原子上にあることができるし、またはそれらは多数の介在する互いに結合した原子（好ましくは、炭素原子）によって結合性化合物分子中で互いに間隔をおいていることかできる。好ましくは、これらの官能性基は、ある与えられた結合性化合物分子中において互いにα、ω関係にある（すなわち、それぞれが異なる反対側の末端領域にある）。

したがって、結合性化合物中の２個の官能性基は、完全に炭化水素性である（すなわち、炭素原子および水素原子のみから成る）かまたは、酸素、硫黄、窒素、リン等から成る群より選択される少なくとも１個の原子を含む少なくとも１個の追加の原子または基を加えた炭素原子および水素原子から成る有機結合性基部分にそれぞれ結合している。好ましくは、このような追加の１個または複数の原子は、ある与えられた出発結合性化合物中に存在するこのような前記に示した２個の官能性基のどちらか一方よりも反応性が実質的に劣るようにこのような有機残基と結合している。飽和脂肪族炭化水素である炭化水素性有機残基が現在好ましく、更に好ましいこの種の残基は、２〜１２個までの炭素原子を有する二価のアルキレン基である。しかしながら、所望ならば、このような飽和脂肪族炭化水素基は少なくとも１個のエーテル基（−０−）かまたは少なくとも１個のチオ−エーテル基（−Ｓ−”）を組込むことができるが、このようなエーテル基がまたはチオエーテル基の一方のみが存在することが現在更に好適である。結合性化合物が、少なくとも２個および合計約２０個以下の炭素原子を有する有機基を組込むことは現在好適であるが、所望ならば、分子当り更に多数の炭素原子が存在することができる。

現在好ましいのは、このような官能性基がそれぞれアミノ基である結合性化合物である。非環状および環状双方のジアミノ化合物を用いることができる。

適当な脂肪族第一ジアミンの例としてはアルキレン第一アミンがあり、そのアルキレン基はプロピレン、ブチレン、ベンチレン、ヘキシレン、ノニレン等である。

適当な脂肪族第ニジアミンの例としては、ＣＨ３ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２、状のこのような化合物の例としては、１．３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン：１，４−ジアミノ−２，３−ジヒドロキシブタン；１，５−ジアミノ−２゜３．４−トリヒドロキシペンタン：１，６−ジアミツー１．６−シチオキシーＤ−マンニトール（またはＤ−グルシトール若しくはＤ−ガラクチトール）、１゜６− ジアミツー２．　３．　４．　５−テトラヒドロキシヘキサン等がある。

適当なポリヒドキシル化漂状次元の例としては、ジアミンが環に束縛されているシスまたはトランス環状ジアミノ化合物、例えば、ｌ、４−ジアミノ−２，３゜５．６−チトラヒドロキシシクロヘキサン、シスおよびトランス１．２−ジアミノシクロヘキサン、シスおよびトランス１．２−ジアミノシクロペンクンおよびそれらのヒドロキシル化誘導体、例えば、１．２−ジアミノ−３，４，５，６− チトラヒドロキシシクロヘキサン、１．２−ジアミノ−３，４，５−）リヒドロキシノクロベンクン、ミオ−イノシトールの３．６−ジアミツー３．６−ジチオキシ誘導体、例えば、等がある。

適当な複素環式ジアミンの例としては、ピペラジン、Ｎ、Ｎ’−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、それらの誘導体等がある。

適当なエーテル基含有ンアミ／の例としては、３−オキソ−１，５−ペンタンジアミン、３．６−シオキソー１．８−ジアミノオクタン等がある。

アミン基およびカルボキシル基双方を含む適当な結合性化合物の例としては、アミノ酸、例えば、サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）およびαアミノ酸、例えば、グリノン、アラニン、グルタル酸、アスパラギン酸、プロリン、ピペコリン酸くピペリシノー２−カルボ／＃）、インピペコリン酸（ピペリジン−４−カルクン酸）、グルコサミノ酸およびそれらの誘導体等がある。

α、ωアミノカルボン酸（前記に定義したアミノ酸に加えて）の例としては、４ −アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、８−アミノオクタン酸等がある。

リン含有二官能性結合性化合物の例としては、α、ωアミノアルキルリン酸、モノエステル、例えば、〇−（２−アミノニチル）リン酸二ナトリウム塩等がある。

適当な硫黄含有二官能性結合性化合物の例としては、α、ωアミノアルキルスルホ／酸、例えば、タウリン（２−アミノニチルスルホン酸）等がある。

二官能性結合性化合物の一つの現在更に好ましい種類は下記の一般式（式中、Ｘは、から成る種類より選択される二価の基であり；Ｒは、２〜１２個までの炭素原子を有するアルキレン基またはベルヒドロキシル化炭素環状環であり、そしてＲ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素および低級アルキルから成る種類より選択される）によって表わされる。

好ましくは、式（１）においてＲは７個以下の炭素原子を有し、満の炭素原子を有する。

種々の結合性化合物、例えば、モノおよび／またはジアミンの混合物を含む結合性化合物の混合物を用いることができるが、このような混合物は、トランスアミノ化制御および使用に関連した問題ゆえに好適ではない。

約７のｐＨ値で遊離非プロトン化種として存在するその比率が大きいことを特徴とするジアミンは、本トランスアミノ化反応を増大させると考えられる。エチレンンアミン（ｐＫ約７．６）は、この性質ゆえに、反応性二官能性アミンとして用いるのに現在量も好適である。

例えば、このような結合性化合物を、以下に記載したように、トランスアミノ化反応を用いてＤＮＡ配列に結合させる場合、トランスアミノ化反応は、結合性化合物中のアミノ基か配列またはセグメントに結合するように行われる。次に、得られた結合性基において、１個の官能性基は自由に更に反応する状態のままである。したがって、第二官能性基がアミン基である場合、引続きこのような基は、以下に記載したように、蛍光性化合物と自由に更に反応する状態のままである。

第二官能性基がカルボキシル基である場合、引続きこのような基は、以下に記載したように、蛍光性化合物と自由に更に反応する状態のままである。

なくとも１個の発蛍光団置換基（または基）および１分子当り更に１個の官能性（すなわち、反応性）置換基（または基）を組込む。

官能性置換基は、トランスアミノ化したポリヌクレオチドの結合性基（例えば、本明細書中に記載したように製造される）中に組込まれた残留する第二官能性置換基と反応性であるように選択される。結合性基は、（前記に記載の）結合性化合物由来である。

例えば、出発蛍光性化合物において、反応性置換基は、（前記に定義の）アミノ置換基と、または（前記に定義の）酸または塩の形であるカルボキシル置換基と反応性であるように選択することができる。

結合性基中のこのようなアミノ置換基との（以下に記載の反応を用いる）反応性のために、蛍光性化合物の反応性置換基は、好都合なアミン反応性官能基、例えば、（前記に定義したような）酸または塩の形であるカルボキシル置換基、アルテヒド基等であることかできる。現在好ましいこの種の反応性置換基は、インチオシアネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、塩化スルホニル、カルボン酸アンド等から成る群より選択され且つそれによって例示される。

結合性基中のこのようなカルボキシル置換基との反応性のために、蛍光性化合物の反応性置換基は、好都合なカルボキシル反応性官能基、例えば、（前記に定義したような）第一級または第二級の形であるアミノ置換基等であることができる。現在好ましいこの種の反応性置換基は第一級アミン置換基である。

更に、反応性置換基は、例えば、チオール、リン酸エステル等であることか時々あり、その選択は、結合性基中に存在する反応置換基の性質に依存する。

概して、発蛍光団置換基または基はいずれも、出発蛍光性化合物中で用いることができる。蛍光性化合物当り２個以上の発蛍光団置換基を用いる場合、各発蛍光団置換基は、単一の蛍光性化合物中の他のものに対して構造か似ているかまたは同一であることか現在のところ好ましい。ここで好ましいのは、蛍光性化合物１分子当り約１〜約３個の発蛍光団置換基を育する蛍光性化合物を用いることであり、そして最も好ましくは、蛍光性化合物は蛍光性化合物１分子当り１個の発蛍光団置換基のみを含む。

好ましくは、出発蛍光性化合物の分子量は、一層大きい分子量が、相補的標的配列との生成物プローブのハイブリダイセージクン能力によって悪影響を与える可能性があるので、約５０００以下であり、更に好ましくは、約１０００以下である。

検出能力の根拠に関して、出発蛍光性化合物およびその中の発蛍光団基は、あの吸光係数を有し、そして更に少なくとも約０．０２の量子収量を有する。［吸味するその慣用的な意味で用いられる。同様に、「量子収量」という用語は、本明細書中において、発蛍光団によって吸収されたプロトン数当りの発蛍光団によって放射されたプロトン数を意味する慣用的な意味で用いられる。

代表的な且つ現在好ましい出発蛍光性化合物を下記の表１に示す。

代表的な出発蛍光性化合物１．７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、スクシンイミジルエステｘＲｄ）という名称でも知られている。

３、５−（および−６）カルボキサミダミン１０１、スクシンイミジルエステル：５−（および−６）カルボキシ−Ｘ−ロダミン、スクシンイミジルエステル（ＣＸＲ）２という名称でも知られている。

４、リサミンロダミンＢスルホニルクロリド（ＬｉｓＲ）。

５．５−（および−６）−カルポキシフルオレセイススクシンイミジルエ７．７ −ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＤＥＣＣＡ）。

８、テトラメチルロダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート（ＴＲＩＴｃ）２゜９、５−（および−６）−カルポキシテトラメチルロダミン、スクシンイミジルエステル（ＣＴＭＲ）２゜１０．７−ヒトロキンクマリンー３−カルボン酸、スクシンイミジルエステル（ＨＣＣＡ）。

１１、ｓ−Ｈフルオレセイン−５−（および−６）−カルボキサミド］へキサン酸（ＦＣＨＡ）２゜１２、Ｎ（４，４−ンフルオロ−５，７−シメチルー４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、スクシンイミジルエステル、５．７−ジメチルＢＯＤＩＰＹ””プロピオン酸、スクシンイミジルエステル（ＤＭＢ　Ｐ＞という名称でも知られている。

１３、「活性フルオレセイン誘導体Ｊ　（ＦＡＰ）；この化合物は、スペーサー基によってＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル反応性基に結合したフルオレセイン核から成り、モレキュラー・ブローブズ・インコーホレーテッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、）という製造業者によりｒＦＡ１６、カスケード７Ｍブルー（Ｃａｓｃａｄｅ　ＴＭ　Ｂｌｕｅ）アセチルアジド（ＣＢＡＡ）＋１−ヒドロキシ−３，６，８−ピレントリスルホン酸の〇−アセチルアジド誘導体である。

１、これらの化合物に関して用いた略語を括弧内に入れる。若干の化合物に対しては、商標名を含む別の名称を提供する。ＴＭはモレキュラー・ブローブズ・インコーホレーテッドの商標を意味する。「スクシンイミジルエステル」という用語は、発蛍光団のカルボン酸置換基およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド間に生成されたエステルを意味し、そして「Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル」若しくは「ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル」またはｒＮＨＳエステル」とも称する。

２６　ある種のフルオレセインおよびロダミン誘導体は、５位かまたは６位に結合した反応性置換基（カルボキシまたはイソチオシアネート）を含む。これらの化合物は、５−（および−６）と示した２種類の異性体の混合物として、または多くの場合精製された異性体として得ることができる。Ｗｔ識および蛍光性は、異性体間でまたは特定の異性体およびその混合物間で大きく変化しないと考えられる。上記に示した異性体または混合物は、標識付は実験において用いたものであった（実施例を参照されたい）。

表１の蛍光性化合物は全て、モレキュラー・ブローブズ・インコーポレーテ・ンド、ニージーン、ＯＲから入手した。

当業者が容易に理解するように、出発蛍光性化合物は、単一の標本において発蛍光団励起の条件下で生じて、ゲノム、特定の染色体若しくは染色体の特定の領域または関与したゲノム中にある類似のものなどの、同一のまたは同類の核型に集中する何等かの同時にまたは連続的に用いた他のプローブまたはプローブ組成物の発蛍光団基含有標識部分によって放射された光の色と対照する色の光を放射するある一定の生成物であるプローブ組成物を製造するのに用いるために選択されるのが好ましい。

（Ｃ）プローブの製造（１）豆晩出発ゲノムＤＮＡ配列の特徴とする比較的大型の典型的な寸法ゆえに、（標識された後に）比較的不十分なハイブリッド形成能力を示しがちであることは明らかである。

更に、ヌクレオチドｆＪ１１、特に、発蛍光団含有標識残基に対して標識残基を結合するための従来の既知の先行技術化学合成法は、配列ごとの標識残基の配置および数を調節する問題、更には配列変更の問題を生じがちである。これらの問題は、得られたプローブの、所望のゲノム標的材料とのハイブリダイゼーション能力に、そして遂には、標本中に存在する全ゲノムＤＮＡの対比染色による検出に悪影響を与えることがある。

ここで、これらの問題を克服することができ、そしてプローブ組成物が本明細書中に記載されているようなゲノムに由来したＤＮＡセグメントの混合物から成り、そこにおいてセグメントは結合性基によって発蛍光団基に化学的に結合している場合、優れたハイブリッド形成能力を有する直接標識プローブ組成物およびｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法でのゲノム対比染色目的のプローブ性能特性が存在することを発見した。

種々の方法を用いてこのようなプローブ組成物を製造することができる。下記の手順工程で行われる現在好ましい且つ例示の製造方法をここに記載する。

（ａ）全ゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ配列をＤＮＡフラグメント（またはセグメント）にフラグメント化しくすなわち、破壊し）：（ｂ）配列中（そして結果的には誘導されたセグメント中）に存在するデオキシシチジンヌクレオチドを（前記に記載の）結合性化合物でトランスアミン化し；そして（Ｃ）このように製造されたトランスアミノ化結合性基の残基を（前記に記載の）蛍光性化合物と共有結合させる。

工程（ｂ）または工程（ｂ）および（Ｃ）が工程（ａ）に先立つことができる場合、工程（ａ）が工程（ｂ）に先立つのが現在好ましい。下記の説明において、前述の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の配列順序を本構成の目的に用いる。

このような工程配列の他の組合わせおよび変更も、本発明のプローブ組成物を製造する場合に用いるのに適している。例えば、蛍光性化合物を結合性化合物に共有結合した後にトランスアミノ化し、そして最後にＤＮＡ配列を（本明細書中に提供したのと同様の工程条件を用いて）フラグメント化することができるが。

しかしながら、この方法は、トランスアミノ化反応における発蛍光団基の一層低い溶解度のために低収率になりがちである。

（２）フラグメント化ＤＮＡセグメントは（前記に特性決定された）出発全ゲノムＤＮＡ由来である。

フラグメント化する前の出発ＤＮＡの平均寸法は少なくとも約１５０ｂｐであるのが好ましい。フラグメント化後のＤＮＡセグメントの平均寸法は、約１５０〜約６００ｂｐの範囲内であるのが好ましく、現在更に好ましい平均寸法は約１８０〜約４００ｂｐであり、そして現在最も好ましい平均セグメント寸法は約３００ｂｐである。これらのセグメントフラグメントはそれぞ枳このようなセグメントフラグメントが由来したゲノムの一つまたはそれ以上の染色体に存在する一つまたはそれ以上のＤＮＡ配列に存在するセグメント部分に対して相補的であると考えられる。

与えられたいずれの場合においても、出発ゲノムＤＮＡ配列に由来したフラグメントの数は未知であり、おそらくはバッチごとに変化しうるし、そして多い。

更に、個々のフラグメントのヌクレオチド配列の構造は未知であり、そしておそらくはバッチごとに変化しつる。与えられたいずれの場合においても、与えられた出発全ゲノムＤＮＡ配列から生成される出発フラグメントの数は１０００で最小値であると現在のところ推定される。生成物であるプローブ組成物のゲノムＤＮΔを対比染色する能力およびそれによって形成されたハイブリッドの蛍光の明るさに関係した根拠に対して、現在、平均寸法が前記に示した範囲で比較的均一であるＤＮＡフラグメントを用いるのが望ましいと考えられる。

当業者か容易に理解するように、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、制限酵素またはポリメラーゼを用いるような酵素処理等：制限されたＤＮアーゼＩ消化：制限されたマ／グヒー７ヌクレアーゼ消化、音波処理：フレンチプレスでのＤＮＡ剪断、細ゲージ針によるＤＮＡ剪断：等を含む様々な既知の技法によって出発ゲノムは配列から生成することができる。

しかしながら、出発全ゲノムＤＮＡの音波処理によってこのようなりＮＡフラグメントを生成するのが現在極めて好適である。現在好ましい音波処理条件は、約０．０５〜約４ｍｇ／ｍｌの範囲であるのが好ましい出発全ゲノムＤＮＡの水性分散液を用いるが、より小ざいおよびより大きい濃度を用いることができる。

適用される超音波周波数は約２０，０００サイクル／秒の範囲であるのが好ましく、好ましくは、試料が入っている試験管を冷却洛中に浸漬して試料の加熱を減少させながら約１〜約１０分間の範囲の合計時間で適用する。適当な冷却浴としては、水浴並びにドライアイスおよびエタノールか入っている浴がある。このような超音波処理が行われるＤＮＡ配列材料に適用されるニネルギー密度は変化しうる。例えば、水溶液中において試験管の底部から約２〜約５ｍｍに位置したマイクロチップを用いるブランワン・ソニファイア−（ＢｒａｎｓｏｎＳｏｎｉｆｉｅｒ）４５０型（ダンベリー、コネチカット州）の場合、適当な出力は約２５〜約３０ワツトの範囲である。好ましくは、このような超音波エネルギーは、本明ｍ＊中下記に例示したように、約８０％オンタイムおよび相対的に約２０％オフタイムを用いて約５分間の合計時間で適用する。

好ましくは、出発ゲノムＤ　Ｎ　Ａは、配列がトランスアミン化される前にフラグメント化される。

フラグメント化の方法とは無関係に、出発全ゲノムＤＮＡを含む多数の配７１１の７ラグメント化の結果、このような出発ＤＮＡ配列の多数のフラグメントを生じる。この豊富さは、用いられたゲノムを含む個々の染色体のそれぞれにおいて多数のことなる位置または領域のそれぞれに個々に存在するＤＮＡセグメントを含む。

ここで特徴的に、出発ＤＮＡ配列（および結果的にそれらに由来したフラグメント化セグメント）は、１００モル％の全ヌクレオチド基準で平均少なくとも約２５モル％のデオキシシチジンヌクレオチドを含むと考えられる。

明らかに、出発全ゲノムＤＮＡを既にフラグメント化した状態で商業的に入手する場合、例えば、Ｃｏｔ　ｌＤＮＡの場合、トランスアミノ化を行うような引続きの工程の前に別個のフラグメント化工程を必要としない。

したがって、フラグメント化セグメントは、ある与えられたゲノムの全ゲノムＤＮＡ由来であり且つこの全ゲノムＤＮＡ中に存在するセグメントをほぼ代表している混合物である。セグメント寸法は前記に示した範囲内である。このようなりＮＡ上セグメント合物は、全ゲノムＤＮＡを含むＤＮＡ配列からいずれの好蔀台な方法によっても製造することができる。ヒトゲノムが現在好ましい。

染色体検出用の直接的に検出しうるゲノムＤＮＡ対比染料として有用である本発明のプローブ組成物を製造するのに現在好ましい個々の出発混合物としては、（ａ）音波処理されており、それによって平均寸法が約１５０〜約６００ｂｐ（好ましくは、約２００〜約４００ｂｐ）のＤＮＡセグメントにフラグメント化されたヒト胎盤ＤＮＡ　；（ｂ）約１５０〜約６００ｂｐ　（好ましくは、約２００〜約４００ｂｐ）のセグメント寸法に音波処理および／または消化されており且つＤＮＡセグメントが、例えば、本明細書中または先行技術において示されたような技法などを用いて変性、選択的再ハイブリダイゼーションおよび酵素消化を更に施されて、それによって、ゲノム中に天然に存在する反復ＤＮＡセグメントの量と比較して反復的（すなわち、反復）ＤＮＡセグメントに富むが、天然に存在するよりも少ない量までであるとしても、完全なゲノムじゅうに存在する典型的な領域またはＤＮＡセグメント部分に特異的であるＤＮＡセグメントをなお含んでいるＤＮＡセグメント混合物を生じた全ヒトゲノムＤＮＡ、および（Ｃ）音波処理によって約１５０〜約６００ｂｐ　（好ましくは、約２００〜約４００ｂｐ）のセグメント寸法にフラグメント化されており且つＤＮＡか細菌等からクローン化したゲノムライブラリーとして製造された全ヒトゲノムＤＮＡントの出発混合物中に存在しているデオキシシチジンヌクレオチド全部の約１〜約７０％がこの種の結合性基でこのように置換されているようにある。好ましくは、出発ＤＮＡ配列またはＤＮＡセグメントのこのような混合物中に含まれたデオキシシチジンヌクレオチド全部の約２〜約２４モル％をこのようにトランスアミノ化する。言い換えると、ＤＮＡフラグメントまたは配列中に存在する全ヌクレオチドの約０．　２〜約１８モル％、好ましくは、約０．５〜約６モル％をトランスアミン化する。このようなトランスアミノ化は、実質的にはデオキシシチジンヌクレオチドのみを必要とする。最も好ましくは、存在する全ヌクレオチドのましいので、各配列は、所望により、トランスアミノ化操作中に少なくとも１個せると考えられる。高アミノ化水準は、例えば、ＣＴＭＲおよびＤＥＣＣＡで標識されたプローブの特異性に大きいように影響しない。より少ない程度までのトランスアミノ化は、生成物ハイブリッドを検出する場合に生じた蛍光の明るさに悪影響を与えると考えられる。

便宜上、トランスアミノ化は、水性液相条件下において重亜硫酸塩触媒の存在下で達成される。ＤＮＡ配列（またはセグメントフラグメント）の濃度は、便宜上的０．１〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲であり、重亜硫酸塩陰イオンの濃度は、便宜上的０．５〜約１．４モル／１　（但し、ｒｌＪはリットルを意味する）の範囲で囲であり、そして接触時間は、典型的に且つ例示的に、（望ましいアミノ化水準に応じて）約３〜約７２時間の範囲である。

本トランスアミノ化手順において、便宜上、重亜硫酸塩をアルカリ金属塩の形で導入し、ナトリウムおよびカリウムが好ましいアルカリ金属である。

トランスアミノ化の時点で、結合性化合物は水性トランスアミノ化媒質中に溶解する。

トランスアミン化中に、ＤＮＡ配列またはセグメントを、例えば、カオトロープ存在下でトランスアミノ化を行うことによって、または水中のＤＮＡ配列若しくはセグメントの予備沸騰を、例えば、約１〜約１０分間の後、（現在好ましい）約４℃未満の温度まで冷却することによって、或いは双方の手順の組合わせによって変性させるのが好ましい。

トランスアミノ化においてカオトロープを用いる技法および利点は、本明細書と同一日付で出願され且つ譲受人の事件整理番号３０，４５６によって確認されるビトナーら、同時係属米国特許出願第０７／７６２，９１２号明細書に記載されており、このような内容は参考として本明細書に包含される。

ＤＮＡフラグメント混合物の複雑さは、沸騰によるＤＮＡフラグメントの変性後に達成されたトランスアミノ化の程度によって例示され且つ代表される。トランスアミノ化は一本ｍＤＮＡ上にかなりの比率で存在するだけであり且つ改質速− らの同時係属出願に示されたように、同一条件下でアミノ化されてペイントプローブを生じるＤＮＡ混合物に特有であるよりも大きい程度までトランスアミノ化することが分かる。実際に、本トランスアミン化において、穏やかなトランスアミノ化条件の使用は、前記に示した範囲を越える過アミノ化を避けるのに好ましい。過アミン化の〜つの悪影響は、トランスアミン化した配列およびセグメントの相補的特性並びに望ましい相補的標的ＤＮＡにハイブリッド形成するそれらされた範囲内で変更して、ある与えられた結合性化合物反応体による望ましい程い程度のトランスアミノ化が得られるまで実施しまたは続ける。概して、最大程度のトランスアミノ化は、本発明のプローブ組成物を用いるｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法の際に、関与したヌクレオチド配列若しくはセグメントの相補的特性に対する悪影響かまたは標本、スライド調製試料等に存在するような標的ＤＮＡ若しくは標的ＤＮ、Ａの他の構成成分を用いる引続き標識されたプローブの非特異的結合の量の増加を引き起こすまたは引き起こし始めるトランスアミン化の達成するという目的によって決定される。低アミノ化水準でさえもこのような均一性を提供する。

低水準のトランスアミノ化を好むもう一つの因子は、実際に、例えば、本発明の対比染色用プローブ組成物との組合わせで用いた他のプローブ組成物によって達成された部分的または特異的染色を不明瞭にしないように相対的に僅かにのみ対比染色された、ある与えられた試料または標本中に存在する全ゲノムＤＮＡの地染色の強さは、所望ならば、ある与えられた標本等において望ましいバックグラウンド対比染色着色強さを達成するように容易に調節するかまたは減少させることができる。このような減少は種々の技法によって、例えば、結合性基トラン物の結合が（下記に記載したように）行われる時間前に、非標識出発全ゲノムＤンシチジンヌクレオチドを少なくとも予め決定されたモル百分率でトランスアミアミノメタン（ＴＲｆ　Ｓ）等に対して、慣用的な透析用膜および周囲温度を用いを濾過、遠心分離等によって分離する。

トランスアミノ化した結合性基および共有結合した発蛍光団基の追加の存在を除いて、出発Ｄ　Ｎ　Ａ混合物中に存在するものと実質的Ｉこ同一であると考えられる。

例えば、トランスアミノ化したＤＮＡセグメントにおける結合性基の末端基に対する蛍光性化合物の共存結合または結合は、便宜上、水性液相条件下において約４〜約５０℃の範囲の温度、約１０〜約５００μｇ／ｍ＋の範囲のトランスアミノ化ＤＮＡ濃度、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの反応のための近中性ｐＨ（例えば、約６〜８のｐＨ）およびイソチオシアネートとスルホン酸塩化物の反応のためのアルカリ性ｐＨ（例えば、ｐＨ８，５〜９．５）並びに典型的且つ例示的に約２〜約１８時間の範囲である時間を用いて行うのが好都合である。

典型的に且つ好ましくは、存在する出発蛍光性化合物の量は、トランスアミノ化ＤＮＡ配列中に存在していると推定される結合性基の全量に相対して実質的モル過剰を与えるのに十分である。与えられたいずれの場合においても、最適のモル過剰は、便宜上、フラグメント中に存在するアミノ化デオキシシチジンヌクレオチド残基の濃度に相対して決定することができる。

理論上は、蛍光性標識化合物の量がプローブＤＮＡ中のアミノ化デオキシシチジンの量に等しいことを必要とするだけであるが、若干の蛍光性化合物分子は、ＤＮＡに対する標識の結合をもたらさない他の経路、例えば、水との反応（至）水分解）によって反応し、それによって脂肪族アミン基と非反応性の標識化合物を与えるので、通常、過剰は極めて好ましい。更に、過剰の標識化合物を用いてアミノ化デオキシシチジンとの反応速度を増大させ、その結果反応はより短時間で完了する。大過剰は、イソチオシアネートなどの加水分解に対して感受性の少ない化合物に相対して、加水分解に一層感受性の化合物、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびスルホン酸塩化物を標識するのに必要である。アミン化デオキシシチジンに対して小過剰の標識化合物は低百分率のプローブ標識をもたらすことがあるが、大過剰の標識化合物は、高標識百分率を与えるのに好都合であることができる。完全な標識を達成するのに必要な標識化合物の過剰量は、標識反応に対して不都合ではない。しかしながら、極めて高い標識化合物量は、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法等で生成物プローブ組成物を用いる前に未反応の蛍光性化合物のほとんど全部を除去する必要があるので、反応後精製の問題をもたらすことがある。したがって、約２５０倍のモル過剰を越える過剰などの極めて大過剰の蛍光性化合物は避けるべきである。

例えば、蛍光性標識化合物がスクシンイミジル誘導体（すなわち、カルボキシル置換発蛍光団等のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）または対応するスルホン酸塩化物誘導体である場合、残留する結合性化合物を含むトランスアミノ化ＤＮＡ配列を、便宜上、約１００〜約２００倍モル過剰の蛍光性標識化合物と反応させ、ここで好ましいのは約１５０倍モル過剰である。

例えば、蛍光性標識化合物かインチオシアネート誘導体である場合、トランスアミノ化ＤＮＡ配列を、便宜上、約５０倍モル過剰の蛍光性１１ｍ化合物と反応させる。

生じる反応において、共有結合は出発蛍光性化合物の反応性基と、ＤＮＡ配列に結合している（結合性化合物由来の）トランスアミン化結合性基の末端基との間で生じると考えられる。好ましくは、１分子当り１個の結合性基の少なくとも１個の末端基を、用いた蛍光性化合物と反応させる。典型的には、結合性基の約１０〜約１００モル％の末端部分を反応させ、そしてこのように蛍光によって標識する。好ましくは、効率のために、その少なくとも７０モル％をそのように標識し、そして最も好ましくは、その約９０モル％をそのように標識する。

反応時間の最後に、プローブに共有結合しなかった残留する結合性化合物を、種々の方法、例えば、ＤＮＡの沈澱、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、透析、ゲル電気泳動およびこれらの方法の組合わせによって除去することができる。標識プローブを精製するのに組合わされた手順の数および種類は、これらの標識化合物の凝集体の寸法を含む標識化合物の寸法並びにイオン性および疎水性相互作用などによって標識ＤＮＡと非共有結合するそれらの能力に依存する。未反応標識化合物を適当に除去する一つの手順は、エタノール沈澱工程の後にゲル浸透クロマトグラフィ一工程、続いて第二のエタノール沈澱工程を行う。得られた沈澱標識プローブは水に溶解してプローブの貯蔵溶液を提供することができ、それを他のハイブリダイゼーション成分（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、緩衝液および特異的プローブ組成物）と組合わされた場合にｉｎ　５ｉｔｕハイブリッド形成反応で直接的に用いることができトランスアミノ化ＤＮＡ配列および選択された蛍光性化合物の得られた反応生成物は、本発明のプローブ組成物を含む。

（５）直接標識プローブ組成物例えば、ＤＮＡセグメントが発蛍光団基に結合している直接標識プローブ組成物を提供する。このようなプローブ組成物は、ゲノムＤＮＡの対比染色で用いるのにおよび選択された多重染色体ゲノムの標的ゲノムＤＮＡを含む標本中でのその存在をｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法等によって検出するのに適している。

このようなプローブ組成物は、多数の位置のそれぞれに個々に存在するゲノム成分染色体それぞれの至る所に存在する多数の種々のＤＮＡセグメントを含む。これらのＤＮＡセグメントは、それらの全デオキシシチンンヌクレオチドの約１〜約７０モル％が、末端官能性（または反応性）基を保持している結合性基構造で置換されている。このような保持された末端官能性基全部の少なくとも約１０％は、発蛍光団置換基を組込む個々の基に対してそれぞれ共有結合した。本発明のプローブ組成物をこのようにして含むこのような標識された多数のＤＮＡセグメントの一つ一つは、選択されたゲノムのＤＮＡじゅうＩこ存在する多数の位置それぞれに存在する領域で見出された相捕的ＤＮＡセグメントに対してハイブリッド形成しつる。

好ましくは、本発明のプローブ組成物において、この二官能性結合性基は、式から成る二価の基より選択され：Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素および低級アルキルから成る群より選択され：ｍおよびｎはそれぞわ、１〜６までの独立して選択された整数であり、そしてｐは０または１の整数であり：そしては、１個の前記ＤＮＡ配列のデオキシシチジンヌクレオチドに対してトランスアミノ化しており且つ基−Ｘ−は、一つの前記Ｗ識残基に対して共有結合している）を特徴とする。

したがって、本発明の直接標識プローブ組成物は、ある与えられたゲノムの全ゲノムＤＮＡに由来し且つそれをほぼ代表するものであるＤＮＡセグメントの混合物を含む。現在好ましいゲノムはヒトゲノムである。これらのＤＮＡセグメントは介在する結合性基によって発蛍光団基に化学的に結合している。本発明のプローブ組成物の特徴を、便宜上、下記の表ＩＩに要約する。

表＋１本発明のプローブ組成物の特徴１、ＤＮＡセグメントの混合物１．１　個々のセグメントの　１５０〜６００　２００〜４００　約〜３００平均寸法ｂｐ１．２　結合性基で置換した　１〜７０　２〜２４　４〜２０ＤＮＡセグメント中の全デオキシシチジンのモル％２、二官能性結合性基２．１　炭素原子数／基　２〜２０　２〜６２２．２　結合性基数　０．４〜１００１〜２４　３〜１５／ＤＮＡセグメント３、発蛍光団基３．１　発蛍光団残基数　１〜１０１１／発蛍光団基３．２　発蛍光団で置換した　１０〜１００　７０〜１００　９０〜１００全結合性基のモル％３．３　発蛍光団／セグメント　０．０４〜１０００　０．７〜２４　２．７〜１５本発明のプローブ組成物は利用する、すなわち、ハイブリッド形成法での直接使用に適合する乾燥固体（特に、粒状）形態、水溶液および水性配合物を含む各種形態で製造し、販売し、そして使用することができる。

水性媒質中において、本発明のプローブ組成物は実質的に完全に溶解した形態であるのが好ましい。当業者が理解するように、プローブ組成物の水性配合物゛　（ハイブリダイセージタン溶液を含む）の含量は、多くの変数および目的に応じて広範囲に変化することができる。例示の実施例に関して、ハイブリダイセージタン溶液の一つの適当な種類は下記の表ＩＩＩに特性表示したような組成を有する。

表ｌｌｌ１ｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法での使用に適した代表的な種類のプローブ組成物２、変性剤　０〜８０％（ｖ／ｖ）　５０〜８０％（ｖ／ｖ）３、ハイブリッド形成速度　０〜１５％（Ｗ／ｖ）　８〜１２％（ｗ／ｖ）促進剤４．１種類または複数の　５〜１００ｍＭ　１０〜５０ｍＭ緩衝塩５、ハイブリッド安定化塩　０．０５Ｍ〜ＬＭ　０．２Ｍ〜０，５Ｍ６、ブロッキングＤＮＡ　Ｏ〜１μｇ／μＩ　Ｃｏｔ−ｌＤＮＡ０．　１〜０．３μｇ／μｌヒトＭ日閤ＤＮＡ０、　２〜０．　７μｇ／μ１７、水　残余　残余表ＩＩＩのこのようなプローブ組成物において、変性剤はプローブ組成物中に存在するＤ　Ｎ　Ａセグメントの変性を促進するように作用する。このように促進された変性は、それが変性およびハイブリダイセージタンに用いた温度を低下させるので望ましい。当該技術分野で知られている種々の変性剤を用いることができるが、現在最も好ましい変性剤はホルムアミドである。

同様に、当該技術分野で知られている種々のハイブリダイセージタン速度促進剤を用いることができる。現在最も好ましいハイブリダイセージタン速度促進剤は硫酸デキストランである。

同様に、当該技術分野で知られている種々の水溶性緩衝塩を用いることができる。ここで好ましいのはプローブ組成物溶液のｐＨを約５．５〜約８．５の範囲の値で保持することである。ｐＨをこのように保持するのに適した緩衝塩としては、例えば、クエン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸等がある。現在好ましい緩衝塩組成物はクエン酸（またはクエン酸ナトリウム）を含むことができる。

同様に、ハイブリッド形成法の際に生成したハイブリッドの安定化を促進するハイブリッド安定化塩は望ましい。当該技術分野で知られているハイブリッド安定化塩、例えば、Ｎ　ａ　ＣＩ、ＫＣＩ、ＭｇＣｌ２等を用いることができる。しかしながら、現在最も好ましいこの種の塩は塩化ナトリウムである。

用いられる水は予め蒸留または脱イオンするのが好ましい。

表ＩＩＩのプローブ組成物の、場合によるが好ましい成分はブロッキングＤＮＡ組成物である。

本発明のプローブ組成物の製造における希釈剤Ｄ　Ｎ　Ａの使用は、ハイブリッド形成した標的での蛍光強さを調節する一つの手段として前記に論及されている（トラ〉スアミノ化についての前記の部分を参照されたい）。希釈剤ＤＮＡは、更に、ブロッキングＤＮＡ組成物として並びに蛍光強さおよびハイブリッド形成特異性を調節する手段として作用することができる。ヒトゲノムまたはその染色体中で的にされている本発明のブロックされたプローブ組成物に現在好ましいブロッキングＤＮＡ組成物としては、フラグメント化したヒト胎盤ＤＮＡおよびＣｏＬ−１かある。

ブロッキングＤＮＡ組成物は、特定のプローブ調製試料を本発明の標識ゲノムプローブ組成物と組合わせて用いる場合、その特定のプローブ調製試料が非標的染色体中の同一の反復配列にハイブリッド形成するのを妨げるので有益である。

このようなハイブリダイセージタンは、更に、本発明のプローブ組成物がハイブリッド形成条件下で標的とハイブリッド形成する時点でブロッキングＤＮＡ組成物が存在する場合に生じる。セグメント領域に相補的な標的に対するブロッキングＤＮＡ組成物ＤＮＡセグメントのハイブリダイセージタンも生じる。このようなハイブリダイセージタンの効果は、標的組成物に対するハイブリダイセージタン後にある与えられたプローブ組成物によって生じた蛍光の強さを調節することである。ここでは、存在するブロッキングＤＮＡ組成物の量は、ハイブリダイセージタン後に観察されたハイブリッド強さに逆比例すると考えられるが；しかしながら、その関係に影響を与える多くの変数が存在すると考えられる。本発明のプローブ組成物およびブロッキング組成物の得られた混合物は、場合により、標的とのハイブリダイセージタンに引続き用いられる前の時間にハイブリッド形成条件を施されることがある。或いは、ハイブリッド形成条件下での標的とのハイブリダイセージタンに関して、変性したブロックプローブ組成物を用いることができる。

表ＩＩＩの組成物は、ハイブリッド形成法での使用時間に一緒に混合される予め製造された前駆物質組成物から製造することができる。このような前駆物質組成物を「キットと称することができる。

プローブ組成物がゲノム対比染料として作用することができる方法および理由の分析をここで理論として提供するが、本明細書中の意味はそれによって拘束されるものではない。

光学顕微鏡を用いて観察された標本中の種々の点から放射された光は、それらの点が別個に区別されるように、回折限界より大きいことによって分離する必要かある。回折限界は５００ｎｍの波長の可視光線に関して約０．４μｍである。

蛍光発光の点が互いに密集する場合、それらは単一の点として見られる。この情報を用いて、染色体に対してハイブリッド形成する必要がある全ゲノムＤＮＡプローブセグメントの部分に接近することができ、顕微鏡検査下で実質的に完全な被覆面（ｃｏｖｅｒａｇｅ）であるように見えるものを提供するようにする。したがって、完全な被覆面すなわち染色は、得られたハイブリッドそれぞれの発蛍光団基が互いに隣接するこのような基から約０．　４μｍ以下に位置しているような方法でプローブが標的ＤＮＡに対してハイブリッド形成した理論的な条件であると考えることができる。

この場合を、理論的に、図面によって、そして例証的に、姉妹染色分体３１および３２を含む単一の中期染色体３０に関して図１に示し、そこにおいて、個々のハイブリッド形成したプローブ（またはハイブリッド部分）それぞれを小点３３で表わす。単純に、視野の深さは、染色体３０の全深さが観察者に見えるように十分に大きいと考えられ、そして染色体３０は二次元であると考えることができる。染色体３０の実質的に完全な被覆面に必要なハイブリッド形成プローブの理論上の数は約７．２プロ一ブ／μｍ２である。

この場合を更に図２に図示し、染色体３０および小点３３の理論上の拡大範囲を示す。小点３３はそれぞれが他のものと０．４μｍずつ離れており、４個の小点３３（またはブロー力を含む小領域を点々の四角形３４で輪郭を描き、その四角形３４の寸法は０．６９２μｍＸＱ、８００μｍであり、したがって、４ドツト１０．５５４μｍ２すなわち７．２ドツト１０．５５４μｍ２を提供する。

個々の染色体中の塩基対密度は、顕微鏡下で中期染色体を見る場合に染色分体の近平均二次元寸法から概算することができる。平均染色分体長さをここで約３μ ｍとし且つ平均幅をここで約０．５μｍとして、約１．５μｍ２／染色分体の面積が得られる。ヒト中期染色体の正常のセット中には９２個の染色分体（４個／染色体対）があるので、全染色体面積は１３８μｍ２である。半数体ヒトゲノム当り約３×１０９塩基対が存在し且つ中期核にはこの数の約４倍存在するので、塩基対密度は約８１×１０　塩基対／μｍ２である。染色体の実質的に完全な被覆面に関する７、２プロ一ブ／μｍ２の最小プローブ密度およびプローブ当り約３００塩基対の平均寸法が与えられると、最小のプローブの１塩基対は染色体の４０，０００塩基対ごとにハイブリッド形成する必要がある。プローブ組成物を、ヒト組織（例えば、ヒト胎盤）から単離された全ＤＮＡなどの全ゲノムＤＮＡから製造する場合、プローブ組成物中に含まれるセグメントの約０．００２５％だけが染色体にハイブリッド形成して、実質的に完全な被覆面を与える必要があり（本発明のプローブ組成物にハイブリッド形成するヒト染色体全部の約０．００２５％に等しい）、染色体の全領域がほぼ等しくハイブリダイゼーションに使用しつると考えられる。

例えば、顕微鏡下の染色体で観察された単一の蛍光スポットの目視検出には、多数の発蛍光団残基または標識の存在が必要である。この数はここで理論的に、蛍光性標識（すなわち、発蛍光団残基）約３００〜約３．０００個であると推定される。視感度は、標的ハイブリッド検査に用いられる装置およびヒトの目などの検出器または感光性検出器の感受性によって影響される。本明細書中に示したように、発蛍光団を用いて約１％の水準（すなわち、塩基１００個中１個に対して１個の発蛍光団基が直接結合した、または発蛍光囲碁約３個／プローブ）でアミノ化され且つ標識されている平均長さが約３００塩基対のＤＮＡプローブを用いると、顕微鏡によって見える蛍光性スポットはハイブリッド形成プローブ約１００〜約１，０００個を含む必要がある。前の段落に記載の実質的に完全な被覆面に関して、この推定は約７２０〜約７．２００プロ一ブ／μｍ２または約１塩基対プローブ／染色体の４００〜４０塩基対に対応する。これは、ヒト全ゲノムプロ〜ブ調製試料中に存在する種々のセグメント領域の全数の約０，２５％〜約２．５％がヒト染色体に対してハイブリッド形成して、完全に染色された染色体（プローブ組成物にハイブリッド形成している染色体ＤＮＡの約０．２５〜約２．５％に等しい）の目視検出の能力を提供する必要があるということを意味する。

前の理論上の推定は、ヒト染色体全部の以外にも小部分がプローブ組成物とハイブリッド形成してそれらの実質的に完全な且つ目視によって検出しつる染色を提供することを必要とするだけであるという実際に観察された結果を例証し且つ支持する。

更に、このような推定は、本発明のプローブ組成物によって与えられた全ゲノムＤＮＡの実質的に完全な対比染色と、そして更に、例えば、染色体領域に特異的なプローブ組成物によってこのように与えられたゲノムＤＮＡ中に存在する特定の染色体領域の共存染色との双方を達成する観察された結果に可能な基準を例証する。したがって、ヒト染色体全部並びにそれらの特定のサブセットまたは領域双方は、ある与えられた標的標本中において同時に且つ別個に染色することができる。

実際に且つ例えば、標的標本中のヒト染色体全部の実質的に完全な染色は、本発明の直接発蛍光団標識プローブ組成物をヒト胎盤組織から抽出された全ＤＮＡから製造する場合に達成される。したがって、例えば、直接発蛍光団標識プローブ組成物を、例えば、ヒト胎盤組織から抽出された全ヒトＤＮＡから構築されたコスミドライブラリー、例えば、ｐＷＥ１５コスミド（Ｃｏｓｍｉｄ）ライブラリー（ストラタジーン・クローニング・システムズ（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、う・ホーヤ、ＣＡから入手可能）から製造し、そしてヒト染色体ぜんぶの実質的に完全な染色（ハイブリダイゼーション）をそれによって達成した。しかしながら、ライブラリー構築は、元の胎盤ＤＮＡ中に存在するＤＮＡセグメント全部がコスミドベクター中に挿入されたことを保証しない。典型的に、コスミドライブラリーから製造されたプローブ組成物で染色された中期染色体は、個々の染色体がハイブリッド（または発蛍光団）の位置ごとに強さが等しくない実質的に完全な染色を示す。個々の染色体の長さを交互に降下するより明るいおよびより弱い染色の帯が観察される。しかしながら、プローブ組成物は、染色体全部が実質的に完全に染色されるので、ゲノム対比染料としてなお有用である。個々の染色体のまだらに見える染色は、各染色体の本体を実質的に完全に識別するのに十分である。

ＤＮ　Ａセグメントが、非反復配列を除去する酵素（例えば、ライフ・チクノロシーズ・／ンコーポレーテッド（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ。

）、ベセスダ、ＭＤからのＣｏｔ−ｌＤＮＡなど）で全ゲノムＤＮＡを処理した結果得られる本発明の直接発蛍光団標識プローブ組成物は、更に、対比染色に有用である。酵素で処理された全ゲノムＤＮＡは若干のゲノム配列の量を減少させるが、それにもかかわらず、このような全ゲノムＤＮＡから製造されたプローブ組成物で染色された（すなわち、ハイブリッド形成された）中期染色体は、染色体全部の長さに沿った染色も、更には染色体の明るく染色された領域および染色体の弱く染色された領域も示す。しかしながら、そのようにハイブリッド形成した染色体はいずれもある程度まで染色されて、実際に、染色を実質的に完全に達成させた。

本発明のプローブ組成物のゲノム対比染色能力を、図３〜６の論及によって更に例証する。ヒト染色体などの極めて大型の多重染色体ゲリムの個々の染色体３０の理論上の外観を図３に示す。この染色体は、本目的に関して、本発明のプロー１組成物によってかまたは先行技術の化学種染料によって対比染色されたと考えられる。

ゲノム対比染色剤が、先行技術で示されたように用いられてきた先行技術のヌクレオチド染色用化学種対比染料であり、そして結果として、隣接するヌクレオチド間に介在しまたはＤＮＡらせんの外面若しくは溝に結合する場合、かなりの高倍率の下でさえも図３に示す得られた対比染色ＤＮＡは、図４に図示したような外観を有すると理論付けられる。２本の鎖の間の個々のヌクレオチドおよび塩基対を、染色体中に存在するＤＮＡ配７１Ｊ鎖の主鎖を表わす長い方の線に結合する小線として表わす。実際に存在するよりもかなり少数のヌクレオチドおよび塩基対をここで図式するために示し、そして存在を例示するために、らせん構造を減少しまたは欠いている。例えば、この化学対比染料の分子は、染色体１０のＤＮＡを含むらせんの鎖１２に沿った多数の別々の位置１１のそれぞれに位置している。これらの位置１１は、このようなりＮＡらせん鎖１２に沿って本質的に無作為に位置し且つ先行技術ヌクレオチド対比染料の高濃度で互いのいくつかの塩基対中に存在することができる。強さが変化することがあり且つ観察しつるとしても、化学対比染料分子間の狭い間隔のために、顕微鏡検査下の染色体１０は実質的に完全に染色されているように見える。

或いは、ゲノム対比染色剤が、本明細書中に記載されたようにゲノムＤＮＡとのハイブリッドを形成するハイブリッド形成条件下のｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で用いた本発明のプローブ組成物である場合、図３に示すこのようなかなりの高倍率の下で得られた対比染色ＤＮＡは、図５に図示したような外観を有すると理論付けられる。例えば、本発明のプローブ組成物中の存在するＤＮＡセグメント１３の一つ一つは、変性（好ましくは、更に脱水）処理の結果として標的ＤＮＡ鎖または配列１２中に存在すると考えられるいくつかの一本鎖（変性した）領域１４に対してハイブリッド形成した。図５に示した非ハイブリッド形成領域１４で図示したように、このような変性した領域全部がプローブ組成物中に存在する全部の個々のＤＮＡセグメントとハイブリッド形成するとはかぎらないと理論付けられ且つ推定される。したがって、プローブ組成物のこのような個々のハイブリッド形成りＮＡ上セグメント、染色体１０のＤＮＡを含むらせんの鎖１２に沿って多数の別々の部位若しくは位置または領域１４に位置している。これらの位置１４はこのようなりＮＡらせん鎖１２に沿って位置していると考えられ、典型的には、一本のＤＮＡＭ１２に沿って隣接する位置１４０間に、更には、１１１２の隣接する位置の間に存在する隣接する位置１４の間にかなりの区域が存在する。ここでは、プローブ組成物のこのようなハイブリッド形成りＮＡ上セグメントれぞれが少なくとも１個の発蛍光団基で標識されているので、染色体１０は、たとえ実際には染色体１０のＤＮＡ配列に関する隣接する標識プローブセグメント間に間隔があるとしても、前記に示した慣用的な光学顕微鏡の限界分解特性のために、蛍光顕微鏡検査下では実質的に完全に染色されているように見える。

図６に図示したように、得られたゲノム対比染色された染色体または染色体の群は、その対比染色が先行技術の介在性化学対比染色を用いることによって達成されていようとまたは本発明のゲノムハイブリッド形成プローブ組成物によろうと、特に、それぞれの対比染料が同一または同様の蛍光色を有するならば、同一または同様の外観を有することができる。本発明のプローブ組成物で達成されたゲノム対比染色の利点は、本明細書の別のところで説明する。

本発明の特徴および有用性を図７〜図１５までの顕微鏡写真を論及することによって更に例証する。図７〜図１５までの顕微鏡写真はそれぞ瓢ヒト血球由来の中期染色体塗抹および間期核を含む標本を固定したスライドを示す。このような標本は全て、ハイブリッド形成条件下においてゲノム対比染料組成物を用いてｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法を行った。顕微鏡写真はいずれも、これらの顕微鏡写真それぞれに印した１０ミクロンのスペーサーラインによって分かるように同倍工であり、全部の顕微鏡写真を同一の蛍光顕微鏡を用いて作成し、各標本に１００ワツトの水銀アーク灯からの光線を照明した。当然ながら、用いられた蛍光色は添付の白黒Ｕ微鏡写真では示されない（米国特許局および商標局がこの時点でカラー顕微鏡写真を用いていないのでそれにしたがった）。

図７は、単一の開期核（中央左）および単一の中期染色体塗抹（中央右）を有する標本を示す。標本を、下記の実施例６に記載したように調製された（下記の表ＩＶに記載した調製試料＃２を用い且つ下記の実施例１５（ａ）に記載したハイブリダイゼーション溶液１０μｌを用いる）０．９５％ＤＥＣＣＡで標識したラグメント化ヒト胎盤ＤＮＡを６００ｎｇ用いて対比染色した。ここで、ハイブリダイゼーションは下記の実施例１５（ａ）に記載したように行い、モしてゲノムハイブリッド形成され且つ対比染色された標本を、下記の表ＩＶで定義したフィルター＃１３を備えた蛍光顕微鏡を用いて観察し且つ撮影した。

図８は、ハイブリダイゼーション溶液中にブロッキングＤＮＡとしてＣｏｔ−１が１μｇ含まれたことを除き、図７の場合と同じ方法で対比染色された３個の開期核および２個の中期塗抹を有する標本を示す。ハイブリッド形成したゲノムによって対比染色された染色体でのＤＥＣＣＡの蛍光強さく図７の場合と同じに観察され且つ撮影された）はある程度減少したが、染料はなお全く明瞭であり且つ実質的に完全であった。

図９は、ハイブリダイゼーション溶液中にブロッキングＤＮＡとして（Ｃｏｔ− Ｉ　ＤＮＡの代わりに）ヒト胎盤ＤＮＡが２μｇ含まれたことを除き、図７の場合と同じ方法で対比染色された間期核および単一の中期塗抹を有する標本を示す。ＤＥＣＣＡの蛍光強さく図７の場合と同じに観察され且つ撮影された）はある程度減少したが、染料はなお全く明瞭であり且つ実質的に完全であった。

図７〜図９までに示した結果は、したがって、本発明のゲノムＤＮＡ対比染色用プローブ組成物は単独でかまたは、同一の標的領域を分担し、同時にゲノムの視覚的に検出しつる完全な識別を更に提供する、ここではヒトゲノムである同一のゲノムからの他のブロッキングＤＮＡとの組合わせで用いることができるということを実証し且つ例示している。これらの結果は更に、ここでは例示的にヒト胎盤ＤＮＡおよびＣｏｔ−Ｉ　ＤＮＡである同一のゲノムのブロッキングＤＮＡを、特定の用途によって必要とされるかまたは望まれる場合、本発明のゲノムプローブ組成物と一緒に用いることができることを示している。

図１０は、数個の間期核および単一の中期塗抹を有する標本を示す。標本を、下記の実施例４に記載したように調製された（表ＩＩに記載した調製試料＃６を用いる）３．６％ＣＴＭＲで標識したＣｏｔ−Ｉ　ＤＮＡをＩｌＣｌ０ｎ用い且つ同一のハイブリダイセーンジン溶液１０μＩを用いて対比染色した。ハイブリダイゼーションは下記の実施例１５（ａ）に記載したように行い、そしてその標本を、下記の表ＩＩＩに示したようなＣＴＭＲ蛍光に特異的であるフィルター＃１６を備えた蛍光顕微鏡を用いて撮影上だ。

本発明の標識されたＣｏｔ　Ｉ　ＤＮＡを基剤とするプローブ組成物に特有である、表Ｖｌ（下記）に記載した明るく染色されたおよびより少ない明るさに染色された領域は図１０において明らかに目に見えるし、更に、標本材料は完全に染色されている。

図１１は、実施例１５（ａ）に記載の抗退色溶液にＤＡＰＩを加えることによって先行技術の（慣用的な）化学対比染料ＤＡＰＩで染色された図１０の場合と同一の標本を示す。得られた標本におけるＤＡＰＩ蛍光を、ＤＡＰＩ励起および発光に特異的であるフィルター＃１（下記の表ＴＶを参照されたい）を備えた蛍光顕微鏡を用いて観察し且つ撮影した。

図１１と図」Ｏとの比較は、図１０のＣｏｔ−１を基剤とするプローブ組成物が、ＤＡＰＩと同様に、標本中の全染色体材料を完全にきわだたせることを実証する。

同様の比較を、同一の標本に関する図１２および図１３の顕微鏡写真で行う。

標本は染色体の単一の中期塗抹を示す。図１２は、ハイブリダイゼーション溶液か、下記の実施例４．３で記載したように調製された（下記の表ＩＶに記載した調製試料＝９を用いる）１．８％ＣＴＭＲ標識コスミドライブリーフラグメント化Ｄ　Ｎ　Ａを１１００ｎ含むことを除き、図１０の標本に関して前記に記載したように行われたｉｎ　５ｉｔｐハイブリツド形成法をこの標本で行った結果得られた。得られたハイブリッド形成標本を、前記の１１１０で用いたのと同じ方法で観察し且つ撮影した。

図１３において、標本を図１１に関して前記に記載したのと同じ方法によってＤＡＰＩで染色した後、図１１に関して前記に記載したように観察し且つ撮影し図１２と図１３との比較は、ＣＴＭＲ蛍光強蛍光度化がそれぞれの対比染色された染色体の長さに沿って観察されるのに、ここでＣＴＭＲプローブ組成物によって達成された対比染色は、先行技術のＤＡＰ１対比染色で達成された蛍光と比較した場合、各染色体に関してなお完全であることを示す。

図１４および図１５は、２個の開期核および１個の中期塗抹を含む同一の標本の顕微鏡写真を示す。４ｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法は、下記の実施例１５（ａ）に記載した方法により、（ａ）０．９５％ＤＥＣＣＡで標識したフラグメント化ヒト胎盤ＤＮＡ　（下記の表ＩＶの調製試料＃２を用いて下記の実施例６にッキングＤＮＡとしてＣｏｔ−１を１μｇを混合物で用いて行った。図１４の顕微鏡写真は、ＤＥＣＣＡ特異性フィルター＃１３（表［１を参照されたい）を備えた顕微鏡を用いて得られ、図１５の顕微鏡写真は、ＣＴＭＲ特異性フィルタび（ｂ）同一であるが膨張した染色体対に対応する開期核それぞれの２個の明るく染色された領域双方を明るく且つ明瞭に示す。したがって、図１４および図１０一ブ組成物と混合することができることを実証し且つ例証する。更に、このような図１４および図１５は、このような混合物が、同−標本中の特異的に染色された染色体ＤＮＡ領域および完全にゲノムによって染色されたＤＮＡ双方を区別する引続きの能力を変更することなくハイブリッド形成法で用いることができることを実証する。

て用いるのに十分に適している。

したがって、本発明は、多重染色体ゲノムを有する生物に由来する標本中に存在するゲノムＤＮＡを識別する方法を提供する。その方法は、（ａ）標本をハイブリッド形成条件下において本発明のプローブ組成物と接触させて、標本中に存在する標的ゲノムＤＮＡと、プローブ組成物中に存在するプローブＤＮＡセグメントとの間にハイブリッドを生じ、（ｂ）得られた標本からプローブ組成物の残留部分を分離し：そして（ｃ）得られた標本を検査するという連続工程を含む。

標本検査は、例えば、蛍光顕微鏡、流動血球計算機等を用いて様々に達成することができる。検査は、ハイブリッド中に存在する発蛍光団基に蛍光を発しさせるのに少なくとも十分であるエネルギーを得られた標本に照射し、同時に、そのようにして生じた得られた蛍光エネルギーを検出することを行う。当業者が理解するように、特定の目的および用いられる条件に応じて、残留するプローブ組成物の量が検査の妨げとならない程度に低い場合、分離工程を伴わずに検査または識別方法を実施することができる。

好都合に、便利なまたは特定のｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法はいずれも本発明の態様の実施において用いることができる。ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法は、由来生物の全ゲノムＤＮＡの全部または一部分のみを含む特定の標本で行うことができる。

現在、ここで好ましいのは、予め調製され且つガラス製スライド等のようなスライド上に固定された標本で一般的に且つ便宜上行われる覆類のｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で本発明のプローブ組成物を用いることである。本発明のこのようなｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法を実施するために、例えば、Ｆ、Ｔ。

ボスマン（Ｂｏｓｍａｎ）　、Ｍ、ファン・デア・ブローク（Ｖａｎ　ｄｅｒＰｌｏｅｇ）、Ａ、シャーベルブ（Ｓｃｈａｂｅｒｇ）およびＰ、ヴアン・デュン（Ｖａｎ　Ｄｕｉｊｎ）（１９７５）　Ｇｅｎｅｔｉｃａ、第５巻、４２５〜４３３頁、ギヤラン・バドゥ−（Ｇａｌｌａｎｄ　Ｐａｒｄｕｅ）（１９６９）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、第６４巻、６００頁に示されたような慣用的なスライド調製法を用いることかできるし、そして例えば、Ｂ。

バット（Ｂｈａ　ｔ　ｔ）　、Ｊ、バーンズ（Ｂｕ　ｒｎ　ｓ）　、Ｄ、　フラ不す−（Ｆｌａｎｎｅｒｙ）およびＪ、Ｏ’　Ｄ、　７クジー（ＭｃＧｅｅ）　（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、第１６巻、３９５１〜３９６１頁およびＡ、　Ｈ，Ｎ、ホブマン（Ｈｏｐｍａｎ）、Ｊ、ライガート（Ｗｉｅｇａｒｔ）およびＰ、ヴアン、デュン（１９８７）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、第１６９巻、３５７〜３６８頁に示されたような慣用的なｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法を用いることかできる。

本発明のプローブ組成物を用いてこのようなスライドに固定し且つ処理した標本の全ゲノムＤＮＡ対比染色および検出を達成するために、下記に例示する方法を行うことができる。

好ましくは、このようなスライドに固定した標本を予め処理して、少なくとも部分的に加水分解し、そして更に、その中に存在すると考えられるＤＮＡを少なくとも部分的に変性させる。慣用的な変性および加水分解手順を用いることができる。代表的な変性用溶液および使用方法を、代表的なハイブリダイゼーション溶液および使用方法であるように下記に記載した実施態様で例証する。好ましいこのような方法は、標本中に存在する任意の染色体のＤＮＡ同一性または構造の顕著な変更または欠失を結果として生じない。続いて、下記の連続ハイブリダイゼーション工程順序を、得られたそのように処理された標本で実施する。

最初に、スライドに固定した標本を本発明のプローブ組成物と接触させる。このような組成物を保存するために、接触するのに用いる量は、好ましくは、この種のプローブ組成物によってこのような標本表面の完全な被覆面を達成するのに必要な最小量である。しかしながら、ある与えられたスライドに固定した標本に用いることができるある与えられたプローブ組成物の最大または最小の量には固有の機能的または処理限界は存在しない。

このような最小のプローブ量の容量または数量は、特定の手順および用いられる装置によって影響される。例えば、標本の表面積が約５００ｎｍ２の範囲内であり且つ標本が不活性スライド表面、例えば、慣用的なガラススライドの表面上に、塗膜厚み約１ミクロンで均一に付着している場合、プローブ組成物（前記に記載の）の１滴約１０μｌをこのような標本表面上に付着させ且つ全体に塗布することができる。用いる量は、この種のプローブ組成物によってこのような表面の完全な湿潤および接触を達成するのに十分である必要がある。次に、慣用的なカバースリップ等をこの表面上に載せ、そしてこれに対して圧縮することができる。

慣用的な接触法および関連装置をいずれも用いることができることは理解される。接触時間において、プローブ組成物および標本は既に一定温度、すなわち、約３０〜約４５℃の範囲であるのが好ましいが、所望ならば、ハイブリダイゼーション溶液中の塩および変性剤濃度に応じてより高温およびより低温を用いることができる。標本は処理用プローブ組成物と均一に接触するのが常に好ましい。

次に、標本およびそれと接触している処理用プローブ組成物の組合わせに、典型的に且つ好ましくは約６０〜約ｉ、ｏｏｏ分間の範囲であるインキュベーション時間を施すが、所望ならば、より長いおよびより短いインキュベーション時間を用いることができる。インキュベーション時間中、温度を約３０〜約４５℃の前記に指定した範囲で保持するのが好ましい。

このインキュベーション時間中に、処理用プローブ組成物は標本中に存在するゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションを受ける。プローブ組成物はこのような標本中におよび介して浸透し且つハイブリッドを形成するように存在するゲノムＤＮＡとハイブリッド形成することができる。処理用プローブ組成物中に組込まれる全ゲノムＤＮＡの性質および組成のために、処理用プローブ組成物は、本明細書中に示した観察と一致する連続的および好ましくは完全な様式で標本中に存在するゲノムＤＮＡとハイブリッド形成することが特徴的に観察される。

次に、インキュベーション時間の最後に、未反応の残留する処理用プローブ組成物を得られた標本から分離するように適応される液体洗浄操作を施す。好都合に、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法の先行技術で知られているものと類似の洗浄操作を用いることかできる（例えば、バットら（１９８８）ＳｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６．３９５１〜３９６１を参照されたい）。

通常、ＮａＣＬ緩衝塩、例えば、クエン酸ナトリウム等およびホルムアミドを様々な濃度で含むいくつかの異なる洗浄浴を用いる。高ホルムアミド濃度および低ＮａＣ］ｉ１度を高緊縮（残留するプローブＤ　Ｎ　Ａを除去するより大きい能力）のために用いる。特に、最後の浴において洗剤も用いることができる。更に、緊縮は洗浄浴の温度を室温以上に上昇させる。高緊縮は非ハイブリッド形成プローブの除去を容易にするが、それは少量のハイブリッド形成プローブ、例えば、個々のプローブヌクレオチド全部が隣接する染色体ヌクレオチドと塩基対を生成しないような染色体の部分的に接近しやすい領域にのみハイブリッド形成したより短いプローブセグメントまたはプローブの除去も容易にする。実際に、これは極限シグナル強さを減少させ、したがって、置かれた状況は許容された緊縮を制限する。

例えば、一つの有効な手順は、それぞれ５０％ホルムアミドおよび２Ｘ　５ＳＣ（標準ＳＳＣ緩衝液の濃度の２倍と読み、標準ＳＳＣ緩衝液は０．１５ＭＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムをｐｆ（７で含む）を含む３個の浴を４５ ℃で、２Ｘ　ＳＳＣを含む第四の浴を４５℃で、そして２Ｘ　ＳＳＣおよび０、　１％ＮＰ−４０（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、う・ホーヤ、ＣＡから入手することができる非イオン性洗剤）を含む第五の浴を４５℃で連続的に用いる。各浴中でスライドを浸漬するのに許容された時間は秒から分まで変化して、非ハイブリッド形成プローブの除去率を変化させることができるが、浴ごとに１０分間より長いインキュベーションはｐシブリッド形成プローブの除去を改良しない。大部分の標本に関して適当なｐシブリッド形成プローブの除去を達成しながら浴の数を減少することもできるし、浴の数の増加は、無視しつると考えることができる改良を与える。最後の浴での浸漬後に、スライドを、好ましくは、はぼ垂直の位置で水気を切り且つ十分にまたは部分的に自然乾燥させた後、引続き固定用媒質を加え、そしてカバースリップで被覆する。固定用媒質は、当業者が理解するように、通常および慣用的に、グリセロール、緩衝塩および、発蛍光団標識の光酸化速度を減少させる抗退色物質を含む。

スライドは処理直後に蛍光顕微鏡下で観察することができ、またはそれらは室温で検査前の数日間等の間貯蔵することができる。好ましくは不活性ガス（例えば、窒素またはアルゴン）環境中の一２０℃での貯蔵は、長期の貯蔵期間にハイブリッド形成した標的の変化、標本の劣化等から守るのに現在好ましい。

得られたスライドに固定した標本は、他のプローブ調製試料と更にハイブリッド形成することかできる。例えば、カバースリップを除去することができ、そしてスライドを洗浄浴の一つに浸漬して（沈めて）固定用溶液を除去することがでの表ＩＶにフィルターの代表的な規格を示し、このようなフィルターを本明細書中に示した実施例に包含された発蛍光団と一緒に用いた。

Ａとを混合した。好都合に、架橋剤は、この種のタンパク質中に存在する１個またはそれ以上の極性基を含むアミノ酸、例えば、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リシン、セリン、チロシンおよびトリプトファンの極性基と反応する。システィンのスルフヒドロ基は時々架橋することがある。適当な架橋剤および適当なｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法は、例えば、ヴ７ン・デン・エング（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅ迦ｇｈ）、米国特許第４，７７０．９９２号明細書（１９８８）に示されている。

本発明のプローブ組成物を、架橋し且つ好ましくは変性した染色体と混合する。

好ましくは、得られた混合物は分離操作を行って、非ハイブリッド形成残留プローブ組成物を単離する。しかしながら、当業者が理解するように、残留プローブ組成物の濃度が、観察される特定の流動血球計算分析を妨げないまたは過度に妨げない程度に十分に低い場合、このような分離操作を避けることができる。

得られた懸濁液は、例えば、前記に引用した参考文献中に記載されたような二重ビーム血球計算器などを用いる流動血球計算分析を行う。

このようにして測定された結果を用いて、例えば、総体的標本形態学に基づいて染色体を識別するかまたは特定の染色体染料の存在と何等かの染色体材料の存在とを関係付けることができる。その相互関係は、特定の染料と混同することがありうるバックグラウンドに対して区別する。

本発明のプローブ組成物を用いる天動血球計算検出法とｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法との組合わせのもう一つの技法は、例えば、トラスフ（Ｔ　ｒ　ａ　ｓ　ｋ）らによってＨｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、７８　：２５１〜２５９　（１９８８）に示された方法で懸濁液中の間期核を用いる。

本発明のプローブ組成物を、それらの化学的構造または機能的能力に悪影響を与えることなく他のプローブ組成物と混合することができることは、それらの重要な特徴であり且つ利点である。例えば、前記に示した最初の手順工程の前に、前記に記載したように製造された本発明のプローブ組成物を、所望ならば、例えば、予め決定された染色体または染色体領域中に存在する特定の標的にハイブリッド形成しうるプローブを含む別のプローブ組成物と混合することができる。このような他のプローブ組成物は、好ましくは、温度、時間等の比較しうる条件下で（本発明のプローブ組成物に関して）ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法を用いるのに適している必要かある。

例えば、このような他のプローブ組成物は直接標識または間接標識プローブ組成物であることができ、例えば、（ａ）本明細書と同一日付に出願され且つ譲受人事件整理番号３１．４３３によって確認され、内容が本明細書中に参考として包含されているビトナーらの同時係属米国特許出願第０７／７６２，９１３号明細書に示されているような直接標識ペイントプローブ組成物または直接標識動原体特異性プローブ組成物；（ｂ）ライ−ガント（Ｗｉｅｇａｎｔ）ら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９．３２３７〜３２４１に記載の発蛍光団で標識したヌクレオシド三リン酸を用いてプローブＤＮＡのニックトランスレーションによって標識されたプローブ組成物；（Ｃ）ライ−ガントら（前掲畜牛）およびバットら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　１６，３９５１〜３９６１を含む多数の公表に記載の、ビオチンまたはジオキシゲニン含有デオキシヌクレオチド三リン酸をプローブＤＮＡ中に組込むことによって製造された間接標識プローブ組成物；　（ｄ）ホブマンら（１９８７）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６９゜３５７〜３６８に記載の、ハイブリッド形成後反応において被修飾発蛍光団の化学基と反応してハイブリッド形成プローブおよび発蛍光団標識間に結合を形成する化学基を含む間接標識プローブ組成物：等である。

次に、このような得られた混合プローブ組成物を、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法においてスライドに固定した標本で用いる。この手順において、標本中に存在する１種類または複数のゲノムＤＮＡ標的本体を、本発明の少な（とも１種類のＤＮＡプローブ組成物および１種類または複数の特定の標的を用いて、たとえあるとしても、標本中に存在する１種類および／または複数のものが、単一のおよび／または混合した１種類または複数のプローブ組成物で同時に染色される程度まで対比染色する。続いて、残留プローブを同じ洗浄工程手順で得られた標本から分離する。

本発明のプローブ組成物のもう一つの特徴およＭＩＪ点は、それらを、前述の特定のハイブリッド形成法、例えば、特定の染色体または特定の染色体の特定の領域か特定のプローブ組成物等の標的であるｉｎ　５ｉｔｕハイブリツト形成法の完了後でさえも対比染色用に用いることができるということである。

本発明の現在好ましいプローブ組成物は、ゲノムＤＮＡを完全に且つ実質的に均一に対比染色し、それによって標本中に存在する個々の染色体または染色体フラグメントの輪郭を効果的に描く能力を特徴とし、その結果として、このような本体は蛍光顕微鏡等の下で検出しつる。

本発明のプローブ組成物との標的のハイブリダイゼーションによって生じた対比染料は、例えば、得られた染色標本の希釈によって先行技術の化学対比染料と区別することができる。化学対比染料は、特徴的に、ハイブリッド形成したプローブよりもはるかに容易に染色体ＤＮＡから解離する。これは、本出願において用いたような、寸法が約１５０〜約６００塩基対の範囲の２本の相補的ＤＮＡ鎖の平衡結合定数が、温度が相補鎖のいくつかの融解温度（Ｔｍ）であるかまたは更に低い場合に極めて大きいからである。例えば、相補的な２０ヌクレオチド長さのオリゴマー対の会合定数は２５℃で約２Ｘ１０２４Ｍ−１である（その鎖の自由エネルギーから計算された）。化学対比染料の会合定数は、通常、十分に１０１０Ｍ　１未満である。対比染料の希釈は、厳密には、スライドに固定した標本を洗浄して非ハイブリッド形成りＮＡを除去するのに前記に記載したように実施されるような洗浄工程の形をとることができる。実際には、染色体用に最も一般的な化学対比染料の内の二つであるＤＡＰＩかまたはヨウ化プロピジウムで染色した標本を、逐次的に、それぞれが５０％ホルムアミドおよび２Ｘ　ＳＳＣを含む４５℃の３種類の浴、２Ｘ　ＳＳＣを含む４５℃の第四の浴並びに２ＸＳＳＣおよび０．１％ＮＰ−４を含む４５℃の第五の浴中に浸漬することは、蛍光顕微鏡下の目視検査によって決定される化学対比染料の強さを、個々の開期核および中期塗抹がそれ以上識別できないかまたはちょうど僅かに目に見える点まで大きく減少するのに役立つ。この同じ洗浄法は非ハイブリッド形成プローブのみを実質的に除去し、したがって、対比染料が本明細書中で提供したような直接標識全ゲノムＤＮＡセグメント組成物である場合、標的とハイブリッド形成した対比染料を除去しない。

本発明のプローブ組成物は、概して、他のｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成試薬に匹敵する。しかしながら、２種類またはそれ以上の間接標識プローブの組合わせの場合、混合物中である場合に互いに交差反応する成分は存在しないということに注意する必要がある。

本発明のプローブ組成物は、特徴的に、スライドに固定した標本などの安定な蛍光着色を有する被処理標本において対比染色されたＤＮＡを生じる。したがって、例えば、このような標本は、更に別のｉｎ　５ｉｔｕノｓ（ブリッド形成条件下において、処理液中への対比染料の溶解によって引き起こされる対比染色強さの実質的な除去または減少を伴うことなく、ハイブリッド形成条件が維持される限り更に処理することができる。

実施態様本発明を、下記の実施例の論及によって更に例証する。

蛍光鏡検法は、下記の蛍光顕微鏡、すなわち、ツアイス・アクジオスコープ（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｓｋｏｐ）、アクジオプラン（Ａｘ　ｉｏｐ　ｌ　ａｎ）またはアクジオフォト（Ａｘｉｏｐｈｏｔ）の１種類またはそれ以上を用いて行った。

実施例１．アミノ化ヒト全ゲノムＤＮＡの製造アミノ化ＤＮＡを３種類の全ヒトゲノムＤＮＡ源から製造した。ヒト胎盤ＤＮＡ（ヒト組織から抽出された）はシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（セント・ルイス、ＭＯ，ＸＩＩＩ型）から入手した。Ｃｏｔ−ｌＤＮＡはライフ・チクノロシーズ・インコーホレーテッド（ゲイサーズバーグ、ＭＤ、　カタログ：５２７９ＳＡ）から入手した。ヒト胎盤ＤＮＡのフスミドライブラリー（ｐＷＥ１５）はストラタジーン（う・ホーヤ、ＣＡ）から入手した。ライブラリーを培養し、そして本明細書と同一日付に出願され且つ譲受人事件整理番号３０．４５６によって確認されるビトナーらの米国特許第０７／７６２．９１２号明細書の実施例１０に記載されたように、ＤＮＡをライブラリーから抽出した。ＤＮＡをそれぞれ水２ｍｌ中に溶解させ且つマイクロチッププローブを備えたブランワン・ソーファイア−４５０型を用いて音波処理した。音波処理は、３に設定した出力を用いてそれぞれ約１分間のオフ時間で間隔をおいた２　２〜１／２分間の時間を用いて行った。効率サイクルは約２５〜３０ワツトで８０％であり、２０％減であった。音波処理したＤＮＡを１：１の等容量のフェノール、クロロホルムで抽出した。ＤＮＡは、ＤＮＡ溶液の１０分の（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ファーミングデール、ＮＹ）中で−シジン時間の後、引続き反応溶液を３種類の１〜２リツトル容量の５ｍＭホウ酸ナトリウム中においてｐＨ８，０で透析し、そして透析した生成物をエタノールで沈澱させた。この手順を種々の反応条件を用いて繰返した。結果を下記の表Ｖに要約する。

てＤＮＡを、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファイブプライム・スリープライム・インコーホレーテッド（５Ｐｒｉｍｅ　３Ｐｒｉｍｅ。

）　Ｉｎｃ、）、バオリ、ＰＡ）を含むスピンカラムで精製した。次に、ＤＮＡを乾表Ｖトランスアミノ化反応条件およびｄＣの修飾％２　胎盤組織　２５　１５時間　１２３　胎盤組織　２５　１５時間　９，５４　胎盤組織　２５　６時間　３．８９　コスミド　２５　６時間　３．１ライブラリー（ａ）アミノ化した全ヌクレオチドの百分Ｉはアミノ化ｄＣ％の０．２５倍であの反応条件を用いてアミン化されたヒト胎盤ＤＮＡおよびコスミドライブリーＤＮＡに対する比較により３〜４である必要がある。

クレオチド部分は、標識濃度をヌクレオチド濃度で割ることによって計算する。

μｇでのＤＮＡ濃度は、３５０ダルトンの平均ヌクレオチド分子量を用いてヌクレオチドのモル濃度から計算する。

実施例４．ＣＴＭＲで標識したヒト胎！！ＤＮＡの製造４．１　アミン化ヒト胎盤ＤＮＡ調製試料＃２およびアミノ化Ｃｏｔ−ｌＤＮＡ調製試料＃６の各４０μ ｇを、０．２Ｍ　３−　［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸から成るｐＨ７，４での緩衝液３７０μｌ中に別個に溶解させた。これらのそれぞれに対してジメチルホルムアミド中の３０ｍＭ　ＣＴＭＲを３０．３μｍ加え、そしてその溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時間）連続的に転化させた。反応後、実施例１に記載したのと同じ方法で、ＤＮＡをエタノールと一緒に沈澱させた。

乾燥した生成物をそれぞれ水３００μｍ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ−２５を充填した内径１ｃｍＸ高さ３０ｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮＡを提供した。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ濃度およびＷ識率は実施例３に記載したように決定した。

４．２　もう一つの手順において、アミノ化ヒト胎盤ＤＮＡｍ製試料＃４を、０．２Ｍ　３−　［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸８８８μｊ中にｐｆ（７゜４で溶解させ且つジメチルホルムアミド中の２０ｍＭ　ＣＴＭＲを１１４μｍ加えることによってＣＴＭＲで標識した。反応および精製は、他のＣＴＭＲ反応に関して記載されたように行った。

４．３　更に別の手順において、アミノ化Ｃｏｔ−ｌＤＮＡ調製試料＃５、＃６および＃７、アミノ化ヒト胎盤ＤＮＡ調製試料＃１並びにアミノ化コスミドライブラリーＤＮＡ調製試料＝８および＃９の５０μｇを、０．２Ｍ　３−　［Ｎ− モルホリノ］プロパンスルホン酸４４４μｌ中にｐＨ７，４でそれぞれ別個に溶解させ且っジメチルホルムアミド中の２０ｍＭ　ＣＴＭＲを５７μｌ加えることによってＣＴＭＲで標識した。反応および精製は、他のＣＴＭＲ反応に関して記載されたように行った。アミノ化ヒト胎盤ＤＮＡ調製試料＃４は、０．　２Ｍ　３−　［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸８８８μｌ中、Ｉ）Ｈ７，４での反応およびジメチルホルムアミド中の２０ｍＭ　ＣＴＭＲの１１１μｍによって同様に標識した。

実施例５．ＴｘＲｄで標識したヒト胎盤ＤＮＡの製造アミン化ヒト胎盤ＤＮＡ３ｉ製試料＃４の１００μｇを、５０ｍＭホウ酸ナトリウムから成るｐＨ９，３での緩衝液８８８μｌ中に溶解させた。これに対してジメチルホルムアミド中の２０ｍＭ　ＴｘＲｄを１１４μＩ加え、そしてその溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時間）連続的に転化させた。反応後、実施例１に記載したのと同じ方法でＤＮＡをエタノールと一緒に沈澱させた。乾燥したＤＮＡを水３００μｌ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ−２５を充填した内径１ｃｍＸ高さ３０ｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。

カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮＡを提供した。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ濃度および標識率は実施例３に記載したように決定した。

実施例６．ＤＥＣＣＡで標識したヒト胎盤ＤＮＡの製造アミノ化ヒト胎盤ＤＮＡ調製試料＃２の５０μｇを、０．２Ｍ　３−　［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸から成るｐＨ７，４での緩衝液４４４μｌ中に溶解させた。これに対してジメチルホルムアミド中の２０ｍＭ　ＤＥＣＣＡを５７μｌ加え、そしてその溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時間）連続的に転化させた。反応後、実施例１に記載したのと同じ方法でＤＮＡをエタノールと一緒に沈澱させた。乾燥した生成物を水３００μｌ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ−２５を充填した内径１ｃｍＸ高さ３Ｑｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮＡを提供した。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ濃度および標識率は実施例３に記載したように決定した。

実施例７．ＡＭＣＡで標識したヒト胎盤ＤＮＡの製造アミノ化ヒト胎盤ＤＮＡ調製試料＃２の５０μｇを、０．２Ｍ　３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸から成るｐＨ７，４での緩衝液４４４μｌ中に溶解させた。これに対してジメチルスルホキシド中の２０ｍＭ　ＡＭＣＡを５７μｍ加え、そしてその溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時ｒｊ１）連続的に転化させた。反応後、実施例１に記載したのと同じ方法でＤ　Ｎ　Ａをエタノールと一緒に沈澱させた。

乾燥した生成物を水３００μｌ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ− ２５を充填した内径１ｃｍＸ高さ３０ｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮ、Ａを提供した。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ濃度および標識率は実施例３に記載したように決定した。

実施例８．全染色体＃４のＦＩＴＣで標識したペイントプローブ全染色体′！４に特異的なりＮＡを入手し、本明細書と同一日付に出願され且つ譲受人事件整理番号３１．４３３によって確認されるビトナーらの同時係属米国特許出願第０７／７６２．９１３号明細書の実施例１に記載されたように精製し且つ音波処理して、平均長さが３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。フラグメント化ＤＮＡを本出願の実施例１にしたがって、フラグメント化染色体＃４ＤＮＡをヒト全ゲノムＤＮＡの代わりに用い且つ反応を２５℃で１５分間進行させることによってアミノ化して、チオ干シシチジンヌクレオチドの約４モル％がトランスアミノ化されたＤＮＡを得た。透析、フェノール抽出およびエタノール沈澱後に、トランスアミノ化ＤＮＡの４０μｇを、５０ｍＭホウ酸ナトリウム２４４μｍ中にｐＨ９，３で溶解させ、そしてジメチルスルホキシド中の５０ｍＭＦｒＴＣを６，１ μｍ加えた。得られた溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時間）連続的に転化させた。反応後、実施例１に記載したのと同し方法でＤＮＡをエタノールと一緒に沈澱させた。乾燥したＤＮＡを水３００μｌ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ−２５を充填した内径１ｃｍＸ高さ３０ｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮＡを得た。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ１１度および標識率は実施例３（本明細書中前記）に記載したように決定した。

実施例９．前染色体＝４のＴｘＲｄ’″−標識したペイントプローブの製造全染色体＃４に特異的なりＮＡ　（平均フラグメント長さ３００ｂｐ）を前記の実施例８にしたがって製造し且つアミノ化して、チオキシンチジンの４．６モル％がトランスアミノ化されたＤＮＡを得た。透析およびエタノール沈澱後に、ＤＮＡの４０μｇを、５０ｍＭホウ酸ナトリウム２７０μ＋中にｐＨ９，３で溶解させ、そしてジメチルホルムアミド中の３０ｍＭ　ＴｘＲｄを３０μｌ加えた。

得られた溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時間）連続的に転化させた。

反応後、実施例１に記載したのと同じ方法でＤＮＡをエタノールと一緒に沈澱させた。乾燥した生成物を水３００μｌ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ−２５を充填した内径１　ｃｍＸ高さ３０ｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮＡを得た。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ濃度および標識率は実施例３に記載したように決定した。

実施例１０６　ヒト染色体＃８の動原体に特異的であるＣＴＭＲで標識したプローブ組成物の製造＃１０〜４で示した染色体＃８の動原体に特異的なトランスアミン化ＤＮＡ（平均フラグメント長さ３００ｂｐ、デオキシンチジンの１４モル％がトランスアミノ化された）を、本明細書と同一日付に出願され且つ譲受人事件整理番号３０４５６によって確認されるビトナーらの同時係属米国特許出願第０７／７６２゜９１２号明細書に記載されたように得た。このＤＮＡの４０μｇを、０，２Ｍ３− 〔Ｎ−モルホリノコプロパンスルホン酸３６２μｌ中にｐＨ７，４で溶解させ、そしてジメチルホルムアミド中の３０ｍＭ　ＣＴＭＲを３８μｌ加えた。得られた溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時間）連続的に転化させた。

反応後、実施例１に記載したのと同じ方法でＤＮＡをエタノールと一緒に沈澱させた。乾燥した生成物を水３００μｌ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ−２５を充填した内径１ｃｍＸ高さ３Ｑｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮＡを得た。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ濃度および標識率は実施例３に記載したように決定した。

したように決定した。

７℃を用いることによってトランスアミノ化して、デオキシシチジンの約２０％がトランスアミノ化されたＤＮＡを得た。透析およびエタノール沈澱の後に、アミノ化ＤＮＡを、０．２Ｍ　３−　［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸中にｐＨ７，４で溶解させ、そして１００倍モル過剰のＮＨ３−ＬＣ−ビオチン（スクシンイミジルエステル：ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）カタログ＃２１３３５）を加えた。過剰はアミノ化デオキシシチジンの数に相対して決定し、ＮＨＳ−ＬＣ− ビオチンを最初にＤＭＳｏ中０．２Ｍで溶解させた後にＤＮＡ溶液に対して加えた。

反応を室温で一晩中（約１８時間）進行させた。反応後、ＤＮＡをエタノールで３回沈澱させて、精製ビオチニル化プローブを得た。

ＨＣＣＡを５７μｍ加え、そしてその溶液を暗所中において室温で一晩中（約１８時間）連続的に転化させた。反応後、実施例１に記載したのと同じ方法でＤＮＡをエタノールと一緒に沈澱させた。乾燥した生成物を水３００μｌ中に溶解させ、その溶液を、セファデックスＧ−２５を充填した内径１ｃｍＸ高さ３０ｃｍのエコツカラムに適用し且つ水で溶離した。カラム空隙率で溶離する標識材料を集め且つ再度エタノールで沈澱させて精製標識ＤＮＡを得た。精製標識ＤＮＡの原液は、乾燥生成物を少量の水に溶解させることによって製造した。ＤＮＡ濃チド当りの発蛍光団モル％を要約する。

操作の　発蛍光団　アミノ化Ｄ　Ｎ　Ａ　発蛍光団％／ヌクレオチド０．３０　（４０μｇｒｘ）実施例１５．ｉｎ　５ｉｔｕハイブリッド形成法形成側実施７までのプローブ組成物それぞれの、１ｎｓｉｔｕハイブリツド形成法における対比染色能力を評価した。標的ＤＮＡは、細胞を中期で止めるように処理された培養された正常のヒト白血球から成った。これらの細胞を多数の顕微鏡用スライドガラス上それぞれに対して約３フイートから滴下して核を破裂次に、スライドを自然乾燥させ且つ室温で貯蔵した。培養およびスライド調製を実施するための典型的な試薬および手順は、ＴＣり０モソーム・カルチャー・キット（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｋｉｔ）（ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）デトロイト、Ｍｌ）に包含実施例３〜７までおよび実施例１４のプローブ組成物それぞれの、ゲノム対比染色能力を下記の手順を用いて評価した。

前記に記載したように調製された標本を有するスライドガラスを用いて、ハイブリダイゼーション直前に各スライドを、７０％ホルムアミドおよび２Ｘ　ＳＳＣを含む７０℃の水性変性用溶液中にｐＨ７，０で３〜１０分間入分間口とによってスライドを変性させた。次に、スライドを、逐次的に、７０％、８５％および１００％エタノール洛中に浸漬し、スライドを各浴中に２分間放置し、そしてスライドを自然乾燥させることによってスライドを脱水した。

所望の容量の標識全ゲノムプローブＤＮＡ原液（典型的に、プローブ２５〜６００μｇを含む）をピペットで小型のプラスチック試験管に移し、そしてプローブを遠心蒸発器中で乾燥させた（容量が３μｍまたはそれ未満である場合、乾燥を省略することがありうる）。プローブに対して、７１．４％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、１４．３％（ｗ／ｖ）ｉ酸デキストラン、２．８６Ｘ　ＳＳＣをｐ）１７゜０で含む溶液７．　０μＪ１所望ならば水３μｍまたはそれ未満中の非標識Ｃｏｔ−１またはヒト胎盤ＤＮＡ、および最終容量１０μｌまでの水を加えた（最終濃度：５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２Ｘ　５ＳＣ）。次に、溶液が入っている試験管を変性のために７０℃の水浴中に３〜１０分間入分間口、ハイブリダイゼーション溶液１０μｌを変性したスライドに直接適用した。

次に、この得られたスライドをカバースリップで被覆し、そしてスライドを湿度調節室に３７℃で一晩中入れた。湿分の蒸発または取込みを防止するために、スライドを湿度調節室に入れる旧に慣例によってラバーセメントを用いてカバースリップの端を密封した。

翌日、カバースリップを除去し、そして二通りの手順のどちらかを用いてスライドを洗浄した。洗浄法＃１では、スライドを以下のように一連の水性浴中に浸漬した。すなわち、５０％ホルムアミドおよび２Ｘ　ＳＳＣ，ｐＨ７を含む浴１〜３中に４５℃で１５分間、２Ｘ　ＳＳＣ，ｐＨ７を含む浴４中に４５℃で１５分間、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐ）（７，０および０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ− ４０を含む浴５中に４５℃で１５分間、モして０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７および０．１％ＮＰ−４０を含む浴６および７中に室温で２分間である。洗浄法＃２では、スライドを以下のように一連の水性浴中に浸漬した。すなわち、５０％ホルムアミドおよび２Ｘ　ＳＳＣ，ｐＨ７を含む浴１〜３中に４５℃で１０分間、２Ｘ　ＳＳＣ，ｐＨ７を含む浴４中に４５℃で１０分間、モして０，１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ’ｉ’、Ｏおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ　４０を含む浴５中に４５℃で５分間である。洗浄後、スライドの水気を切り且つ自然乾燥させた。

抗退色溶液（下記を参照されたい）７．５μｍをスライドに直接適用し、そしてカバースリップを抗退色溶液の馬上に置いた。化学対比染料は、抗退色溶液中にヨウ化プロピジウム０．　２μｇ／ｍｌまたは４，６−ジアミツー２−フェニルインドール塩酸塩（ＤＡＰＩ）１．０μｇ／ｍｌを含むことによって標本に適用することができる。スライドは直ちに観察することができるしまたは窒素若しくはアルゴン下において一２０℃で貯蔵することができる（場合により、スライドは空気中の暗所において室温で数日間貯蔵することができる）。抗退色溶液は、エエＩｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　４３，３４９　（１９８１）にしたがって以下のように製造された。すなわち、ｐ−フエニレンジアミンニ塩酸塩（ングマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ＭＯ）１００ミリグラムをリン酸緩衝溶液１０ミリリツトル中に溶解させた。この溶液のｐＨを、水１０ミリリットルに対してＮ　ａ　ＨＣＯ３を０．４２ｇ加え且つ５０％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨを加えてｐＨを９４０に調整することによって調製された重炭酸塩緩衝溶液を用いてｐＨ８に調整した。ｐＨか調整されたｐ−フエニレンジアミンニ塩酸塩の溶液をグリセロール９０ミリリツトルに加え、そして得られた溶液を０．２２μｍの濾過装置を介して濾過した。この溶液を暗所において一２０℃で貯蔵する。

全ゲノムＤＮＡプローブによって染色された標本を、更に、化学対比染料ＤＡＰＩまたはＰＩの一方で染色し、そして全ゲノムＤＮＡプローブおよび化学対比染料の染色の完全さを同一の中期塗抹で比較した。全ゲノムＤＮＡプローブおよび化学対比染料の双方が同一の材料を染色することが分かった。

結果を下記の表ＶＩＩに要約する。

これらの結果は、実施例３〜実施例１４までのプローブ組成物が、評価された個々のスライド標本中に存在する全部の染色体を完全に染色することを示している。

（ｂ）染色体特異性ペンイトプローブを同時に用いるゲノム対比染色発蛍光団で標識したヒト胎盤ＤＮＡおよび発蛍光団で標識した染色体特異性ペイントプローブを、下記の手順にしたがってｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で同時に用いて、特定の染色体対を一つの蛍光色で染色し且つ全部の染色体を第二の色で対比染色した。

標本を付着させたスライドガラスを用いて、前記に記載のハイブリダイゼーションの直前に標本を変性し且つ脱水した。所望の容量の標識ヒト胎盤ＤＮＡ原液（典型的に、プローブを５０〜６４０ｎｇ含む）を、所望の容量の標識全染色体ペイントプローブ（典型的に、プローブを１００〜６４０ｎｇ含む）と−緒にピペットで小型のプラスチック試験管に移し、そしてプローブを遠心蒸発器中で乾燥させた。プローブに対して、７１．４％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、１４．３％（Ｗ／Ｖ）硫酸デキストランおよび２．８６Ｘ　５ＳＣ）ｆ：ｐＨ７，０で含む溶液７．０μｌと、用いるならば、非標識Ｃｏｔ−ｌＤＮＡから成るブロッキングＤＮＡを１マイクロリツトル（原液濃度＝１μｇ／ｌμＩ）と、そして最終容量１０μｌまでの水とを加えた（最終濃度＝５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２Ｘ　５ＳＣ）。次に、溶液が入っている試験管を７０℃の水浴中に３〜１０分間入れた後、ハイブリダイゼーション溶液１０μｍを変性したスライドに直接適用した。次に、スライドを前記の（ａ）の部分のように処理して、（１）−晩中ハイブリッド形成させ、（２）非ハイブリッド形成プローブを洗浄によって除去し、そして（３）蛍光顕微鏡下で観察するためにスライドを固定した。

下記の表Ｖｌｌ〜Ｘは、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法によるハイブリッド形成試験の詳細を示し且つヒト胎盤対比染料プローブ組成物性能の説明を提供する。示された条件のいずれに関しても、染色体ペイント用プローブが集中した染色体は、対比染料の色とは異なる蛍光色で特異的に且つ明瞭に染色された。これらの結果は、蛍光ヒト胎盤Ｄ　Ｎ　Ａプローブが全部の染色体を視覚的に明瞭に且つ完全に染色し、そして２種類のプローブ組成物かｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法において同時に存在している場合に蛍光染色体ペイント用プローブのハイブリダイゼーシヨンを妨げないということを示している。

表ＶＩＩ発蛍光団で標識したゲノムプローブの対比染色プローブ　結果ヒト胎盤ＤＮＡプローブ・１．５％ＣＴＭＲ１００全部の染色体の極めて明るい−調製試料：４　均一の染色５０　全部の染色体の明るい均一の染色３．６％ＣＴＭＲ１００全部の染色体の極めて明るい領域）を含み、どの染色体も全゛　長全体がある程度まで染色される。

０．７６％ＴｘＲｄ　１００　全部の染色体の明るい均一の染色。

−調製試料＝４溶液１０μ】中のどの染色体も全長全体がある程度まで染色される。

を含み、どの染色体も全長全体がある程度まで染色される。

・　どの染色体も全長全体がある程度まで染色される。

コスミドライブラリーブローブ：Ｃｏｔ−ｌＤＮＡブローブチ観察されたよりも複雑である。

どの染色体も全長全体かある程度まで染色される。

Ｃｏｔ−ＩＤＮ；ヘプローブで観察されたよりも複雑である。

どの染色体も全長全体がある程度まで染色される。

表Ｖｌｌ！ＦＩＴＣ標識全染色体＃４ペイントプローブと用いたＣＴＭＲ−ヒト胎盤ＤＮＡ対比染料（追加のブロッキングＤＮＡ不使用）３２００　３１６　＋＋　＋＋＋＋（〒＋＋）明るい、　（十＋＋＋）極めて明るい。

表ＩＸＦＪＴＣ−ヒト胎盤ＤＮＡ対比染料（追加のブロッキングＤ　Ｎ　Ａ不使用）３２０　２００　＋τ＋　÷〒＋＋（−１−二十）明るい、（キ＋＋＋）極めて明るい。

（４）　Ｈ，Ｐ、はヒト胎盤ＤＮ、Ａセグメントを意味する。

（５）Ｃ４はヒト染色体”：４　Ｄ　Ｎ　Ａセグメントを意味する。

ＣＴＭＲ標織全染色体＃８ペイントプローブと用いたＤＥＣＣＡ−ヒト胎盤ＤＮＡ対比染料（対比染料１０μｍごとにＣｏｔ〜１ブロンキングＤＮＡを１μｇ使用）色された染色体の若干の領域は他の領域よりもかなり明るい、（−４−↓−Ｌ）対比染（＋＋十）明るい、＜＋−＋＋）極めて明るい。

（４）　）Ｔ、Ｐ、はヒト胎盤ＤＮＡセグメントを意味する。

（５）Ｃ４はヒト染色体＃４ＤＮＡセグメントを意味する。

（ｃ）染色体動原体特異性プローブを同時に用いるゲノム対比染色発蛍光団で標識したヒト胎盤ＤＮＡおよび発蛍光団で標識した原体体特異性プローブを、下記の手順にしたがってｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で同時に用いて、特定の染色体動原体対を一つの蛍光色で染色し且つ全部の染色体を第二の色で対比染色した。

標本を付着させたスライドガラスを用いて、前記に記載のハイブリダイゼーシヨンの直前に標本を変性し且つ脱水した。所望の容量の０．３０％ＦＩＴＣ調製試料＃４原液を、所望の容量の３％ＣＴＭＲ染色体＃８動原体特異性プローブ原液と一緒にピペットで小型のプラスチック試験管に移し、そしてプローブを遠心蒸発器中で乾燥させた。プローブに対して、７８．６％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、１４．３％（Ｗ／Ｖ）硫酸デキストラン、２．８６Ｘ　ＳＳＣをｐＨ７，０で含む溶液７．　０μ】と、ブロッキングＤＮＡとして役立つ非標識の音波処理済みヒト胎盤ＤＮＡを２〜４１μｇと、そして最終容量１０μｌまでの水とを加えた（最終濃度、５５％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２Ｘ　５ＳＣ）。

次に、溶液が入っている試験管を７０℃の水浴中に３〜１０分間入分間後、ノーイブリダイゼーション溶液１０μｌを変性したスライドに直接適用した。次に、このスライドを前記の（ａ）の部分と同様に処理して、（１）−晩中ハイブリッド形成させ、（２）非ハイブリッド形成プローブを洗浄によって除去しく洗浄法＃１）、そして（３）蛍光顕微鏡下で観察するためにスライドを固定したが、一つの例外として、−晩中のハイブリダイゼーションは３７℃の代わりに４２℃で行った。

下記の表Ｘ■は、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法によるハイブリッド形成試験の詳細と一緒に、ヒト胎盤対比染色性能の説明を示す。示された条件のいずれに関しても、染色体＃８動原体は、緑色蛍光対比染料の色とは異なる橙色蛍光で特異的に且つ明瞭に染色された。これらの結果は、蛍光ヒト胎盤ＤＮＡプローブが全部の染色体を視覚的に明瞭に且つ完全に染色し、そして２種類のプローブ組成物がｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法において同時に存在している場合に蛍光染色体動原体特異性プローブのハイブリダイゼーションを妨げないということを示している。

表ＸＩＣＴＭＲ標識染色体＃８動原体原体性プローブと用いたＦＩＴＣ−ヒト胎盤対比染料［ＦＩＴＣ−Ｈ，Ｐ、］　ＥＣＴＭＲ−Ｃｅｎ＃８〕　対比染料の目視評価３２０　３２　＋＋＋　＋＋＋＋表ＸＩ脚注・（１）下記の脚注（２）および（３）に示した目視評価の基準。

（２）完全性−（＝）不均一の対比染色、（＋）均一の対比染色であるが、対比染料による染色体表面が極めて平坦でない、（＋＋）染色体表面が均一で、染色された染色体の若干の領域は他の領域よりもかなり明るい、（＋　＋　＋）対比束（＋＋＋）明るい、　（十＋＋＋）極めて明るい。

（４）　Ｈ，Ｐ、　はヒト胎盤ＤＮＡセグメントを意味する。

（５）Ｃｅｎ：：（３はヒト染色体＃８動原体のみに相補的なりＮＡ上セグメント意味する。

（ｄ）連続染色：標識ヒト胎盤Ｄ　Ｎ　Ａを用いるｉｎ　５ｉｔｕｚ＼イブ１ルンド形成法とそれに続く標識動原体ペイント用プローブを用いるｉｎ　５ｉｔｔ＋ｚｓイブ下記の手順にしたがって逐次的にｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で用いて、特定の染色体対を一つの蛍光色で染色し且つ全部の染色体を第二の色で対比染色した。

ヒトゲノムの標本を付着させたスライドガラスを用いて、前記に記載のハイブリダイゼーションの直前に標本を変性し且つ脱水した。０．２９％ＦＩＴＣｉｉ製試料＃４原液２，２３μｌ　（プローブ６００　ｎ　ｇ）をピペットで小型のプラスチック試験管に移し、そしてプローブ組成物を遠心蒸発器中で乾燥させた。

プローブに対して、７１．４％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、１４．３％（ｗ／ｖ）硫酸デキストランおよび２．８６Ｘ　ＳＳＣをｐＨ７，０で含む溶液７．０μｌと、最終容量１０μｍまでの水とを加えた（最終濃度：５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストランおよび２Ｘ　５ＳＣ）。次に、溶液が入っている試験管を７０℃の水浴中に５分間入れ、そしてハイブリダイゼーション溶液１０μｍを変性したスライドに直接適用した。次に、スライドを前記の（ａ）の部分と同様に処理して、（１）−晩中ハイブリッド形成させ、（２）非ハイブリッド形成プローブを洗浄によって除去しく洗浄法２）、そして（３）蛍光顕微鏡下で観察するためにスライドを固定した。

染色した標本を観察した後、カバースリップを除去し且つ２Ｘ　ＳＳＣおよび０．１％ＮＰ４０を含むｐＨ７，０の水性浴中において室温で３０分間スライドを洗浄して固定用媒質を除去することによって標本を第二のハイブリダイゼーション用に調製した。次に、スライドの水気を切り且つ自然乾燥させた。本明細書中前記に記載したように製造された２、０％ＣＴＭＲ全染色体＝８ペイント用プローブ組成物原液３．３３μｌ　（１００ｎ　ｇ）をピペットで小型のプラスチ・ンク試験管に移し、そしてプローブ組成物を遠心蒸発器中で乾燥させた。プローブ組成物に対して、７１．４％（ｖ／′ｖ）ホルムアミド、１４．３％（Ｗ／’ Ｖ）　ｖＦＬ酸デキストラン、２．８６Ｘ　ＳＳＣをｐＨ７，０で含む溶液７．　０μｍと、ブロッキングＤＮＡのためのＣｏ　ｔ−ｌＤＮＡ　（Ｃｏ　ｔ−ｌＤＮＡが１ｔｔｇ／ａＩ（原液））１μＪと、そして最終容量１０μｌまでの水とを加えた（最終濃度：５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、２Ｘ　５ＳＣ）。次に、溶液が入っている試験管を７０℃の水浴中に５分間入れ、そしてハイブリダイゼーション溶液１０μｍをスライドに直接適用した。次に、スライドを前記の（ａ）の部分と同様に処理して、（１）−晩中ハイブリッド形成させ、（２）非ハイブリッド形成プローブを洗浄によって除去しく洗浄法２）、そして（３）蛍光顕微鏡下で観察するためにスライドを固定した。

最初のハイブリダイゼーション後に、蛍光顕微鏡下の検査は全部の染色体について十分な強さの均一なＦＩＴＣ染色を示した（緑色室１．第二のハイブリダイゼーション後に、ＦＩＴＣ染色の強さはある程度減少したが、なお均一であり且つ容易に識別された。更に、単一の染色体対の明るく且つ特異的ＣＴＭＲ染色（橙色蛍光）か観察された。したがって、対比染料プローブ組成物は、２種類の異なるプローブ組成物を同一標本に用いるこのような逐次的染色方法においてゲノムＤＮＡを完全に染色する。

（ｅ）連続染色：標識染色体ペイント用プローブ組成物を用いるｔｎ　５ｉｔＵハイブリツド形成法とそれに続く標識ヒト胎盤ＤＮＡを用いるｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法ＣＴＭＲ標識染色体ペイント用プローブおよびＤＥＣＣＡ標識ヒト胎盤ＤＮＡを、下記の手順にしたがって逐次的にｉｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成法で用いて、特定の染色体対を一つの蛍光色で染色し且つ全部の染色体を第二の色で対比染色した。

標本を付着させたスライドガラスを用いて、前記に記載のハイブリダイゼーションの直前に標本を変性し且つ脱水した。前記に記載したように製造された３゜０％ＣＴＭＲ全染色体＃７ペイント用プローブ岨成物原液３．３３μｌ（１００ｎｇ）をピペットで小型のプラスチック試験管に移し、そしてプローブ組成物を遠心蒸発器中で乾燥させた。乾燥したプローブ組成物に対して、７１．４％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミド、１４．３％（Ｗ／Ｖ）硫酸デキストランおよび２．８６ＸＳＳＣをｐＨ７，０で含む溶液７．０μｌと、ブロッキングＤＮＡのためのＣｏ　ｔ−ｌＤＮＡ　（Ｃｏ　ｔ−ｌＤＮＡが１μｇ／１μｍ　（原液））１μｍと、そして最終容量１０μｍまでの水とを加えた（最終濃度：５０％ホルムアミド、１０プローブを洗浄によって除去しく洗浄法２）、そして（３）蛍光顕微鏡下で観察ＥＣＣＡ調製試調製試料液２原液６８μｌ　（プローブ３００ｎｇ）をピペットで小ブを洗浄によって除去しく洗浄、−！−２）、そして（３）蛍光顕微鏡下で観察するためにスライドを固定した。

ンヨン後に、ＣＴ〜ＩＲ染色の強さはある程度減少したが、それはなおかなり明るく且つ容易に識別された。更に、全部の染色体について十分な強さの完全なりＥＣＣＡ染色（淡緑青色蛍光）が観察された。

染色ハイブリダイゼーションは、実施例１３のビオチン標識プローブ１１００ｎを、ハイブリダイモーション溶液１０μｍ中の１．５％ＣＭＴＲ樟識調製試料＃４の１１００ｎおよびＣｏｔ−ｌＤＮＡの１μｇと一緒にインキュベートしたことを除き、実施例１５（ａ）の場合と本質的に同じに行った。更に、下記のように、間接標識試薬を結合するのに数回のハイブリダイモーション後インキュベージコンを必要とした。−晩生のハイブリダイゼーション後に、スライドを洗浄（洗浄法＃１）した後、蛍光性ストレプトアビジン（ベクター・ラブダ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）、バーリンゲーム、ＣＡから入手した）５μｇ／ｍｌ　（ＰＭＮ緩衝液）（ＰＭＮ緩衡液＝０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０．０．１％（Ｗ／ｖ）ＮＰ−４０，０，２％アジ化ナトリウムおよび５％脱脂粉乳）の溶液中において室温で２０分間インキュベートした。次に、スライドをＰＮ緩衝液（ＰＮ緩衝液＝Ｏ，１Ｍリン酸ナトリウムおよび０．１％（ｗ／ｖ）ＮＰ−４０、ｐＨ７，０）中において室温でそれぞれ２分間２回洗浄した後、ビオチニル化抗ストレプトアビジン（ベクター・ラブダから入手した）５μｇ／ｍｌ　（ＰＭＮ緩衝ａの溶液中において室温で２０分間インキュベートした。次に、スライドをＰＮ緩衝液中において室温でそれぞれ２分間２回洗浄し、そして蛍光性ストレプトアビジン（上記と同一）の溶液中において室温で２０分間インキュベートした。次に、スライドをＰＮ緩衝液中においてそれぞれ２分間最後に２回洗浄し、そしてスライドの水気を切り且つ自然乾燥させた後、抗退色溶液を適用し、カバースリップで被覆し、そして蛍光顕微鏡下で観察した。

蛍光顕微鏡下の検査は、単一の中期染色体対の明るく且つ特異的な緑色染色と一緒に、染色体全部の明るく且つ完全な橙色染色を示した。この結果は、直接標識ヒト胎盤ＤＮＡプローブが、間接標識プローブによって必要とされるハイプリダイセージタン後標識反応によって悪影響を及ぼされないし、そして関節標識プローブのハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後反応を妨げない、視覚的に明瞭なゲノム対比染色を提供することを示す。

他のおよび更に別の実施態様は、前述の説明および実施例から当業者に明らかである。不合理な制限等がそこから引き出されることはない。

ＳＡ　６５２０４国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．標本中に存在するゲノムＤＮＡを対比染色するための直接標識プローブ組成物であって、発蛍光団に対して結合性基によって共有結合しているＤＮＡセグメントの混合物を含み、該ＤＮＡセグメントが、ゲノムＤＮＡが存在する標本が由来した生物の全ゲノムＤＮＡに由来しており且つ該全ゲノムＤＮＡをほぼ代表している上記の組成物。
２．前記のセグメントの平均寸法が約１５０〜約６００塩基対の範囲であり、該セグメントはそれらの全デオキシシチジンヌクレオチドの約１〜約７０モル％上において前記の結合性基で置換されており、そして該結合性基全部の少なくとも約１０モル％が前記の発蛍光団基に更に共有待合している請求項１に記載の組成物。
３．多数の標準的な細胞に位置した染色体じゅうに通常分布しているゲノムを含にゲノムＤＮＡの存在を検出するための直接標識プローブ組成物であって、（ａ）該ゲノムの全ゲノムＤＮＡに由来し且つＤＮＡセグメント部分に対して相補的である種々のＤＮＡセグメントの混合物が該染色体の連続ＤＮＡじゅうに存在し、該ＤＮＡセグメントの平均寸法が約１５０〜約６００塩基対の範囲であり、（ｂ）該ＤＮＡセグメントがそれらの全デオキシシチジンヌクレオチドの約１〜約７０モル％上において結合性基で置換されていて、そして（ｃ）前記のそのように置換した結合性基全部の少なくとも約１０モル％がそれぞれ発蛍光団基に更に共有結合しておりその結果、ＤＮＡセグメントを含む該発蛍光団基の一つ一つが、該ゲノムのゲノムＤＮＡを実質的に完全に対比染色するために、ゲノムじゅうに存在するＤＮＡ配列の相補的セグメント部分に対してハイブリッド形成しうることを特徴とする上記のプローブ組成物。
４．前記のゲノムがヒトゲノムであり且つ前記のＤＮＡセグメントの平均寸法が約１８０〜約４００塩基対の範囲である請求項３に記載のプローブ組成物。
５．前記のＤＮＡセグメントが、変性し、部分的に再生され（ｒｅｎａｔｕｒｅｄ）、そして酵素で消化されて、そこに通常存在するＤＮＡ非反復セグメントの量を減少したフラグメント化ヒト全ゲノムＤＮＡ由来である請求項４に記載のプローブ組成物。
６．前記のＤＮＡセグメントがヒト全ゲノムＤＮＡのフラグメント化ライブラリー由来である請求項４に記載のプローブ組成物。
７．少なくとも１種類の他の直接標識プローブ組成物との混合物で存在し、該他のプローブ組成物それぞれが、前記のゲノムを含に全ゲノムＤＮＡの特定の部分に集中している請求項３に記載のプローブ組成物。
８．前記の他の直接標識プローブ組成物が、前記の属の一つの染色体の一つの領域の存在を検出する請求項７に記載のプローブ組成物。
９．前記の他の直接標識プローブ組成物が、前記の属の一つの予め決定された染色体の存在を検出する請求項７に記載のプローブ組成物。
１０．前記のゲノムの全ゲノムＤＮＡ由来であり且つ前記の染色体じゅうに存在するＤＮＡセグメント部分に対して相補的である種々のＤＮＡセグメントの混合物を含み、該セグメントの平均寸法が約１５０〜約６００塩基対の範囲であるブロッキングＤＮＡ組成物との混合物で存在する請求項３に記載のプローブ組成物。
１１．少なくとも１種類の直接標識プローブ組成物との混合物で存在する請求項３に記載のプローブ組成物。
１２．前記の二官能性結合性基が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼から成る残基の群より選択され；Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素および低級アルキルから成る群より選択され；ｍおよびｎはそれぞれ、１〜６までの独立して選択された整数であり；そしてｐは０または１の整数であり；そして各残基▲数式、化学式、表等があります▼は種々の前記のデオキシシチジンヌクレオチドに結合しており且つ各残基−Ｘ−は、−Ｘ−と反応して共有結合生成を引き起こす置換基を含に発蛍光団基と共有結合している）を特徴とする請求項３に記載のプローブ組成物。
１３．前記のセグメント混合物中に存在する全デオキシシチジンヌクレオチドの約１〜約７０モル％が前記の結合性基で置換されていて、そして前記のそのように置換された結合性基全部の約１０〜約１００モル％がそれぞれ前記の発蛍光団基に更に共有結合している請求項１２に記載のプローブ組成物。
１４．前記の発蛍光団基が、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、スクシンイミジルエステル；スルホロダミン１０１スルホニルクロリド；５−（および−６）カルボキシロダミン１０１、スクシンイミジルエステル；リサミンロダミンＢスルホニルクロリド；５−（および−６）−カルボキシ−フルオレセイン、スクシンイミジルエステル；フルオレセイン−５−イソチオシアネート；７− ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、スクシンイミジルエステル；テトラメチルロダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシテトラメチルロダミン、スクシンイミジルエステル；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、スクシンイミジルエステル；６−［フルオレセイン−５−（および−６）−方ルボキサミド］ヘキサン酸スクシンイミジルエステル；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ− ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、スクシンイミジルエステル；スペーサ− 基によってＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル反応性基に結合したフルオレセイン核；エオシン−５−イソチオシアネート；エリトロシン−５−イソチオシアネート；および１−ヒドロキシ−３，６，８−ピレントリスルホン酸の０−アセチルアジド誘導体から成る群より選択される化合物の誘導体である請求項１２に記載のプローブ組成物。
１５．前記の発蛍光団基それぞれが、スクシンイミジルエステル、スルホン酸塩化物、イソチオシアネートおよびアセチルアジドから成る群より選択される反応性基によって前記の結合性基に結合しており、前記の発蛍光団基それぞれが１個の発蛍光団置換基を含み、そして前記の発蛍光団基それぞれの吸光係数が少なくとも約６．０００ｍ−１ｃｍ−１であり且つ量子収量が少なくとも約０．０２である請求項３に記載のプローブ組成物。
１６．多数の細胞に位置した染色体じゅうに通常分布しているゲノムの全ゲノムＤＮＡを対比染色するプローブ組成物を製造する方法であって、（ａ）前記のゲノムの全ゲノムＤＮＡに由来し且つ前記の染色体の一つ一つにおいて多数の位置に独立して存在する多数のＤＮＡ配列をセグメントの混合物にフラグメント化し，該セグメントの平均寸法は約１５０〜約６００塩基対の範囲であり；（ｂ）前記のセグメントを、２個の官能性置換基の一方がデオキシシチジンヌクレオチドと反応性である二官能性結合性化合物でトランスアミノ化し、該トランスアミノ化を、アルカリ金属重亜硫酸塩触媒を中に溶解した、そしてｐＨが約４．５〜約７．５の範囲である水性媒質中で行い、該水性媒質は、該セグメント中に存在する全デオキシシチジンヌクレオチドの約１〜約７０重量％が前記の一方の官能性置換基で置換され、それによってトランスアミノ化したセグメントを生じるまで約２０〜約６０℃の範囲の温度で保持され；そして（ｃ）少なくとも若干の前記のそのようにトランスアミノ化した結合性化合物の第二の残りの官能性置換基に対して、少なくとも１個の発蛍光団置換基および前記の第二の反応性置換基と反応性である反応性置換基双方を組込む蛍光化合物を共有結合させ、該共有結合を、水性液相条件下において前記のそのようにトランスアミノ化したセグメントと、実質的にモル過剰の該蛍光化合物とを、温度を約４〜約５０℃の範囲で保持しながら接触させることによって行うという工程を含む上記の方法。
１７．前記のフラグメント化を音波処理によって行い、そして前記のフラグメントの平均寸法が約２００〜約４００塩基対の範囲である請求項１６に記載の方法。
１８．前記の全ゲノムＤＮＡが、ヒト胎盤ＤＮＡ；変性し、部分的に再生され、そして酵素で処理されたヒト全ゲノムＤＮＡ；およびヒトゲノムのライブラーから成る群より選択される請求項１６に記載の方法。
１９．前記の結合性化合物が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘは、 ▲数式、化学式、表等があります▼および▲数式、化学式、表等があります▼から成る種類より選択される二官能性基であり；Ｒは、２〜１２値までの炭素原子を有するアルキレン基並びに２〜１２個までの炭素原子および１個のエーテル酸素原子を有するアルコキシアルキレン基から成る群より選択される二官能性基であり；そしてＲ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素および低級アルキルから成る種類より選択される）を有する請求項１６に記載の方法。
２０．前記のトランスアミノ化した結合性基全部の少なくとも約１０重量％が前記の蛍光化合物に対して共有結合した請求項１６に記載の方法。
２１．多重染色体生物由来である標本中に存在するゲノムＤＮＡを識別する方法であって、逐次的に（ａ）該標本を、ハイブリッド形成条件下で請求項１に記載のプローブ組成物と接触させて、該ゲノムＤＮＡと、該プローブ組成物中に存在するプローブＤＮＡセグメントとの間にハイブリッドを生じるようにし；（ｂ）得られた該標本から該プローブ組成物の残留部分を分離し；そして（ｃ）該ハイブリッド中に存在する発蛍光団基が蛍光を発するのに少なくとも十分であるようにエネルギーを照射し、同時に、そのようにして生じた得られた蛍光エネルギーを検出し、それによって該標本中に存在する該ゲノムＤＮＡを識別することにより該得られた標本を検査するという工程を含に上記の方法。
２２．（ａ）前記の標本が、スライドの片側表面上に固体付着層として分布している細胞学的材料から成り；（ｂ）前記の接触を、前記のプローブ組成物の水溶液をハイブリッド形成条件を用いて該標本に適用することによって行い、（ｃ）前記の分離を、前記の得られた標本を水性液で洗浄することによって行い；（ｄ）前記の検査を、蛍光顕微鏡を用いて行う請求項２１に記載の方法。
２３．（ａ）前記の標本が染色体の水性懸濁液から成り；（ｂ）前記の接触を、前記のプローブ組成物を該懸濁液中に溶解させることによって行い、（ｃ）前記の分離を遠心分離によって行い；（ｄ）前記の検査を流動血球計算器を用いて行う請求項２１に記載の方法。
２４．前記の接触後に残留する前記のプローブ組成物の濃度が、前記の検査を妨げない程度に低く且つ前記の分離工程を実施しない請求項２３に記載の方法。
２５．前記の接触の前に、前記のプローブ組成物を少なくとも１種類の追加の異なるプローブ組成物と混合し、そして該追加のプローブ組成物がそれぞれ前記のゲノムの予め決定された部分領域に集中する請求項２１に記載の方法。
２６．前記の追加のプローブ組成物それぞれが、蛍光発生顕微鏡条件下でそれぞれが関係した観察しうる色が該条件下の該プローブ組成物での発蛍光団基の観察しうる色とは異なる直接検出可能な発蛍光団基を組込む請求項２５に記載の方法。
２７．１種類の追加のプローブ組成物をそのように混合し、そして前記の接触中に、前記のゲノムの単一の予め決定された特定の染色体が前記の標本中に存在する場合に、該１種類の追加のプローブ組成物が該染色体とハイブリッド形成する請求項２５に記載の方法。
２８．１種類の追加のプローブ組成物をそのように混合し、そして前記の接触中、前記のゲノムの単一の予め決定された特定の染色体の動原体領域が前記の標本中に存在する場合に、該１種類の追加のプローブ組成物が該動原体領域に対してハイブリッド形成する請求項２５に記載の方法。
２９．少なくとも１種類の前記の追加の異なるプローブ組成物が間接標識プローブ組成物である請求項２５に記載の方法。
３０．前記の工程（ｃ）の前に、前記の工程（ａ）および（ｂ）の順序を少なくとも１回繰返し、前記の繰返し毎に、異なるプローブ組成物を、一度用いた請求項１に記載の前記のプローブ組成物と一緒におよび前記のゲノムの異なる予め決定された部分領域に集中しているそれぞれのこのような他のプローブ組成物と一緒に用いる請求項２１に記載の方法。
３１．前記のゲノムがヒトゲノムである請求項２１に記載の方法。
３２．請求項２１に記載の方法によって製造されたハイブリッド。
３３．請求項２１に記載の方法によって製造された、対比染色されたゲノムＤＮＡ。
３４．（ａ）請求項１に記載の直接標識プローブ組成物約２〜約２００ｎｇ／μ １；（ｂ）変性剤０〜約８０％（ｖ／ｖ）；（ｃ）ハイブリダイゼーシヨン速度促進剤約５〜約１５％（ｗ／ｖ）；（ｄ）緩衝塩約５〜約１００ミリモル；（ｅ）ハイブリッド安定化塩約０．０５〜約１モル；および（ｆ）水の平衡を含にハイブリダイゼーシヨン組成物。
３５．ブロッキングＤＮＡを０〜約１マイクログラム／マイクロリットル更に含む請求項３４に記載の組成物。