JP2001514741A

JP2001514741A - 緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体による標的の検出

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Publication number: JP2001514741A
Application number: JP53601098A
Authority: JP
Inventors: トッドダブリュー．プライア
Original assignee: オンカーインク．
Priority date: 1997-02-18
Filing date: 1998-02-18
Publication date: 2001-09-11
Also published as: WO1998036099A1; EP1000172A1; EP1000172A4; AU6658898A; CA2283094A1

Abstract

(57)【要約】緑色蛍光蛋白質またはその蛍光変異体を、標的の検出において標識されたマーカーとして使用するためにリガンドと結合させる。適したリガンドには、核酸プローブ、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンが含まれる。蛍光顕微鏡のような技術を用いて標識されたマーカーを可視化する。

Description

【発明の詳細な説明】緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体による標的の検出発明の背景１．発明の分野本発明は、生きている生物から、生きている生物中での、または生きていない生物中での、蛋白質、ペプチド、DNA、RNA、糖質等の標的化合物の検出および／または単離に関する。より詳しく述べると、そのような化合物は、緑色蛍光蛋白質またはその蛍光変異体を組み入れた蛍光マーカーを使用することによって検出および／または単離される。２．関連技術の説明生きている生物から、または生きている生物において化合物を検出、位置特定および単離するためには、そのような生物をよりよく理解することがしばしば必要となる。結果として、生体系における標的分子の位置を特定するために様々な技法が開発された。例えば、感染に対する防御として脊椎動物が産生する蛋白質である抗体は、特異的な分子、すなわち抗原を認識する。放射性化合物または蛍光化合物のような検出可能な標識で標識した抗体は、特異的抗原に対する該抗体の親和性のために、特定の分子の位置を特定するために強力なツールとなる。標識抗体が抗原に結合すれば、放射活性または蛍光の部位を観察することによって、得られた複合体を検出することができる。核酸プローブは、遺伝子材料を検出、位置特定、および／または単離するために用いられる。放射活性または蛍光標識は、検出可能な標識プローブを作製するためにオリゴヌクレオチド上に位置する。そのようなプローブを使用することによって、cDNAおよびゲノムライブラリにおける特定の遺伝子の位置を特定することができる。より詳しく述べると、二本鎖の核酸を高温または高いpHによって変性させると、相補的塩基対が解離し、二本鎖ヘリックスは分離した２つの鎖に分かれる。一本鎖は、ハイブリダイゼーションとして知られるプロセスにおいて、それ自身と、または他の相補的核酸と再会合することができる。このように、核酸の性質を変性させることによって、変性した核酸の標的部分に対する相補的核酸を作製することによって、相補的核酸配列を³²Pのような放射性物質で標識することによって、および相補的核酸を変性した核酸とハイブリダイズさせ、それにより検出可能な放射活性プローブを二本鎖核酸に組み入れることによって、遺伝子配列を検出してもよい。プローブとして知られる標識された核酸により、放射活性部位を観察することによって標的核酸の位置が特定できる。標識された核酸プローブはまた、液体および組織中のウイルスおよび細菌のような病原体を検出するために用いられる。上記検出技法において用いられる標識は、放射性であっても、非放射性であってもよい。一般的な非放射性標識には、検出可能な酵素および蛍光分子が含まれる。蛍光分子は、ある波長で光を吸収し、別の波長でこれを放出して、例えば蛍光顕微鏡によって可視化される。分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーおよびフローソーターは周知であり、それらを蛍光色素と共有的にカップリングさせることによって蛍光体となった特異的分子を検出するためにしばしば用いられる。アミノクマリン酢酸（AMCA）、フルオレセイン・イソチオシアネート（ FITC）、テトラメチルコダミン・イソチオシアネート（TRITC）、テキサスレッド、Cy 3.0およびCy 5.0のような蛍光色素は、蛍光顕微鏡を用いた検出の際に、抗体分子および核酸プローブに共有的にカップリングする。緑色蛍光蛋白質（GFP）は近年、GFPをコードする遺伝子がクローニングされて以来関心を集めるようになった。GFPは腔腸動物門、例えばクラゲのアエコレア・ビクトリア（Aequorea victoria）およびウミシイタケであるレニラ・レニフォルミス（Renilla reniformis）において産生される生物発光蛋白質である。レニラ GFPの放出スペクトルはアエコレアGFPのスペクトルとほぼ同一であるが、アエコレア GFPの最大励起波長は393nmであるのに対し、レニラでは498nmである。デラグレーブら（Delagrave）の「緑色蛍光蛋白質の赤色シフト励起変異体（Red -shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescent Protein）」、Bio/Te chnology、13巻、151〜154頁（1995）を参照のこと。アエコレアおよびレニラGF Pは、ヘキサペプチドからなり、蛋白質骨格を通じて共有結合した環状トリペプチド配列を含む、構造的に同一の発色団であると考えられている。アエコレアおよびレニラGFPの発色団の蛍光特性は、周辺の蛋白質マトリクスによって実質的に影響を受ける。エーリヒら（Ehrig）、「蛍光励起スペクトルが変化した緑色蛍光蛋白質変異体（Green-fluorescent protein mutants with alter ed fluorescence excitation spectra）」、FEBS Letters、367、163〜166頁（1 995）を参照のこと。単離されたヘキサペプチドも変性蛋白質も蛍光ではない。蛋白質の誤まった折り畳みを生じるGFPのほとんどの変異は、部分的または完全な蛍光の喪失を引き起こすと考えられている。キュビットら（Cubit）、「緑色蛍光蛋白質の理解、改善および使用（Understanding，improving and using gre en fluorescent proteins）」、TIBS 20、448〜455頁（1995）を参照のこと。一つの理論は、誤まって折り畳まれたGFPでは周辺の水から発色団を遮蔽することができないということである。フルオレセイン・フィルターによって励起される野生型アエコレアGFPは、遊離のフルオレセインの同じ分子数より明るさが約１桁弱いことが判明している。 GFP融合蛋白質は、生きている組織および固定した組織における遺伝子発現および蛋白質の位置特定のマーカーとして用いられている。例えば、米国特許第5, 491,084号を参照のこと。同様に、雌性胚芽細胞におけるGFPとex蛋白質との融合体をコードするキメラ遺伝子の発現を含む、ワンら（Wang）、「ショウジョウバエの卵形成におけるex蛋白質の空間的分布からのbcd mRNA位置特定の持つ意味（ Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis）」、Nature、369巻、400〜403頁（1994）も参照のこと。関係する標的の検出に用いることができる新しい蛍光分子および技法に関する研究が進行中である。研究は、分光測光法、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーおよびフローソーターを利用する技法の検出感度および解像度のレベルを増加させるために必須である。発明の概要緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識と、標的に結合するよう形成されたリガンドとを含む、標的を検出するための標識されたマーカーについて記述する。リガンドには、もう一つの物質に対して親和性を有するいかなる分子または分子の組合せも含まれる。例えばリガンドは、核酸プローブ、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択することができる。緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識と、標的に結合するためのリガンドとを含む、標識されたリガンドを提供することを含む標的の検出法も提供される。標識したリガンドに標的を接触させ、標識したリガンドを標的に結合させる。標識したリガンドおよび標的に、標識を励起する波長を有する光を照射して、蛍光の位置を観察する。標的に結合するよう形成された一次リガンドを提供する段階、および一次リガンドに結合するよう形成された二次リガンドを提供する段階を含む、標的の検出法についても記述する。二次リガンドには、緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識が含まれる。標的を一次リガンドに接触させ、一次リガンドを標的に結合させる。標識した二次リガンドを一次リガンドに接触させて、二次リガンドを一次リガンドに結合させる。結合した標識二次リガンドに、標識を励起する波長を有する光を照射して、蛍光の位置を観察する。標的に結合するよう形成された一次リガンドを提供する段階、および一次リガンドに結合するように形成された二次リガンドを提供する段階を含む、標的の検出法についても記述する。標識を組み入れ、二次リガンドに結合するよう形成された三次リガンドについても提供する。標識は、緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される。標的を一次リガンドに接触させ、一次リガンドを標的に結合させる。一次リガンドを二次リガンドに接触させ、二次リガンドを一次リガンドに結合させる。二次リガンドを標識した三次リガンドに接触させ、標識したリガンドを二次リガンドに結合させる。結合した標識三次リガンドに、標識を励起する波長を有する光を照射して、蛍光の位置を観察する。緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識を有するマーカーと複合体を形成した標的を含む、標識したマーカー／標的複合体についても記述する。マーカーはさらに、抗体、核酸プローブ、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジンおよびハプテン結合体からなる群より選択される、標的に結合するよう形成されたリガンドを少なくとも一つ組み入れる。マーカーは選択的に、標的に結合するよう形成された少なくとも一つのリガンドに結合することができる他のリガンドを組み入れてもよい。緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識を提供する段階ならびにリガンドに標識を結合させる段階を含む、標識されたマーカーの製造法についても記述する。適したパッケージング材料と、緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識を含むリガンドとを含むキットについても記述する。図面の簡単な説明図1Aは、分裂中期のヒト第17染色体相同体のセントロメア付近で標的と複合体を形成した標識マーカーからの緑色蛍光シグナルを示す写真である。図1Bは、分裂間期の各第17染色体相同体のセントロメア付近で標的と複合体を形成した標識マーカーからの２つの緑色蛍光シグナルを示す写真である。図２は、標的と複合体を形成した標識マーカーからの３つの緑色蛍光シグナル、すなわち２つは、２つの第16染色体相同体のそれぞれのセントロメア付近、そしてもう一つは分裂中期の核における１つのY染色体のYq12領域上のセントロメア付近のシグナル、を示す写真である。図3Aは、正常な分裂中期の核におけるHER-2/neu遺伝子の各コピーの位置で標的と複合体を形成した標識マーカーからの緑色蛍光シグナルを示す写真である。図3Bは、正常な分裂間期の核におけるHER-2/neu遺伝子の各コピーの位置で標的と複合体を形成した標識マーカーからの緑色蛍光シグナルを示す写真である。発明の詳細な説明本発明の標識マーカーには、標識部分とリガンド部分とが含まれる。標識は、標識したマーカーの位置が周囲から識別されるようなシグナルを提供する。リガンドは所望の標的に結合し、それにより、標的に標識を輸送する媒体となる。標識は、緑色蛍光蛋白質（GFP）またはその蛍光変異体である。GFPはアミノ酸 238個を有する特徴分析が十分に成された蛋白質である。その蛍光変異体についても記述されている。例えば、ハイムら（Heim）、「緑色蛍光の改善（Improved Green Fluorescence）」、Nature、373巻、663〜664頁（1995）（65位のセリンがアラニン、ロイシン、システインまたはトレオニンになる）、またはデルグレーブら（Delgrave）、「緑色蛍光蛋白質の赤色シフト励起変異体（Red shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescent Protein）」、Biotechnology、 13 巻、151〜154頁（1995）を参照のこと（表１参照）。RSGFP（64位のフェニルアラニンがメチオニン、65位のセリンがトレオニン）およびGFP-S65Tは、最大励起ピークが約490nmにシフトしている。変異体GFPuv（99位のフェニルアラニンがセリン、153位のメチオニンがトレオニン、163位のバリンがアラニン）は、UV光（ 360〜400nm）で励起すると最大蛍光を発する。増強されたGFP（「EGFP」）は、トランスフェクトされた細胞において、野生型GFPより350倍まで明るい赤色シフト変異であると報告されている。変異体EGFPは、カリフォルニア州のクロンテック・ラボラトリーズ・インク（Clontech Laboratories，Inc.）より販売されている。このようにGFPの蛍光変異体およびそれらを得る方法は当業者に周知である。GFPの変性または誤まった折り畳みによって蛍光が喪失することは確立されているが、本発明において用いられる標識は、後述するように、リガンドに対するクロスリンクによって蛍光を喪失する点まで有害に変化しない。本明細書のリガンドは、標的に対する親和性を示すあらゆる分子または分子の組み合わせである。リガンドの例には、核酸プローブ、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、ストレプトアビジン、およびアビジンが含まれる。そのようなリガンドを得て使用することに関係するメカニズムは周知である。本発明の態様に従って、核酸プローブは、GFPまたはその蛍光変異体を組み入れる一つ以上のヌクレオチドによって構築する。標識をヌクレオチドと結合させる適した架橋剤については以下で考察する。本発明は、インサイチューハイブリダイゼーションでの使用、すなわちインサイチューで特異的な核酸配列の位置特定に核酸プローブを使用すること、に特によく適合している。GFPまたはその蛍光変異体で直接または間接的に標識した核酸プローブを、例えば高いpHによって変性させた染色体とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション段階において標識されたプローブと結合した染色体領域は、当技術分野で頭字語FISHによって知られる方法において、蛍光顕微鏡によって可視化される。抗原を特異的に認識する抗体は、本発明のもう一つの態様に従って有用である。GFPまたはその蛍光変異体で標識した抗体は、蛍光顕微鏡のような蛍光検出技法によって特異的標的分子の位置特定に用いられる。従来の技法を用いてモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を作製して精製してもよい。精製後、抗体をGFPまたはその蛍光変異体で標識する。標識と抗体とのカップリングの際に使用することが適当な架橋剤は後述する。GFP標識抗体または蛍光GFP変異体標識抗体は、細胞抽出物中での標識分子の検出および定量に、または標的が細胞またはウイルス表面上に存在する場合には不均一な集団から特定の種類の生きている細胞またはウイルスを取り出すために用いられる。このようにして、本発明の検出マーカーは、病原体、癌細胞、またはペプチド、蛋白質、核酸等のような独自の標的分子の存在を特徴とするその他の疾患状態の有無を検出するために用いることができる。もう一つの態様において、GFPまたはその蛍光変異体は、ジゴキシゲニンおよびジニトロフェニルのようなハプテン結合体に結合させる。そのようなハプテンは免疫学において重要なツールとなる。ハプテン、例えばジニトロフェニルをペプチドまたは蛋白質のような担体とカップリングさせることによって、ペプチドまたは蛋白質は抗原性となる。このように、GFPまたはその蛍光変異体を既知のハプテンまたはそのようなハプテンを認識する抗体と結合させることによって、検出可能なマーカーが作製される。ジゴキシゲニン結合体の使用については、例えば、米国特許第4,469,797号に記述されている。ハプテン結合体に反応して形成された抗体／抗原複合体は、GFPもしくはその蛍光変異体を、ハプテンまたはハプテンに対する担体、またはそのようなハプテンもしくはハプテンに対する担体を認識する抗体と結合させることによって、そして蛍光顕微鏡のような蛍光検出技法を用いて蛍光部位を観察することによって、容易に検出される。本発明のもう一つの局面において、核酸プローブまたは抗体の感度は、シグナル増幅技法によって増強される。上記のように、GFPまたはその蛍光変異体は標的に結合するリガンドに直接結合させることができる。しかし、第一または一次リガンドが標的に結合して、一次リガンドがそれに結合するGFPまたはその蛍光変異体で標識された二次リガンドのグループで検出される場合には、より強いシグナルが可能である。一つの態様において、リガンドが抗体である場合、そのような増幅技法には、間接的な免疫組織化学が組み入れられる。この場合、一次抗体はGFPまたはその蛍光変異体を標識として組み入れる複数の二次抗体によって結合される。複数の標識が標的部位に集められるために、シグナル強度は増加する。もう一つの態様において、ストレプトアビジンまたはアビジンに対するビオチンの高い結合親和性により、本発明において増幅したシグナルを提供することができるよく適合した検出マーカーが提供される。同様に、標識した抗ビオチン、抗ストレプトアビジン、または抗アビジン抗体を本発明に従って使用することも可能である。一つの局面において、検出可能なマーカーを作製するためにGFPまたはその蛍光変異体をビオチンと結合させる。この場合、ビオチンは従来の技法を用いて核酸プローブに結合させる。次に、ビオチン化プローブを、変性した標的核酸にハイブリダイズさせる。GFPまたはその蛍光変異体で標識したストレプトアビジンまたはアビジンを、ハイブリダイズした核酸と接触させると、これによって、標識したストレプトアビジンまたはアビジンと、ビオチン化プローブのビオチン部分との結合が起こる。このようにストレプトアビジンまたはアビジンはリガンドとして機能する。蛍光顕微鏡によって蛍光シグナルが可視化され、標的の位置が正確に示されるようになる。または、GFPまたはその蛍光変異体はビオチンに結合するが、ストレプトアビジンまたはアビジンは核酸プローブに結合してもよい。このようにして、標識したビオチンは、ストレプトアビジンまたはアビジン結合核酸プローブとの結合において、リガンドとして作用する。各ストレプトアビジンまたはアビジン分子はビオチン分子４個と結合することができるため、４個もの蛍光シグナルが標的部位に濃縮される可能性がある。ストレプトアビジンまたはアビジンのビオチン分子４個との結合能によって、標的でのシグナルを増幅するさらなる技法が提供される。この態様において、核酸プローブは、それに結合したビオチンを有する１つ以上のヌクレオチドによって構築される。次にプローブを標的核酸配列とハイブリダイズさせ、このようにして一次リガンドとして作用する。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズした核酸を、ビオチン化プローブとの結合において二次リガンドとして作用するストレプトアビジンまたはアビジンと接触させる。次に、GFPまたはその蛍光変異体で標識したさらなるビオチンを、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させる。標識したビオチンはリガンドとして作用し、ストレプトアビジンまたはアビジンと結合する。各ストレプトアビジンまたはアビジン分子は、標識したビオチン分子４個と結合することができるため、多くの蛍光蛋白質分子を含む比較的大きい三次元ネットワークが形成される。次に、増幅したシグナルを蛍光顕微鏡のような蛍光検出技法によって検出する。同様にして、検出および増幅した検出が得られるように、ビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジンは抗体分子に結合させることができる。例えば従来のクロスリンク技法によって、ビオチンを、定義された標的抗原に特異的な抗体と結合させる。次に、ビオチン化抗体を標的と接触させ結合させる。次に、GFP またはその蛍光変異体で標識したストレプトアビジンまたはアビジンを、抗体／標的抗原複合体と接触させると、ビオチン化抗体のビオチン部分に対する標識ストレプトアビジンまたはアビジンの結合が起こる。このように、ストレプトアビジンまたはアビジンは、ビオチンに結合するためのリガンドとして機能する。蛍光顕微鏡によって蛍光シグナルは可視化され、標的の正確な位置を示すことができる。または、ストレプトアビジンまたはアビジンは、定義された標的抗原に特異的な抗体に結合してもよい。ストレプトアビジンまたはアビジン結合抗体を標的に接触させて結合させる。GFPまたはその蛍光変異体で標識されたビオチンを、抗体／標的抗原複合体と接触させると、抗体のストレプトアビジンまたはアビジン部分と標識ビオチンとの結合が起こる。このようにして、標識されたビオチンは、ストレプトアビジンまたはアビジン結合抗体との結合においてリガンドとして作用する。上記のように、４個もの蛍光分子が標的部位で濃縮される。同様に、ストレプトアビジンまたはアビジンのビオチン分子４個との結合能によって、標的抗原でシグナルを増幅するさらなる技法が提供される。抗体は従来の技法を用いてビオチンと結合させる。次に、一次リガンドとして作用する抗体は、標的抗原と複合体を形成する。次に抗体／抗原複合体を、ビオチン化抗体との結合において二次リガンドとして作用するストレプトアビジンまたはアビジンと接触させる。GFPまたはその蛍光変異体で標識したさらなるビオチンを、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させて、標識リガンドとして作用させ、ストレプトアビジンまたはアビジンと結合させる。各ストレプトアビジンまたはアビジン分子は標識ビオチン分子４個と結合するため、多くの蛍光蛋白質分子を含む比較的大きい３次元ネットワークが形成される。ビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジンと複合体を形成するよう作製され、GFPまたはその蛍光変異体を組み入れる抗体もまた、標的を検出する標識リガンドとして有用である。ビオチンと結合させたヌクレオチドを含む核酸プローブは、変性させた標的核酸の相補配列とハイブリダイズする。次に、ハイブリダイズした核酸を、GFPまたはその蛍光変異体を結合した抗ビオチン抗体と接触させ、検出可能な蛍光マーカーを含む複合体を形成する。複合体の位置は蛍光顕微鏡のような蛍光検出技法を用いて可視化される。同様に、ストレプトアビジンまたはアビジンは核酸プローブに結合させてもよい。相補的標的核酸とハイブリダイズさせた後、標識複合体の形成にストレプトアビジンまたはアビジン結合プローブを用いたか否かに応じて、ハイブリダイズした核酸を抗ストレプトアビジン抗体または抗アビジン抗体と接触させる。複合体の位置は蛍光顕微鏡を用いて可視化される。 GFPまたはその蛍光変異体は、クロスリンク技法によって、本発明に従って、G FPまたはその蛍光変異体の変性または誤まった折り畳みを生じないリガンドに結合する。本明細書で用いられる「結合した（linked or conjugated）」という用語は、標識をリガンドにカップリングさせるために、当技術分野で公知のいくつかまたは全てのメカニズムを含むと解釈される。例えば、当業者に公知のいかなる化学または酵素的結合も、光活性化等に起因する結合を含むと予想される。ホモ機能的およびヘテロ機能的架橋剤は全て適している。架橋剤とクロスリンクすることができる反応基には、１級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、糖質およびカルボン酸が含まれる。様々な長さのスペーサー・アームまたはブリッジを有する架橋剤が利用できる。１級アミンとの反応に適した架橋剤には、イミドエステルおよびN-ヒドロキシスクシンイミジル（NHS）エステルのようなホモ二機能的架橋剤が含まれる。イミドエステル架橋剤の例には、ジメチルアジピン酸イミドエステル（dimethylad ipimidate）、ジメチルピメリン酸イミドエステル（dimethylpimelimidate）、およびジメチルスベリン酸イミドエステル（dimethylsuberimidate）が含まれる。NHS-エステル架橋剤の例には、グルタミン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ジスクシンイミニジルおよびスベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）が含まれる。ペプチドのN末端上に存在する、近づくことができるαアミン基はNHS-エステルと反応してアミドを形成する。NHS-エステルのクロスリンク反応は、燐酸、重炭酸／炭酸、HEPESおよびホウ酸緩衝液中で実施することができる。他の緩衝液も１級アミンを含まなければ、用いることができる。NHS-エステルと１級アミンとの反応は、約７〜約９の間のpHで、約４℃〜室温にて約30分〜２時間実施すべきである。NHS-エステルの架橋剤の濃度は約0.1〜約10mMまで変化することができる。NHS-エステルは親水性または疎水性のいずれかである。親水性NHS-エステルは水溶液中で反応させるが、溶解度を増加させるためにDMSOを含めてもよい。疎水性NHS-エステルは、水混和性の有機溶媒に溶解してから水性反応混合物に加える。スルフヒドリル反応性架橋剤には、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、およびスルフヒドリルと反応してチオエーテル結合を形成するα -ハロアシル、およびスルフヒドリルと反応して混合ジスルフィドを形成するピリジルジスルフィドが含まれる。ペプチドおよび蛋白質上のスルフヒドリル基は、当業者に公知の技術によって、例えばジスルフィド基の還元または2-イミノチオランを用いた１級アミンとの反応による付加によって、産生することができる。マレイミド架橋剤の例は、スクシンイミジル4-(N-マレイミド-メチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレートおよびm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミド・エステルである。ハロアセタール架橋剤の例には、N-スクシンイミジル（4-ヨードアセタール）アミノベンゾエートおよびスルホスクシンイミジル（4-ヨードアセタール）アミノベンゾエートが含まれる。ピリジルジスルフィド架橋剤の例には、1,4-ジ-[3'-2'-ピリジルジチオ(プロピオンアミド)ブタン]およびN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオネートが含まれる。カルボキシル基は、カルボジミドを用いることによって、１級アミンまたはヒドラジンとクロスリンクして、アミドまたはヒドラゾン結合を形成する。このようにして、ペプチドまたは蛋白質のカルボキシ末端を結合することができる。カルボジイミド架橋剤の例には、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドおよびN，N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドが含まれる。アリールアジド架橋剤は、紫外線放射に暴露された場合に反応性となり、アリールナイトレンを形成する。アリールアジド架橋剤の例には、アジドベンゾイルヒドラジドおよびN-5-アジド-2-ニトロベンゾイル-オキシスクシンイミドが含まれる。グリオキサール架橋剤は、アルギニンのグアニジル部分を標的にする。グリオキサール架橋剤の例は、p-アジドフェニルグリオキサール１水和物である。２つ以上の異なる反応基を有するヘテロ二機能的架橋剤は、本明細書における使用に適している。例としては、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-(2- ピリジルジチオ)-トルエン、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオン酸塩のような、一方の末端でアミン反応性でもう一方ではスルフヒドリル反応性である架橋剤、および上記のマレイミド架橋剤が含まれる。本発明のキットは、適したパッケージング材料と、緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識を含むリガンド（上記のような）とを含む。好ましくは、リガンドは抗体であり、最も好ましくは、抗ジゴキシゲニン抗体である。キットはFISHを適用する際に用いられる対比染色、例えばDAPIまたはヨウ化プロピジウムのような他の材料を含んでもよい。以下の実施例は、説明を目的として含まれるものであり、本発明を制限するものと解釈してはならない。実施例１ GFPのビオチン標識ビオチン（長腕）N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（BNHS）（カリフォルニア州のベクター・ラボラトリーズ社(Vector Laboratories)から販売されている）粉末を25mg/mlの濃度でDMSOに溶解した。GFP蛋白質100μg（100μl中）（カリフォルニア州のクロンテック・ラボラトリーズ社(Clontech Laboratories)から販売されている）を、蛋白質のアミノ基の標識を妨害するトリス緩衝液中で加えた。トリス緩衝液を除去するために、GFPを未滴定の100mM重炭酸ナトリウムに対して、これを３回取り替えて一晩透析した。得られた蛋白質250μlを、ナノセップ（Nanosep）スピンフィルター（Filtron）OMEGAメンブレン、カットオフ分子量10,000）を用いて、GFPをフィルターの上部に載せて、微量遠心器においてスピンカラムを４℃で１時間、6000rpmで遠心することによって、容量40μlに濃縮した。溶解したBNHS 50μgをGFP溶液に加えて、混合液を室温の暗所で回転台に載せて２時間インキュベートした。グリシン10mgを加えて反応を停止させた。得られたビオチン結合GFPを、未滴定の100mM重炭酸ナトリウムに対して、これを３回取り替えて一晩透析した。実施例２プローブの調製第17染色体（17q11.2-q12）上のヒトゲノムDNAの約75キロベースに及ぶHER-2/ neu遺伝子の核酸プローブ、ヒト第17染色体（D17Z1）第16染色体（D16Z1）の反復配列プローブ、およびY染色体（DYZ1/DYZ3）（メリーランド州のオンコー・インク社（Oncor,Inc.）から販売されている）を利用した。核酸プローブは、標準的なニックトランスレーションを用いて、ビオチン-14-デオキシシトシン三燐酸（Oncor，Inc.）で標識した。ビオチンヌクレオチドの標識DNAへの組み込みは、ドットブロット技法によって確認した。DNA断片の大きさは、核酸スメアの大部分が600塩基対未満となるように、ゲル電気泳動（３％ヌシーブ(NuSieve)アガロース）によって決定した。実施例３インサイチューハイブリダイゼーション健常な男性の末梢血から単離した、固定された分裂中期および分裂間期の核をガラススライド上に調製した。試料標本を70％ホルムアミド／２×SSC溶液、pH7 .0に72℃で２分間浸した後、一連の冷（-20℃）エタノール中で直ちに脱水し、風乾させることによって、標的DNAを変性させた。ビオチン標識HER-2/neuプローブを全体で500ng、50％ホルムアミド／２×SSC／10％硫酸デキストランを含むハイブリダイゼーション混合液10μlを72℃で５分間変性させ、スライド上の試料に加えてカバーガラスを載せた。反復配列プローブのハイブリダイゼーションは以下のように実施した。標識した反復配列プローブ5.0ng、65％ホルムアミド／２×SSC／10％硫酸デキストランを含むハイブリダイゼーション混合液10μlを72 ℃で５分変性させ、スライド上の試料に加えてカバーガラスを載せた。ハイブリダイゼーション後、試料をSSC溶液（独自の配列プローブについては１×SSC、反復配列プローブについては0.25×SSC、中で72℃で５分間洗浄し、１×PBD（燐酸緩衝洗浄剤）を含むコプリン・ジャーに直ちに入れて、蛍光検出技法の前に室温で少なくとも２分間放置した。実施例４ GFPによる蛍光の検出全ての試料を、アビジン（10μg/ml）（Vector Laboratories）、１×PBS、５％ドライミルク粉末、および0.02％アジドナトリウムを含む検出試薬60μlで染色し、これをスライドガラスに載せて、プラスチックのカバーグラスを載せて湿潤チャンバー内で37℃で15分間インキュベートした。スライドを１×PBDで室温で数回洗浄した。次に、試料をGFP-ビオチン結合体（100μg/mlまたは10μg/ml ）の100mM重炭酸ナトリウム緩衝液溶液60μlで染色して、湿潤チャンバー内で37 ℃で30分インキュベートした。スライドを１×PBDまたはまたは１×PBSのいずれかですすぎ、ヨウ化プロピジウム（0.3μg/ml）のアンチフェード溶液（Oncor， Inc.）で対比染色した。分析しない場合は、スライドを-20℃の暗所で保存した。蛍光顕微鏡については、100ワット水銀アーク灯、100×プラン・ネオフルオロ・油浸レンズ（Zeiss、西ドイツ）、ツァイスMC-100カメラ（Zeiss、西ドイツ）、ならびに励起波長490nmおよび放射波長525mを有するFITC/P1蛍光用の適当なフィルターセット（Chroma、VT）を備えた、ツァイス・アキシオスコップ(Zeiss A xioskop)・エピ蛍光顕微鏡（Zeiss、西ドイツ）を用いて、コダック・エクタクローム(Kodak Ektachrome)・カラースライドフィルム（EL 400）で顕微鏡写真を撮影した。画像分析および記録保持についても、OIS（Oncor Instrument System s、MD）3CCD冷却カメラシステムおよびOIS 2.01画像分析ソフトを用いて実施した。サテライト第17染色体特異的プローブは、ヒト第17染色体のセントロメアに存在する、より高度に反復されるアルフォイド（alphoid）DNAとハイブリダイズする。緑色蛍光シグナルは、分裂中期の第17染色体相同体の双方のセントロメア付近で見ることができる（図1A参照のこと）が、それぞれの分裂間期の核においても２つの蛍光シグナルが認められる（図1B参照）。Y染色体カクテルプローブと組合せたαサテライト第16染色体特異的プローブのハイブリダイゼーションは成功であった。蛍光シグナルは、第16染色体相同体の双方のセントロメア付近に存在し、分裂中期の核では、セントロメア付近および一つのY染色体のYqI2領域で１つのシグナルを見ることができる。したがって、分裂間期の核は３つのシグナルを示す（図２参照）。 HER-2/neu遺伝子を可視化すると予想通りの結果が得られた。単一の緑色蛍光シグナルはHER-2/neu遺伝子の各コピーの位置で見ることができる。正常な分裂中期染色体におけるシグナルの数は２つ；それぞれの染色分体上に１つずつ（図 3A参照）であり、正常な分裂間期の核におけるシグナルの数もまた２つで、または細胞がG2期にある場合には２組である（図3B参照）。蛍光シグナルは光安定性で、調べた条件下ではシグナル強度に顕著な損失を起こすことなく肉眼で見えるままである。実施例５ GFPによる抗ジゴキシゲニン抗体Fab断片の標識チオール化抗体をスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（「スルホ-SMCC」）と以下のように結合させる：GFP を１×PBS（燐酸緩衝塩類溶液、Biofluids Inc.）、pH7.2に10mg/mlで溶解する。GFP １mlあたりスルホSMCC（ピアス社カタログ番号22322）１mgを加えて溶解するまで混合する。混合液を室温の暗所で30〜60分反応させる。得られたマレイミド活性化GFPを、１×PBS、pH7.2に対するゲル濾過（セファデックスG-25）によって、過剰量の架橋剤および反応産物から分離する。溶出後、結合反応のために濃度を10mg/mlに調節する。得られた溶液を用いて下記のようにチオール化抗体と直ちに結合させる。改変したヒツジ抗ジゴキシゲニン、Fab断片（Boehringe r Mannheim）は、以下のように調製する：Fab断片は１×PBS、pH7.2に10mg/mlで溶解する。N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート（SATA）（ピアス社、カタログ番号26102）保存溶液は、SATAを換気フード下でDMSOに13mg/mlで溶解することによって調製する。10mg/ml Fab断片溶液１mlあたりSATA保存溶液25μl を加える（10％DMSOを超えない）。得られた溶液を暗所で30分反応させる。得られたSATA結合抗ジゴキシゲニンFab断片を、10mM EDTAを含む１×PBS、pH7.2に対するゲル濾過（Sephadex G-25）によって精製する。SATA-抗ジゴキシゲニン上のアセチル化スルフヒドリル基は、以下のように脱保護される：SATA-抗-ジゴキシゲニン１mlあたり、0.5Mヒドロキシルアミンの0.1M燐酸ナトリウム溶液、pH7 .2、10mM EDTAを含むヒドロキシルアミン保存溶液100μlを、ヒドロキシルアミンの最終濃度が50mMとなるように加える。得られた混合液を室温の暗所で２時間反応させる。得られたチオール化抗ジゴキシゲニンを、10mM EDTAを含む１×PBS に対するゲル濾過（Sephadex G-25）によって精製する。GFP／抗ジゴキシゲニン複合体は、チオール化抗ジゴキシゲニンとマレイミド活性化GFPをモル比４：１（抗体：GFP）で直ちに混合することによって産生される。得られた混合液を37 ℃で２時間反応させると結合体が得られる。別の方法では、得られた混合液を室温の暗所で２時間、または４℃の暗所で一晩反応させてもよい。上記実施例において、ゲル濾過の代わりに透析を用いてもよい。本明細書に記述の態様には、様々な改変を加えてもよいことが理解されると思われる。例えば、本明細書に記述した以外のリガンドまたは結合パートナーをGF Pまたはその蛍光変異体に結合させてもよい。同様に、GFPまたはその蛍光変異体は、シグナル増幅を増加させるために、リガンドとの結合前に、同じまたは他の蛍光分子に結合させてもよいと考えられる。例えば、GFPはフルオレセインと結合して、他の分子と組み合わせて結合させることができる。GFPはまた、さらなるGFPと結合してGFPのオリゴマー鎖を形成することができる。次に、そのような蛍光の組合せをリガンドに結合させて本明細書に記述のように使用する。同様に、少なくとも一次リガンドおよび二次リガンドを組み入れる技法を使用する場合には、シグナル増幅の増加を得るために、個々のおよびあらゆるリガンドをGFP またはその蛍光変異体で個別に標識することができる。さらに、方法の段階の順序は、リガンドと標的または他のリガンドとの結合を容易にするために変更してもよい。従って、上記記述は制限的に解釈してはならず、好ましい態様の例示として解釈すべきである。当業者はその他の改変を行うことができるが、それも以下の請求の範囲に含まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年４月８日（１９９９．４．８）【補正内容】請求の範囲１．リガンドと標識とを含む組成物であって、該リガンドが核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、およびアビジンからなる群より選択され、該標識が緑色蛍光蛋白質または緑色蛍光蛋白質の蛍光変異体からなる群より選択される組成物。２．核酸が抗原、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合されている、請求項１記載の組成物。３．抗体が抗原、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合されている、請求項１記載の組成物。４．リガンドが標識と共有結合している、請求項１記載の組成物。５．架橋剤がリガンドと標識との間にあり、該リガンドおよび該標識が該架橋剤に共有結合されている、請求項１記載の組成物。６．架橋剤がイミドエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロアセタール、ピリジルジスルフィド、カルボジイミド、アリールアジド、およびグリオキサールからなる群より選択される、請求項５記載の組成物。７．標的とマーカーとを含む複合体であって、該マーカーがリガンドと標識とを含み、該リガンドが核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチンおよびアビジンからなる群より選択され、該標識が緑色蛍光蛋白質または緑色蛍光蛋白質の蛍光変異体からなる群より選択される複合体。８．リガンドと標識とを含むキットであって、該リガンドが核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチンおよびアビジンからなる群より選択され、該標識が緑色蛍光蛋白質または緑色蛍光蛋白質の蛍光変異体からなる群より選択されるキット。９．リガンドが抗体である請求項８記載のキット。 10．抗体が抗ジゴキシゲニン抗体である請求項９記載のキット。 11．対比染色剤を含む請求項８記載のキット。 12．対比染色剤がDAPIおよびヨウ化プロピジウムからなる群より選択される、請求項11記載のキット。 13．下記の段階を含む、リガンドと標識とを含む組成物の製造方法： (a)リガンドと標識とを提供する段階であって、該標識が緑色蛍光蛋白質または緑色蛍光蛋白質の蛍光変異体からなる群より選択される段階；および (b)インビトロにおいて該リガンドを該標識に結合させる段階。 14．リガンドが核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、ストレプトアビジン、およびアビジンからなる群より選択される、請求項13記載の方法。 15．核酸が抗原、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項14記載の方法。 16．抗体が抗原、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項14記載の方法。 17．リガンドが標識に共有結合される、請求項13記載の方法。 18．リガンドが、該リガンドと標識とを架橋剤に共有結合させることにより標識に結合される、請求項13記載の方法。 19．架橋剤がイミドエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロアセタール、ピリジルジスルフィド、カルボジイミド、アリールアジド、およびグリオキサールから成る群より選択される、請求項13記載の方法。 20．下記の段階を含む標的を検出する方法： (a)標的とマーカーとを提供する段階であって、該マーカーがリガンドと標識とを含み、該リガンドが核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチンおよびアビジンからなる群より選択され、該リガンドが標的に結合することができ、該標識が緑色蛍光蛋白質または緑色蛍光蛋白質の蛍光変異体からなる群より選択される段階； (b)該マーカーを該標的に結合させる段階；および (c)該マーカーを検出し、それによって該標的を検出する段階。 21．核酸が抗原、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項20記載の方法。 22．抗体が抗原、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項20記載の方法。 23．下記の段階を含む、標的を検出する方法： (a)(i)標的と、 (ii)核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチンおよびアビジンから成る群より選択される第１リガンドであって、該標的に結合することのできるリガンドと、 (iii)第２リガンドと標識とを含むマーカーであって、該第２リガンドが核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチンおよびアビジンからなる群より選択され、該第２リガンドが該第１リガンドに結合することができ、該標識が緑色蛍光蛋白質または緑色蛍光蛋白質の蛍光変異体からなる群より選択されるマーカーとを提供する段階； (b)(i)該第１リガンドを該標的に結合させ、 (ii)該第２リガンドを該第１リガンドに結合させる段階；および (c)該マーカーを検出し、それによって該標的を検出する段階。 24．(a)(ii)または(a)(iii)における核酸が抗原、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項23記載の方法。 25．(a)(ii)または(a)(iii)における抗体が抗原、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項23記載の方法。 26．下記の段階を含む、標的を検出する方法： (a)(i)標的と、 (ii)核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチンおよびアビジンから成る群より選択される第１リガンドであって、該標的に結合することのできるリガンドと、 (iii)核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチンおよびアビジンからなる群より選択され、該第１リガンドに結合することができる第２リガンドと、 (iv)第３リガンドと標識とを含むマーカーであって、該第３リガンドが核酸、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、およびアビジンからなる群より選択され、第２リガンドに結合することができ、該標識が緑色蛍光蛋白質または緑色蛍光蛋白質の蛍光変異体からなる群より選択されるマーカーとを提供する段階； (b)(i)該第１リガンドを該標的に結合させ、 (ii)該第２リガンドを該第１リガンドに結合させ、 (iii)該第３リガンドを該第２リガンドに結合させる段階；および (c)該マーカーを検出し、それによって該標的を検出する段階。 27．(a)(ii)、(a)(iii)、または(a)(iv)における核酸が抗原、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項26記載の方法。 28．(a)(ii)、(a)(iii)、または(a)(iv)における抗体が抗原、ビオチン、アビジン、およびストレプトアビジンからなる群より選択される因子に結合される、請求項26記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識と、標的に結合するよう形成されたリガンドとを含む、標的を検出するための標識されたマーカー。２．リガンドが核酸プローブ、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項１記載の標的を検出するための標識されたマーカー。３．標識が標的に結合するよう形成されたリガンドと直接結合する、請求項２記載の標的を検出するための標識されたマーカー。４．標識が標的に結合するよう形成されたリガンドと間接的に結合する、請求項２記載の標的を検出するための標識されたマーカー。５．標識が、標的に結合するよう形成されたリガンドに結合するよう形成されたリガンドに結合する、請求項４記載の標的を検出するための標識されたマーカー。６．標的に結合するよう形成されたリガンドに結合するよう形成されたリガンドが、抗体、アビジン、ストレプトアビジン、およびビオチンからなる群より選択される、請求項５記載の標識されたマーカー。７．標的に結合するよう形成されたリガンドが、抗原を組み入れた核酸プローブ、アビジンを組み入れた核酸プローブ、ストレプトアビジンを組み入れた核酸プローブ、ビオチンを組み入れた核酸プローブ、抗原を組み入れた抗体、アビジンを組み入れた抗体、ストレプトアビジンを組み入れた抗体、およびビオチンを組み入れた抗体からなる群より選択される、請求項５記載の標識されたマーカー。８．標識が、イミドエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロアセタール、ピリジルジスルフィド、カルボジイミド、アリールアジドおよびグリオキサールからなる群より選択される架橋剤によってリガンドと結合する、請求項１記載の標的を検出するための標識されたマーカー。９．緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識と、標的を結合するためのリガンドとを組み入れる、標識されたリガンドを提供する段階；標的を該標識されたリガンドと接触させる段階；該標識されたリガンドを該標的と結合させる段階；該標識されたリガンドおよび標的に、該標識を励起する波長を有する光を照射する段階；および蛍光の位置を観察する段階を含む、標的の検出法。 10．標識されたリガンドが一次リガンドと二次リガンドとを含む請求項９記載の標的の検出法であって、該一次リガンドが標的に結合するよう形成され、該二次リガンドが該一次リガンドに結合するよう形成され、該二次リガンドが標識を組み入れるものである、下記の段階を含む方法：標的を一次リガンドと接触させる段階；一次リガンドを標的と結合させる段階；一次リガンドを二次リガンドと接触させる段階；二次リガンドを一次リガンドと結合させる段階。 11．リガンドが核酸プローブ、抗体、ハプテン結合体、ビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群より選択される、請求項９記載の標的の検出法。 12．一次リガンドが、ビオチン、ストレプトアビジン、もしくはアビジンを組み入れる核酸プローブ、またはビオチン、ストレプトアビジンもしくはアビジンを組み入れる抗体である、請求項10記載の標的の検出法。 13．標識した二次リガンドが、標識した抗体、標識したビオチン、標識したストレプトアビジン、および標識したアビジンからなる群より選択される、請求項10 記載の標的の検出法。 14．標識されたリガンドが一次リガンドと二次リガンドと三次リガンドとを含む請求項９記載の標的の検出法であって、該一次リガンドが標的に結合するよう形成され、該二次リガンドが該一次リガンドに結合するよう形成され、該三次リガンドが該二次リガンドに結合するよう形成され、該三次リガンドが標識を組み入れるものである、下記の段階を含む方法：標的を一次リガンドと接触させる段階；一次リガンドを標的と結合させる段階；一次リガンドを二次リガンドと接触させる段階；二次リガンドを一次リガンドと結合させる段階；二次リガンドを三次リガンドと接触させる段階；および三次リガンドを二次リガンドと結合させる段階。 15．一次リガンドがビオチン、ストレプトアビジン、もしくはアビジンを組み入れる核酸プローブ、またはビオチン、ストレプトアビジン、もしくはアビジンを組み入れる抗体である、請求項14記載の標的の検出法。 16．二次リガンドがビオチン、ストレプトアビジン、アビジンまたは抗体である、請求項14記載の標的の検出法。 17．標識したリガンドが、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、または抗体を組み入れる、請求項14記載の標的の検出法。 18．標識が、緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択され、マーカーが標的に結合するよう形成されたリガンドをさらに組み入れ、リガンドが抗体、核酸プローブ、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジンおよびハプテン結合体からなる群より選択される、標識を有するマーカーと複合体を形成した標的を含む、標識されたマーカー／標的複合体。 19．緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識を提供する段階；リガンドを提供する段階；および標識をリガンドに結合させる段階、を含む、標識されたマーカーの製造法。 20．リガンドが抗体、核酸プローブ、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジンおよびハプテン結合体からなる群より選択される、請求項19記載の方法。 21．標識が、イミドエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、マレイミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、またはハロアセタール、ピリジルジスルフィド、カルボジイミド、アリールアジド、およびグリオキサールからなる群より選択される架橋剤によってリガンドと結合する、請求項19記載の方法。 22．適したパッケージング材料と、緑色蛍光蛋白質およびその蛍光変異体からなる群より選択される標識を含むリガンドとを含むキット。 23．リガンドが抗体である、請求項22記載のキット。 24．リガンドが抗ジゴキシゲニン抗体である、請求項23記載のキット。 25．対比染色をさらに含む、請求項22記載のキット。 26．対比染色が、DAPIおよびヨウ化プロピジウムからなる群より選択される、請求項25記載のキット。